Artykuł metodologiczny

Izolacja kropelek lipidów do ilościowej analizy spektrometrii mas

10.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55585

⸱

17 kwietnia 2017

 ,  ,  , 
1Heinrich Pette Institute, Leibniz Institute for Experimental Virology, 2Core Facility Mass Spectrometric Proteomics, University Medical Center Hamburg-Eppendorf

W tym artykule

Podsumowanie

Kropelki lipidów są ważnymi organellami do replikacji kilku patogenów, w tym wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV). Opisujemy metodę izolowania kropelek lipidów do ilościowej spektrometrii mas powiązanych białek; Może być stosowany w różnych warunkach, takich jak infekcja wirusowa, stres środowiskowy lub leczenie farmakologiczne.

Streszczenie

Kropelki lipidów są niezbędne do replikacji wielu różnych patogenów, w szczególności wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV), jako przypuszczalnego miejsca morfogenezy wirionu. Ilościowa analiza proteomu kropelek lipidów może być wykorzystana do identyfikacji białek, które lokalizują się lub są przemieszczane z kropelek lipidów w warunkach takich jak infekcje wirusowe. W tym miejscu opisujemy protokół, który został z powodzeniem zastosowany do scharakteryzowania zmian w proteomie kropelkowym lipidów po zakażeniu HCV. Używamy znakowania stabilnymi izotopami za pomocą aminokwasów w hodowli komórkowej (SILAC), a tym samym znakujemy cały proteom jednej populacji komórek "ciężkimi" aminokwasami w celu ilościowego określenia białek za pomocą spektrometrii mas. W celu izolacji kropelek lipidów dwie populacje komórek (tj. zakażone HCV/"lekkie" aminokwasy i niezakażone aminokwasy kontrolne/"ciężkie") miesza się w stosunku 1:1 i poddaje lizie mechanicznej w buforze hipotonicznym. Po usunięciu jąder i resztek komórkowych za pomocą wirowania z niską prędkością, białka związane z kropelkami lipidów są wzbogacane przez dwa kolejne etapy ultrawirowania, po których następują trzy etapy płukania w buforze izotonicznym. Czystość frakcji kropelek lipidów jest analizowana za pomocą western blot z przeciwciałami rozpoznającymi różne przedziały subkomórkowe. Białka związane z kropelkami lipidów są następnie rozdzielane za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym SDS (SDS-PAGE), a następnie barwienia Coomassie. Po trawieniu tryptycznym peptydy są oznaczane ilościowo metodą chromatografii cieczowej z jonizacją elektronopryskową i tandemową spektrometrią mas (LC-ESI-MS/MS). Korzystając z tej metody, zidentyfikowaliśmy białka rekrutowane do kropelek lipidów po zakażeniu HCV, które mogą reprezentować pro- lub przeciwwirusowe czynniki gospodarza. Nasza metoda może być stosowana do wielu różnych komórek i warunków hodowli, takich jak zakażenie patogenami, stres środowiskowy lub leczenie farmakologiczne.

Wprowadzenie

Kropelki lipidów to wysoce dynamiczne cytoplazmatyczne (i jądrowe) organelle komórkowe złożone z rdzenia neutralnych lipidów (trójglicerydów (TG) i estru cholesterolu (CE)) otoczonych monowarstwą fosfolipidów z osadzonymi białkami1. Wszystkie typy komórek wytwarzają kropelki lipidów, ale różnią się one wielkością, składem lipidowym i dekoracją białka. Kropelki lipidów pełnią różne funkcje, w tym służą jako rezerwuary prekursorów energii i błon lub jako depozyty białkowe. Ponadto, poprzez wychwyt lipidów, chronią komórki przed lipotoksycznością, uwalniają lipidy jako cząsteczki sygnałowe i biorą udział w degradacji białek i reakcjach na stres retikulum endoplazmatycznego (ER)2. W związku z tym wiele białek wiąże się z kropelkami lipidów i zarządza ich generowaniem, degradacją, transportem i interakcją z innymi organellami. Wśród nich znajduje się rodzina perylipiny białek wiążących kropelki lipidów w dobrej wierze (PLIN1-5)3.

Biogeneza kropelek lipidów prawdopodobnie zaczyna się w ER, gdzie enzymy rezydujące w ER katalizują syntezę neutralnych lipidów, które gromadzą się w dwuwarstwie błony, tworząc soczewkę neutralnych lipidów, proces, który został niedawno ładnie zwizualizowany w drożdżach4. Uważa się, że zginanie błony i podwyższony poziom kwasu fosfatydowego i diacyloglicerolu przyciągają białka biorące udział w biosyntezie fosfolipidów, ponieważ jednoczesna synteza neutralnych lipidów rdzeniowych i fosfolipidów ekranujących jest wymagana do wytwarzania kropelek lipidów5. Enzymy zawierające domeny transbłonowe, które znajdują się w ER, katalizują ten proces. Ekspansja do dużych kropelek lipidów wymaga aktywności innej klasy enzymów syntetyzujących lipidy, które zawierają amfipatyczną helisę i mogą w ten sposób przemieszczać się z ER do kropelek lipidów. Mobilizacja lipidów z kropelek lipidów zachodzi poprzez lokalną aktywację lipaz triglicerydowych i diacylogliceryjskich, tłuszczowej lipazy trójglicerydowej (ATGL) i lipazy hormonowrażliwej (HSL) lub przez różne szlaki autofagiczne, takie jak makro- i mikrolipofagia lub autofagia za pośrednictwem chaperonu6. Kropelki lipidów oddziałują z innymi organellami komórkowymi, takimi jak mitochondria (do beta-oksydacji i syntezy lipidów) i ER (do syntezy lipidów i transportu białek), ale także z lizosomami, endosomami i wakuolami indukowanymi przez bakterie wewnątrzkomórkowe7. Rzeczywiście, bakterie, wirusy, a nawet pasożyty atakują kropelki lipidów w celu replikacji i trwałości, wśród nich HCV8.

Zakażenie HCV jest jedną z głównych przyczyn zachorowalności i śmiertelności związanej z wątrobą na całym świecie, odpowiadając za około 0,5 miliona zgonów rocznie9. Prawdziwa liczba zakażeń HCV nie jest znana, ale ostatnie szacunki sugerują, że 130 - 150 milionów ludzi jest przewlekle zakażonych. Nie ma szczepionki, ale niedawno zatwierdzone leki przeciwwirusowe o bezpośrednim działaniu znacznie zwiększają odpowiedź terapeutyczną w porównaniu ze standardową terapią opartą na interferonie. Jednak na całym świecie leczenie pacjentów będzie prawdopodobnie ograniczone ze względu na niezwykle wysokie koszty nowych terapii. U około połowy wszystkich osób przewlekle zakażonych HCV rozwija się stłuszczenie wątroby (stłuszczenie), stan charakteryzujący się nadmiernym gromadzeniem się kropelek lipidów w hepatocytach. Co ciekawe, kropelki lipidów okazały się również ważnymi organellami komórkowymi do replikacji HCV, przypuszczalnie służąc jako miejsca składania wirusów10,11.

W komórkach zakażonych HCV, rdzeń białka wirusa i NS5A lokalizują się w kropelkach lipidów w procesie, który zależy od biosyntezy trójglicerydów, ponieważ inhibitory acylotransferazy diacyloglicerolu-1 (DGAT1) upośledzają transport do kropelek lipidów i późniejszą produkcję cząsteczek HCV12,13,14,15. Ponadto mutacje w domenach wiążących kropelki lipidów zarówno rdzenia, jak i NS5A hamują montaż HCV16,17. Core i NS5A następnie rekrutują wszystkie inne białka wirusowe, a także wirusowe kompleksy replikacyjne RNA, do błon ściśle związanych z kropelkami lipidów16. Do pomyślnego wytworzenia zakaźnego potomstwa wirusa wymagane jest skoordynowane działanie wszystkich białek wirusowych10,11. Białka strukturalne są częścią wirionów, a białka niestrukturalne promują interakcje białko-białko wymagane w tym procesie. Co ciekawe, prawdziwe białko wiążące kropelki lipidów PLIN3/TIP47 jest wymagane zarówno do replikacji RNA HCV, jak i uwalniania wirionów18,19,20. Pomimo tych ostatnich postępów, szczegóły mechanistyczne, zwłaszcza interakcje wirus-gospodarz w późnych stadiach replikacji HCV, pozostają słabo zdefiniowane, a dokładna funkcja kropelek lipidów jest nieznana.

Tutaj opisujemy metodę izolowania kropelek lipidów do ilościowej spektrometrii mas powiązanych białek. Korzystając z tej metody, znaleźliśmy głębokie zmiany w proteomie kropelek lipidów podczas infekcji HCV i zidentyfikowaliśmy anektynę A3 jako białko gospodarza, które współfrakcjonuje z kropelkami lipidów i jest wymagane do efektywnego dojrzewania HCV21.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie pożywki do znakowania stabilnych izotopów aminokwasami w hodowli komórkowej (SILAC)

UWAGA: Tutaj, do znakowania SILAC użyto zestawu do oznaczania SILAC Protein Quantitation Kit - DMEM uzupełnionego o 50 mg 13C6 L-arginina-HCl. Dializowana płodowa surowica cielęca (FCS) jest dostarczana z zestawem do oznaczania ilościowego białka SILAC.

  1. Usunąć 50 ml z każdej butelki pożywki DMEM i dodać 50 ml dializowanego FCS.
  2. Rozpuścić 50 mg 13C6 L-lizyny-2HCl i 50 mg 13C6 L-argininy-HCl w 1 ml pożywki. Dokładnie wymieszaj i dodaj aminokwasy do pożywki DMEM + FCS.
  3. Dodaj 1x Pen/Strep i 1x substytut L-glutaminy. Przefiltruj pożywkę w sterylny sposób za pomocą filtra 0,45 μm. Oznacz butelkę jako "ciężkie" podłoże SILAC.
  4. Aby przygotować "lekką" pożywkę, powtórz kroki 1,1 - 1,3 używając 50 mg L-Argininy-HCl i 50 mg L-Lizyny-2HCl. Oznacz butelkę jako "lekkie" podłoże SILAC.

2. Znakowanie SILAC i kontrola inkorporacji aminokwasów

  1. Trypsynizuj komórki (1x Trypsin-EDTA) i podziel 1 x 105 komórek Huh7.5 na 2 dołki 6-dołkowej płytki hodowlanej zawierającej 2 ml pożywki, jedną studzienkę z "ciężką" pożywką SILAC i jedną z "lekką" pożywką SILAC.
  2. Hoduj komórki przez co najmniej 6 pasaży (stosunek podziału: 1:6); po 6 pasażach włączenie "ciężkich" aminokwasów powinno wynosić ponad 95%.
  3. Zbierz 1 x 106 komórek z populacji komórek znakowanych "ciężkimi" i "lekkimi", aby przeanalizować skuteczność inkorporacji. Umyć komórki w 1x PBS i granulować komórki przez odwirowanie przez 5 minut w temperaturze 160 x g i 4 °C.
  4. Zawiesić osady komórkowe w 150 μl buforu MS (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7,4 i 1 mM EDTA uzupełnione 1x koktajlem inhibitorów proteazy) i inkubować komórki na lodzie przez 30 minut. Lizować komórki przez sonikację w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Poniżej przedstawiono używane tutaj ustawienia sonikacji: timer, hold; sterowanie wyjściem, 8; cykl pracy, 80%; i 2 x 30 impulsów.
  5. Usunąć resztki komórek przez odwirowanie przez 10 minut w temperaturze 11 000 x g i temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant do nowej probówki i oznaczyć stężenie białka za pomocą testu białkowego kompatybilnego z detergentem.
  6. Wymieszać 75 μg białka z 6 razy buforem próbki (375 mM Tris-HCl, pH 6,8, 25,8% glicerolu, 123 mg/ml SDS, 600 μg/ml błękitu bromofenolowego i 60 μl/ml β-merkaptoetanolu), gotować w temperaturze 95 °C przez 5 minut i oddzielić białka za pomocą SDS-PAGE w buforze do pracy SDS (3,02 g/L zasady Tris, 18,8 g/l glicyny i 1 g/l SDS) przy napięciu 180 V przez około 1 godzinę lub zgodnie z instrukcjami producenta.
  7. Przenieś żel do koloidalnego roztworu barwiącego Coomassie. Wyciąć ten sam pasek białka z każdego pasa. Trawić białka za pomocą trypsyny i analizować skuteczność inkorporacji za pomocą analizy MS, zgodnie z opisem22.

3. Izolacja kropelek lipidów komórek Huh7.5 znakowanych SILAC

  1. Zainfekuj jedną populację komórek (tj. te znakowane "lekkimi" aminokwasami) wirusem reporterowym HCV poprzez inkubację z zapasami wirusów (np. Jc1NS5AB-mKO2-BSD, MOI 1) przez 4 godziny w temperaturze 37 °C, zgodnie z opisem21.
    UWAGA: Jc1NS5AB-mKO2-BSD jest wirusem HCV przenoszącym reporter fluorescencyjny (monomeryczny Kusabira Orange 2, mKO2) do monitorowania wskaźników infekcji, po których następuje gen oporności na blastydynę (BSD) między zduplikowanym miejscem cięcia NS5A-NS5B, opisanym wcześniej21,23. Praca z HCV wymaga przestrzegania zasad i praktyk bezpieczeństwa biologicznego BSL2+ (USA) lub S3** (Niemcy). Zamiast zakażenia HCV, komórki mogą być zakażone różnymi patogenami.
  2. Rozszerzaj "lekkie" komórki zakażone HCV i niezakażone "ciężkie" komórki. Podczas pasażowania kultur należy ustalić podwielokrotność z 4% paraformaldehydem (PFA) w PBS i określić szybkość infekcji HCV za pomocą cytometrii przepływowej białka markera fluorescencyjnego (np. mKO2), zgodnie z opisem21; Wskaźniki infekcji powinny być wyższe niż 90% w przypadku izolacji kropelek lipidów. UWAGA: W przypadku stosowania szczepu HCV Jc1NS5AB-mKO2-BSD, dodaj 10 μg/ml blasticydyny S do "lekkiej" pożywki, aby wybrać komórki HCV-dodatnie.
  3. 1 dzień przed izolacją kropelek lipidów, przemyć komórki PBS, trypsynizować, ponownie zawiesić w "lekkim" i "ciężkim" podłożu i policzyć komórki za pomocą komory liczącej Neubauera. Wysiew 7 x 106 komórek z każdej populacji w naczyniu do hodowli2 komórek o długości 150 cm. Przygotuj co najmniej 5 potraw na "lekką" i "ciężką" populację komórek. Hodować komórki w 30 ml pożywki/szalki O/N.
  4. Usuń pożywkę i umyj komórki w 1x PBS. Odłącz komórki w 1x PBS za pomocą skrobaka do komórek.
  5. Policz obie populacje komórek za pomocą komory liczącej Neubauera i zbierz równą liczbę komórek w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Granulować komórki przez odwirowywanie przez 5 minut w temperaturze 160 x g i temperaturze 4 °C.
  6. Usunąć PBS i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml buforu sacharozy (0,25 M sacharozy, 1 mM EDTA i 1 mM DTT, uzupełnione koktajlem inhibitorów proteazy). Przenieś zawiesinę komórek do ciasno dopasowanego homogenizatora Dounce i poddaj komórki lizie za pomocą 200 uderzeń na lodzie.
    UWAGA: Potwierdź całkowitą lizę komórek za pomocą barwienia błękitem trypanowym.
  7. Przenieść lizat do probówki do mikrofug o pojemności 1,5 ml i wirować jądra i resztki komórek przez 10 minut w temperaturze 1 000 x g i 4 °C.
  8. Po odwirowaniu przechowywać podwielokrotność 25 μl frakcji pojądrowej (PNS) w temperaturze -20 °C jako kontrolę wejściową.
  9. Umieścić pozostałą część frakcji PNS na dnie probówki wirówkowej (11 x 60 mm) i nałożyć na bufor do przemywania kropelkami lipidów (~3 ml; łącznie 4 ml) (50 mM bufor fosforanu potasu o pH 7,4, 100 mM chlorek potasu, 1 mM EDTA i 1 mM fluorek fenylometanosulfonylu).
  10. Wirować przez 2 godziny w temperaturze 100 000 x g i temperaturze 4 °C. Zebrać pływającą frakcję kropelek lipidów za pomocą wygiętej, kaniuli od góry probówki (około 250 - 500 μl, w zależności od ilości kropelek lipidów). Umieścić frakcję kropelek lipidów w probówce wirówkowej (11 x 60 mm), nałożyć na nią bufor do przemywania kropelkami lipidów (~3,5 ml; łącznie 4 ml) i powtórzyć etap wirowania.
  11. Zbierz unoszącą się frakcję kropelek lipidów za pomocą wygiętej, kaniuli z górnej części probówki i przenieś kropelki lipidów do nowej probówki do mikrofugi o pojemności 1,5 ml. Dodać 500 μl buforu do przemywania kropelkami lipidów i wirować przez 20 minut w temperaturze 21 000 x g i temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Kropelki lipidów pojawiają się jako biały pasek unoszący się na górze bufora.
  12. Usuń subjacent wash buffer za pomocą żelowej końcówki pipety i powtórz ten krok mycia trzy razy.
  13. Po ostatecznym usunięciu buforu płuczącego za pomocą żelowej końcówki pipety należy zmieszać 5 μL frakcji kropelkowych lipidów z 10 μL buforu do lizy NP-40 (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl i 1% NP-40, uzupełnione koktajlem inhibitorów proteazy). Próbkę należy inkubować na lodzie przez 1 godzinę w celu dezaktywacji wirusa w przypadku pracy z materiałem zakaźnym. Określić poziom białka za pomocą testu białkowego kompatybilnego z detergentem; do analizy MS potrzebne jest co najmniej 35 μg białka.
  14. Frakcje kropelek lipidów przechowywać w temperaturze -20 °C.
  15. Wymieszaj odpowiednią objętość frakcji kropelek lipidów z 4x barwnikiem ładującym. Inkubować na lodzie przez 1 godzinę w celu dezaktywacji wirusa w przypadku pracy z materiałem zakaźnym. Gotować w temperaturze 95 °C przez 5 minut.
  16. Oddziel białka za pomocą SDS-PAGE zgodnie z protokołem producenta. Przenieś żel do koloidalnego roztworu barwiącego Coomassie. Wyciąć wszystkie prążki białkowe z żelu. Po tryptycznym roztrawieniu w żelu24, odparuj próbki i rozpuść je w 0,1% kwasie mrówkowym. Analiza przez LC-MS/MS.
    UWAGA: W tym przypadku analizy LC-MS/MS przeprowadzono na kwadrupolowym spektrometrze masowym czasu przelotu (Q-TOF) lub na orbitalnym spektrometrze masowym z liniową pułapką kwadrupolową (LTQ). Oba instrumenty zostały sprzężone ze źródłem ESI do systemu nano-UPLC. Analizy danych i analizy LC-MS/MS na Q-TOF i na spektrometrze masowym orbitrap przeprowadzono zgodnie z opisem21,22. Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie zanieczyścić próbki ludzką keratyną. Zawsze używaj końcówek i probówek do pipet bez keratyny. Przygotuj pod okapem z przepływem laminarnym z chemikaliami niezawierającymi keratyny. Przed użyciem wyczyść wszystkie powierzchnie i urządzenia wodą destylowaną i etanolem. Zawsze noś rękawice i fartuch laboratoryjny.

4. Analiza czystości kropelek lipidów

  1. Rozcieńczyć podwielokrotności frakcji kropelek lipidów w stosunku 1:2 i frakcji wejściowych (patrz krok 3.9) w stosunku 1:10 za pomocą buforu do lizy NP-40. Próbki należy inkubować na lodzie przez 1 godzinę w celu dezaktywacji wirusa w przypadku pracy z materiałem zakaźnym. Określ poziom białka za pomocą testu białkowego kompatybilnego z detergentem.
  2. Wymieszać równe ilości białka z 6-krotnym buforem próbki i inkubować próbki na lodzie przez 1 godzinę w celu dezaktywacji wirusa w przypadku pracy z materiałem zakaźnym. Postępuj z SDS-PAGE i przenieś białka na membranę nitrocelulozową poprzez osuszanie w zbiorniku pod napięciem 80 V przez 90 min.
    UWAGA: Po zablokowaniu błony w buforze blokującym (5% beztłuszczowego mleka w proszku w TBS-T (10 mM Tris-HCl pH 7,6, 150 mM NaCl i 0,05% Tween20)), inkubuj z przeciwciałami skierowanymi przeciwko markerom kropelek lipidów (np. PLIN1, PLIN2 lub PLIN3) i markerom innych przedziałów subkomórkowych (np. CALR, MnSOD lub tubulina), a następnie wtórnymi przeciwciałami sprzężonymi z HRP. Użyj chemiluminescencji do wykrywania białek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Kropelki lipidowe są kluczowe dla infekcji HCV jako domniemane miejsca montażu wirionów, jednak molekularne mechanizmy morfogenezy i uwalniania wirionów pozostają w dużej mierze nieznane. Aby zidentyfikować nowe czynniki zależne od gospodarza uczestniczące w tym procesie, przeprowadziliśmy ilościową analizę proteomu kropelek lipidowych w komórkach zainfekowanych HCV21 (Rycina 1A). Opracowaliśmy protokół oczyszczania kropelek lipidowych, w którym ru...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu opisujemy protokół izolowania kropelek lipidów do ilościowej analizy proteomu kropelek lipidów w celu porównania wzbogacania i zubożania białek związanych z kropelkami lipidów w różnych warunkach hodowli, takich jak infekcje wirusowe. Alternatywną metodą jest analiza proteomu z bezznacznikowymi kwantyfikacjami opartymi na całkowitych intensywnościach pików. Ta metoda nie ma ograniczenia zakresu dynamicznego i pozwala uniknąć problemów metabolicznych. Zaletą podejścia SILAC jest to, że próbki są łączone prze...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy R. Bartenschlagerowi (Uniwersytet w Heidelbergu) za konstrukty Jc1, C.M. Rice (Uniwersytet Rockefellera) za komórki Huh7.5, J. McLauchlanowi (Medical Research Council Virology Unit) za konstrukt JFH1, T. Wakita (National Institute of Infectious Diseases, Japonia) za JFH1, oraz B. Websterowi i W.C. Greene'owi (Gladstone Institute of Virology and Immunology) za konstrukcje reporterowe HCVcc. Prace te były wspierane przez fundusze DFG (HE 6889/2-1 (EH), INST 337/15-1 2013 i INST 337/16-1 2013 (HS)). Instytut Heinricha Pettego, Instytut Wirusologii Eksperymentalnej im. Leibniza jest wspierany przez Wolne i Hanzeatyckie Miasto Hamburg oraz Federalne Ministerstwo Zdrowia. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zestaw do oznaczania ilościowego białka SILAC - DMEMThermo Fisher89983 
13C6 L-arginina-HCl 50  mgThermo Fisher88210
Roti-Load 1Roth GmbHK929.1
Roti-Blue 5x KoncentratRoth GmbHA152.2 
10x SDS-Tris-Glycine - BuforGeyer Th. GmbH & Co.KG A1415,0250 
GlutaMAX (100x)Life Technologies GmbH 350500038 
Roztwór penicyliny/streptomycyny do hodowli komórkowychSigma-Aldrich Chemie GmbH P4333-100ml 
DPBS 1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami firmy DulbeccoSigma-Aldrich Chemie GmbH D8537 
Trypsin-EDTASigma-Aldrich Chemie GmbH T3924-100ML 
Chlorek sodu BioChemicaAppliChem GmbHA1149,1000
Tris Ultrapure   AppliChem GmbHA1086,5000A 
EDTA BioChemicaAppliChem GmbHA1103,0250
Koktajl inhibitorów proteazy 5 mlSigma-Aldrich Chemie GmbH P8340-5ML 
D(+)-sacharoza BioChemicaAppliChem GmbHA3935,1000
Kwas solny (HCl) o czystości 37% Ph. Eur., NFAppliChem GmbHA0625
Test białka DC Bio-Rad Laboratoris GmbH 500-0116 
GlycerolAppliChem GmbH151339
SDS UltrapureAppliChem GmbHA1112
Błękit bromofenolowyAppliChem GmbHA2331
β-Merkaptoetanol AppliChem GmbHA4338
BlasticidinInvivogenant-bl-1 
Chlorek potasu AppliChem GmbHA1039
Fluorek fenylometanosulfonylu AppliChem GmbHA0999
Fosforan potasu MonobasicSigma-Aldrich Chemie GmbH 
Wodorofosforan dipotasuSigma-Aldrich Chemie GmbH P3786 
Naziemna telewizja cyfrowa AppliChem GmbHA2948
NP-40AppliChemA1694
TWEEN 20AppliChemA4974
Beztłuszczowe mleko w proszku w proszkuAppliChemA0830
Anti-ADFP/ ADRP abcamab52355
M6PRB1/TIP47 100 & mikro; gabcamab47639
Kalretykulina, pAb 200 i mikro; gEnzo Life Science GmbH ADI-SPA-600-F 
Anty-β-tubulina Sigma-Aldrich Chemie GmbH T6074 200&mikro; l  
Etanol absolutny (EtOH)Geyer Th. GmbH & Co.KG A3678,0250  
Anty-MnSODEnzo Life Science GmbH ADI-SOD-110-F
Przeciw myszom HRPThermo Fisher Pierce32430
Przeciw królikomHRP Thermo Fisher  Pierce32460
Amersham Hyperfilm ECLGE Healthcare28906836
Lumi-Light Western Blotting SubstrateSigma-Aldrich Chemie GmbH 
96-dołkowa płytka do hodowli komórkowejGreiner Bio-One GmbH 655 180 
Strzykawka Terumo 1 mlTerumoSS-01T
Filtropur BT 50, 500 mL, 0,45 &mikro; m SARSTEDT 83.1823.100 
Żele prefabrykowane Mini-PROTEAN TGX, dowolny żel rozdzielczy kDBio-Rad Laboratoris GmbH tel. 456-9034 
6-dołkowa płytka do hodowli komórkowejGreiner Bio-One GmbH 657160 
Naczynia Nunclon 150/20 Fisher Scientific GmbH 10098720 - 168381 
Skrobak do komórekneoLab Migge GmbH C-8120 
Probówka, 50 mlGreiner Bio-One GmbH 227261 
Rurka SafeSeal bez RNaz SARSTEDT 72.706.400 
Probówki wirówkowe Ultra Clear 11 x 60 mmBeckman Coulter GmbH 344062 
Igły ssąceTranscodent6482
Biosphere Fil. Napiwek 1000 SARSTEDT 70.762.211 
Biosfera Fil. Wskazówka 200SARSTEDT 70.760.211 
Biosfera Fil. Wskazówka 10SARSTEDT 70.1130.210 
Młynek do tkanek DounceFisher Scientific GmbH 
Tłuczki do całoszklanych młynków do tkanek DounceFisher Scientific GmbH 
Orbitrap Fusion
Branson Sonifier 450
Thermomixer comfort, z Thermoblock 1,5 mlEppendorf5355  000.127
Mini-PROTEAN Tetra Cell, moduł Mini Trans-Blot i zasilacz PowerPac Basic, BioRad165-8033
Mini-PROTEAN 3 Komora odlewniczaBioRad165-4110
Zasilacz PowerPac HC WirówkaBiorad164-5052
 Eppendorf5424R
Wirówka Eppendorf5424
Optima L-90KBeckman Coulter GmbH 365670
SW 60 Ti RotorBeckman Coulter GmbH 
Nieskończony M1000 PROTecan
221309120151960011188372210389444335649

Bibliografia

  1. Thiam, A. R., Farese, R. V. Jr, Walther, T. C. The biophysics and cell biology of lipid droplets. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (12), 775-786 (2013).
  2. Welte, M. A. Expanding roles for lipid droplets. Curr Biol. 25 (11), R470-R481 (2015).
  3. Brasaemle, D. L. Thematic review series: adipocyte biology. The perilipin family of structural lipid droplet proteins: stabilization of lipid droplets and control of lipolysis. J Lipid Res. 48 (12), 2547-2559 (2007).
  4. Choudhary, V., Ojha, N., Golden, A., Prinz, W. A. A conserved family of proteins facilitates nascent lipid droplet budding from the ER. J Cell Biol. 211 (2), 261-271 (2015).
  5. Kory, N., Farese, R. V. Jr, Walther, T. C. Targeting Fat: Mechanisms of Protein Localization to Lipid Droplets. Trends Cell Biol. 26 (7), 535-546 (2016).
  6. Hashemi, H. F., Goodman, J. M. The life cycle of lipid droplets. Curr Opin Cell Biol. 33, 119-124 (2015).
  7. Gao, Q., Goodman, J. M. The lipid droplet-a well-connected organelle. Front Cell Dev Biol. 3, 49(2015).
  8. Herker, E., Ott, M. Emerging role of lipid droplets in host/pathogen interactions. J Biol Chem. 287 (4), 2280-2287 (2012).
  9. Wedemeyer, H., Dore, G. J., Ward, J. W. Estimates on HCV disease burden worldwide - filling the gaps. J Viral Hepat. 22 Suppl 1, 1-5 (2015).
  10. Paul, D., Madan, V., Bartenschlager, R. Hepatitis C virus RNA replication and assembly: living on the fat of the land. Cell Host Microbe. 16 (5), 569-579 (2014).
  11. Lindenbach, B. D., Rice, C. M. The ins and outs of hepatitis C virus entry and assembly. Nat Rev Microbiol. 11 (10), 688-700 (2013).
  12. Barba, G., et al. Hepatitis C virus core protein shows a cytoplasmic localization and associates to cellular lipid storage droplets. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (4), 1200-1205 (1997).
  13. Shi, S. T., et al. Hepatitis C virus NS5A colocalizes with the core protein on lipid droplets and interacts with apolipoproteins. Virology. 292 (2), 198-210 (2002).
  14. Herker, E., et al. Efficient hepatitis C virus particle formation requires diacylglycerol acyltransferase-1. Nat Med. 16 (11), 1295-1298 (2010).
  15. Camus, G., et al. Diacylglycerol acyltransferase-1 localizes hepatitis C virus NS5A protein to lipid droplets and enhances NS5A interaction with the viral capsid core. J Biol Chem. 288 (14), 9915-9923 (2013).
  16. Miyanari, Y., et al. The lipid droplet is an important organelle for hepatitis C virus production. Nat Cell Biol. 9 (9), 1089-1097 (2007).
  17. Boulant, S., Targett-Adams, P., McLauchlan, J. Disrupting the association of hepatitis C virus core protein with lipid droplets correlates with a loss in production of infectious virus. J Gen Virol. 88 (Pt 8), 2204-2213 (2007).
  18. Vogt, D. A., et al. Lipid droplet-binding protein TIP47 regulates hepatitis C Virus RNA replication through interaction with the viral NS5A protein. PLoS Pathog. 9 (4), e1003302(2013).
  19. Ploen, D., et al. TIP47 plays a crucial role in the life cycle of hepatitis C virus. J Hepatol. 58 (6), 1081-1088 (2013).
  20. Ploen, D., et al. TIP47 is associated with the hepatitis C virus and its interaction with Rab9 is required for release of viral particles. Eur J Cell Biol. 92 (12), 374-382 (2013).
  21. Rosch, K., et al. Quantitative Lipid Droplet Proteome Analysis Identifies Annexin A3 as a Cofactor for HCV Particle Production. Cell Rep. 16 (12), 3219-3231 (2016).
  22. Kwiatkowski, M., et al. Ultrafast extraction of proteins from tissues using desorption by impulsive vibrational excitation. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (1), 285-288 (2015).
  23. Webster, B., Ott, M., Greene, W. C. Evasion of superinfection exclusion and elimination of primary viral RNA by an adapted strain of hepatitis C virus. J Virol. 87 (24), 13354-13369 (2013).
  24. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nat Protoc. 1 (6), 2856-2860 (2006).
  25. Ting, L., et al. Normalization and statistical analysis of quantitative proteomics data generated by metabolic labeling. Mol Cell Proteomics. 8 (10), 2227-2242 (2009).
  26. Brasaemle, D. L., Dolios, G., Shapiro, L., Wang, R. Proteomic analysis of proteins associated with lipid droplets of basal and lipolytically stimulated 3T3-L1 adipocytes. J Biol Chem. 279 (45), 46835-46842 (2004).
  27. Tingting, P., Caiyun, F., Zhigang, Y., Pengyuan, Y., Zhenghong, Y. Subproteomic analysis of the cellular proteins associated with the 3' untranslated region of the hepatitis C virus genome in human liver cells. Biochem Biophys Res Commun. 347 (3), 683-691 (2006).
  28. Ariumi, Y., et al. DDX3 DEAD-box RNA helicase is required for hepatitis C virus RNA replication. J Virol. 81 (24), 13922-13926 (2007).
  29. Weinlich, S., et al. IGF2BP1 enhances HCV IRES-mediated translation initiation via the 3'UTR. RNA. 15 (8), 1528-1542 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Znakowanie SILACetapy ultrawirowaniaanaliza Western blotrozdzia SDS PAGEilo ciowe oznaczanie LC ESI MS MSmodel zaka enia HCVmarkery perilipinyoznaczenie st enia bia ka

Powiązane artykuły