Method Article

Analiza zawiesin komórkowych wyizolowanych z tkanek stałych za pomocą spektralnej cytometrii przepływowej

DOI:

10.3791/55578

⸱

May 5th, 2017

 ,  ,  , 
1Flow Cytometry Core Facility, Center for Translational Research-Technical Core, Institut Pasteur, 2Unit for Lymphopoiesis, Immunology Department, INSERM U1223, University Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, Cellule Pasteur, Institut Pasteur, 3Stem-Cell Microenvironments in Repair/Regeneration Team, Instituto de Investigação e Inovação em Saúde (i3s), INEB - Instituto de Engenharia Biomédica, 4ICBAS - Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar, Universidade do Porto, 5Stem Cells and Regenerative Medicine Team, UMRS 1166, ICAN - Institute of Cardiometabolism And Nutrition, UPMC - Université Pierre et Marie Curie - Paris 6, INSERM

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł opisuje cytometrię spektralną, nowe podejście w cytometrii przepływowej, które wykorzystuje kształty widm emisyjnych do rozróżniania fluorochromów. Algorytm zastępuje kompensacje i może traktować autofluorescencję jako niezależny parametr. To nowe podejście pozwala na prawidłową analizę komórek wyizolowanych z narządów stałych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cytometria przepływowa była używana przez ostatnie 40 lat do definiowania i analizowania fenotypu komórek limfoidalnych i innych komórek krwiotwórczych. Początkowo ograniczone do analizy kilku fluorochromów, obecnie istnieją dziesiątki różnych barwników fluorescencyjnych, a jednocześnie można łączyć do 14-18 różnych barwników. Jednak kilka ograniczeń nadal ogranicza możliwości analityczne. Ze względu na mnogość sond fluorescencyjnych, analiza danych staje się coraz bardziej złożona ze względu na zapotrzebowanie na duże, wieloparametryczne matryce kompensacyjne. Co więcej, dostępne stały się zmutowane modele myszy przenoszące białka fluorescencyjne w celu wykrywania i śledzenia określonych typów komórek w różnych tkankach, dlatego wymagana jest analiza (za pomocą cytometrii przepływowej) autofluorescencyjnych zawiesin komórkowych uzyskanych z narządów stałych. Spektralna cytometria przepływowa, która rozróżnia kształty widm emisyjnych w szerokim zakresie ciągłych długości fal, rozwiązuje niektóre z tych problemów. Dane są analizowane za pomocą algorytmu, który zastępuje matryce kompensacji i traktuje autofluorescencję jako niezależny parametr. W związku z tym spektralna cytometria przepływowa powinna być w stanie rozróżnić fluorochromy o podobnych pikach emisji i może zapewnić analizę wieloparametryczną bez wymagań dotyczących kompensacji.

Ten protokół opisuje analizę spektralnej cytometrii przepływowej, pozwalając na charakterystykę 21 parametrów (19 sond fluorescencyjnych) i zarządzanie sygnałem autofluorescencyjnym, zapewniając wysoką rozdzielczość w wykrywaniu mniejszych populacji. Przedstawione wyniki pokazują, że spektralna cytometria przepływowa ma zalety w analizie populacji komórek z tkanek trudnych do scharakteryzowania w konwencjonalnej cytometrii przepływowej, takich jak serce i jelito. Spektralna cytometria przepływowa demonstruje zatem wieloparametryczną zdolność analityczną wysokowydajnej konwencjonalnej cytometrii przepływowej bez konieczności kompensacji i umożliwia zarządzanie autofluorescencją.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ciągu ostatnich kilku dekad cytometria przepływowa (FCM) stała się powszechnie dostępną metodą analityczną, niezbędną do badań fenotypowania komórek. Nastąpił znaczny wzrost dostępnych barwników fluorescencyjnych, w szczególności fluorochromów wzbudzanych laserem fioletowym (405 nm) (np. Brilliant Violet i nowe barwniki Q-dot). Jednak wzrost dostępnych barwników fluorescencyjnych zwiększa ryzyko nakładania się emisji i wymaga pracochłonnych matryc kompensacyjnych. FCM stał się szeroko stosowany do analizy zawiesin komórkowych z tkanek stałych, ale obecność komórek autofluorescencyjnych ogranicza dyskryminację specyficznie znakowanych populacji.

Podstawowe zasady spektralnego FCM są szczegółowo opisane w Futamura et al.1,2. Krótko mówiąc, zastosowany tutaj spektralny FCM (patrz tabela materiałów) jest wyposażony w lasery o długości fali 405, 488 i 638 nm. Widmowy FCM wychwytuje całą emitowaną fluorescencję jako widma w 32-kanałowym układzie liniowym PMT (32-kanałowym PMT) dla 500 nm do 800 nm i 2 niezależnych PMT dla 420 nm do 440 nm i 450 nm do 469 nm, które zastępują konwencjonalne filtry pasmowo-przepustowe. Plamki laserowe 488 i 405/638 nm są przestrzennie oddzielone, natomiast plamki laserowe 405 nm i 638 nm są współliniowe. Dla każdej pojedynczej cząstki spektralny FCM mierzy do 66 kanałów danych fluorescencyjnych wzbudzonych przez lasery 405 nm i 488 nm. Gdy komórki są wzbudzane przez laser 638 nm, spektralny FCM mierzy 58 kanałów danych fluorescencyjnych, ponieważ wkładana jest maska, aby zapobiec świeceniu lasera 638 nm do PMT. Spectral FCM analizuje uzyskane dane o pełnym spektrum za pomocą algorytmu opartego na metodzie ważonych najmniejszych kwadratów (WLSM), która umożliwia separację nakładających się widm fluorescencyjnych. Widma pochodzące z próbek barwionych pojedynczo i niebarwionych są uznawane za podstawowe widma referencyjne. Próbki barwione wielobarwnie są matematycznie dopasowane i niewymieszane, a widmo próbki z mieszanymi znacznikami fluorescencyjnymi jest rozkładane na zbiór widm składowych. Unmixing, w technologii spektralnej3,4, zastępuje kompensację, która usuwa sygnał ze wszystkich detektorów z wyjątkiem tego, który mierzy dany barwnik.

W tym badaniu połączyliśmy i przetestowaliśmy 19 fluorochromów w pojedynczej, 21-parametrowej analizie, która charakteryzowała główne podzbiory hematopoetyczne znalezione w śledzionie myszy. Dodatkowo wykazaliśmy, że cytometria spektralna może zarządzać sygnałem autofluorescencyjnym, poprawiając w ten sposób charakterystykę jelitowych limfocytów śródnabłonkowych i serca embrionalnego. Rzeczywiście, w tych tkankach zarządzanie autofluorescencją pozwoliło na przypisanie określonej fluorescencji komórkom, które zostałyby wyłączone z analizy w konwencjonalnym FCM.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z Kartą Etyki Instytutu Pasteura oraz wytycznymi UE i zostały zatwierdzone przez francuskie Ministerstwo Rolnictwa.

1. Przygotowanie zawiesiny komórek z organów dorosłych myszy

  1. Izolacja splenocytów
    1. Poddaj eutanazji dorosłe myszy przez zwichnięcie szyjki macicy. Wykonaj nacięcie na linii środkowej brzucha i otwórz skórę nożyczkami. Zbierz śledzionę za pomocą kleszczy.
    2. Zmiażdż śledzionę między 2 szklanymi szkiełkami mikroskopowymi, aby zdysocjować komórki i rozcieńczyć je w 5 ml zbilansowanego solonego roztworu Hanka (HBSS) zawierającego 1% płodowej surowicy cielęcej (FCS).
    3. Wirować przez 10 minut w temperaturze 120 x g i temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
    4. Zawiesić osad w 5 ml HBSS 1% FCS. Policz komórki za pomocą komory Neubauera za pomocą barwienia przyżyciowego Trypana.
      UWAGA: Z jednej dorosłej śledziony należy uzyskać 80 milionów komórek.
  2. Izolacja komórek z jelita cienkiego
    1. Poddaj eutanazji dorosłe myszy przez zwichnięcie szyjki macicy. Za pomocą nożyczek wykonaj nacięcie w skórze na linii środkowej brzucha. Chwyć jelito cienkie kleszczami jedną ręką i nożyczkami przeciąć je na obu końcach: najpierw zaraz za żołądkiem, a następnie na końcu jelita cienkiego, tuż przed jelitem grubym. Przepłukać jelito cienkie 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco za pomocą strzykawki o pojemności 2 ml z igłą.
    2. Połóż jelito cienkie na ręczniku papierowym i ostrożnie usuń plastry Peyera ostrymi nożyczkami.
    3. Użyj nożyczek, aby otworzyć jelito na jego dłuższym boku, wkładając jedną gałąź nożyczek do jelita. Pokrój otwarte jelito na 1-centymetrowe kawałki ostrymi nożyczkami.
    4. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C przy ciągłym mieszaniu w 30 ml HBSS z 10% FCS.
    5. Umieść zawiesinę komórek z pozostałymi niezdysocjowanymi fragmentami w plastikowej probówce o pojemności 50 ml i wiruj przez 5 minut z dużą prędkością. UWAGA: Nie dochodzi do dalszej dysocjacji tkanki.
    6. Inkubować przez 10 minut na lodzie, aby duże, niezdysocjowane fragmenty mogły się osadzać.
    7. Zebrać supernatant i zagęścić go przez odwirowanie przez 7 minut przy 120 x g.
    8. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 10 ml HBSS z 1% FCS. Policz komórki za pomocą komory Neubauera za pomocą barwienia przyżyciowego błękitem trypanowym.
      UWAGA: ~60 milionów komórek śródnabłonkowych (IEL) należy uzyskać z jednego dorosłego jelita cienkiego.
  3. Strategia projektowania paneli
    1. Przygotować panele z przeciwciałami bezpośrednio sprzężonymi z fluorochromami.
      UWAGA: Wszystkie przeciwciała są wcześniej miareczkowane w celu uzyskania optymalnej definicji populacji komórek (miareczkowanie może się różnić w zależności od partii przeciwciał). Przeciwciała stosowane w 19-kolorowym panelu do barwienia splenocytów są wymienione w Tabeli 1.
    2. Zbuduj wielokolorowe panele do cytometrii. Ponieważ może to być trudne zadanie, skorzystaj z poniższych wskazówek, aby zoptymalizować panele:
      1. Sprawdź konfigurację spektralną i barwniki fluorescencyjne, które można stosować w instrumencie.
      2. Skorzystaj z informacji o indeksie jasności/indeksie barwienia dostarczonych przez producenta.
        UWAGA: Indeks jasności/indeks barwienia jest względnym wskaźnikiem intensywności fluorescencji w funkcji tła dla każdego fluorochromu.
      3. Wybierz przeciwciała zgodnie z poniższymi zasadami:
        1. Wybierz najjaśniejsze fluorochromy dla białek, które mają słabą ekspresję, i najciemniejsze fluorochromy, aby uzyskać białka o wyższej ekspresji.
          UWAGA: Na przykład CD45, CD4 i CD8 są silnie eksprymowane i mogą być używane ze słabymi fluorochromami.
        2. Projektowanie panelu należy rozpocząć od wyboru przeciwciał o najmniejszych możliwościach barwnika fluorescencyjnego.
        3. Jeśli to możliwe, wybierz barwniki fluorescencyjne o najmniejszym nakładaniu się widm emisyjnych dla markerów wyrażonych na tych samych typach komórek.
          UWAGA: Tandemy (np. PE-Cy5, PE-Cy7 i PerCP-Cy5.5) należy używać ostrożnie, ponieważ są one bardziej podatne na degradację pod wpływem światła.
  4. Barwienie komórek do analizy cytometrycznej
    1. Przygotować jedną probówkę o pojemności 5 ml z 1 x 106 splenocytów i jedną probówkę o pojemności 5 ml z komórkami jelitowymi 1 x 106 i przechowywać je w stanie niezabarwionym do użycia jako kontrola ujemna.
    2. Przygotować i oznaczyć jedną probówkę o pojemności 5 ml na próbkę i na panel zgodnie z tabelą 1. Przygotować mieszaninę przeciwciał, zgodnie z tabelą 1, w HBSS 1% FCS.
    3. Przenieś 1 x 106 komórek – splenocytów lub komórek jelitowych – do każdej probówki o pojemności 5 ml. Dodać 2 ml HBSS 1% FCS i wirować przez 5 minut w temperaturze 4 °C i 120 x g. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 50 μl mieszaniny przeciwciał.
    4. Oznacz splenocyty w 2 krokach. Najpierw użyj 50 μl mieszanki zawierającej przeciwciała znakowane PE-cyjaniną 5, PerCP-cyjaniną 5,5 i PerCP (z blokadą receptora Fc) w probówce o pojemności 5 ml. Po 20 minutach inkubacji w ciemności w temperaturze 4 °C, dodać 50 μl mieszaniny zawierającej wszystkie pozostałe przeciwciała do probówki o pojemności 5 ml.
      UWAGA: Ta strategia ogranicza przeszkodę steryczną.
    5. Inkubować przez 20 minut w ciemności w temperaturze 4 °C.
    6. Dodać 2 ml HBSS 1% FCS i odwirowywać przez 5 minut w temperaturze 4 °C i 120 x g. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 200 μl HBSS 1% FCS z 0,5 μg/ml jodku propidyny (PI).

2. Przygotowanie pojedynczego barwienia dla każdego fluorochromu na komercyjnych mikrosferach koralików kompensacyjnych (np. UltraComp eBeads), zwanych dalej koralikami

  1. Przygotuj i oznacz tyle probówek o pojemności 5 ml, ile przeciwciał jest używanych w panelach. Umieść 1 kroplę kulek w każdej probówce i dodaj 1 μl przeciwciała na probówkę.
    UWAGA: Użyte tutaj koraliki (patrz tabela materiałów) zawierają koraliki barwione (pozytywowe) i niebarwione (negatywowe). Przeciwciała są nakładane w nadmiarze na kulki, aby zapewnić jasny sygnał, a tym samym wyraźną sygnaturę spektralną dla każdego barwnika. Jest to wymagane przez oprogramowanie, aby móc dokonać precyzyjnego rozmieszania.
  2. Inkubować przez 20 minut w ciemności w temperaturze 4 °C.
  3. Dodać 2 ml HBSS 1% FCS i wirować przez 5 minut przy 120 x g. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 100 μl HBSS 1% FCS.

3. Przygotowanie zawiesiny komórkowej z embrionalnych serc myszy

  1. Sekcje zarodków
    1. Zaplanuj wcześniejsze uzyskanie samic w ciąży w czasie, kryjąc 2 samice z jednym samcem (zawsze w klatce samca) pod koniec dnia (między 17 a 19 godziną). Następnego ranka uważa się, że samice z czopami pochwowymi są w 0,5 dnia po stosunku.
    2. Poddaj eutanazji ciężarne kobiety E17.5 przez zwichnięcie szyjki macicy. Upewnij się, że zwierzę nie reaguje, mocno naciskając łapę myszy (odruch szczypania palców). Zwilż brzuch 70% etanolem, aby wysterylizować i zapobiec rozprzestrzenianiu się sierści myszy.
    3. Wykonaj nacięcie w skórze na środku brzucha za pomocą nożyczek i rozciągnij skórę palcami.
    4. Otwórz jamę brzuszną, ciągnąc i wykonując nacięcia w mięśniu brzucha od środka w kierunku dwóch stron brzucha za pomocą grubych kleszczy i nożyczek.
      UWAGA: Uważaj, aby nie uszkodzić jelita cienkiego, które znajduje się bezpośrednio pod mięśniem otrzewnej.
    5. Zbierz rogi macicy (z zarodkami), przecinając je zarówno na poziomie trzonu macicy, jak i jajników. Namocz je na szalce Petriego o wymiarach 90 x 15 mm2 z 50 ml DPBS.
    6. Izoluj każdy zarodek, przecinając między każdym decidua, a następnie ścianę mięśniową macicy i woreczek trzewny za pomocą cienkich kleszczy i nożyczek. Wyciągnij zarodki w stanie nienaruszonym. Na koniec przetnij pępowinę.
    7. Przed rozpoczęciem sekcji należy odciąć głowy zarodków E17,5 nożyczkami (dekapitacja).
  2. Kolekcja serc
    1. Namocz odcięte zarodki na szalce Petriego o wymiarach 90 x 15 mm2 zawierającej mokry ręcznik papierowy na dnie naczynia i 50 ml HBSS z 1% FCS.
    2. Pod mikroskopem stereoskopowym trzymaj każdy zarodek grubymi kleszczami tak, aby strona brzuszna była skierowana do góry.
    3. Ostrożnie otwórz siatkę piersiową, przecinając prawą stronę klatki piersiowej nożyczkami, aby zapobiec uszkodzeniu serca.
    4. Odsłoń serce, przytrzymując klatkę piersiową grubymi kleszczami.
    5. Rozsuń serce (nadal połączone z płucami i grasicą), trzymając duże naczynia (zawierające duże naczynia wpływające i wypływające z serca) i umieść je na szalce Petriego o wymiarach 35 x 15 mm2 z 2 ml HBSS 1% z FCS.
    6. Odizoluj serca od otaczających narządów i tkanki łącznej za pomocą cienkich kleszczy i skalpela.
    7. Umyj serca na nowej szalce Petriego o wymiarach 35 x 15 mm z 2 ml HBSS 1% FCS i trzymaj je na lodzie przez 20 minut, aby serce mogło wypompować krew do komór.
  3. Przygotowanie zawiesin komórek serca
    1. Podgrzej 200 μg/ml kolagenazy w HBSS+/+ (zwanym dalej roztworem enzymatycznym) do temperatury 37 °C.
      UWAGA: Rozcieńczyć kolagenazę w HBSS+/+ (z kationamiCa2+ i Mg2+), aby zmaksymalizować aktywność enzymu; Aktywność kolagenazy jest stabilna między partiami.
    2. Zastąp roztwór myjący namoczony serca (HBSS 1% FCS) 1 ml wstępnie podgrzanego roztworu enzymatycznego.
    3. Pod mikroskopem stereoskopowym zmiel serca na1 mm 3 kawałki za pomocą cienkich kleszczy i skalpela. Dodać kolejny 1 ml wstępnie podgrzanego roztworu enzymatycznego i przenieść zmieloną tkankę do probówki o pojemności 5 ml z pokrywką.
      UWAGA: Aby uzyskać optymalne trawienie, umieść maksymalnie 5 serc E17,5 na 2 ml roztworu enzymatycznego. Jeśli w tym samym czasie trawionych jest więcej serc, podziel je na różne probówki o pojemności 5 ml .
    4. Inkubować zmielone serca przez 15 minut w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Umieść probówki o pojemności 5 ml (prawidłowo zamknięte) w inkubatorze, aby rozprowadzić tkankę wzdłuż roztworu.
      1. Pod koniec inkubacji homogenizować tkankę w tym samym roztworze enzymatycznym, pipetując około 20 razy w górę i w dół za pomocą pipety P1000. Umieść probówkę o pojemności 5 ml w pozycji pionowej i pozwól, aby pozostały fragment tkanki osiadł (około 3 minuty).
      2. Zebrać supernatant (zawierający strawione komórki w zawiesinie) do probówki o pojemności 50 ml, dodać 2 ml HBSS 10% FCS (taka sama objętość jak objętość roztworu enzymatycznego dodanego do fragmentów tkanki) i trzymać je na lodzie, kontynuując proces trawienia.
        UWAGA: Roztwór HBSS 10% FCS i lód są ważne dla dezaktywacji działania enzymu podczas trawienia pozostałej tkanki.
      3. Dodać 2 ml wstępnie podgrzanego roztworu enzymatycznego do probówek o pojemności 5 ml z pozostałymi fragmentami tkanek i kontynuować trawienie, powtarzając krok 3.3.4, aż do momentu, gdy nie będzie już obserwowana żadna tkanka.
        UWAGA: Wystarczy około 4 cykli trawienia, aby całkowicie zdysocjować tkankę serca (5 serc E17,5 w 2 ml roztworu enzymatycznego).
    5. Odwirować probówki o pojemności 50 ml z komórkami w zawiesinie przez 10 minut przy 300 x g i odrzucić supernatant.
    6. Ponownie zawiesić osad komórkowy, dodać 1 ml HBSS-/- 1% FCS i przefiltrować zawiesinę komórek przez siatkę nylonową o grubości 70 μm. Policz komórki za pomocą komory Neubauera za pomocą barwienia przyżyciowego Trypana.
      UWAGA: Ponownie zawieś komórki za pomocą HBSS-/- (bez kationów Ca2+ i Mg2+), aby zminimalizować agregację komórek. Z jednego serca E17,5 uzyskuje się od 800 000 do 1 000 000 komórek.
  4. Barwienie komórek serca przeciwciałami fluorescencyjnymi
    UWAGA: Wszystkie przeciwciała są wcześniej miareczkowane w celu uzyskania optymalnej definicji populacji komórek (miareczkowanie może się różnić w zależności od partii przeciwciał). Przeciwciała stosowane w panelu serca są wymienione w Tabeli 1.
    1. Rozprowadź komórki serca w zawiesinie przez 96-dołkową płytkę (okrągłe dno). Rozprowadzić je równomiernie we wszystkich potrzebnych dołkach (200 μl na studzienkę), odwirować 96-dołkową płytkę z krótkim wirowaniem przez 1 minutę przy 480 x g i wyrzucić supernatant.
      UWAGA: Można użyć wszystkich dołków płytki 96-dołkowej (z okrągłym dnem).
    2. Zawiesić osad i inkubować komórki serca przez 20 minut w ciemności w temperaturze 4 °C ze 100 μl koktajlu przeciwciał (tj. CD45-PE, TER119-PE, CD31-Alexa 647 i Sca-1-PE-cyjaninina5) rozcieńczonych w HBSS-/- 1% FCS.
    3. Umyj komórki serca z nadmiaru przeciwciał, dodając 200 μl HBSS-/- 1% FCS i odwirowując komórki krótkoobrotowo przez 1 minutę przy 480 x g.
    4. Odrzucić supernatant i powtórzyć wirowanie z krótkim wirowaniem (etap 3.4.3).
    5. Ponownie zawiesić komórki w 200 μl HBSS-/- 1% FCS i przenieść je do probówki o pojemności 5 ml zawierającej już 200 μl HBSS-/- 1% FCS.
    6. Przed akwizycją dodaj 400 μl HBSS-/- 1% FCS z 0,5 μg/ml PI i przefiltruj zawiesinę komórek przez nylonową siatkę o grubości 70 μm.

4. Pobieranie znakowanych komórek śledziony, jelit i serca za pomocą cytometru spektralnego przepływu

  1. Przed uzyskaniem danych należy automatycznie skalibrować cytometr spektralny zgodnie z instrukcjami producenta. Wykonuj codzienne i miesięczne procedury kontroli jakości każdego dnia eksperymentu.
  2. Gdy cytometr będzie gotowy, rozpocznij podgląd próbek zawierających zawiesiny komórek znakowane wszystkimi przeciwciałami.
    UWAGA: Nie nabywaj.
  3. Upewnij się, że wszystkie lasery są włączone zgodnie z wymaganiami. Dostosuj wzmocnienie FSC tak, aby wszystkie komórki były widoczne na odpowiednich wykresach. Bramkować populację komórek i stosować tę bramkę do dwóch wykresów widmowych odpowiadających laserom 488 nm i 638/405 nm.
    UWAGA: Gdy fluorochromy są wzbudzane przez laser 638 nm (tj. gdy laser 638 nm jest włączony), istnieje maska, która osłania światło od 617-662 nm, aby zapobiec świeceniu lasera 638 nm do PMT. Powoduje to utratę części widma, a tym samym powoduje mniejszą separację bliskich barwników emitujących w tych długościach fal. Jednak cały sygnał można zebrać, wyłączając laser 638 nm, jeśli nie jest on wymagany do akwizycji.
  4. Dostosuj napięcie (%) 32-kanałowego powielacza zdjęć (PMT) tak, aby wszystkie fluorochromy mieściły się w zakresie intensywności wyświetlanej na osi y (1-106) na dwóch różnych wykresach widmowych wyświetlających wzbudzenia 488 nm i 405/638 nm.
    UWAGA: Wymagane jest szkolenie, aby rozpoznać widma wszystkich użytych fluorochromów.
  5. Zacznij pobierać próbki. Kliknij "Podgląd", aby wyświetlić komórki na ekranie, a następnie kliknij "Pobierz", aby nagrać próbkę. Zapisz do 2 x 106 zdarzeń z każdej próbki.
  6. Po pobraniu barwionych próbek, należy pobrać próbkę wybarwioną barwnikiem przyżyciowym, a następnie koraliki kompensacyjne indywidualnie wybarwione wszystkimi użytymi przeciwciałami. Kliknij "Podgląd", aby wyświetlić komórki na ekranie, a następnie "Pobierz", aby nagrać próbki.
    UWAGA: Zachowaj tę samą objętość PMT voltage dla wszystkich próbek i kontroli (tj. koralików i niebarwionych próbek); 5 000 wydarzeń w dużej mierze wystarczy.
  7. Na koniec uzyskaj dane z niebarwionych zawiesin komórek. Kliknij "Podgląd", aby wyświetlić komórki na ekranie, a następnie "Pobierz", aby nagrać próbki.
    UWAGA: Pobranie niebarwionych próbek pod koniec eksperymentu minimalizuje przenoszenie komórek fluorescencyjnych.
  8. Wyczyść cytometr zgodnie z instrukcjami producenta i zamknij eksperyment w folderze akwizycji.
    UWAGA: Dopiero po zamknięciu eksperymentu zostanie on zapisany i będzie dostępny do analizy.

5. Analiza danych za pomocą oprogramowania Spectral FCM

  1. W oknie "Paleta kolorów" w zakładce "Analiza" zarejestruj wszystkie parametry obecne w panelu, dodając każdy użyty fluorochrom i odpowiadający mu znacznik (wybierz z dostępnej listy lub dodaj nowy parametr). Uwzględnij również parametry autofluorescencji i żywotności; Wszystkie wybrane parametry pojawią się w oknie "Unmixing".
  2. Wybierz pierwszą pojedynczą wybarwioną próbkę (wykonaną za pomocą kulek kompensacyjnych) w oknie "Kontrola" w "Liście probówek" tego eksperymentu na karcie "Analiza". W arkuszu roboczym kliknij "narzędzie do projektowania wielokątów" i zaprojektuj bramkę na populacji koralików na wykresie FSC/SSC. Kliknij dwukrotnie górną część bramy, aby otworzyć wykres spektralny lub punktowy, aby zwizualizować bramkowane koraliki na wykresie podrzędnym.
    1. Zaprojektuj jedną bramkę dla dodatnich i jedną bramkę dla ujemnych koralików na widmie lub na wykresie kropkowym. Sprawdź całe widma odpowiadające dwóm zestawom laserowym dla każdej frakcji dodatniej i ujemnej i wyeliminuj wartości odstające, kolejno bramkując i klikając na bramkę, aby zweryfikować populację potomną. Wprowadź bramki ujemne i dodatnie w oknie "Unmixing".
    2. Powtórzyć krok 5.2 dla każdej pojedynczo barwionej próbki.
      UWAGA: Należy pamiętać, że strategia bramkowania dodatniego i ujemnego odpowiada analizowanej próbce, chociaż program pozwala na umieszczenie jej w dowolnej próbce. Zamiast określać frakcję ujemną dla każdej pojedynczo barwionej próbki, użyj niebarwionej próbki kulek, aby ustawić uniwersalny negatyw.
  3. Wybierz niebarwioną próbkę komórek z "Listy probówek" i zaprojektuj bramki dla komórek autofluorescencyjnych i nieautofluorescencyjnych.
  4. Po wybraniu wszystkich ujemnych i dodatnich bramek dla wszystkich parametrów, w tym autofluorescencji i żywotności, w oknie "Unmixing", kliknij "Oblicz". Zastosuj odmieszanie do próbek, które mają być analizowane.
  5. Analizuj dane, projektując bramki i tworząc wykresy dwuparametrowe.
    1. Najpierw zaprojektuj bramkę dla SSC w porównaniu z FSC, a następnie usuń martwe komórki, wykluczając wszystkie komórki oznaczone markerem żywotności (PI kontra CD45). Na pozostałych komórkach zaprojektuj bramki dla wszystkich populacji będących przedmiotem zainteresowania, postępując zgodnie ze strategią opisaną dla każdej zawiesiny komórek (ryc. 1-3).
      UWAGA: W razie potrzeby wyreguluj kompensację w "regulatorze widma odniesienia". Jest to narzędzie, które może być użyte po rozmieszaniu do ponownego dostosowania mediany populacji dodatnich dla każdego fluorochromu, jeśli algorytm nie mógłby tego zrobić idealnie.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

21-parametrowy panel spektralny FCM do analizy splenocytów

Rysunek 1 pokazuje wyniki uzyskane za pomocą panelu przeciwciał 19-fluorescencyjnych zastosowanego do komórek śledziony zawierających różne przeciwciała, rozpoznając podzbiory komórek T, B, NK, dendrytycznych i szpikowych, podczas gdy CD45 oznacza wszystkie hematopoetyczne komórki jądrzaste. Panel zawiera również parametr żywotności barwnika (PI), a także p...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Konwencjonalny FCM opiera się na detekcji fotonów emitowanych po wzbudzeniu sond fluorescencyjnych. Emisja fluorescencji jednego fluorochromu wykryta w detektorze przeznaczonym do pomiaru sygnału z innego fluorochromu indukuje fizyczne nakładanie się. To rozlanie się widm emisji musi zostać skorygowane za pomocą kompensacji.

Spektralny FCM i przetwarzanie danych przez algorytm dekonwolucji bez mieszania pozwala na łączenie fluorochromów o bliskich pikach emisji bez dodatkowej kompensacji, pod ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doceniamy techniczny i teoretyczny wkład w cytometrię spektralną K. Futamury, który również krytycznie zrewidował manuskrypt. Mamy również dług wdzięczności wobec C. Ait-Mansoura, P.-H. Commere, A. Bandeirze i P. Pereirze za krytyczną lekturę manuskryptu oraz za niekończące się porady i wsparcie techniczne. Dziękujemy również P. Pereira za dar przeciwciał znakowanych anty Vγ7-APC i Vδ4-biotyną. Dziękujemy Centre d'Enseignements z Instytutu Pasteura za przyjęcie i wsparcie w logistyce filmowania. Prace te były wspierane przez Instytut Pasteura, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM); Szwajcarska Narodowa Fundacja Nauki i Pasteur Bourse Roux (S.S.); Fundação para a Ciência e a Tecnologia - SFRH/BD/74218/2010 (M.V.); oraz Université Paris Diderot, Agence Nationale de la Recherche (ANR), projekt Twothyme, ANR i Program REVIVE (Inwestycja dla Przyszłości) (A.C.).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
MyszyJanvier LabsCD45.2Źródło komórek
Etanol 70%VWR83801.36Sterylizacja
DPBS (Ca2+, Mg2+)GIBCO ThermoFisher14040-174Kolekcja zarodków
Zbilansowany roztwór soli Hanksa (+Ca2+ +Mg2+) (HBSS+/+)GIBCO Life ThermoFisher14025092Roztwory dysocjacyjne, mineralizujące i barwiące
Zbilansowany roztwór soli Hanksa (-Ca2+, -Mg2+) (HBSS-/-)GIBCO Life ThermoFisher14175095Roztwory dysocjacyjne, trawiące i barwiące
Surowica cielęca płodu (FCS)EUROBIOCVFSVF00-0URoztwory dysocjacyjne, trawienne i barwiące
KolagenazaSigmaC2139Roztwór enzymatyczny
90 x 15 mm,
plastikowa kultura tkankowa szalki Petriego.		TPPT93100Kolekcja zarodków i serc
35 x 15 mm,
plastikowa hodowla tkankowa szalki Petriego.		TPPT9340Kolekcja serc
Nożyczki do cienkiej tęczówkiFine Science Tools14090-09Narzędzia do preparowania
Kleszcze grube (kleszcze o wąskim wzorze, zakrzywione 12 cm)Narzędzia do nauki o11003-12Narzędzia do preparowania
Kleszcze drobnoziarniste (kleszcze Dumont nr 7)Narzędzia do nauki o11272-30Narzędzia do preparowania
Skalpel VWR21909-668Narzędzia preparacyjne
LEICA MZ6 Mikroskop preparacyjnyLEICAMZ6 10445111Pobieranie próbek; Okkularny W-Pl10x/23
Źródło zimnej lampySCHOTT VWRKL1500 kompaktowePobieranie próbek;
Dwa włókna gęsiej szyi dostosowane
do rurek FACSVWR60819-310Komory trawiące
Płytka 96-dołkowa (okrągłe dno)VWR10861-564Komórki barwiące
Tkanina kotwiąca z siatki nylonowej sterylizowana,
50/50 mm sztuki.		SEFAR NITEXSEFAR NITEXFiltracja komórkowa
UltrasComp eBeads
Przeciwciała znakowane fluorescencjąBiolegendNumer katalogowy patrz tabela poniżejBarwienie komórek
nauce nauce

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Futamura, K., et al. Novel full-spectral flow cytometry with multiple spectrally-adjacent fluorescent proteins and fluorochromes and visualization of in vivo cellular movement. Cytometry A. 87 (9), 830-842 (2015).
  2. Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. Spectral Cytometry Has Unique Properties Allowing Multicolor Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues. PLoS One. 11 (8), e0159961(2016).
  3. Roederer, M. Multiparameter FACS analysis. Curr Protoc Immunol. , Chapter 5, Unit 5.8, (2002).
  4. Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nat Rev Immunol. 4 (8), 648-655 (2004).
  5. Grigoriadou, K., Boucontet, L., Pereira, P. T cell receptor-gamma allele-specific selection of V gamma 1/V delta 4 cells in the intestinal epithelium. J Immunol. 169 (7), 3736-3743 (2002).
  6. Guy-Grand, D., et al. Origin, trafficking, and intraepithelial fate of gut-tropic T cells. J Exp Med. 210 (9), 1839-1854 (2013).
  7. Lavoinne, A., Cauliez, B. [Cardiac troponin I and T: specific biomarkers of cardiomyocyte]. Rev Med Interne. 25 (2), 115-123 (2004).
  8. Staudt, D. W., Liu, J., Thorn, K. S., Stuurman, N., Liebling, M., Stainier, D. Y. High-resolution imaging of cardiomyocyte behavior reveals two distinct steps in ventricular trabeculation. Development. 141 (3), 585-593 (2014).
  9. Beltrami, A. P., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. Cell. 114 (6), 763-776 (2003).
  10. Keith, M. C., Bolli, R. "String theory" of c-kit(pos) cardiac cells: a new paradigm regarding the nature of these cells that may reconcile apparently discrepant results. Circ Res. 116 (7), 1216-1230 (2015).
  11. Valente, M., Nascimento, D. S., Cumano, A., Pinto-do-Ó, P. Sca-1+ cardiac progenitor cells and heart-making: a critical synopsis. Stem Cells Dev. 23 (19), 2263-2273 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Spectral Flow CytometryCell Suspension IsolationSolid Tissue AnalysisAutofluorescence ManagementMulti parameter AnalysisCompensation free DetectionHeart Intestine Cell IsolationPropidium Iodide StainingAntibody Panel StainingFlow Cytometry Gating

Related Articles