Opisujemy użycie fenotypowego testu hamowania neuraminidazy opartego na fluorescencji do oceny podatności wirusów grypy A i B na inhibitory neuraminidazy klasy leków przeciwwirusowych.
Artykuł metodologiczny
Test hamowania neuraminidazy oparty na fluorescencji w celu oceny wrażliwości wirusów grypy na grupę inhibitorów neuraminidazy leków przeciwwirusowych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Inhibitory neuraminidazy (NA) są jedyną klasą leków przeciwwirusowych zatwierdzonych do leczenia i profilaktyki grypy, które są skuteczne przeciwko obecnie krążącym szczepom. Oprócz zastosowania w leczeniu grypy sezonowej, inhibitory NA zostały zgromadzone przez wiele krajów do stosowania w przypadku pandemii. Dlatego ważne jest monitorowanie podatności krążących wirusów grypy na tę klasę leków przeciwwirusowych. Istnieją różne rodzaje testów, które można wykorzystać do oceny podatności wirusów grypy na inhibitory NA, ale najczęściej stosowane i zalecane są testy hamowania enzymów przy użyciu substratu fluorescencyjnego lub chemiluminescencyjnego. Protokół ten opisuje zastosowanie testu opartego na fluorescencji do oceny wrażliwości wirusa grypy na inhibitory NA. Test opiera się na enzymie NA rozszczepiającym substrat kwasu 2′-(4-metylumbliferyl)-α-D-N-acetyloneuraminowego (MUNANA) w celu uwolnienia produktu fluorescencyjnego 4-metylolumbelliferonu (4-MU). W związku z tym hamujące działanie inhibitora NA na wirusa grypy określa się na podstawie stężenia inhibitora NA, które jest wymagane do zmniejszenia o 50% aktywności NA, podanego jako wartość IC50.
Wprowadzenie
Hemaglutynina (HA) i neuraminidaza (NA) to dwie główne glikoproteiny powierzchniowe wirusów grypy A i B. HA wiąże się z kwasem sjalowym-galaktozą glikoprotein powierzchniowych komórek lub glikolipidów, podczas gdy NA uwalnia wirusa poprzez rozszczepienie kwasu sjalowego z galaktozy na powierzchni komórki1. Inhibitory NA to klasa leków przeciwwirusowych przeciw grypie, które zostały racjonalnie zaprojektowane tak, aby ściśle wiązać się z enzymatycznym miejscem aktywnym NA, zapobiegając w ten sposób uwalnianiu i rozprzestrzenianiu się potomstwa wirusa. Oseltamiwir i zanamiwir to dwa inhibitory NA, które zostały zatwierdzone w wielu krajach na całym świecie do leczenia i profilaktyki grypy. W ostatnich latach dwa dodatkowe inhibitory NA, peramiwir i laninamiwir, zostały zatwierdzone do stosowania w ograniczonej liczbie krajów. Badania przesiewowe wirusów grypy pod kątem wrażliwości na inhibitory NA oraz identyfikacja mutacji nadających oporność są ważne w określaniu i monitorowaniu skuteczności tej klasy leków przeciwwirusowych.
W ciągu ostatnich 16 lat, test hamowania NA oparty na fluorescencji był rutynowo wykonywany w Centrum Referencyjnym i Badawczym WHO nad grypą w Melbourne (Melbourne WHOCCRRI) w celu monitorowania zmieniającego się trendu podatności na leki przeciwwirusowe wśród krążących wirusów grypy. Rocznie ponad 2000 wirusów grypy jest testowanych pod kątem wrażliwości na leki przeciwwirusowe. W większości sezonów grypowych >98% wirusów jest podatnych na wszystkie cztery inhibitory NA2,3,4, chociaż w sezonie grypowym na półkuli północnej 2007-2008 nastąpił gwałtowny wzrost liczby byłych sezonowych wirusów A(H1N1), które zmniejszyły podatność na oseltamivir5. Ta grupa wirusów, która zawierała substytucję aminokwasu NA H275Y, rozprzestrzeniła się na resztę świata pod koniec 2008 roku, co sprawiło, że oseltamiwir stał się nieodpowiedni na całym świecie w leczeniu tego wirusa. Zdecydowana większość obecnie krążących szczepów grypy B, grypy A(H3N2) i grypy A(H1N1)pdm09 jest podatna na oseltamiwir, chociaż klastry odmian A(H1N1)pdm09 zawierających substytucję aminokwasu NA H275Y, która nadaje zmniejszoną wrażliwość na oseltamiwir i peramiwir, zostały zgłoszone w różnych częściach świata6,7.
Ze względu na konieczność wystarczająco wysokiego miana wirusa, próbki kliniczne (w tym płukanie nosa zwierząt) muszą zostać przepuszczone albo do hodowli komórkowej, albo do zarodków kurzych przed testem wrażliwości na leki przeciwwirusowe. Test inhibicji NA opisany w tym artykule można podzielić na trzy sekcje:
Określanie zakresu liniowego dla produktu fluorescencyjnego 4-metylolumbelliferon (4-MU) na konkretnym fluorometrze
Ze względu na nieodłączne różnice między fluorometrami należy ustalić zakres liniowy dla fluorescencyjnego produktu końcowego, 4-MU, oraz względnej jednostki fluorescencji (RFU). Po ustaleniu zakresu liniowego dla 4-MU wybierany jest optymalny sygnał docelowy, do którego dostosowuje się stężenie wirusów grypy w teście aktywności NA. Po wykonaniu dla konkretnego fluorometru nie powinno być konieczne powtarzanie.
Określanie aktywności NA wirusów
Test aktywności NA jest prostym testem, który polega na dodaniu substratu kwasu 2′-(4-metylumbeliryl)-α-D-N-acetyloneuraminowego (MUNANA) do seryjnie rozcieńczanych wirusów. Ilość fluorescencyjnego produktu końcowego 4-MU powstałego w wyniku rozszczepienia MUNANA przez NA mierzy się za pomocą fluorometru. Odpowiednie rozcieńczenie wirusa do użycia w teście inhibicji NA wybiera się poprzez wykreślenie jednostek fluorescencji w stosunku do rozcieńczenia wirusa. Na podstawie wytworzonej krzywej esicznej punkt środkowy przekroju liniowego powinien odpowiadać zakresowi liniowemu 4-MU fluorometru określonemu w sekcji 1 i informować o odpowiednim stężeniu wirusów, które należy zastosować w sekcji 3.
Ocena podatności wirusa na inhibitory NA za pomocą testu inhibicji NA
W celu oceny wrażliwości wirusów na określony inhibitor NA, wirusy w rozcieńczeniu określonym w sekcji 2 są inkubowane z różnymi stężeniami inhibitora NA. Po kolejnej inkubacji z MUNANA 4-MU generowany przez nieinhibitowane wirusy jest mierzony w RFU za pomocą fluorometru. Hamujący wpływ inhibitora NA na aktywność enzymu NA wirusa oblicza się zgodnie ze stężeniem inhibitora NA wymaganym do zmniejszenia 50% aktywności NA, podanym jako wartość IC50.
Protokół
1. Określanie zakresu liniowego produktu fluorescencyjnego 4-MU na fluorometrze
- Przygotować 10 ml 6,4 mM roztworu podstawowego 4-MU, rozpuszczając 11,3 mg 4-MU w 5 ml absolutnego alkoholu etylowego. Dodaj 5 ml 0,9% NaCl (w/v) do roztworu podstawowego, aby uzyskać 10 ml. Przygotować roztwór roboczy o stężeniu 640 μM, rozcieńczając 1 ml 6,4 mM 4-MU w 9 ml 1x buforu do oznaczania (33,3 mM kwasu 2-(N-morfolino)etanosulfonowego (MES) i 4 mM CaCl2, pH 6,5).
UWAGA: Przygotować 2x bufor do oznaczania, dodając 13 g MES i 8 ml 1 M CaCl2 do 992 ml wody destylowanej. Doprowadzić pH do 6,5 za pomocą 10 M NaOH. Przefiltrować bufor za pomocą sterylnego filtra z octanu celulozy o wielkości porów 0,2 μm. Uwaga! Wodorotlenek sodu jest i może powodować oparzenia chemiczne skóry i oczu. Upewnij się, że noszone są pełne środki ochrony osobistej. - Przygotować 5 ml o różnych stężeniach 4 mln (tj. 5 μM, 10 μM, 20 μM, 40 μM, 80 μM, 160 μM i 320 μM) przez dwukrotne seryjne rozcieńczenie 640 μM 4-MU przy użyciu 1x buforu do oznaczania.
- Dozować 50 μl każdego seryjnego rozcieńczenia 4-MU (tj. 5 μM, 10 μM, 20 μM, 40 μM, 80 μM, 160 μM, 320 μM i 640 μM) (dwie studzienki na rozcieńczenie) do przezroczystej, 96-dołkowej płytki płaskodennej i 50 μl 1x buforu do oznaczania do pozostałych studzienek (które służą jako ślepe próby do pomiaru sygnałów tła).
UWAGA: Końcowe stężenia 4-MU w objętości reakcyjnej (50 μL 4-MU + 50 μL 300 μM MUNANA) wynoszą 2,5 μM, 5 μM, 10 μM, 20 μM, 40 μM, 80 μM, 160 μM i 320 μM. - Przygotować 2,5 mM roztwór podstawowy MUNANA, rozpuszczając 25 mg MUNANA w 20 ml wody destylowanej. Zmieszać 0,72 ml 2,5 mM MUNANA z 5,28 ml 1x buforu testowego, aby uzyskać 300 μM roztworu roboczego MUNANA (objętość wystarczająca na jedną płytkę). Przykryj probówkę zawierającą roztwór roboczy MUNANA o stężeniu 300 μM folią aluminiową i trzymaj ją na lodzie, chyba że zostanie natychmiast użyta. Wyrzuć wszelkie resztki materiałów.
UWAGA: Roztwór podstawowy MUNANA o stężeniu 2,5 mM może być przechowywany w temperaturze -20 °C przez 1 miesiąc i musi być zużyty w ciągu jednego cyklu zamrażania/rozmrażania. Roztwory 4-MU i MUNANA są wrażliwe na światło i muszą być chronione przed długotrwałym nasłonecznieniem. - Dodać 50 μl 300 μM MUNANA do każdego dołka, delikatnie postukać do wymieszania i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Przykryj płytkę uszczelniaczem do płytek, aby zapobiec parowaniu.
UWAGA: Ten krok ma na celu uwzględnienie fluorescencji tła w teście inhibicji NA. - Przygotować roztwór zatrzymujący, mieszając 11 ml absolutnego etanolu z 2,225 ml 0,824 M NaOH (objętość wystarczająca na jedną płytkę).
- Dodaj 100 μl roztworu zatrzymującego do każdej studzienki, aby zatrzymać reakcję i delikatnie postukaj, aby wymieszać.
- Odczytaj tabliczkę za pomocą fluorometru z ustawieniem długości fali wzbudzenia 355 nm i ustawieniem długości fali emisji 460 nm, zgodnie z instrukcjami producenta.
- Obliczyć średni sygnał tła przy użyciu sygnałów fluorescencyjnych ze wszystkich studzienek niezawierających 4-MU. Odejmij ten średni sygnał tła z każdej ze studzienek zawierających 4-MU i oblicz średnie sygnały (RFU) dla każdego stężenia 4-MU. Wykreślić krzywą wzorcową RFU w stosunku do stężenia 4-MU (μM), jak pokazano na rysunku 1a; Zbliżenie liniowego przekroju krzywej pokazano na rysunku 1b.
- Wizualizacja wykresu RFU w stosunku do stężenia 4-MU (μM) w celu określenia zakresu liniowego i optymalnego sygnału docelowego; zakres liniowy to miejsce, w którym sygnał fluorescencji wzrasta proporcjonalnie do rosnących stężeń 4-MU na wykresie, podczas gdy optymalnym sygnałem docelowym jest dowolne stężenie 4-MU w zakresie liniowym.
UWAGA: Zakres liniowy i optymalny sygnał docelowy są specyficzne dla fluorometru. Na przykład fluorometr w Melbourne WHOCCRRI ma zakres liniowy 2,5-40 μM 4-MU i optymalny sygnał docelowy ~30 μM 4-MU, co odpowiada ~1,500 RFU.
2. Określanie aktywności NA wirusów
UWAGA: Wirusy grypy są hodowane do wystarczającej liczby mian w komórkach Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) lub zarodkach kurzych jaj8.
- Dozować 120 μl na studzienkę nierozcieńczonych wirusów grypy z hodowli do kolumny 1 i 60 μl 1x buforu testowego zawierającego 0,1% NP-40 do pozostałych 11 kolumn 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery U.
- Kolejno przeprowadzić dwukrotne rozcieńczenie wirusów na płytce (tj. przenieść 60 μl z kolumny 1 do kolumny 2 i tak dalej, aż do kolumny 11) za pomocą pipety wielokanałowej, pozostawiając kolumnę 12 jako ślepą próbę zawierającą tylko 1x bufor do oznaczania.
- Przenieść 50 μl z każdej z studzienek (rozcieńczone wirusy i ślepe próby) do klarownej, 96-dołkowej płytki o płaskim dnie.
UWAGA: Nie ma potrzeby wymiany końcówek pipet, jeśli materiały są przenoszone z kolumny 12 do kolumny 1. - Dodać 50 μl 300 μM MUNANA (przygotowanej zgodnie z krokiem 1.4) do dołka i delikatnie postukać w płytkę, aby wymieszać. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Przykryj płytkę uszczelniaczem do płyt, aby zapobiec parowaniu.
- Dodać 100 μl roztworu zatrzymującego (przygotowanego zgodnie z krokiem 1.6) do studzienki, aby zakończyć reakcję i delikatnie postukać w płytkę, aby wymieszać.
- Odczytać tabliczkę za pomocą fluorometru.
- Użyj ustawienia długości fali wzbudzenia 355 nm i ustawienia długości fali emisji 460 nm.
- Określ średni sygnał tła na podstawie odczytów fluorescencji w kolumnie 12 i odejmij średni sygnał tła z każdej studzienki. Wykreśl wykres RFU w stosunku do rozcieńczeń wirusa.
UWAGA: Wartości tła dla 100 μM MUNANA w WHOCCRRI Melbourne wynoszą zwykle od 50 do 120 RFU, ale będą się różnić w zależności od używanego fluorometru. - Wyświetl wykres RFU w stosunku do rozcieńczeń wirusa, aby określić punkt środkowy przekroju liniowego krzywej dla każdego wirusa (rysunek 2). Użyj optymalnego sygnału docelowego (określonego w kroku 1) jako punktu odniesienia.
UWAGA: Powinno to odpowiadać zakresowi liniowemu 4-MU fluorometru określonemu w sekcji 1 i zapewni odpowiednie stężenie wirusów, które należy zastosować w sekcji 3.
3. Ocena podatności wirusa na inhibitory NA za pomocą testu hamowania NA
- Przygotować zapasy wzorcowe inhibitorów NA w stężeniach 300 μM.
- Przygotować 300 μM zanamiwiru (masa cząsteczkowa, MW = 332,32 g/mol), rozpuszczając 5,0 mg zanamiwiru w 50 ml 2x buforu do oznaczania (66,6 mM MES i 8 mM CaCl2, pH 6,5).
- Przygotować 300 μM karboksylanu oseltamiwiru (D-winian; MW = 386,44 g/mol) przez rozpuszczenie 5,8 mg w 50 ml 2x buforu do oznaczania.
- Przygotować 300 μM trójwodzianu peramiwiru (MW = 382,45 g/mol), rozpuszczając 5,7 mg w 50 ml 2x buforu do oznaczania.
- Przygotować 300 μM laninamiwiru (MW = 346,34 g/mol), rozpuszczając 5,2 mg w 50 ml 2x buforu do oznaczania.
UWAGA: Główny inhibitor NA może być przechowywany w temperaturze -20 °C przez 12 miesięcy. Należy sprawdzić MW inhibitorów NA, aby upewnić się, że do rekonstytucji użyto prawidłowych mas i objętości. Karboksylan oseltamiwiru jest związkiem czynnym proleku fosforanu oseltamiwiru. Z tego względu w teście inhibicji NA należy stosować wyłącznie karboksylan oseltamiwiru.
- Z zapasów wzorcowych przygotować zapasy robocze dziesięciokrotnych seryjnych rozcieńczeń inhibitorów NA w probówkach wirówkowych o pojemności 50 ml w stężeniach 0,03 nM, 0,3 nM, 3 nM, 30 nM, 300 nM, 3000 nM i 30 000 nM w 2-krotnym buforze testowym (66,6 mM MES i 8 mM CaCl2, pH 6,5); jest to przeznaczone do stosowania w wielu testach.
UWAGA: Końcowe stężenia inhibitorów NA w objętości reakcji (50 μL rozcieńczenia wirusa + 50 μL inhibitora NA + 50 μL 300 μM MUNANA) wynoszą odpowiednio 0,01 nM, 0,1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 000 nM i 10 000 nM. Końcowe stężenie nie obejmuje 100 μl roztworu zatrzymującego. Wszystkie rozcieńczone inhibitory NA należy przechowywać w temperaturze 2-8 °C. Data wygaśnięcia jest taka sama jak w przypadku zapasów podstawowych. - Przygotować rozcieńczenia wirusa w 1x buforze testowym zawierającym 0,1% środka powierzchniowo czynnego NP-40 w bloku 96 studni głębinowych. Stosować rozcieńczenia wirusa w oparciu o wyniki testu aktywności NA pochodzące z sekcji 2. Użyj całkowitej objętości 2 ml na wirusa do przetestowania czterech inhibitorów NA.
UWAGA: Przygotuj dwie studzienki (1 ml na studzienkę) na wirusa w bloku z 96 dołkami. Przykłady rozcieńczeń wirusa VIRUS 1, 2 i 3 przedstawiono w Tabeli 1. - Dozować wymaganą objętość inhibitorów NA (przygotowanych zgodnie z krokiem 3.2) do zbiornika z 8 studniami. Stamtąd dozuj 50 μl inhibitorów NA w rozcieńczeniach w zakresie od 0 nM (tylko 2x bufor testowy) do 30 000 nM w rzędach od A do H na przezroczystej, 96-dołkowej płytce o płaskim dnie.
UWAGA: Układ płyt jest zilustrowany na rysunku 3. - Dodać 50 μl rozcieńczonych wirusów testowych na basenik do kolumn 1-11 i 50 μl na basenik 1x bufor do oznaczania tylko do kolumny 12. Delikatnie postukaj w płytkę, aby wymieszać i inkubować w temperaturze pokojowej przez 45 minut. Przykryj płytkę uszczelniaczem do płyt, aby zapobiec parowaniu.
- Dodać 50 μl 300 μM MUNANA (przygotowanej zgodnie z krokiem 1.4) do dołka i delikatnie postukać w płytkę, aby wymieszać. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Przykryj płytkę uszczelniaczem do płyt, aby zapobiec parowaniu.
- Dodać 100 μl roztworu zatrzymującego (przygotowanego zgodnie z krokiem 1.6) do każdego dołka i delikatnie postukać w płytkę, aby wymieszać.
- Odczytać tabliczkę za pomocą fluorometru.
- Należy użyć długości fali wzbudzenia 355 nm i długości fali emisji 460 nm, jak opisano wcześniej.
4. Obliczanie wartości IC50
UWAGA: JASPR v1.2 to oprogramowanie do dopasowywania krzywych, które umożliwia obliczanie wartości IC50. Oprogramowanie zostało opracowane przez Wydział ds. Grypy w CDC w Atlancie w USA. Oprogramowanie wykorzystuje równanie: V=Vmax x(1-([I]/(Ki +[I]))), gdzie Vmax to maksymalne tempo metabolizmu, [I] to stężenie inhibitora, V to hamowana odpowiedź, a Ki to IC50 dla krzywej hamowania.
- Skopiuj i wklej surowe dane wyjściowe przez fluorometr do arkusza kalkulacyjnego w formacie 12-kolumnowym (96-dołkowym), zaczynając od komórki A1.
UWAGA: Surowe dane z każdej kolejnej płyty muszą być rozłożone naprzemiennie o jeden pusty wiersz. Jeśli każdy wirus został przetestowany przeciwko czterem inhibitorom NA, wklej surowe dane do zestawu czterech (z pustym wierszem między każdą płytką). - Otwórz oprogramowanie do dopasowywania i kliknij zakładkę "Eksperyment". Wybierz "Alternatywne próbki 2-lekowego Fluoro 11".
- Kliknij zakładkę "Opcje" i zaznacz "Generuj wykresy".
- Kliknij ponownie "Opcje" i kliknij zakładkę "Nowy klucz". Zapisz plik .csv "inhibition_key" w tym samym folderze, co plik arkusza kalkulacyjnego z surowymi danymi.
- W pliku inhibition_key wymień wszystkie przykładowe nazwy poniżej identyfikatora. Każda nazwa próbki musi być unikatowa.
- Jeśli testowane były cztery inhibitory NA, wstaw spacje na dwa dodatkowe wiersze poniżej Oseltamiwiru i wpisz "Peramiwir" i "Laninamiwir". Zapisz wprowadzone zmiany w pliku inhibition_key.
- Wróć do okna "jaspr v 1.2-Inhibition Curve fitting" i wybierz plik z surowymi danymi jako "Plik eksperymentu", a następnie inhibition_key jako "Plik klucza". Uruchom analizę. Zapisz wyniki w formatach .csv i .pdf.
UWAGA: Oprogramowanie automatycznie wykreśli krzywą inhibicji (RFU w stosunku do stężeń inhibitora NA), jak pokazano na rysunku 4. Program oblicza również wartości IC50 dla każdego wirusa w stosunku do pojedynczego inhibitora NA (ryc. 4). Dodatkowo JASPR prezentuje wartości IC50 i stosunek sygnału do tła (S/B) w formacie arkusza kalkulacyjnego. Wartości tła mogą się różnić w zależności od laboratorium, w zależności od użytego fluorometru. W Melbourne WHOCCRRI wartości tła dla 100 μM MUNANA mieszczą się w zakresie od 50 do 120 RFU. Aby uzyskać wiarygodną wartość IC50, preferowany jest stosunek S/B wynoszący ≥10, chociaż stosunek mniejszy niż 10 jest nadal dopuszczalny, szczególnie w przypadku zmutowanych wirusów, które mają bardzo niską aktywność NA. - Sprawdź wartości IC50 i kształty krzywych wygenerowane przez oprogramowanie. Wszystkie punkty danych powinny znajdować się na krzywej lub w jej pobliżu; jeśli tak się nie stanie, powtórzyć test hamowania NA.
UWAGA: W przypadku wirusów, które wykazują niezwykle wysokie wartości IC50, test należy powtórzyć w celu potwierdzenia wyniku.
Wyniki
Zgodnie ze zstandaryzowanymi wytycznymi raportowania opracowanymi przez Grupę Roboczą WHO ds. Nadzoru nad Podatnością Grypy na Leki Przeciwwirusowe9, podatność wirusów grypy na inhibitory NA raportowana jest przy użyciu określeń: inhibicja prawidłowa (NI), inhibicja zmniejszona (RI) oraz inhibicja silnie zmniejszona (HRI). Wirusy NI to takie, których wartości IC50 są mniejsze niż 10-krotność referencyjnej mediany IC50 dla wirusów grypy A (lub mniejsze niż 5-krotność dla wirusów grypy B). Wirusy RI to takie, których wartości IC50 mieszczą się w zakresie od 10- do 100-krotności referencyjnej mediany IC50 dla wirusów grypy A (lub od 5- do 50-krotności dla grypy B). Wirusy HRI to takie, których wartości IC50 przekraczają 100-krotność referencyjnej mediany IC50 dla wirusów grypy A (lub 50-krotność dla wirusów grypy B); patrz Tabela 2.
Referencyjne medianowe wartości IC50 dla wirusów A(H1N1)pdm09, A(H3N2) oraz B Yamagata/B Victoria są obliczane i aktualizowane corocznie w Melbourne WHOCCRRI, aby odzwierciedlać niewielkie zmiany w wartościach IC50 krążących szczepów grypy w odpowiedzi na inhibitory NA (Tabela 3). Medianowe wartości IC50 w wirusach grypy A(H1N1)pdm09 są niemal identyczne dla czterech inhibitorów NA, natomiast medianowe wartości IC50 zanamiwiru i laninamiwiru dla wirusów A(H3N2) są od 2 do 4 razy wyższe w porównaniu do wartości IC50 oseltamiwiru i peramiwiru (Tabela 3). Medianowa wartość IC50 oseltamiwiru dla wirusów grypy B jest zazwyczaj od 5 do 10 razy wyższa niż wartości IC50 zanamiwiru, peramiwiru i laninamiwiru (Tabela 3).
Test hamowania NA jest testem fenotypowym, który nie dostarcza informacji na temat zmian genetycznych związanych z RI lub HRI. Dlatego ważne jest, aby po zidentyfikowaniu wirusów z RI lub HRI przeprowadzono analizę genetyczną. W Melbourne WHOCCRRI gen NA wariantów jest analizowany przy użyciu sekwencjonowania metodą Sangera oraz pirosekwencjonowania. Reprezentatywna lista substytucji aminokwasowych, które mogą wystąpić w genie NA wirusów z wariantami RI i HRI, została przedstawiona w Tabeli 4. Bardziej obszerna lista substytucji aminokwasowych, które mogą zmieniać podatność na NAI, jest również dostępna na stronie internetowej WHO10.
Rycina 1: Wartości RFU w zależności od stężenia 4-MU. (a) Krzywa wzorcowa RFU w zależności od stężenia 4-MU (µM). Przerywana ramka wskazuje zakres liniowy 4-MU dla fluorometru. Sygnały fluorescencji powyżej zakresu liniowego mogą być nasycone, w związku z czym niewielkie zmiany fluorescencji mogą nie zostać wykryte przez fluorometr. (b) Powiększenie liniowego odcinka krzywej wzorcowej z Ryciny 1a w celu identyfikacji „optymalnego sygnału docelowego”. Fluorometr w Melbourne WHOCCRRI posiada zakres liniowy od 2,5-40 µM 4-MU i optymalny sygnał docelowy wynoszący ~30 µM 4-MU, co odpowiada ~1,500 RFU. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 2: Przykład krzywych aktywności NA wirusów grypy. Od każdego punktu rozcieńczenia na krzywych aktywności NA odjęto średnią wartość tła wynoszącą 50,61 RFU. Strzałki wskazują odpowiednie rozcieńczenie wirusa do zastosowania w teście inhibicji NA dla każdego wirusa. W celu ułatwienia przygotowania rozcieńczeń wirusa można zdecydować się na rozcieńczenie 1/100 dla VIRUS 3 zamiast rozcieńczenia 1/96. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 3: Układ płytki dla przygotowania testu inhibicji NA. Każda płytka zawiera ostatnią kolumnę, która służy jako kontrola negatywna; nie zawiera ona wirusa, a jedynie 1x bufor do testu (AB), inhibitor NA, MUNANA i roztwór stopujący. UWAGA: JASPR wykorzystuje odczyty z kolumny 12 każdej płytki do wyznaczenia średniego sygnału tła używanego w obliczeniach wartości IC50. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 4: Przykład krzywej inhibicji i wartości IC50 dla wirusa A(H1N1)pdm09, A/Perth/82/2015. Oprogramowanie JASPR przedstawia krzywą inhibicji jako fluorescencję (RFU) w funkcji rosnącego stężenia (nM) inhibitora NA, z każdym punktem dopasowanym do krzywej. Na podstawie krzywej inhibicji wartość IC50 jest określana jako stężenie inhibitora NA redukujące aktywność NA wirusa o 50%. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.
| Wirus | Wymagane rozcieńczenie wirusa | objętość buforu do analizy 1x (µL) | Surfaktant Amps-NP-40 (10%) (ml) | Objętość wirusa (ml) |
| 1 | 1/20 | 940 | 10 | 50 |
| 2 | 1/40 | 965 | 10 | 25 |
| 3 | 1/100 | 890 | 10 | 10 |
Tabela 1: Przygotowanie rozcieńczeń wirusów VIRUS 1, 2 i 3 w teście inhibicji NA.
| Typ/podtyp/linia wirusa | Hamowanie normalne | Zmniejszone hamowanie | Znacznie zredukowane hamowanie |
| (NI) | (RI) | (HRI) | |
| A(H1N1)pdm09 | <10-krotny | 10–100-krotnie | >100-krotnie |
| A(H3N2) | <10-krotny | 10–100 krotnie | >100-krotny |
| B Yamagata i B Victoria | <5-krotny | 5–50-krotny | >50-krotny |
Tabela 2: Wytyczne rekomendowane przez Grupę Roboczą ds. Leków Przeciwirusowych WHO dotyczące klasyfikacji podatności wirusa grypy na inhibitory NA.
| Typ/podtyp/linia wirusa | N | Zanamiwir | Oseltamiwir | Peramiwir | Laninamiwir |
| Mediana (zakres) IC50 nM | Mediana (zakres) IC50 nM | Mediana (zakres) IC50 nM | Mediana (zakres) IC50 nM | ||
| A(H1N1)pdm09 | 1,326 | 0.42 (0.1-3.43) | 0.36 (0.01-3.48) | 0.19 (0.07-1.60) | 0.55 (0.05-2.29) |
| A(H3N2) | 1,654 | 0.9 (0.11-4.0) | 0.38 (0.01-3.65) | 0.33 (0.12-3.06) | 1.38 (0.01-9.38) |
| B Yamagata i B Victoria | 1,115 | 2.2 (1.24-10.72) | 15.12 (2.39-70.75) | 1.36 (0.57-6.67) | 2.89 (1.62-9.15) |
Tabela 3: Mediana IC50 oraz zakres IC50 wirusów o normalnym hamowaniu (NI) z 2015 roku, wyizolowanych w WHO CCRRI w Melbourne.
| Substytucja aminokwasu | Typ/podtyp/linia | Krotność zmiany IC50 w porównaniu do referencyjnych median wartości IC50. | |||
| Zanamivir | Oseltamivir | Peramivir | Laninamivir | ||
| H275Y | A(H1N1)pdm09 | 1 | 557 (HRI) | 123 (HRI) | 2 |
| E119V | A(H3N2) | 1 | 63 (RI) | 1 | 1 |
| H134Y | B Victoria | 1 | 4 | 76 (HRI) | 2 |
| N151T | B Victoria | 4 | 4 | 42 (HRI) | 1 |
| G104E | B Victoria | 1,220 (HRI) | 87 (HRI) | 17,724 (HRI) | 701 (HRI) |
| E105K | B Victoria | 3 | 5 (RI) | 59 (HRI) | 2 |
| I222T | B Victoria | 2 | 7 (RI) | 8 (RI) | 3 |
| H273Y | B Yamagata | 1 | 230 (HRI) | 377 (HRI) | 2 |
| D197N | B Yamagata | 4 | 7 (RI) | 32 (RI) | 3 |
Tabela 4: Reprezentatywna lista substytucji aminokwasowych powiązanych ze zmniejszonym hamowaniem (RI) lub silnie zmniejszonym hamowaniem (HRI) w odniesieniu do inhibitorów NA.
| Problem | Możliwa przyczyna(y) | Rozwiązanie(ia) |
| Brak lub niska aktywność NA | Brak wirusa lub niska wydajność wirusa. | Próbkę kliniczną należy hodować w liniach komórkowych (np. komórki Madin-Darby Canine Kidney) lub w zarodkowych jajach kurzych, aby uzyskać wyższe miano wirusa do zastosowania w teście hamowania NA. |
| Niektóre wirusy zmutowane wykazują ekstremalnie niską aktywność NA mimo wysokiego miana wirusa. | Do testów należy użyć niezmieszanego stężenia wirusa. Można zastosować bufor do testu o niższym pH (np. pH 5.3). Należy jednak zachować ostrożność przy porównywaniu danych. | |
| Brak lub niska aktywność NA w teście hamowania NA | Nie dodano wirusa. | Należy ponownie rozcieńczyć wirusa. Należy upewnić się, że wirus jest dodawany bezpośrednio do 1x buforu do testu. |
| Użyto błędnego rozcieńczenia wirusa. | Należy powtórzyć test aktywności NA. | |
| Niewystarczający czas inkubacji. | Należy upewnić się, że zachowano czas inkubacji. | |
| Punkty danych wypadają poza krzywą IC50 | Zanieczyszczenie krzyżowe inhibitorem NA o wyższym stężeniu. | Należy upewnić się, że końcówki nie mają kontaktu z inhibitorem NA podczas dozowania rozcieńczonych wirusów do płytki 96-dołkowej. |
| Jeśli użyto 8-dołkowego zbiornika, należy go wyrzucić i ponownie dozować stężenia inhibitora NA do nowego 8-dołkowego zbiornika. | ||
| Objętość inhibitora NA, MUNANA lub rozcieńczonego wirusa nie została dodana równomiernie do każdego dołka. | Należy powtórzyć test za pomocą skalibrowanej pipety wielokanałowej. Należy upewnić się, że do każdego dołka dozowano taką samą objętość każdego odczynnika. | |
| Nienaturalnie wysokie wartości IC50 | Dodano zbyt wysokie stężenie wirusa. | Należy powtórzyć test aktywności NA oraz test hamowania NA. |
| Próbka testowa zawierała mieszaniny grypy A i grypy B. | Należy przeprowadzić real-time PCR w celu zidentyfikowania obecności mieszanin wirusów. | |
| Zanieczyszczenie bakteryjne próbki | Wirus należy hodować w warunkach sterylnych z dodatkiem antybiotyku. | |
| Wysoki sygnał fluorescencji tła | Substrat MUNANA może ulegać degradacji w czasie. | Należy użyć nowej partii substratu MUNANA. |
| Wykrywanie fluorescencji z sąsiednich dołków. | Należy stosować czarne płytki 96-dołkowe z płaskim dnem. |
Tabela 5: Rozwiązywanie problemów w przypadku potencjalnych trudności w teście hamowania NA.
Dyskusja
Globalne monitorowanie wrażliwości wirusa grypy na inhibitory NA jest obecnie prowadzone przez szereg laboratoriów przy użyciu fluorescencyjnych lub chemiluminescencyjnych testów hamowania NA11,12. Test fluorescencyjny jest częściej stosowany niż test chemiluminescencyjny. Chociaż oba testy są solidne i powtarzalne, wartości IC50 uzyskane z testu opartego na fluorescencji są często wyższe niż w teście opartym na chemiluminescencji, co utrudnia bezpośrednie porównanie danych z obu testów13. Nawet przy użyciu tego samego protokołu dane generowane z jednego laboratorium mogą różnić się od drugiego. Ze względu na te różnice między laboratoriami, Grupa Robocza WHO ds. Nadzoru nad Wrażliwością Przeciwwirusową Grypy opracowała wytyczne, które mają pomóc w porównaniach międzylaboratoryjnych. Zamiast porównywać bezwzględne wartości IC50, w niniejszych wytycznych zastosowano porównanie oparte na50-krotnej różnicy IC w stosunku do mediany IC50 wirusów grypy NI badanych w każdym konkretnym laboratorium. Możliwość porównania danych z pięciu współpracujących ośrodków zaowocowała coroczną publikacją globalnych danych dotyczących wrażliwości na leki przeciwwirusowena grypę 2,3,4. Dostępność dużej ilości danych na temat wrażliwości na grypę w domenie publicznej pozwala naukowcom na porównanie danych IC50 z tych badań z danymi uzyskanymi w ich własnych laboratoriach.
Inne testy hamowania NA, które przyjmują podobną koncepcję, są również dostępne na rynku. Te komercyjne zestawy, które zawierają gotowe do użycia odczynniki (w tym inhibitory NA), są równie powtarzalne. Jednak wewnętrzny test inhibicji NA jest znacznie tańszy niż zestawy komercyjne, ponieważ większość odczynników można wytwarzać we własnym zakresie w większych ilościach, a substrat MUNANA, który wcześniej stanowił główny koszt testu, można teraz kupić z różnych źródeł po konkurencyjnych cenach. Koszt przetestowania jednego izolatu grypy na lek wynosi około 1 USD (USD). W WHOCCRRI w Melbourne wprowadzono ulepszenia do wewnętrznego testu inhibicji NA po włączeniu platformy robotycznej do komponentów testu do obsługi cieczy. Oprócz ręcznego przygotowania rozcieńczeń wirusa, większość zabiegów jest wykonywana przy użyciu robota do obsługi cieczy. Nie tylko minimalizuje to ręczną obsługę, ale także zwiększa liczbę testów, które można przeprowadzić w ciągu dnia.
Chociaż test inhibicji NA jest bardzo solidny, istnieje szereg krytycznych kroków, które należy wykonać z dodatkową ostrożnością. Po pierwsze, wszelkie nieprawidłowości w stężeniach inhibitora NA mogą spowodować przesunięcie krzywych inhibicji i wartości IC50; dlatego należy zwrócić szczególną uwagę podczas przygotowywania stężeń inhibitora NA. Po drugie, dokładne pipetowanie i precyzyjne okresy inkubacji mają kluczowe znaczenie dla utrzymania spójnych wyników we wszystkich testach; Można to osiągnąć za pomocą skalibrowanych pipet i timerów. Włączenie wirusów kontrolnych do każdego testu umożliwia również monitorowanie wydajności testu od testu do testu i przez długi czas. Po trzecie, ponieważ aktywność enzymu NA wirusów grypy sezonowej jest optymalna przy pH 6,5, ważne jest prawidłowe pH buforu testowego. Niektóre doniesienia wykazały, że stosowanie warunków o niższym pH może poprawić identyfikację wariantów grypy, takich jak wariant A(H7N9) zawierający mutację R292K14,15. Jednak modyfikacja pH buforu testowego spowoduje przesunięcie wartości IC50, co może skomplikować porównanie danych w laboratoriach i między laboratoriami. Inne modyfikacje i sposoby rozwiązywania problemów, które można wykonać, wymieniono w Tabeli 5.
Inhibitory NA są jedyną klasą zatwierdzonych leków przeciwwirusowych, które są obecnie skuteczne przeciwko krążącym wirusom grypy. Dopóki inne klasy leków przeciwwirusowych nie staną się dostępne do użytku klinicznego, nadzór nad wrażliwością krążących wirusów grypy będzie koncentrował się wyłącznie na inhibitorach NA. Ze względu na prostotę i powtarzalność wyników, stosowanie testu inhibicji NA do oceny wrażliwości wirusa grypy na inhibitory NA będzie kontynuowane.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Centrum Współpracy WHO w Melbourne dla Referencji i Badań nad Grypą jest wspierane przez Departament Zdrowia Rządu Australii.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| grypy A i B | hodowane w komórkach MDCK lub 9-dniowych zarodkach jajowych wolnych od specyficznych patogenów (SPF) | ||
| Biosynth AG | M-5507 | ||
| Kwas 2-(4-metyloumbelliryl)-a-D-N-acetyloneuraminowy (MUNANA) | Sigma | M8639 | |
| 4-metylumbelliloron (4-MU) | Sigma | M1381-25G | |
| Kwas 2-[N-morfolino]etanosulfonowy (hydrat MES) (wolny kwas) | Sigma | M8250-250G | |
| Chlorek wapnia (Ca Cl2) | APS AJAX Finechem | 127-500G | |
| Surfaktant-Amps-NP-40 (10% roztwór) | Thermo Fisher Naukowy | ||
| Wodorotlenek sodu (NaOH) | APS AJAX Finechem | 482-2,5KG | |
| Absolutny Etanol | APS AJAX Finechem | 214-2.5L GL | |
| 96-dołkowe przezroczyste płytki płaskodenne | NUNC | 456537 | |
| 96-dołkowe płyty dolne w kształcie litery U | Greiner Bio-one | ||
| 8-kanałowy blok studni | głębinowych Pacific Produkty laboratoryjne | RES-MW8-HP | |
| 96-dołkowe płytki głębinowe, 2,0 ml studzienki kwadratowe | Pacific Laboratory Products | P-2ML-SQ-C | |
| Uszczelniacze do płyt | Thermo Fisher Scientific | ||
| System filtrów próżniowych butelkowych (membrana celulozowa (azotan), wielkość porów 0,2 i mu; m, powierzchnia membrany 33,2 cm2, pojemność filtra 500 mL) | Sigma-Aldrich | CLS430758-12EA | |
| Pipety jednokanałowe (1 µ L - 1 000 i mikro; L) | Różnorodność dostawców (np. Eppendorf, Sartorius) | ||
| Pipety wielokanałowe | Różnorodność dostawców (np. Eppendorf, Sartorius) | 8 lub 12-kanałowa pipeta elektroniczna i ręczna (5 - 1250 µ Objętość L) | |
| Końcówki do pipet (1 i mikro; L - 1,250 &mikro; L) | Różnorodność dostawców (np. Eppendorf, Sartorius) | ||
| Pipety jednorazowe (10 ml i 25 ml) | Greiner Bio-one | P7740-200EA i P7865-200EA | |
| Kontroler pipet | Eppendorf | 4430000018 | |
| Probówki wirówkowe 50 ml | BD Bioscience | 352070 | |
| Probówki stojakowe | Scientific Specialties, Inc. | 1750-00 | |
| Fluorometr z ustawieniem długości fali wzbudzenia 355 nm i ustawieniem długości fali emisji 460 nm | TermoFisher Scientific | ASCENT FL 374 | |
| Oprogramowanie Ascent | TermoFisher Scientific | 5185410CD | |
| Inkubator ustawiony na 37 & deg; C | Lab Supply | Biocell 1000 | |
| Zanamivir | GlaxoSmithKline | Zapytaj bezpośrednio od firmy | |
| Karboksylan Oseltamiwiru | Roche | ||
| Peramivir (BCX-1812) | BioCryst | ||
| Laninamivir (R-125489) | Daiichi-Sankyo | ||
| JASPR v1.2 | Oddział ds. Grypy w CDC Atlanta, USA | Bezpłatne dostępne na żądanie (fluantiviral@cdc.gov) |
Bibliografia
- Moscona, A. Neuraminidase inhibitors for influenza. N.Engl.J.Med. 353 (13), 1363-1373 (2005).
- Hurt, A. C., et al. Global update on the susceptibility of human influenza viruses to neuraminidase inhibitors. Antiviral Res. 132, 178-185 (2016).
- Meijer, A., et al. Global update on the susceptibility of human influenza viruses to neuraminidase inhibitors. Antiviral Res. 110, 31-41 (2014).
- Takashita, E., et al. Global update on the susceptibility of human influenza viruses to neuraminidase inhibitors. Antiviral Res. 117, 27-38 (2015).
- Lackenby, A., et al. Emergence of resistance to oseltamivir among influenza A(H1N1) viruses in Europe. Euro Surveill. 13 (5), (2008).
- Hurt, A. C., et al. Community transmission of oseltamivir-resistant A(H1N1)pdm09 influenza. N Engl J Med. 365 (26), 2541-2542 (2011).
- Takashita, E., et al. Characterization of a large cluster of influenza A(H1N1)pdm09 viruses cross-resistant to oseltamivir and peramivir during the 2013-2014 influenza season in Japan. Antimicrob Agents Chemother. 59 (5), 2607-2617 (2015).
- Eisfeld, A. J., Neumann, G., Kawaoka, Y. Influenza A virus isolation, culture and identification. Nat Protoc. 9 (11), 2663-2681 (2014).
- Meetings of the WHO working group on surveillance of influenza antiviral susceptibility - Geneva, November 2011 and June 2012. Wkly Epidemiol Rec. 87 (39), 369-374 (2012).
- A summary of amino acid substitutions in the influenza neuraminidase associated with resistance or reduced susceptibility to NAIs. WHO. , Available from: http://www.who.int/influenza/gisrs_laboratory/antiviral_susceptibility/avwg2014_nai_substitution_table.pdf?ua=1 (2016).
- Okomo-Adhiambo, M., Hurt, A. C., Gubareva, L. V. The chemiluminescent neuraminidase inhibition assay: a functional method for detection of influenza virus resistance to the neuraminidase inhibitors. Methods Mol Biol. 865, 95-113 (2012).
- Hurt, A. C., Okomo-Adhiambo, M., Gubareva, L. V. The fluorescence neuraminidase inhibition assay: a functional method for detection of influenza virus resistance to the neuraminidase inhibitors. Methods Mol Biol. 865, 115-125 (2012).
- Analysis of IC50 data. isirv Antiviral Group (isirv-AVG). , Available from: https://isirv.org/site/index.php/methodology/analysis-of-ic50-data (2016).
- Sleeman, K., et al. R292K substitution and drug susceptibility of influenza A(H7N9) viruses. Emerg Infect Dis. 19 (9), 1521-1524 (2013).
- Gubareva, L. V., Robinson, M. J., Bethell, R. C., Webster, R. G. Catalytic and framework mutations in the neuraminidase active site of influenza viruses that are resistant to 4-guanidino-Neu5Ac2en. J Virol. 71 (5), 3385-3390 (1997).
Przedruki i uprawnienia
