Badania strukturyczno-funkcjonalne w embrionalnych komórkach macierzystych myszy z wykorzystaniem wymiany kasetowej za pośrednictwem rekombinazy

Summary

Białka często zawierają wiele domen, które mogą pełnić różne funkcje komórkowe. Nokauty genów (KO) nie uwzględniają tej różnorodności funkcjonalnej. W tym miejscu przedstawiamy podejście oparte na wymianie kasetowej za pośrednictwem rekombinacji (RMCE) oparte na strukturze i funkcji w embrionalnych komórkach macierzystych KO, które pozwala na molekularną sekcję różnych domen funkcjonalnych lub wariantów białka.

Abstract

Inżynieria genowa w embrionach myszy lub embrionalnych komórkach macierzystych (mESC) pozwala na badanie funkcji danego białka. Białka są końmi roboczymi komórki i często składają się z wielu domen funkcjonalnych, na które mogą wpływać modyfikacje potranslacyjne. Zubożenie całego białka u myszy z warunkowym lub konstytutywnym nokautem (KO) nie uwzględnia tej funkcjonalnej różnorodności i regulacji. Wcześniej doniesiono o linii mESC i pochodnym modelu myszy, w którym miejsce dokowania do wymiany kasetowej za pośrednictwem rekombinacji FLPe (RMCE) zostało wstawione do locus ROSA26 (R26). W tym artykule przedstawiamy podejście struktura-funkcja, które pozwala na molekularną analizę różnych funkcji białka wielodomenowego. W tym celu myszy kompatybilne z RMCE należy skrzyżować z myszami KO, a następnie mESC KO kompatybilne z RMCE muszą zostać wyizolowane. Następnie, panel domniemanych konstruktów ratowniczych może zostać wprowadzony do locus R26 poprzez celowanie RMCE. Kandydujące do uratowania cDNA można łatwo wprowadzić między miejsca RMCE wektora docelowego za pomocą klonowania rekombinacyjnego. Następnie mESC KO są transfekowane wektorem docelowym w połączeniu z plazmidem ekspresyjnym rekombinazy FLPe. RMCE reaktywuje gen oporności na neomycynę bez promotora w miejscach dokowania ROSA26 i pozwala na wybór właściwego zdarzenia docelowego. W ten sposób uzyskuje się wysoką skuteczność celowania bliską 100%, co pozwala na wprowadzenie wielu przypuszczalnych konstruktów ratowniczych w sposób średnio wysokoprzepustowy. Wreszcie, wiele konstruktów ratowniczych napędzanych przez R26 może być testowanych pod kątem ich zdolności do ratowania fenotypu, który zaobserwowano w rodzicielskich mESC KO. Przedstawiamy badanie typu proof-of-principle struktura-funkcja w mESC KO KO p120 kateniny (p120ctn) wykorzystujące różnicowanie endodermy w ciałach zarodkowych (EBs) jako odczyt fenotypowy. Podejście to umożliwia identyfikację ważnych domen, przypuszczalnych szlaków dalszych i istotnych dla choroby mutacji punktowych, które leżą u podstaw fenotypów KO dla danego białka.

Introduction

Szacuje się, że genomy ssaków zawierają około 20 000 genów kodujących białka. Alternatywny splicing i modyfikacje potranslacyjne dodatkowo zwiększają repertuar białek. Białka mają budowę modułową¹ i często zawierają wiele domen interakcji, co pozwala na ich rekrutację do różnych kompleksów białkowych i udział w wielu procesach komórkowych². Jednym z przykładów jest wielofunkcyjne białko o nazwie p120ctn. p120ctn jest kodowany przez gen Ctnnd1 i składa się z dużej centralnej domeny powtórzeń pancernika otoczonej regionem N-końcowym i C-końcowym. Domena pancernika p120ctn wiąże się z wysoce konserwatywną domeną bł....

Protocol

Wszystkie eksperymenty na myszach zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi, krajowymi i europejskimi przepisami dotyczącymi zwierząt.

1. Izolacja mESC KO kompatybilnych z RMCE

1. Hoduj heterozygotyczne myszy KO z myszami kompatybilnymi z RMCE, takimi jak myszy ROSALUC ¹⁰ lub myszy ROSA26-iPSC²¹. Obie myszy kompatybilne z RMCE były utrzymywane na mieszanym tle 129/C57BL6/szwajcarskim.
   UWAGA: Zaleca się krzyżowanie z heterozygotycznymi myszami KO w celu przezwyciężenia śmiertelności embrionalnej u homozygotycznych myszy KO.
2. Użyj PCR, aby wybrać heterozygotyczne myszy KO zawierające ....

Results

Procedura izolowania linii KO mESC kompatybilnych z RMCE jest przedstawiona na rysunku 2. Do uzyskania blastocyst KO zgodnych z RMCE wymagane są dwa kolejne hodowle. Po pierwsze, heterozygotyczne myszy KO krzyżuje się z myszami kompatybilnymi z RMCE, aby uzyskać kompatybilne z RMCE, heterozygotyczne myszy KO. Myszy te są następnie wykorzystywane do krzyżowania w czasie z innymi heterozygotycznymi myszami KO w celu uzyskania 3,5-dpc, zgodnych z RMCE, homozygotycznych blast.......

Discussion

Nasza metoda izolacji mESC jest przyjazna dla użytkownika i nie wymaga zaawansowanych umiejętności ani sprzętu, takiego jak mikrochirurgia blastocyst. Dzięki temu technologia ta jest dostępna dla dużej części społeczności naukowej. Każdy, kto ma podstawowe doświadczenie w hodowli komórkowej, może rozmnażać wyrostki ICM i ustanawiać linie mESC. Jednak płukanie i obchodzenie się z blastocystami wymaga pewnej praktyki. Pipeta doustna służy do przenoszenia blastocyst i składa się z mikropipety, uchwytu na mikropipetę, rurki .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ROSALUC Myszy	wykonane w domu		zamrożone nasienie dostępne na żądanie
R26-iPSC	wyprodukowane w domu		zamrożone plemniki dostępne na żądanie
Sonda naczyń	Fine Science Tools	10160-13	do sprawdzania zatyczek kopulacyjnych
M2 medium	Sigma-Aldrich	M7167	wytwarzać porcje i przechowywać w temperaturze -20 & deg; C
Cienkie kleszcze (Dumont #5 Standard tip Kleszcze studenckie)	Fine Science Tools	11251-10	spray z 70% EtOH przed użyciem (nie autoklawować)
Igły 23 G	Fine-ject	8697
Strzykawki 1 ml	Soft-ject	6680
60-mm płytki bakteryjne (do spłukiwania)	Gosselin	BB60-01
Pipeta do ust	wyprodukowana we własnym zakresie		zobacz dyskusję
Fibroblasty embrionalne myszy (MEF, szczep TgN (DR4)1 Jae)	ATTC	SCRC-1045
TgN (DR4)1 Myszy Jae	The Jackson Laboratory	3208
Mitomycyna C	Sigma-Aldrich	M0503
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) bez wapnia i magnezu	Gibco	14190-094
Tg(DR4)1Jae/J myszy	JAX	3208	które zawierają cztery geny wybierane przez leki, a DR4 MEFS nadaje odporność na neomycynę, puromycynę, higromycynę i 6-tioguaninę
0,1% żelatyny	Sigma-Aldrich	G1393	Rozpuścić 0,5 g w 500 ml wody destylowanej, umieścić w autoklawie i przechowywać w temperaturze 4 °C.
Trypsyna (0,25%)	Gibco	25200-056
2 μ M pluripotin	Cayman Chemical	10009557
pRMCE-DV1	Kolekcja BCCM/LMBP	LMBP 08870	dostępny publicznie w kolekcji BCCM/LMBP (http://bccm.belspo.be)
Kolekcja pRMCE-DV1	BCCM/LMBP	LMBP 08195	publicznie dostępny w kolekcji BCCM/LMBP (http://bccm.belspo.be)
pCAG-FlpE-IRES-Puro-pA	Addgene	20733
kompetentny szok termiczny DH5 i alfa bakterie	made in house
Gateway pDONR221 wektor wektorowy	Thermo Fisher	12536-017	zawiera gen oporności na kanamycynę
BP klonaza II mix	Thermo Fisher	11789-020
LR clonase II mix	Thermo Fisher	11791-020
Rosół Luria (LB)
Ampicylina
Applied Biosystems 3730XL Analizator DNA	Thermo Fisher	3730XL
G418	Thermo Fisher	11811-023
Odczynnik do transfekcji Lipofectamine 2000	Thermo Fisher	11668027
Odczynnik do transfekcji Lipofectamine LTX	Thermo Fisher	15338100
Effectene	Qiagen	301425
GATEWAY pENTR 1A wektor	Thermo Fisher	A10462	kompatybilny z rekombinacją wektorowy
monoklonalne przeciwciało anty-p120ctn	Laboratoria transdukcji BD 610134
mysie przeciwciało monoklonalne anty-Ecadherin	Laboratoria Transdukcji 610181
General equipment
Sterylne narzędzia			cienkie nożyczki i kleszcze do preparowania macicy
Sterylne pipety: 5 ml, 10 ml i 25 ml
stożkowe probówki wirówkowe 15 ml i 50 ml
płytki hodowlane Dno w kształcie litery V i płaskie dno)
Naczynia hodowlane: 24 dołki, 12 dołków i 6 dołków Pipety
wielokanałowe (do pipetowania 30, 50, 100 i 200 μ L)
Sterylne zbiorniki wielokanałowe Dostęp
do laminarnego przepływu
Dostęp do inkubatora pod kątem 37 stopni C z 5% CO2
Dostęp do mikroskopu
Dostęp do wirówki
Dostęp do mikroskopu stereoskopowego ze światłem przechodzącym
Pożywka hodowlana
MEF Medium			w temperaturze 4 stopni; C; ciepły 30 min przy 37 stopniach; C przed użyciem
produktu Dulbecco" s zmodyfikowany Orzeł" s medium (DMEM)	Gibco	41965-062
10% płodowa surowica bydlęca (FBS)	Sigma-Aldrich	F-7524
L-glutamina (2 mM)	Gibco	25030-024
Pirogronian sodu  (0,4 mM)	Gibco	11360-039
penicylina (100 U/mL)	Gibco	15140-122
Streptomycyna (100 &mikro; g/mL)	Gibco	15140-122
SR pożywka mESC			przechowywana w temperaturze 4 stopni; C; ciepły 30 min przy 37 stopniach; C przed użyciem
DMEM/F12	Gibco	31330-038	zmieszany w stosunku 1:1
15% nokautujący zamiennik surowicy (SR)	Gibco	10828– 028
L-glutamina (2 mM)	Gibco	25030-024
0,1 mM aminokwasów endogennych	Gibco	11140-050
penicylina (100 U/mL)	Gibco	15140-122
Streptomycyna (100 &mikro; g/mL)	Gibco	15140-122
β-merkaptoetanol (0,1 mM)	Sigma-Aldrich	M 3148
2,000 U/ml rekombinowanej myszy LIF	(IRC/VIB Protein Service facility)
FBS-based mESC substrate (podobny do mESC based SR)			przechowywany w temperaturze 4° C; ciepły 30 min w 37& C przed użyciem
Knockout DMEM	Gibco	10829-018
15% FBS	Hyclone	SH30070.03E
Differention Medium			w temperaturze 4 stopni; C; ciepły 30 min przy 37 stopniach; C przed użyciem
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)	Gibco	21980-032
15% FBS	Hyclone	SH30070.03E
5% CD Hybridoma Medium(1x) płyn	Gibco	11279-023
2 mM L-glutamina	Gibco	25030-024
0,4 mM 1-tioglicerol	Sigma-Aldrich	M-6145
50 μ g/ml kwas askorbinowy	Sigma-Aldrich	A-4544
penicylina (100 U/mL)	Gibco	15140-122
Streptomycyna (100 &mikro; g/mL)	Gibco	15140-122
2i
1 μ Inhibitor M Erk PD0325901	Axon Medchem	Axon 1408
3 μ Inhibitor M Gsk3 CHIR99021	Axon Medchem	Axon 1386