Artykuł metodologiczny

Wielowarstwowe obrazowanie kory Ca2+ u swobodnie poruszających się myszy z sondami pryzmatycznymi i zminiaturyzowaną mikroskopią fluorescencyjną

31.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55579

⸱

13 czerwca 2017

 ,  , 
1Inscopix Inc.

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy procedurę wykonywania wielkoskalowego obrazowania Ca2+ z rozdzielczością komórkową w wielu warstwach kory mózgowej u swobodnie poruszających się myszy. Setki aktywnych komórek można obserwować jednocześnie za pomocą miniaturowego mikroskopu montowanego na głowie w połączeniu z wszczepioną sondą pryzmatyczną.

Streszczenie

Obrazowanie funkcjonalne obwodów i komórek in vivo jest kluczowym narzędziem do zrozumienia mózgu w działaniu. Obrazowanie w wysokiej rozdzielczości mysich neuronów korowych za pomocą mikroskopii dwufotonowej dostarczyło unikalnych informacji na temat struktury, funkcji i plastyczności kory mózgowej. Jednak badania te są ograniczone do zwierząt z unieruchomioną głową, co znacznie zmniejsza złożoność behawioralną dostępną do badań. W tym artykule opisujemy procedurę wykonywania przewlekłej mikroskopii fluorescencyjnej z rozdzielczością komórkową w wielu warstwach kory mózgowej u swobodnie zachowujących się myszy. Użyliśmy zintegrowanego zminiaturyzowanego mikroskopu fluorescencyjnego w połączeniu z wszczepioną sondą pryzmatyczną, aby jednocześnie wizualizować i rejestrować dynamikę wapnia setek neuronów w wielu warstwach kory somatosensorycznej, gdy mysz angażowała się w nowe zadanie eksploracji obiektów przez kilka dni. Technika ta może być zaadaptowana do innych obszarów mózgu u różnych gatunków zwierząt dla innych paradygmatów behawioralnych.

Wprowadzenie

Kora jest kluczowym graczem w wielu złożonych funkcjach umysłowych i behawioralnych, od uwagi, percepcji sensorycznej i kontroli poznawczej odgórnej1,2,3 do ścieżek motywacyjnych, nagród i uzależnień4,5. Zrozumienie procesów obliczeniowych, które leżą u podstaw jego funkcji, jest ważnym celem lepszego zrozumienia klinicznego wielu zaburzeń psychicznych i behawioralnych.

Wiele obecnych teorii chorób psychiatrycznych skupia się wokół idei, że dysfunkcja lub brak koordynacji obwodów nerwowych kory mózgowej może leżeć u podstaw zaburzeń poznawczych i behawioralnych, które są cechami charakterystycznymi stanów takich jak schizofrenia6, autism7 lub zaburzenie obsesyjno-kompulsywne8. W związku z tym uzyskanie danych o aktywności neuronalnej na poziomie populacji z obwodów korowych w odpowiednim kontekście jednoczesnych informacji behawioralnych ma ogromne znaczenie i idealnie może być ukierunkowane na określone typy komórek w celu dokładniejszej sekcji obwodów neuronalnych.

Zminiaturyzowane mikroskopy w połączeniu z wszczepialnymi mikrosoczewkami gradientowego indeksu załamania światła (GRIN) umożliwiają optyczny dostęp do zespołów neuronalnych w warunkach swobodnego ruchu z różnych możliwych obszarów mózgu9,10,11,12,13, w tym cortex14,15,16. Korzystanie z mobilnego systemu mikroskopowego w połączeniu z genetycznie kodowanymi wskaźnikami wapnia pozwala na spójne obrazowanie tej samej populacji komórkowej obejmującej setki neuronów w ciągu dni lub tygodni w wielu regionach mózgu9, i może być genetycznie ukierunkowana na określone typy komórek za pomocą wektora wirusowego lub technik transgenicznych.

Ponieważ wiadomo, że kora mózgowa obsługuje różne funkcje i łączy się z różnymi obszarami mózgu, w zależności od lokalizacji komórek w blaszce korowej17,18,19, jesteśmy zainteresowani uzyskaniem jednoczesnej wielowarstwowej aktywności neuronalnej u osób zachowujących się w stanie czuwania. Tutaj pokazujemy, jak zobrazować setki fluorescencyjnie znakowanych neuronów u swobodnie zachowujących się myszy w ciągu kilku dni, używając zminiaturyzowanego mikroskopu fluorescencyjnego20 w połączeniu z wszczepioną sondą pryzmatyczną, która oferuje wielowarstwowy widok kory mózgowej (Figura 1).

Używana tutaj sonda pryzmatyczna składa się z dwóch oddzielnych soczewek GRIN: pryzmatu i cylindrycznej soczewki przekaźnikowej (Rysunek 1). Światło z mikroskopu wzbudza fluorescencyjnie znakowane komórki znajdujące się wzdłuż powierzchni obrazowania sondy pryzmatycznej, po odbiciu od przeciwprostokątnej pryzmatycznej części sondy. Światło emitowane z komórek odbija się również od przeciwprostokątnej pryzmatu, jest zbierane przez obiektyw mikroskopu i dociera do czujnika w mikroskopie. Sonda pryzmatyczna użyta w tej procedurze jest przystosowana do łatwego użycia ze standardowym sprzętem stereotaktycznym.

Zminiaturyzowany mikroskop fluorescencyjny20 wykrywa stany przejściowe Ca2+ wywołane potencjałem czynnościowym w populacjach neuronów o rozdzielczości pojedynczej komórki, po tym jak komórki te zostały specjalnie oznaczone genetycznie kodowanymi wskaźnikami fluorescencyjnymi wrażliwymi na Ca2+. W tym protokole wstrzykujemy wskaźnik Ca2+ zakodowany w wektorze wirusowym (AAV1. CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40), wszczepić sondę pryzmatyczną, zainstalować mikroskop, a następnie uzyskać dane o aktywności neuronalnej somatosensorycznej (kończyna tylna S1) z wielu dni od zwierzęcia wystawionego na działanie nowych powierzchni obiektów podczas swobodnej eksploracji (ryc. 2).

Protokół

Procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) w LifeSource Biomedical Services, NASA Ames Research Center, Kalifornia.

1. Przygotowanie przedoperacyjne

  1. Wysterylizuj narzędzia do zabiegów chirurgicznych w sterylizatorze z gorącymi kulkami i przetrzyj obszar operacji 70% etanolem. Włącz poduszkę grzewczą umieszczoną nad stereotaktycznym stage i utrzymuj ją w temperaturze 37 °C.
  2. Znieczulić zwierzę za pomocą izofluranu (5% do indukcji i 1-2% do konserwacji, 0,6-0,8 l/minO2). Sprawdź, czy nie ma odruchu szczypania palców u stóp, aby ocenić głębokość znieczulenia.
  3. Zamontuj zwierzę w stereotaktycznej ramie wyposażonej w listwy do uszu i zębów.
  4. Nałóż maść okulistyczną na oczy zwierzęcia i przykryj je kawałkiem ciemnego papieru, aby chronić je przed wysuszeniem i intensywnym światłem chirurgicznym.
  5. Wstrzyknąć zwierzęciu podskórnie ketoprofen (2,5 mg/kg) lub karprofen (2,5 mg/kg)

2. Chirurgia iniekcji wirusa

  1. Przytnij i ogol skórę głowy między oczami a uszami i zdezynfekuj skórę za pomocą 3 naprzemiennych wacików z 70% etanolu i betadyny.
  2. Odsłoń czaszkę, wykonując nacięcie w skórze głowy, zaczynając między oczami i przedłużając 1,5 cm ostrocaudal za pomocą sterylnego ostrza chirurgicznego. Otwórz skórę, aby odsłonić czaszkę, i usuń okostną wokół pożądanego miejsca wstrzyknięcia za pomocą bawełnianych wacików i skalpela. Opłucz czaszkę sterylnym PBS. Oczyść i wypoleruj czaszkę bawełnianymi wacikami.
  3. Wypoziomuj czaszkę i markerem zaznacz współrzędne stereotaktyczne do wstrzyknięcia wirusa. Używając zadziorów 0,5 mm na szybkoobrotowym mikrowiertle (ustawionym na około 7 000-10 000 obr./min), utwórz mały otwór w czaszce. Wywieraj lekki nacisk podczas wiercenia i co jakiś czas czyść pył kostny i zwilżaj obszar sterylnym PBS, aby zapobiec przegrzaniu tkanki mózgowej, aż do osiągnięcia powierzchni mózgu. Utrzymuj mózg wilgotny w miejscu, w którym wywiercony jest otwór.
  4. Do pobrania wirusa należy użyć igły 26 G (np. AAV1. CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40) w mikrostrzykawce, a następnie zastąpić ją igłą 35 G do wstrzykiwań. Przymocuj mikrostrzykawkę załadowaną wirusem do ramienia manipulatora aparatu stereotaktycznego.
  5. Zbliżyć strzykawkę do otworu w miejscu wstrzyknięcia i wyregulować kąt nachylenia igły tak, aby weszła pod kątem 90° do powierzchni mózgu. Opuść igłę, aż dotknie pia mater i przebij oponę twardą. Rozpocznij obniżanie igły w krokach co 10 μm/s, aż osiągnie żądaną głębokość (z). Ustal położenie igły w tym miejscu za pomocą ramienia stereotaktycznego.
  6. Ustawić pompę mikrostrzykawkową tak, aby wstrzykiwała 250 nl wirusa przy 25 nl/min.
    1. Krok krytyczny: Ponieważ objętość wirusa do wstrzyknięcia zależy od miana i rozcieńczenia, należy wcześniej przeprowadzić eksperymenty z rozcieńczeniem, aby ustalić optymalne kryteria objętości i stężenia do obrazowania komórek w eksperymencie.
  7. Jeśli zauważy, że jakiś wirus wydziela się z miejsca wstrzyknięcia, należy przerwać wstrzyknięcie i poczekać, aż tkanka mózgowa wchłonie kroplę wirusa. Odczekaj 5-7 minut po wstrzyknięciu całkowitej objętości przed wycofaniem igły. Barwniki, takie jak fast green, mogą być również dodawane do roztworu wirusa, aby pomóc kontrolować szybkość wstrzykiwania w przypadku, gdy wirus jest widoczny z powierzchni mózgu.
  8. Aby oznaczyć wiele warstw w korze mózgowej, w razie potrzeby użyj wielu wstrzyknięć. Najpierw należy rozpocząć od najbardziej brzusznego miejsca, odczekać 5-7 minut po wstrzyknięciu i podciągnąć igłę do następnego najbardziej grzbietowego punktu wstrzyknięcia (np. wstrzyknąć przy -1,0 mm AP, 1,5 mm ± ML oraz 400 i 600 μm DV). Należy odczekać 10 minut po ostatnim wstrzyknięciu przed wyciągnięciem igły i wyjęciem jej z zestawu stereotaktycznego.
  9. Wymieszać niewielką ilość biokompatybilnego przezroczystego kleju elastomerowego in vivo ze strzykawki dwucylindrowej (np. Kwik-Sil) i zakryć nim otwór w czaszce. Nałóż klej cyjanoakrylowy na warstwę kleju elastomerowego i pozwól mu się utwardzić.
  10. Zszyj skórę głowy i pozwól zwierzęciu dojść do siebie po znieczuleniu w ciepłej klatce rekonwalescencji, dopóki nie będzie w stanie chodzić. Ketoprofen (2,5 mg/kg) lub karprofen (2,5 mg/kg) należy podawać podskórnie przed powrotem zwierzęcia do klatki domowej. Pojedynczo należy umieszczać osoby po operacji w celu ochrony miejsca operacji i powtórzyć dawkę 24 godziny później.
  11. Po wyjęciu mikrostrzykawki należy przepłukać igły 26 G i 35 G 7-10 razy wodą destylowaną w celu oczyszczenia przed przechowywaniem.

3. Chirurgia implantu sondy pryzmatycznej

  1. 1-2 tygodnie po wstrzyknięciu wirusa przygotuj się do operacji wszczepienia implantu sondy pryzmatycznej. Zdezynfekuj sondę pryzmatyczną w 70% etanolu i wyczyść ją papierem do soczewek. Włóż sondę pryzmatyczną do narzędzia do mocowania obiektywu i dokręć sześciokątną śrubokrętem. Umieść mikroskop w uchwycie podstawy (magnesy utrzymają go na miejscu).
  2. Przygotuj zwierzę zgodnie z opisem w sekcji Przygotowanie przedoperacyjne.
  3. Przytnij i ogol głowę zwierzęcia między oczami a uszami i zdezynfekuj skórę naprzemiennymi wacikami z 70% etanolu i betadyny.
  4. Odsłoń czaszkę, nacinając skórę sterylnymi nożyczkami i usuń płat skóry i leżącą pod nim okostną. Osusz i wypoleruj czaszkę wacikami. Upewnij się, że otaczająca tkanka mięśniowa jest odpowiednio usunięta, aby stworzyć czystą, suchą, szeroką podstawę kostną w ramach przygotowań do kolejnych kroków.
  5. Implant czaszki przykręca się w przeciwległej półkuli, aby implant był stabilny i bezpieczny. Mogą one być również przydatne, jeśli zdecydujesz się na wszczepienie pałąka na głowę w celu naprawienia głowy w stanie czuwania, aby przygotować zwierzę do eksperymentalnych sesji obrazowania w sekcji 5.
  6. Wypoziomuj czaszkę i markerem zaznacz współrzędne AP i ML do wprowadzenia soczewki. Za pomocą zadzioru 0,5 mm na mikrowiertle otwórz okrągłą kraniotomię, upewniając się, że średnica kraniotomii jest nieco większa niż średnica pryzmatu, tj. w tym przypadku 1,0 mm. Wiercić delikatnie, robiąc przerwy z przerwami, aby przepłukać czaszkę sterylnym PBS i odessać ją bawełnianymi wacikami. Usuń powstający pył kostny.
    1. Krok krytyczny: Umieść kraniotomię w taki sposób, aby po wprowadzeniu pryzmatu do kory jego płaska krawędź (powierzchnia obrazowania) była skierowana w stronę miejsca wstrzyknięcia wirusa i znajdowała się w promieniu 150-200 μm.
  7. Przerwij wiercenie tuż przed całkowitym rozrzedzeniem czaszki. Naczynia krwionośne powinny być widoczne przez przerzedzoną kość. Delikatnie usuń korek kostny za pomocą cienkich kleszczy 45°.
  8. Usuń oponę twardą za pomocą kleszczy #5.
    1. Krok krytyczny: Po odsłonięciu tkanki mózgowej zawsze utrzymuj ją wilgotną. Umieść bawełniany wacik zamoczony w sterylnym roztworze soli fizjologicznej na kraniotomii. To również utrzyma nacisk na tkankę.
  9. Aby zmniejszyć ciśnienie w tkance mózgowej podczas wprowadzania sondy pryzmatycznej, należy z wyprzedzeniem utworzyć drogę wprowadzającą. Przymocować nóż do preparacji o prostych krawędziach do ramienia uchwytu elektrody aparatu stereotaktycznego i zamontować go na aparacie stereotaktycznym pod takim kątem, aby ostrze noża było prostopadłe do krzywizny czaszki (w tym przypadku kąt 10°) i w płaszczyźnie równoległej do kolumny iniekcyjnej wirusa.
  10. W tym przypadku ostrożnie umieść nóż nad kraniotomią wzdłuż jej przedniej krawędzi przyśrodkowej i ~200 μm bocznie do miejsca wstrzyknięcia wirusa, z krawędzią tnącą skierowaną do tyłu (ryc. 1). Wyzeruj oś Z, gdy końcówka noża dotknie pia i stopniowo ją obniżaj (w krokach co 10 μm / s) do głębokości, na której zostanie włożona sonda pryzmatyczna. Następnie przesuń nóż o 1 mm do tyłu, aby utworzyć ścieżkę dla krawędzi natarcia pryzmatu. Zrób przerwę i kontroluj krwawienie, które może wystąpić podczas wykonywania nacięcia za pomocą wstępnie sterylnego kawałka pianki żelowej nasączonej solą fizjologiczną.
  11. Gdy nóż znajdzie się w tej pozycji, przepłucz to miejsce sterylną solą fizjologiczną i poczekaj, aż krwawienie ustąpi. Następnie powoli nóż za pomocą stereotaktycznego mikromanipulatora ramienia w krokach co 10 μm/s i umieść kawałek gąbki żelowej nasączonej sterylną solą fizjologiczną na nacięciu.
  12. Przymocuj uchwyt obiektywu (z sondą pryzmatyczną i mikroskopem) do ramienia manipulatora stereotaktycznego pod tym samym kątem, co nóż w poprzednim kroku. Ustaw pryzmat tak, aby płaska strona pryzmatu znajdowała się nad nacięciem i równolegle do kolumny do wstrzykiwania wirusa. Ten krok może wymagać drobnej korekty stereotaktycznej pozycji ramienia. Dostosuj wyrównanie, trzymając się blisko czaszki, aby uzyskać szybsze rezultaty.
  13. Gdy pryzmat znajdzie się pod odpowiednim kątem, stopniowo obniżaj go w mózgu w krokach co 10 μm, aż do końcowego z 1,1 mm dla tej sondy, zaczynając od powierzchni mózgu. Tkanka mózgowa rozszerzy się wokół pryzmatu, a wszelkie ciśnienie, które powstanie, znajduje się za płaszczyzną wizualizacji i nie wpłynie na pole widzenia. Podłącz mikroskop do komputera z oprogramowaniem akwizycyjnym zainstalowanym przez port USB3 i zwizualizuj fluorescencję pola, włączając diodę LED.
  14. Przykryj odsłoniętą tkankę wokół pryzmatu podczas kraniotomii bardzo cienką warstwą ochronną kleju elastomerowego za pomocą igły 25G.
  15. Po utwardzeniu kleju elastomerowego (zwykle w ciągu ~ 3-5 minut) za pomocą igły 25G nałożyć trochę kleju cyjanoakrylowego, aby przymocować szkło soczewki pryzmatycznej do sąsiedniej czaszki na warstwie kleju elastomerowego, aby zapobiec przesuwaniu się soczewki wewnątrz kraniotomii. Uwzględnij krawędzie mankietu sondy pryzmatycznej, aby uzyskać lepszą przyczepność. Nie dotrzyj do żadnych klei na górnej powierzchni wszczepionej sondy pryzmatycznej. Po utwardzeniu kleju cyjanoakrylowego odkręć uchwyt obiektywu i ostrożnie wyjmij mikroskop. Następnie powoli cofnij ramię manipulatora stereotaktycznego, aby sonda pryzmatyczna była bezpiecznie wszczepiona.
  16. Nałóż warstwę akrylowego kleju dentystycznego lub kleju cyjanoakrylowego wokół implantu, aby pokryć całą odsłoniętą powierzchnię czaszki, aż do otaczającej cofniętej tkanki mięśniowej, ale nie dotykając jej. Pokrycie dużego obszaru czaszki tą czapeczką czaszki pomoże później w mocowaniu płytki podstawowej. Skóra wokół miejsca implantu powinna goić się samoistnie wokół czapeczki czaszki.
    1. Krytyczny krok: Nie pozwól, aby klej dotykał otaczającej skóry lub tkanki mięśniowej i nie pochłaniaj żadnej skóry w czapce czaszki. Spowoduje to podrażnienie skóry i może spowodować nadmierne drapanie i potencjalne uszkodzenie implantu.
  17. Opcjonalnie: Jeśli chcesz użyć konfiguracji unieruchomionej głowy do mocowania i odłączania mikroskopu od płytki podstawy zwierzęcia podczas eksperymentalnych sesji obrazowania, zamiast krótkotrwałego znieczulania lub znieczulania zwierzęcia, wszczepij pręt na głowę w czapce czaszki, który jest kompatybilny z wybraną konfiguracją unieruchomioną na wybudzonej głowie (nie wykazano w tym protokole).
  18. Wymieszaj katalizator i podstawę ze strzykawki z klejem silikonowym i umieść kroplę elastomeru w mankiecie sondy pryzmatycznej, aby zakryć górną część soczewki sondy, aby zapobiec uszkodzeniom i osadzaniu się kurzu.
  19. Wyjmij zwierzę z ramy stereotaktycznej i pozwól mu dojść do siebie po znieczuleniu w ciepłej komorze. Ketoprofen (2,5 mg/kg) lub karprofen (2,5 mg/kg) należy podawać podskórnie, a po zakończeniu chodzenia zwierzę należy umieścić z powrotem w czystej klatce domowej. Pojedynczo należy umieścić wszystkie osoby w celu ochrony implantu i powtórzyć dawkę 24 godziny później.

4. Mocowanie płytki bazowej do instalacji mikroskopu miniaturowego

  1. Od tygodnia do 10 dni po wszczepieniu sondy pryzmatycznej należy sprawdzić ekspresję wirusa w tkance za pomocą wszczepionej sondy pryzmatycznej i przymocować płytkę bazową do czaszki, jeśli preparat wykazuje aktywność komórkową. Mikroskop zadokuje się na płycie podstawy podczas obrazowania na żywo.
  2. Postępuj zgodnie z krokami opisanymi w procedurze przedoperacyjnej w celu przygotowania zwierzęcia do założenia płytki podstawowej.
  3. Zdejmij silikonową nasadkę samoprzylepną z powierzchni wszczepionej górnej soczewki sondy pryzmatycznej. Sprawdź powierzchnię sondy obiektywu i delikatnie usuń wszelkie zanieczyszczenia papierem do soczewek i 70% etanolem, aby upewnić się, że powierzchnia obrazowania jest czysta.
  4. Podłącz mikroskop do skrzynki DAQ i podłącz go przez port USB3 do komputera.
  5. Otwórz oprogramowanie do akwizycji na komputerze i podłącz mikroskop przez port USB3. Użyj oprogramowania do akwizycji do sprawdzania aktywności neuronalnej oraz do pomiaru i dokumentowania ustawień pola widzenia dla przyszłych nagrań w tym temacie.
  6. Przymocuj płytkę bazową do mikroskopu i dokręć ustalającą płytkę podstawy, aby utrzymać płytkę podstawy na miejscu, a następnie przymocuj mikroskop do chwytaka mikroskopu na ramieniu mikromanipulatora stereotaktycznego przy korpusie mikroskopu. Przymocuj chwytak do pręta Newport, który można zamontować na ramieniu stereotaktycznego mikromanipulatora.
  7. Umieść mikroskop nad soczewką sondy pryzmatycznej za pomocą ramienia mikromanipulatora stereotaktycznego. Sprawdź wzrokowo orientację, patrząc na soczewkę pryzmatyczną z boku i z tyłu sceny zwierzęcej. Osie optyczne zarówno obiektywu mikroskopu, jak i soczewki sondy pryzmatycznej muszą być wyrównane.
  8. Włącz diodę LED mikroskopu za pomocą oprogramowania. Oceń jakość wyrównania mikroskopu, skupiając się na górnej powierzchni wszczepionej soczewki sondy pryzmatycznej w oprogramowaniu do akwizycji. Po prawidłowym ustawieniu krawędzie górnej powierzchni soczewki sondy pryzmatycznej powinny być ostre.
  9. Dostosuj fizyczną odległość mikroskopu nad wszczepioną sondą pryzmatyczną za pomocą ramienia manipulatora stereotaktycznego, aby uzyskać pożądaną płaszczyznę ogniskową wewnątrz tkanki. Optycznie zoptymalizowana odległość między obiektywem mikroskopu a wszczepioną soczewką GRIN wynosi ~500 μm.
  10. Zapisz referencyjny obraz fluorescencyjny po przechwyceniu żądanej płaszczyzny obrazowania.
    Punkt krytyczny: Od tego momentu nie należy regulować położenia mikroskopu, ponieważ spowoduje to zmianę położenia płaszczyzny obrazowania w tkance.
    UWAGA: W następnym kroku nałóż klej, aby trwale ustalić położenie płytki bazowej w stosunku do czapeczki czaszki. Klej może ulec pewnemu zmniejszeniu objętości w ciągu następnego dnia lub dwóch, co może zmienić płaszczyznę ogniskową w tkance. Uwzględnij to zapobiegawczo, mierząc wielkość skurczu mieszanki klejowej i odległość ex vivo, a następnie cofając ostateczną pozycję Z mikroskopu + płytki bazowej o tę wartość przed przejściem do etapu nakładania kleju.
  11. Użyj akrylu dentystycznego lub cyjanoakrylanu, aby trwale przymocować płytkę bazową do akrylowej nasadki zakrywającej czaszkę zwierzęcia, wypełniając szczelinę akrylem lub klejem. Stopniowe nakładanie akrylu/cyjanoakrylu dentystycznego i wieloetapowe utwardzanie może zminimalizować wpływ wspomnianego wcześniej skurczu na ostateczne położenie płaszczyzny obrazu mikroskopu.
    1. Krytyczny krok: Zachowaj ostrożność podczas nakładania akrylu dentystycznego/cyjanoakrylanu, aby zapobiec kontaktowi jakiegokolwiek materiału z soczewką obiektywu mikroskopu, śrubą ustalającą lub korpusem mikroskopu, co uniemożliwi późniejsze prawidłowe działanie oprzyrządowania.
    2. Krytyczny krok: Podczas nakładania kleju nie naciskaj na mikroskop. Nacisk na mikroskop lub płytkę bazową może powodować ruch obiektywu mikroskopu względem soczewki sondy pryzmatycznej, co może spowodować niewspółosiowość lub zmianę płaszczyzny ogniskowej w tkance, co wymagałoby natychmiastowej ponownej regulacji.
  12. Sprawdź, czy akryl dentystyczny/cyjanoakrylan utwardził się i stwardniał, stukając w akryl kleszkami lub końcówką strzykawki. Uzyskaj ostateczny referencyjny obraz fluorescencyjny za pomocą oprogramowania do akwizycji.
  13. Zwolnij mikroskop z chwytaka i schuj chwytak z mikroskopu. Jeśli użyto cyjanoakrylanu lub innego przezroczystego kleju, przykryj go czarnym lakierem do paznokci lub warstwą czarnego cementu dentystycznego, aby zapobiec przedostawaniu się światła otoczenia do nasadki głowy, co może zanieczyścić przyszłe obrazy uzyskane podczas eksperymentów.
  14. W tym momencie wyjmij mikroskop, jeśli to konieczne. Aby oddzielić mikroskop od płytki podstawy, odkręć dociskową płytki podstawy, obracając ustalającą o około 1/2 obrotu w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara. Ściśnij korpus mikroskopu, drugą ręką podtrzymując płytkę podstawy i akrylową nasadkę, a następnie pociągnij mikroskop prosto do góry. Wymień go w pojemniku do przechowywania.
  15. Chroń wszczepioną sondę pryzmatyczną za pomocą osłony płyty podstawy. Zapobiegnie to osadzaniu się cząsteczek kurzu na powierzchni obiektywu, które mogą być trudne do wyczyszczenia po zainstalowaniu płytki bazowej.
  16. Przymocuj pokrywę płyty podstawy do płyty podstawy i przesuń ustalającą o około 1/2 obrotu zgodnie z ruchem wskazówek zegara lub do momentu, gdy śruba ustalająca zrówna się z pokrywą podstawy . Nie dokręcaj zbyt mocno.
  17. Wyjmij zwierzę ze znieczulenia i monitoruj w ciepłej komorze rekonwalescencji do czasu rozpoczęcia ambulatoryjnego. Umieść zwierzę z powrotem w jego klatce domowej. Wszystkie zwierzęta powinny być trzymane pojedynczo z wszczepionymi płytkami podstawowymi w celu ochrony implantu.

5. Obrazowanie wielu warstw korowych w swobodnie poruszającej się myszy

  1. Przygotuj aparat behawioralny (np. Phenotyper, Noldus), czyszcząc go i dezynfekując, a następnie przecierając 10% roztworem wybielacza.
  2. Podłącz mikroskop do skrzynki DAQ, podłącz go do komputera i uruchom oprogramowanie do akwizycji.
  3. Sprawdź, czy na komputerze akwizycji jest wystarczająco dużo miejsca na pliki i zrób miejsce na filmy z obrazowania wapnia. Zapisuj bezpośrednio z oprogramowania na lokalnym dysku twardym, zamiast zapisywać na zewnętrznym dysku twardym, aby dostosować się do dużej szybkości przesyłania danych między mikroskopem a komputerem i zapobiec utracie danych podczas nagrywania.
  4. Znieczulić zwierzę izofluranem (5% w tlenie) w komorze indukcyjnej w celu zamocowania mikroskopu. Alternatywnie, delikatnie potrząśnij zwierzęciem lub użyj konfiguracji z głową w stanie czuwania z prętem na głowę, jeśli wiadomo, że znieczulenie koliduje z wybranym paradygmatem behawioralnym.
  5. Zdejmij pokrywę płyty podstawy, obracając dociskową płyty podstawy w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara i podnosząc pokrywę płyty podstawy.
  6. Umieść mikroskop w płytce podstawy na zwierzęciu. Mikroskop powinien zatrzasnąć się na swoim miejscu za pomocą magnesów na płycie podstawy. Przesuń dociskową płyty podstawy, aż poczujesz lekki opór.
    1. Krok krytyczny: Nie dokręcaj zbyt mocno dociskowej płyty podstawy, aby zapobiec uszkodzeniu obudowy mikroskopu.
  7. Sprawdź płaszczyznę obrazowania w tkance, uzyskując migawkę fluorescencji w oprogramowaniu, a jeśli to konieczne, wyreguluj płaszczyznę ogniskowej w tkance, poluzowując dociskową wieżyczki mikroskopu, obracając wieżyczkę mikroskopu w celu regulacji precyzyjnej ostrości, a następnie ponownie dokręcając dociskową obudowy głowicy.
    1. Krok krytyczny: Nigdy nie zmuszaj wieżyczki do obracania się bez uprzedniego poluzowania ustalającej i nie dokręcaj zbyt mocno dociskowej wieżyczki.
  8. Jeśli przeprowadzasz badanie podłużne, wróć do fizycznej pozycji wieżyczki, aby uchwycić to samo pole widzenia. W sprzęcie zwróć uwagę na liczbę obrotów wieżyczki lub fizyczne położenie wieżyczki dla każdego zwierzęcia sfotografowanego za pomocą tego samego mikroskopu, aby szybko powrócić do tego samego pola widzenia.
  9. Wypuść zwierzę niosące mikroskop do jego domowej klatki lub komory behawioralnej w celu aklimatyzacji i oczekiwania na zakończenie znieczulenia, jeśli ma to zastosowanie.
    1. Krok krytyczny: Przed rozpoczęciem sesji eksperymentalnych wytrenuj zwierzęta do przenoszenia ciężaru mikroskopu za pomocą mikroskopu atrapy przez kilka sesji, aż upewnisz się, że noszenie mikroskopu nie zakłóca ich normalnego zachowania. Regularne obchodzenie się z zwierzętami i szkolenie w zakresie unieruchamiania ich w stanie czuwania zapobiegnie nadmiernemu stresowi.
  10. Wybierz ustawienia pozyskiwania, które mają być używane do zbierania danych. Obejmuje to liczbę klatek na sekundę podczas przechwytywania danych (np. 20 kl./s, wzmocnienie 1 i moc diody LED 50%). Sprawdź histogram obrazu podczas wybierania ustawień, aby zapewnić dobry SNR.
    UWAGA: Apertura numeryczna do zbierania fluorescencji wynosi 0,35 dla sondy pryzmatycznej 1 mm w porównaniu do 0,5 dla sondy prostej 1 mm.
  11. Uruchom oprogramowanie behawioralne i zaprogramuj je tak, aby uruchamiało mikroskop w żądanym cyklu zapisu obrazowania (np. 4X, 5 min ON, 2 min OFF). Podłącz port TTL w skrzynce I/O Noldus do portu TRIG w skrzynce DAQ za pomocą RJ45 do BNC.
  12. Umieść zwierzę na arenie behawioralnej, jeśli jeszcze tam nie jest, i rozpocznij eksperyment.
  13. Po uzyskaniu pożądanych danych należy ponownie znieczulić zwierzę izofluranem (5% w tlenie) w komorze indukcyjnej lub delikatnie obudzić zwierzę.
  14. Poluzuj dociskową płyty podstawy i odłącz mikroskop od płytki podstawy, delikatnie pociągając mikroskop do góry. Załóż pokrywę płyty podstawy i delikatnie dokręć dociskową płyty podstawy.
  15. Zwróć zwierzę do klatki domowej do następnej sesji nagraniowej. Użyj referencyjnych obrazów fluorescencyjnych jako przewodnika dla kolejnych sesji obrazowania, aby powrócić do tego samego pola widzenia.

6. Ocena danych obrazowania Ca2+ na dużą skalę

  1. Aby wyodrębnić lokalizację komórek i dynamikę Ca2+ w polu widzenia z danych, można użyć różnych platform analizy danych. Mosaic, platforma analizy danych zaprojektowana specjalnie do przetwarzania filmów obrazowania Ca2+ na dużą skalę, została wykorzystana w tym badaniu.
  2. Napraw uszkodzone piksele i interpoluj pojedyncze pominięte klatki w filmach RAW na etapie przetwarzania wstępnego. Umieść obrazy w przestrzeni z pełnego pola widzenia 1 440 x 1 080 pikseli do 720 x 540 pikseli, aby zmniejszyć ślad danych.
  3. Aby skorygować artefakty ruchu w mózgu w odniesieniu do czujnika obrazu mikroskopu, zarejestruj filmy za pomocą rygorystycznego algorytmu rejestracji obrazu opartego na ImageJ (TurboReg).
  4. Aby zidentyfikować poszczególne neurony, ponownie wyraź obrazy jako względne zmiany fluorescencji ΔF/F0 = F-F0/F0, gdzie F0 jest średnim obrazem uzyskanym przez uśrednienie całego filmu.
  5. Zidentyfikuj filtry przestrzenne odpowiadające poszczególnym komórkom przy użyciu ustalonego algorytmu sortowania komórek. W tym przypadku użyliśmy analizy składowych głównych i indywidualnych21, aby zidentyfikować poszczególne neurony.
    UWAGA: Zdarzenie zostało określone, gdy amplituda szczytowa zdarzenia w śladzie była większa niż 8 odchyleń standardowych od linii bazowej śladu w naszym zestawie danych, a lokalizacja komórki i dane dynamiki Ca2+ zostały wyeksportowane do dalszej analizy.

Wyniki

Protokół opisany w niniejszym opracowaniu przedstawia skuteczną i wydajną metodę prowadzenia podłużnego wielowarstwowego obrazowania Ca2+ setek neuronów korowych u myszy w stanie swobodnego zachowania z wykorzystaniem sond pryzmatycznych (Rysunek 1). Poprzednie podejścia do wielowarstwowego obrazowania kory ograniczały się głównie do zwierząt z unieruchomioną głową 2,23,24,25,26,27. Aby uzyskać dane na tym poziomie w kontekście swobodnego zachowania, zastosowano platformę miniaturowego mikroskopu w celu zapewnienia elastyczności behawioralnej; użyto genetycznie kodowanego wskaźnika wapnia (GCaMP6f) do ukierunkowania na konkretną populację komórek (komórki CAMKII+ w korze); oraz wybrano sondę pryzmatyczną, aby zapewnić przewlekłe, wielowarstwowe pole widzenia.

Przedstawiliśmy przebieg prac związanych z przygotowaniem zwierzęcia do obrazowania. Do kory wstrzyknięto wektor wirusowy kodujący odpowiedni wskaźnik wapnia (Rysunek 2, krok 1), a następnie trwale wszczepiono sondę pryzmatyczną, aby umożliwić dostęp optyczny do znakowanych komórek (Rysunek 2, krok 2). Następnie na głowie zwierzęcia zamontowano płytkę bazową, służącą jako stabilny, tymczasowy uchwyt do pozycjonowania mikroskopu podczas sesji obrazowania (Rysunek 2, krok 3), co umożliwiło wizualizację aktywności korowej w wielu warstwach komórkowych w układzie eksperymentalnym z zachowaniem aktywności zwierzęcia w stanie czuwania (Rysunek 2, krok 4).

Aby upewnić się, że celem była pożądana populacja komórek, na Rysunku 3 przedstawiono pośmiertny koronalny przekrój mózgu reprezentatywnej myszy z zaznaczonym traktem sondy pryzmowej oraz polem widzenia w odniesieniu do neuronów etykietowanych GCaMP6f w warstwach 2/3 i 5 kory somatosensorycznej.

Podczas obrazowania zachowania zwierząt w stanie czuwania za pomocą systemu, rejestrowano aktywność neuronów kory somatosensorycznej, gdy mysz była eksponowana na trzy różne środowiska: Otwarte Pole (Dzień 1), Zapoznanie z Obiektami (Dzień 2-4) oraz Nowy Obiekt (Dzień 5) (Rysunek 4). Pierwszego dnia mysz umieszczono w arenie behawioralnej pozbawionej jakichkolwiek obiektów. W dniach 2-4 mysz umieszczano w arenie z tymi samymi dwoma obiektami o różnej teksturze (podkładka żelowa i drewniany klocek). Piątego dnia jeden z obiektów zastąpiono nowym obiektem. Obrazowanie zwierzęcia trwało 5 dni po 20 min każdego dnia.

Po ekstrakcji komórek przy użyciu oprogramowania do analizy danych obrazowych Ca2+, filtry przestrzenne odpowiadające lokalizacjom komórek nałożono na projekcję średniej intensywności fluorescencji z danych rejestracji mikroskopowej (Rysunek 5)). Biała przerywana linia oddziela komórki warstw 2/3 i 5. Odpowiednie przebiegi Ca2+ z 5 komórek z każdej z warstw pokazują wzorzec wyładowań komórek w dwóch różnych kontekstach behawioralnych: zapoznaniu z obiektem oraz ekspozycji na nowy obiekt. Komórki warstwy 2/3 były bardziej aktywne w porównaniu z komórkami warstwy 5 w dniu, w którym mysz została poddana ekspozycji na nowy obiekt. Jest to również widoczne na wykresach rastrowych, które przedstawiają aktywność wyładowań przekraczających próg dla wszystkich obrazowanych komórek w dniach 1, 4 i 5.

Konfiguracja sondy pryzmatycznej miniskopu do obrazowania GCaMP; schematy i wyniki fluorescencji pola.
Rysunek 1: In vivo Ca2+ Obrazowanie wielu warstw korowych u swobodnie poruszających się myszy. (A) Specyfikacja sondy pryzmowej i przedstawienie płaszczyzny obrazowania. Powłoka refleksyjna na wewnętrznej stronie przeciwprostokątnej umożliwia obrazowanie 90° od płaszczyzny wprowadzenia sondy pryzmatycznej. Mufa soczewki integruje się z uchwytem soczewki, co usprawnia procedurę implantacji i umożliwia potencjalną obserwację fluorescencji tkanek otaczających podczas implantacji (B) (i). Ilustracja rozmieszczenia kraniotomii pod sondę pryzmatyczną i nacięcia nożem względem miejsca wstrzyknięcia wirusa oraz (ii) ilustracja położenia płaskiej strony sondy pryzmatycznej względem nacięcia nożem i miejsca wstrzyknięcia wirusa. (CIlustracja in vivo Ca2+ układ obrazowania przedstawiający drogę światła dla niewielkiego obszaru w obrębie pełnego pola widzenia poprzez sondę pryzmatyczną wszczepioną w korę mózgu myszy.DPrzykład pola widzenia podczas instalacji sondy pryzmatycznej. Mikroskop miniaturowy jest przymocowany do uchwytu soczewki, który trzyma sondę pryzmatyczną, umożliwiając sprawdzenie ekspresji wirusa podczas instalacji sondy.E) Integracja mikroskopu z sondą pryzmatyczną do wielowarstwowego obrazowania kory z komórkami S1 znakowanymi GCaMP6f. F Przykład pola widzenia podczas instalacji płytki bazowej. W momencie instalacji płytki bazowej widoczny jest wyraźny wzór naczyń krwionośnych, a w obrazie surowym widoczne są niektóre komórki. Po włączeniu funkcji DF/F w oknie oprogramowania akwizycyjnego wyraźnie widocznych jest więcej komórek. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Harmonogram obrazowania mózgu myszy; etapy: iniekcja wirusa, sonda pryzmatyczna, płyta bazowa, mikroskop.
Rycina 2: Schemat przedstawiający harmonogram zdarzeń w procesie implantacji sondy pryzmatycznej i instalacji mikroskopu. Liczba tygodni została przedstawiona na osi X, a kroki procedur w ramach przepływu pracy na osi Y.AGrafika ilustrująca iniekcję wirusową (AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40) wzdłuż tej samej osi grzbietowo-brzusznej w celu znakowania wielu warstw kory somatosensorycznej myszy.B) 2 tygodnie po wstrzyknięciach wirusa implantowany jest pryzmatyczny sensor (prism probe) w osi równoległej do miejsc wstrzyknięć wirusa. (COkoło tydzień po implantacji sondy pryzmowej sprawdza się pod mikroskopem, czy występuje ekspresja; jeśli widoczna jest populacja komórek, na głowie zwierzęcia montuje się płytkę podstawową.DZwierzę jest następnie gotowe do obrazowania chronicznego podczas odpowiednich zadań behawioralnych (Rysunek myszy zmodyfikowany po uzyskaniu zgody od UW-Madison Biochemistry MediaLab). Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Obrazowanie tkanki mózgowej za pomocą sondy pryzmatycznej; mikroskopia fluorescencyjna; opona twarda i miękka; płaszczyzna ogniskowania.
Rycina 3: Pośmiertna walidacja histologiczna lokalizacji sondy Prism oraz ekspresji GCaMP. (A) Przekrój wieńcowy reprezentatywnego mózgu mysiego przedstawiający tor sondy pryzmatycznej, z jej stroną obrazującą skierowaną w stronę komórek wykazujących ekspresję GCaMP6f (AAV1.CaMKII.GCaMP6f wykazujący ekspresję w neuronach warstw 2/3 i 5). (B) Ten sam koronalny przekrój mózgu po barwieniu DAPI. Pasek skali = 250 µm (C) Powiększony widok komórek wykazujących ekspresję GCaMP6f w korze somatosensorycznej. Pasek skali = 100 µm. Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Mapa ciepła przedstawiająca aktywność zwierząt w otwartym polu, podczas zapoznawania z obiektem oraz ekspozycji na nowy obiekt.
Rysunek 4: Aktywność myszy podczas habituacji, oswajania i testu ekspozycji na nowy obiekt była śledzona za pomocą oprogramowania wideo. (AW 1. dniu zwierzę umieszczono w arena behawioralnej pozbawionej jakichkolwiek obiektów (Open Field).B) W dniach 2–4 w arenie umieszczono te same dwa obiekty o różnej teksturze (podkład żelowy i blok drewniany) (Oswajanie z Obiektami). (C) W 5. dniu jeden z obiektów zastąpiono nowym przedmiotem (drewniany blok z papierem ściernym) (Ekspozycja na Nowy Obiekt). Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Analiza aktywności neuronalnej, dane elektrofizjologiczne; wizualizacja za pomocą wykresów liniowych i punktowych; 151 komórek, głębokość warstwy.
Rysunek 5: Dynamika wapnia w warstwach powierzchownych i głębokich kory somatosensorycznej reprezentatywnej myszy obrazowanej za pomocą mikroskopu. (A) Nałożony obraz neuronalnych filtrów przestrzennych (zielone plamy) i projekcja średniej intensywności fluorescencji z zapisu mikroskopowego w polu widzenia sondy pryzmatycznej. Granica między warstwami supragranularnymi a infragranularnymi zaznaczona białą przerywaną linią. Pasek skali = 100 µm. (B) Przebiegi wapniowe z pięciu przykładowych komórek z warstwy powierzchownej i głębokiej (wypełnione niebieskie i czerwone komórki na panelu A), wskazujące jednostki odchylenia standardowego fluorescencji po analizie głównych i niezależnych komponentów. Poziomy pasek skali 50 s i pionowy pasek skali 10 S.D. (CWykres rastrowy komórek z warstw powierzchownych (warstwy 2/3) i głębokich (warstwa 5) przedstawiony podczas testu otwartego pola (Open field), zapoznawania z obiektem (Object Familiarization) oraz eksploracji nowego obiektu (Novel object exploration). Pasek skali = 10 s. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Dyskusja

Zrozumienie aktywności obwodów nerwowych podczas czuwania jest istotnym poziomem badań neurobiologicznych potrzebnych do skutecznego zbadania funkcji mózgu w zdrowiu i chorobie. Kora mózgowa jest szczególnie ważnym regionem do badania w kontekście zachowania na jawie, ponieważ odgrywa ważną rolę w wielu ważnych funkcjach sensorycznych, poznawczych i wykonawczych28,29.

Uważa się, że kolumna korowa jest podstawową jednostką funkcjonalną w korze mózgowej, a wiadomo, że aktywność komórek korowych na poziomie populacji różni się w zależności od ich fizycznego położenia w kolumnie. Na przykład neurony pobudzające w warstwach 2/3 kory somatosensorycznej rzutują głównie na inne obszary kory nowej i modulują inne sieci korowe30, podczas gdy komórki w głębszych warstwach rzutują głównie na regiony podkorowe, takie jak wzgórze31. Rejestrowanie aktywności setek wcześniej określonych komórek korowych jednocześnie i niezawodnie w czasie na różnych blaszkach u swobodnie zachowujących się osób znacznie poszerzyłoby nasze zrozumienie przepływu informacji korowych, umożliwiając dokładniejszą funkcjonalną analizę kolumn korowych na podstawie informacji behawioralnych w czasie rzeczywistym i skal czasowych istotnych dla zadania.

Gromadzenie danych o obwodach neuronowych na tym poziomie jest możliwe dzięki zastosowaniu wydajnej i usprawnionej zminiaturyzowanej platformy mikroskopowej do przeprowadzania wielkoskalowego obrazowania Ca2+ u swobodnie zachowujących się osób (lub osób z głową w zależności od potrzeb). Stosowany z genetycznie kodowanymi wskaźnikami wapnia w celu umożliwienia celowania specyficznego dla typu komórki i obrazowania wielowarstwowego pola widzenia zapewnianego przez przewlekle wszczepioną sondę pryzmatyczną, protokół ten zbadał jeden przypadek spośród wielu możliwych zastosowań: obserwację laminarnych różnic w somatosensorycznym przetwarzaniu korowym, gdy myszy fizycznie angażowały się w nowy obiekt (Figura 5). Jest to pierwsza proceduralna ilustracja tego rodzaju specyficznego dla typu komórki, in vivo podejścia do badania wielu warstw korowych u obudzonych, swobodnie zachowujących się zwierząt, i poszerza spektrum dostępnych metod eksperymentalnych do zrozumienia struktur laminarnych w aktywnym mózgu.

Peryskopowe pole widzenia, które umożliwia sonda pryzmatyczna w tej technice, może być z powodzeniem zastosowane do innych struktur mózgu, gdy pożądane jest zachowanie tkanki bezpośrednio grzbietowej do obszaru zainteresowania; na przykład obrazowanie CA3 można uzyskać bez zakłócenia funkcji hipokampa.

Podejście oparte na sondzie pryzmatycznej do obrazowania aktywności Ca2 + wymaga fizycznego wprowadzenia i trwałego wszczepienia mikropryzmatu do kory mózgowej, co jest równoznaczne z utworzeniem zmiany korowej w miejscu, w którym wprowadzana jest sonda soczewkowa. Może to spowodować zakłócenia lokalnych obwodów neuronalnych, w tym zerwanie dendrytów i procesów wierzchołkowych. Procedura ta spowoduje również początkową aktywację komórek glejowych w regionie, chociaż oczekuje się, że zostanie ona zlokalizowana w tkance około 150 μm od powierzchni pryzmatu i ustąpi po zagojeniu się mózgu22. Bardzo ważne jest, aby rozważyć, czy ta technika wpłynie na normalną anatomię obwodu i/lub zachowanie zwierząt podczas planowania eksperymentów. Grupy kontroli behawioralnej powinny być zawsze przeprowadzane, aby upewnić się, że nie ma znaczących zmian w podstawowych zachowaniach, które mogłyby spowodować mylące wyniki eksperymentalne.

Wykorzystanie tej zminiaturyzowanej, mobilnej techniki obrazowania Ca2 + z manipulacją neurofarmakologiczną, różnymi paradygmatami poznawczymi, społecznymi, motorycznymi lub behawioralnymi oraz połączenie jej z innymi wskaźnikami fizjologicznymi może pogłębić i wzbogacić badania skoncentrowane na zrozumieniu funkcjonalnych ról obwodów nerwowych w zachowaniu i przetwarzaniu sygnałów32. Tłumienie lub aktywacja pewnych szlaków modulowanych przez leki może wpływać na powiązane zachowania, które można łatwo badać za pomocą tej technologii33. Rozgałęzianie się na różne typy komórek poprzez modyfikację ukierunkowania wskaźnika wapnia to kolejne potężne i użyteczne zastosowanie, które umożliwia wiele kreatywnych kombinacji narzędzi eksperymentalnych w celu rozwiązania różnych problemów dotyczących obwodów neuronalnych.

Oświadczenia

Autorzy zapoznali się z polityką czasopisma i mają następujące konkurencyjne interesy: SG, SO i VC są płatnymi pracownikami Inscopix.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować V. Jayaramanowi, D.S. Kimowi, L.L. Loogerowi i K. Svobodzie z projektu Genetically-Encoded Neuronal Indicator and Effector (GENIE) w Janelia Research Campus of the Howard Hughes Medical Institute za hojną darowiznę AAV1-GCaMP6f na rzecz University of Pennsylvania Vector Core. Chcieliby również podziękować A. Olsonowi i Neuroscience Microscopy Core na Uniwersytecie Stanforda, wspieranemu przez NIH NS069375 grant za ich usługi mikroskopii konfokalnej.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Neurostar Motorized
Ultra precyzyjny instrument stereotaktyczny dla małych zwierząt		KopfModel 963SDChirurgia
StereoskopLabomedPrima DNTChirurgia i obrazowanie
Mini sonda termistorowa odbytnicy (średnica .062"/1,6 mm) - 1/4" JackFHC40-90-5D-02Chirurgiczna
poduszka grzewcza 5 x 12,5 cm FHC40-90-2-07Chirurgiczny
regulator temperatury DCFHC40-90-8DChirurgiczna
pompa mikrostrzykawkowaWorld Precision InstrumentsModel UMP3; seryjny 155788 F110Chirurgia
NanoFil 10 μ L Świat strzykawekInstrumenty precyzyjneNANOFILSurgery
35 G Końcówka skośna Nanofil NDL 2PKWorld Precision InstrumentsNF35BV-2Chirurgia
Omnidrill35, 115 - 230 VWorld Precision Instruments503598Frezy chirurgiczne
do Micro DrillFine Science Tools19007-05Chirurgia
nVistaInscopix100-001048Obrazowania
AAV1. CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40Penn Vector CoreAV-1-PV3435Chirurgia
KetoprofenVictor Medical5487Chirurgia
CarprofenVictor Medical1699008 chirurgia
IsofluraneVictor Medical1001054Surgery
Gelfoam (Patterson Veterinary Supply Inc Gąbka żelpiankowa 12 cm x 7 mm)Pfizer (Fisher Scientific)NC9841478Chirurgia
Dumont #5/45 kleszczeFine Science Tools11251-35Chirurgia
Dumont #5kleszcze Fine Science Tools11251-30Chirurgia
Noże preparacyjneGrzywna Science Tools10055-12Zestaw
implantów chirurgicznych ProViewInscopix100-000756Chirurgia i obrazowanie
Sonda pryzmatyczna ProView o średnicy 1,0 mm o średnicy ~4,3 mmInscopix100-000592Chirurgia i obrazowanie
Zestaw kleju Kwik-Sil składający się z 2światowych instrumentów precyzyjnychChirurgia KWIK-SIL
Uszczelniacz Kwik-CastWorld InstrumentyprecyzyjneKWIK-CASTChirurgia i obrazowanie
Miniaturowy optyczny słupek montażowy NewportM-TSP-3Mikroskop do obrazowania
Płytka bazowaInscopixBPL-2
Osłona podstawy mikroskopuInscopixBPC-2Obrazowanie
Inscopix BPC-2

Bibliografia

  1. McConnell, S. K. Development and decision-making in the mammalian cerebral cortex. Brain Res. 472 (1), 1-23 (1988).
  2. Kwon, S. E., Yang, H., Minamisawa, G., O'Connor, D. H. Sensory and decision-related activity propagate in a cortical feedback loop during touch perception. Nat. Neurosci. 19 (9), 1243-1249 (2016).
  3. Miller, E. K., Cohen, J. D. An integrative theory of prefrontal cortex function. Annu. Rev. Neurosci. 24, 167-202 (2001).
  4. Bailey, M. R., Simpson, E. H., Balsam, P. D. Neural substrates underlying effort, time, and risk-based decision making in motivated behavior. Neurobiol. Learn. Mem. 133, 233-256 (2016).
  5. Dehaene, S., Changeux, J. P. Reward-dependent learning in neuronal networks for planning and decision making. Prog. Brain Res. 126, 217-229 (2000).
  6. Ferenczi, E. A., et al. Prefrontal cortical regulation of brainwide circuit dynamics and reward-related behavior. Science. 351 (6268), aac9698(2016).
  7. Anomal, R. F., et al. Impaired Processing in the Primary Auditory Cortex of an Animal Model of Autism. Front. Sys. Neurosci. 9, 158(2015).
  8. Pauls, D. L., Abramovitch, A., Rauch, S. L., Geller, D. A. Obsessive-compulsive disorder: an integrative genetic and neurobiological perspective. Nat. Rev. Neurosci. 15 (6), 410-424 (2014).
  9. Ziv, Y., et al. Long-term dynamics of CA1 hippocampal place codes. Nat. Neurosci. 16 (3), 264-266 (2013).
  10. Jennings, J. H., et al. Visualizing hypothalamic network dynamics for appetitive and consummatory behaviors. Cell. 160 (3), 516-527 (2015).
  11. Betley, J. N., et al. Neurons for hunger and thirst transmit a negative-valence teaching signal. Nature. 521 (7551), 180-185 (2015).
  12. Sun, C., et al. Distinct speed dependence of entorhinal island and ocean cells, including respective grid cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 112 (30), 9466-9471 (2015).
  13. Kitamura, T., et al. Entorhinal Cortical Ocean Cells Encode Specific Contexts and Drive Context-Specific Fear Memory. Neuron. 87 (6), 1317-1331 (2015).
  14. Pinto, L., Dan, Y. Cell-Type-Specific Activity in Prefrontal Cortex during Goal-Directed Behavior. Neuron. 87 (2), 437-450 (2015).
  15. Cox, J., Pinto, L., Dan, Y. Calcium imaging of sleep-wake related neuronal activity in the dorsal pons. Nat. Comm. 7, 10763(2016).
  16. Resendez, S. L., et al. Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nat. Protoc. 11 (3), 566-597 (2016).
  17. Hooks, B. M., et al. Organization of cortical and thalamic input to pyramidal neurons in mouse motor cortex. The J. Neurosci. 33 (2), 748-760 (2013).
  18. Masamizu, Y., et al. Two distinct layer-specific dynamics of cortical ensembles during learning of a motor task. Nat. Neurosci. 17 (7), 987-994 (2014).
  19. Rowland, D. C., Moser, M. -B. From cortical modules to memories. Curr. Opin. Neurobiol. 24 (1), 22-27 (2014).
  20. Ghosh, K. K., et al. Miniaturized integration of a fluorescence microscope. Nat. Methods. 8 (10), 871-878 (2011).
  21. Mukamel, E. A., Nimmerjahn, A., Schnitzer, M. J. Automated analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data. Neuron. 63 (6), 747-760 (2009).
  22. Andermann, M. L., et al. Chronic cellular imaging of entire cortical columns in awake mice using microprisms. Neuron. 80 (4), 900-913 (2013).
  23. Goldey, G. J., et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nat. Protoc. 9 (11), 2515-2538 (2014).
  24. Chia, T. H., Levene, M. J. In vivo imaging of deep cortical layers using a microprism. J. Vis. Exp. (30), (2009).
  25. Chia, T. H., Levene, M. J. Microprisms for in vivo multilayer cortical imaging. J. Neurophysiol. 102 (2), 1310-1314 (2009).
  26. Chia, T. H., Levene, M. J. Multi-layer in vivo imaging of neocortex using a microprism. Cold Spring Harb. Protoc. 2010 (8), pdb.prot5476 (2010).
  27. Low, R. J., Gu, Y., Tank, D. W. Cellular resolution optical access to brain regions in fissures: imaging medial prefrontal cortex and grid cells in entorhinal cortex. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (52), 18739-18744 (2014).
  28. Zeisel, A., et al. Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. 347 (6226), 1138-1142 (2015).
  29. Hawrylycz, M., et al. Inferring cortical function in the mouse visual system through large-scale systems neuroscience. Proc. Natl. Acad. Sci. 113 (27), 7337-7344 (2016).
  30. Petrof, I., Viaene, A. N., Sherman, S. M. Properties of the primary somatosensory cortex projection to the primary motor cortex in the mouse. J. Neurophysiol. 113 (7), 2400-2407 (2015).
  31. Aronoff, R., et al. Long-range connectivity of mouse primary somatosensory barrel cortex. Euro. J. Neurosci. 31 (12), 2221-2233 (2010).
  32. Rogan, S. C., Roth, B. L. Remote control of neuronal signaling. Pharma. Rev. 63 (2), 291-315 (2011).
  33. Berdyyeva, T., et al. Zolpidem reduces hippocampal neuronal activity in freely behaving mice: a large scale calcium imaging study with miniaturized fluorescence microscope. PloS One. 9 (11), e112068(2014).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Obrazowanie wapnia w korze m zgowejimplantacja sondy Prismkora somatosensorycznamikroskopia dwufotonowamikroskop montowany na g owiemocowanie p yty bazowejznakowanie wirusowedynamika wapnia

Powiązane artykuły