Badania strukturyczno-funkcjonalne w embrionalnych komórkach macierzystych myszy z wykorzystaniem wymiany kasetowej za pośrednictwem rekombinazy

Tim Pieters; Lieven Haenebalcke; Kenneth Bruneel; Niels Vandamme; Tino Hochepied; Jolanda van Hengel; Dagmar Wirth; Geert Berx; Jody J. Haigh; Frans van Roy; Steven Goossens

doi:10.3791/55575

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Badania strukturyczno-funkcjonalne w embrionalnych komórkach macierzystych myszy z wykorzystaniem wymiany kasetowej za pośrednictwem rekombinazy

11K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55575

⸱

27 kwietnia 2017

Tim Pieters¹^,²^,³^,⁴ , Lieven Haenebalcke¹^,² , Kenneth Bruneel¹^,²^,⁴ , Niels Vandamme¹^,²^,⁴ , Tino Hochepied¹^,² , Jolanda van Hengel⁵ , Dagmar Wirth⁶ , Geert Berx¹^,²^,⁴ , Jody J. Haigh⁷ , Frans van Roy¹^,²^,⁴ , Steven Goossens¹^,²^,³^,⁴

¹Department of Biomedical Molecular Biology, Ghent University, ²Inflammation Research Center, VIB, ³Center for Medical Genetics, Ghent University Hospital, ⁴Cancer Research Institute Ghent (CRIG), ⁵Department of Basic Medical Sciences, Faculty of Medicine and Health Sciences, Ghent University, ⁶Helmholtz Center for Infection Research, ⁷Mammalian Functional Genetics Laboratory, Division of Blood Cancers, Australian Centre for Blood Diseases, Department of Clinical Haematology, Monash University and Alfred Health Alfred Centre

W tym artykule

Podsumowanie

Białka często zawierają wiele domen, które mogą pełnić różne funkcje komórkowe. Nokauty genów (KO) nie uwzględniają tej różnorodności funkcjonalnej. W tym miejscu przedstawiamy podejście oparte na wymianie kasetowej za pośrednictwem rekombinacji (RMCE) oparte na strukturze i funkcji w embrionalnych komórkach macierzystych KO, które pozwala na molekularną sekcję różnych domen funkcjonalnych lub wariantów białka.

Streszczenie

Inżynieria genowa w embrionach myszy lub embrionalnych komórkach macierzystych (mESC) pozwala na badanie funkcji danego białka. Białka są końmi roboczymi komórki i często składają się z wielu domen funkcjonalnych, na które mogą wpływać modyfikacje potranslacyjne. Zubożenie całego białka u myszy z warunkowym lub konstytutywnym nokautem (KO) nie uwzględnia tej funkcjonalnej różnorodności i regulacji. Wcześniej doniesiono o linii mESC i pochodnym modelu myszy, w którym miejsce dokowania do wymiany kasetowej za pośrednictwem rekombinacji FLPe (RMCE) zostało wstawione do locus ROSA26 (R26). W tym artykule przedstawiamy podejście struktura-funkcja, które pozwala na molekularną analizę różnych funkcji białka wielodomenowego. W tym celu myszy kompatybilne z RMCE należy skrzyżować z myszami KO, a następnie mESC KO kompatybilne z RMCE muszą zostać wyizolowane. Następnie, panel domniemanych konstruktów ratowniczych może zostać wprowadzony do locus R26 poprzez celowanie RMCE. Kandydujące do uratowania cDNA można łatwo wprowadzić między miejsca RMCE wektora docelowego za pomocą klonowania rekombinacyjnego. Następnie mESC KO są transfekowane wektorem docelowym w połączeniu z plazmidem ekspresyjnym rekombinazy FLPe. RMCE reaktywuje gen oporności na neomycynę bez promotora w miejscach dokowania ROSA26 i pozwala na wybór właściwego zdarzenia docelowego. W ten sposób uzyskuje się wysoką skuteczność celowania bliską 100%, co pozwala na wprowadzenie wielu przypuszczalnych konstruktów ratowniczych w sposób średnio wysokoprzepustowy. Wreszcie, wiele konstruktów ratowniczych napędzanych przez R26 może być testowanych pod kątem ich zdolności do ratowania fenotypu, który zaobserwowano w rodzicielskich mESC KO. Przedstawiamy badanie typu proof-of-principle struktura-funkcja w mESC KO KO p120 kateniny (p120ctn) wykorzystujące różnicowanie endodermy w ciałach zarodkowych (EBs) jako odczyt fenotypowy. Podejście to umożliwia identyfikację ważnych domen, przypuszczalnych szlaków dalszych i istotnych dla choroby mutacji punktowych, które leżą u podstaw fenotypów KO dla danego białka.

Wprowadzenie

Szacuje się, że genomy ssaków zawierają około 20 000 genów kodujących białka. Alternatywny splicing oraz modyfikacje potranslacyjne dodatkowo zwiększają repertuar białek. Białka mają strukturę modularną¹ i często zawierają wiele domen oddziaływania, co pozwala na ich rekrutację do różnych kompleksów białkowych i udział w wielu procesach komórkowych². Przykładem jest wielofunkcyjne białko o nazwie p120ctn. p120ctn jest kodowane przez gen Ctnnd1 i składa się z dużej centralnej domeny powtórzeń armadillo, flankowanej przez region N-terminalny i C-terminalny. Domena armadillo p120ctn wiąże się z wysoko konserwatywną....