Method Article

Analiza zawiesin komórkowych wyizolowanych z tkanek stałych za pomocą spektralnej cytometrii przepływowej

DOI:

10.3791/55578

⸱

May 5th, 2017

 ,  ,  , 
1Flow Cytometry Core Facility, Center for Translational Research-Technical Core, Institut Pasteur, 2Unit for Lymphopoiesis, Immunology Department, INSERM U1223, University Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, Cellule Pasteur, Institut Pasteur, 3Stem-Cell Microenvironments in Repair/Regeneration Team, Instituto de Investigação e Inovação em Saúde (i3s), INEB - Instituto de Engenharia Biomédica, 4ICBAS - Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar, Universidade do Porto, 5Stem Cells and Regenerative Medicine Team, UMRS 1166, ICAN - Institute of Cardiometabolism And Nutrition, UPMC - Université Pierre et Marie Curie - Paris 6, INSERM

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł opisuje cytometrię spektralną, nowe podejście w cytometrii przepływowej, które wykorzystuje kształty widm emisyjnych do rozróżniania fluorochromów. Algorytm zastępuje kompensacje i może traktować autofluorescencję jako niezależny parametr. To nowe podejście pozwala na prawidłową analizę komórek wyizolowanych z narządów stałych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cytometria przepływowa była używana przez ostatnie 40 lat do definiowania i analizowania fenotypu komórek limfoidalnych i innych komórek krwiotwórczych. Początkowo ograniczone do analizy kilku fluorochromów, obecnie istnieją dziesiątki różnych barwników fluorescencyjnych, a jednocześnie można łączyć do 14-18 różnych barwników. Jednak kilka ograniczeń nadal ogranicza możliwości analityczne. Ze względu na mnogość sond fluorescencyjnych, analiza danych staje się coraz bardziej złożona ze względu na zapotrzebowanie na duże, wieloparametryczne matryce kompensacyjne. Co więcej, dostępne stały się zmutowane modele myszy przenoszące białka fluorescencyjne w celu wykrywania i śledzenia określonych typów komórek w różnych tkankach, dlatego wymagana jest analiza (za pomocą cytometrii przepływowej) autofluorescencyjnych zawiesin komórkowych uzyskanych z narządów stałych. Spektralna cytometria przepływowa, która rozróżnia kształty widm emisyjnych w szerokim zakresie ciągłych długości fal, rozwiązuje niektóre z tych problemów. Dane są analizowane za pomocą algorytmu, który zastępuje matryce kompensacji i traktuje autofluorescencję jako niezależny parametr. W związku z tym spektralna cytometria przepływowa powinna być w stanie rozróżnić fluorochromy o podobnych pikach emisji i może zapewnić analizę wieloparametryczną bez wymagań dotyczących kompensacji.

Ten protokół opisuje analizę spektralnej cytometrii przepływowej, pozwalając na charakterystykę 21 parametrów (19 sond fluorescencyjnych) i zarządzanie sygnałem autofluorescencyjnym, zapewniając wysoką rozdzielczość w wykrywaniu mniejszych populacji. Przedstawione wyniki pokazują, że spektralna cytometria przepływowa ma zalety w analizie populacji komórek z tkanek trudnych do scharakteryzowania w konwencjonalnej cytometrii przepływowej, takich jak serce i jelito. Spektralna cytometria przepływowa demonstruje zatem wieloparametryczną zdolność analityczną wysokowydajnej konwencjonalnej cytometrii przepływowej bez konieczności kompensacji i umożliwia zarządzanie autofluorescencją.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ciągu ostatnich kilku dekad cytometria przepływowa (FCM) stała się powszechnie dostępną metodą analityczną, niezbędną do badań fenotypowania komórek. Nastąpił znaczny wzrost dostępnych barwników fluorescencyjnych, w szczególności fluorochromów wzbudzanych laserem fioletowym (405 nm) (np. Brilliant Violet i nowe barwniki Q-dot). Jednak wzrost dostępnych barwników fluorescencyjnych zwiększa ryzyko nakładania się emisji i wymaga pracochłonnych matryc kompensacyjnych. FCM stał się szeroko stosowany do analizy zawiesin komórkowych z tkanek stałych, ale obecność komórek autofluorescencyjnych ogranicza dyskryminację specyficznie znakowanych populacji.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z Kartą Etyki Instytutu Pasteura oraz wytycznymi UE i zostały zatwierdzone przez francuskie Ministerstwo Rolnictwa.

1. Przygotowanie zawiesiny komórek z organów dorosłych myszy

  1. Izolacja splenocytów
    1. Poddaj eutanazji dorosłe myszy przez zwichnięcie szyjki macicy. Wykonaj nacięcie na linii środkowej brzucha i otwórz skórę nożyczkami. Zbierz śledzionę za pomocą kleszczy.
    2. Zmiażdż śledzionę między 2 szklanymi szkiełkami mikroskopowymi, aby zdysocjować komórki i rozcieńczyć je w 5 ml zbilansowanego solonego roztworu Hanka (HBSS) zawierającego ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

21-parametrowy panel spektralny FCM do analizy splenocytów

Rysunek 1 pokazuje wyniki uzyskane za pomocą panelu przeciwciał 19-fluorescencyjnych zastosowanego do komórek śledziony zawierających różne przeciwciała, rozpoznając podzbiory komórek T, B, NK, dendrytycznych i szpikowych, podczas gdy CD45 oznacza wszystkie hematopoetyczne komórki jądrzaste. Panel zawiera również parametr żywotności barwnika (PI), a także p.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Konwencjonalny FCM opiera się na detekcji fotonów emitowanych po wzbudzeniu sond fluorescencyjnych. Emisja fluorescencji jednego fluorochromu wykryta w detektorze przeznaczonym do pomiaru sygnału z innego fluorochromu indukuje fizyczne nakładanie się. To rozlanie się widm emisji musi zostać skorygowane za pomocą kompensacji.

Spektralny FCM i przetwarzanie danych przez algorytm dekonwolucji bez mieszania pozwala na łączenie fluorochromów o bliskich pikach emisji bez dodatkowej kompensacji, pod .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doceniamy techniczny i teoretyczny wkład w cytometrię spektralną K. Futamury, który również krytycznie zrewidował manuskrypt. Mamy również dług wdzięczności wobec C. Ait-Mansoura, P.-H. Commere, A. Bandeirze i P. Pereirze za krytyczną lekturę manuskryptu oraz za niekończące się porady i wsparcie techniczne. Dziękujemy również P. Pereira za dar przeciwciał znakowanych anty Vγ7-APC i Vδ4-biotyną. Dziękujemy Centre d'Enseignements z Instytutu Pasteura za przyjęcie i wsparcie w logistyce filmowania. Prace te były wspierane przez Instytut Pasteura, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM); Szwajcarska Narodowa Fundacja Nauki i Pasteur Bourse Roux ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
MyszyJanvier LabsCD45.2Źródło komórek
Etanol 70%VWR83801.36Sterylizacja
DPBS (Ca2+, Mg2+)GIBCO ThermoFisher14040-174Kolekcja zarodków
Zbilansowany roztwór soli Hanksa (+Ca2+ +Mg2+) (HBSS+/+)GIBCO Life ThermoFisher14025092Roztwory dysocjacyjne, mineralizujące i barwiące
Zbilansowany roztwór soli Hanksa (-Ca2+, -Mg2+) (HBSS-/-)GIBCO Life ThermoFisher14175095Roztwory dysocjacyjne, trawiące i barwiące
Surowica cielęca płodu (FCS)EUROBIOCVFSVF00-0URoztwory dysocjacyjne, trawienne i barwiące
KolagenazaSigmaC2139Roztwór enzymatyczny
90 x 15 mm,
plastikowa kultura tkankowa szalki Petriego.		TPPT93100Kolekcja zarodków i serc
35 x 15 mm,
plastikowa hodowla tkankowa szalki Petriego.		TPPT9340Kolekcja serc
Nożyczki do cienkiej tęczówkiFine Science Tools14090-09Narzędzia do preparowania
Kleszcze grube (kleszcze o wąskim wzorze, zakrzywione 12 cm)Narzędzia do nauki o11003-12Narzędzia do preparowania
Kleszcze drobnoziarniste (kleszcze Dumont nr 7)Narzędzia do nauki o11272-30Narzędzia do preparowania
Skalpel VWR21909-668Narzędzia preparacyjne
LEICA MZ6 Mikroskop preparacyjnyLEICAMZ6 10445111Pobieranie próbek; Okkularny W-Pl10x/23
Źródło zimnej lampySCHOTT VWRKL1500 kompaktowePobieranie próbek;
Dwa włókna gęsiej szyi dostosowane
do rurek FACSVWR60819-310Komory trawiące
Płytka 96-dołkowa (okrągłe dno)VWR10861-564Komórki barwiące
Tkanina kotwiąca z siatki nylonowej sterylizowana,
50/50 mm sztuki.		SEFAR NITEXSEFAR NITEXFiltracja komórkowa
UltrasComp eBeads
Przeciwciała znakowane fluorescencjąBiolegendNumer katalogowy patrz tabela poniżejBarwienie komórek
nauce nauce

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Futamura, K., et al. Novel full-spectral flow cytometry with multiple spectrally-adjacent fluorescent proteins and fluorochromes and visualization of in vivo cellular movement. Cytometry A. 87 (9), 830-842 (2015).
  2. Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Spectral Flow CytometryCell Suspension IsolationSolid Tissue AnalysisAutofluorescence ManagementMulti parameter AnalysisCompensation free DetectionHeart Intestine Cell IsolationPropidium Iodide StainingAntibody Panel StainingFlow Cytometry Gating

Related Articles