Ten protokół pokazuje, jak konsekwentnie wycinać wypławki oczu (panewki wzrokowe) bez naruszania otaczających tkanek. Za pomocą igły insulinowej i strzykawki można dokonać ablacji jednego lub obu oczu, aby ułatwić badania nad mechanizmami regulującymi regenerację oczu, ewolucją regeneracji wzroku i neuronalnymi podstawami zachowań wywołanych światłem.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Test ablacji chirurgicznej do badania regeneracji oka u wypławków
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
W badaniach nad dorosłymi komórkami macierzystymi i mechanizmami regeneracyjnymi, płazińce płaskie są podstawowym systemem modelowym in vivo. Wynika to w dużej mierze z ich obfitej populacji pluripotencjalnych komórek macierzystych i zdolności do regeneracji wszystkich typów komórek i tkanek po urazach, które byłyby katastrofalne dla większości zwierząt. W ostatnim czasie wypławki zyskały popularność jako model do regeneracji oczu. Ich zdolność do regeneracji całego oka (składającego się z dwóch typów tkanek: komórek barwnikowych i fotoreceptorów) pozwala na rozebranie mechanizmów regulujących regenerację układu wzrokowego. Ablacja oka ma kilka zalet w porównaniu z innymi technikami (takimi jak dekapitacja lub dziurkowanie) do badania ścieżek i mechanizmów specyficznych dla oka, z których najważniejszą jest to, że regeneracja jest w dużej mierze ograniczona do samych tkanek oka. Celem tego artykułu wideo jest pokazanie, jak niezawodnie usunąć wypławkową miseczkę nerwu wzrokowego bez naruszania mózgu lub otaczających tkanek. Opisano również postępowanie z robakami i utrzymanie założonej kolonii. Technika ta wykorzystuje igłę insulinową o gramaturze 31 G, 5/16 cala do chirurgicznego nabierania miseczki optycznej wypławków unieruchomionych na zimnej płytce. Metoda ta obejmuje zarówno ablację pojedynczego, jak i podwójnego oka, przy czym oczy regenerują się w ciągu 1-2 tygodni, co pozwala na szeroki zakres zastosowań. W szczególności tę technikę ablacji można łatwo połączyć z farmakologicznymi i genetycznymi (interferencja RNA) badaniami przesiewowymi w celu lepszego zrozumienia mechanizmów regeneracyjnych i ich ewolucji, komórek macierzystych oka i ich utrzymania oraz fototaktycznych reakcji behawioralnych i ich podstaw neurologicznych.
Wprowadzenie
Planarianie są potężnym organizmem modelowym do badania regeneracji za pośrednictwem dorosłych komórek macierzystych. Te niepasożytnicze płazińce słodkowodne posiadają zdolność do regeneracji wszelkich brakujących tkanek, w tym ośrodkowego układu nerwowego i mózgu1. Badane już w 1700 roku2, postęp technologiczny w dziedzinie wypławków w ciągu ostatnich 10-15 lat (taki jak sekwencjonowany genom, hybrydyzacja in situ, immunohistochemia, interferencja RNA (RNAi) i transkryptomika) zaktualizowały ten historyczny organizm modelowy. W szczególności wypławki zyskały ostatnio popularność jako wyłaniający się model do badań nad wzrokiem3.
Planarianie mają prototypowe oczy z tylko dwoma typami tkanek, neuronami fotoreceptorowymi i komórkami pigmentowymi; umożliwiło to scharakteryzowanie populacji komórek macierzystych oka i pokazało, że wiele z tych samych genów regulujących rozwój oczu kręgowców jest zachowanych u wypławków4,5. Miseczki wzrokowe są zlokalizowane grzbietowo i składają się z białych, niepigmentowanych dendrytów neuronów fotoreceptorowych i półksiężycowych czarnych komórek pigmentowych, a oczy unerwiają mózg poprzez skrzyżowanie wzrokowe. Oprócz tego, że jest modelem do wyjaśniania procesów regeneracyjnych6, oko wypławkowe doskonale nadaje się do badania ewolucji mechanizmów wzrokowych7, reakcji behawioralnych na światło (wypławki wykazują ujemne fototaksje)8, oraz neurologicznych podstaw zachowania9.
Regeneracja oczu u wypławków była szeroko badana w dwóch głównych kontekstach: jako część regeneracji głowy po dekapitacji4,10, oraz po wycięciu samych tkanek oka11,12. Większość badań wypławkowych dotyczących regeneracji oczu wykorzystywała metodę dekapitacji, ponieważ jest ona prosta i nieskomplikowana. Do tej pory najpowszechniejszą metodą wycinania wypławki oka było przebijanie dziurki za pomocą cienkiej szklanej rurki kapilarnej13,14, chociaż niektóre badania wykonywały również amputacje tuż za oczami (częściowa dekapitacja)15. Jednak wszystkie te metody wiążą się z utratą wielu tkanek innych niż tylko oko (takich jak mózg, jelita i nerwy), co potencjalnie komplikuje interpretację wyników. Przedstawiony tutaj protokół ablacji oka ogranicza wycięcie do tkanek oka (w szczególności z wyłączeniem mózgu), w wyniku czego dane są bardziej specyficzne dla oka. Dodatkowo, w przeciwieństwie do robaków pozbawionych głów, które potrzebują 7-14 dni, aby rozpocząć żerowanie, robaki z ablacją oczu będą żywić się w ciągu 24 godzin od ablacji12, co pozwala na jednoczesne przeprowadzanie eksperymentów z RNAi (w których RNAi jest dostarczane z pożywieniem).
Chociaż ablacja oczu jest technicznie trudniejsza do skutecznego przeprowadzenia niż dekapitacja, obecne badania dotyczące wycinania oczu nie zawierają szczegółowych instrukcji dotyczących ich procedur. Celem tego artykułu wideo jest umożliwienie naukowcom konsekwentnego usuwania wypławki nerwu wzrokowego bez naruszania leżących pod spodem tkanek mózgowych i usuwania jak najmniejszej liczby innych tkanek. Metoda ta może być stosowana zarówno do ablacji pojedynczego, jak i podwójnego oka i ma zastosowanie w szerokim zakresie badań. Podobnie jak większość testów regeneracji, ablacja oka dobrze nadaje się do łączenia zarówno z badaniami farmakologicznymi, jak i genetycznymi (RNAi), a także badaniami behawioralnymi. Tutaj opisujemy metody obchodzenia się z robakami, utrzymywania kolonii wypławków oraz samej techniki ablacji oczu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Hodowla zwierząt i obchodzenie się z nimi
UWAGA: Ten protokół wykorzystuje Schmidtea mediterranea, diploidalny gatunek wypławkowy o zsekwencjonowanym genomie16,17, który jest powszechnie używany do badań nad regeneracją. Jednak test jest równie skuteczny w przypadku innych gatunków, takich jak Girardia tigrina i Girardia dorotocephala (które są dostępne w handlu).
- Utrzymuj robaki w "wodzie robaka" wykonanej z 0,5 g/l soli morskich w ultraczystej (lub przefiltrowanej dejonizowanej) wodzie. Używaj sterylnych pojemników polipropylenowych lub szklanych do przechowywania wody z robaków. Zobacz Plik uzupełniający 1, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat przygotowania wody z robaków.
UWAGA: Nigdy nie używaj mydła do czyszczenia pojemników (lub innych materiałów), ponieważ mydło jest toksyczne dla robaków; Zamiast tego przetrzyj 70% etanolem i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.- Podczas pracy z planariami należy nosić rękawice, aby chronić je przed zanieczyszczeniem.
UWAGA: Robaki są bardzo wrażliwe na toksyny środowiskowe i chemikalia, w tym mydło, wybielacz, szampon, odżywkę i balsam do rąk.
- Podczas pracy z planariami należy nosić rękawice, aby chronić je przed zanieczyszczeniem.
- Trzymaj kolonie w polipropylenowych pojemnikach na żywność, z częściowo otwartą pokrywą w celu wymiany powietrza w temperaturze ~20 °C (temperatura pokojowa). Przechowuj eksperymentalne robaki na szalkach Petriego (20 robaków na 100 mm szalkach) lub na płytkach do hodowli tkankowych niepoddanych działaniu substancji (1 robak na studzienkę, dla płytek 12-dołkowych). Aby zmniejszyć stres, trzymaj zarówno kolonie, jak i eksperymenty w ciemności.
UWAGA: Kolonie nie powinny mieć więcej niż 500-1,000 robaków na litr wody z robaków. W przypadku eksperymentów pozostaw pokrywki całkowicie na miejscu, ponieważ przepływ powietrza jest zaprojektowany w tych naczyniach. - Karm nieeksperymentalne robaki raz w tygodniu puree z ekologicznej wołowiny lub wątroby drobiowej, upuszczając puree z pipety transferowej, umieszczając krople jedzenia w pojemniku. Pozwól robakom na 2 godziny spożyć pokarm w ciemności przed czyszczeniem pojemnika (patrz krok 1.4). Przed użyciem przechowywać puree w temperaturze -20 °C przez krótki okres (tygodnie) lub -80 °C przez długi czas (miesiące); Nie zamrażaj ponownie puree do ponownego użycia (ponieważ bakterie mogą zakwitnąć i uszkodzić robaki).
UWAGA: Wątroba nie powinna zawierać hormonów ani antybiotyków i najlepiej, aby nie była wcześniej zamrożona. Odwiruj puree przed zamrożeniem (lub przed karmieniem), aby usunąć powietrze i zapobiec unoszeniu się pokarmu. Jedzenie powinno opadać na dno pojemnika. 1 ml puree wystarcza na 500-1,000 robaków. - Wymieniaj wodę raz w tygodniu ze świeżą wodą z robaków zarówno dla kolonii, jak i eksperymentów. Pojemniki kolonijne należy również przecierać niebielonym ręcznikiem papierowym (w celu usunięcia resztek śluzu, które zatrzymują odpady) raz w tygodniu w przypadku głodujących robaków lub dwa razy w tygodniu w przypadku karmienia robaków (2 godziny po karmieniu i ponownie 2 dni później). Aby zachować biofilm, nie należy wycierać więcej niż 80% pojemnika.
- Przenoś robaki między pojemnikami (lub zestawem chirurgicznym) za pomocą pipety transferowej. Aby uwolnić robaki przyklejone do powierzchni pojemnika, spryskaj robaka / za robakiem, aby uwolnić go z powierzchni. Następnie zassaj robaka do pipety, starając się utrzymać robaka w dolnej calowej (cieńszej) części pipety.
- Napełnij pipety niewielką ilością wody z robaków przed ich zassaniem.
- Staraj się przesuwać wodę wokół robaka, a nie samego robaka, aby zapobiec rozdarciu miękkich robaków poprzez dotykanie ich pipetą.
- Naczynia eksperymentalne należy przykryć, chyba że przenosisz robaki lub wymieniasz wodę.
2. Przygotowanie
- Przestań karmić robaki co najmniej tydzień przed eksperymentami.
- Wybierz robaki, które nie były karmione przez ≥1 tydzień i mają co najmniej 5-7 mm długości. Przenieś robaki na szalkę Petriego w 2/3 wypełnioną wodą z robaków i potwierdź długość robaka, wsuwając linijkę pod szalkę. Mierz robaki, gdy są w pełni wysunięte i w ruchu.
UWAGA: Podczas gdy mniejsze (5-7 mm) robaki działają lepiej podczas wykonywania późniejszych analiz immunofluorescencyjnych i hybrydyzacji in situ, większe robaki (8-10 mm) są łatwiejsze w obsłudze – zwłaszcza podczas nauki ablacji. - Upewnij się, że robaki są całe, nieuszkodzone i nie regenerują się niedawno.
UWAGA: Regenerujące się robaki będą miały znacznie jaśniejszy (lub żadny) pigment w okolicy głowy i/lub ogona w porównaniu z normalnymi robakami. - Jeśli wykonujesz zabiegi RNAi lub farmakologiczne na robakach, zrób to w tym momencie. Jeśli robaki były karmione w ramach leczenia (jak w przypadku RNAi), odczekaj co najmniej 7 dni po ostatnim karmieniu przed kontynuowaniem kroku 2.2.
- Wybierz robaki, które nie były karmione przez ≥1 tydzień i mają co najmniej 5-7 mm długości. Przenieś robaki na szalkę Petriego w 2/3 wypełnioną wodą z robaków i potwierdź długość robaka, wsuwając linijkę pod szalkę. Mierz robaki, gdy są w pełni wysunięte i w ruchu.
- Oczyść przestrzeń roboczą i podstawę mikroskopu preparacyjnego 70% etanolem i pozostaw do całkowitego wyschnięcia. Umieść miskę z wybranymi robakami po lewej stronie lunety. Po prawej stronie lunety umieść parę kleszczy #5, igłę do insuliny 31 G 5/16 cala ze strzykawką o pojemności 1 ml i czystą pipetę do przenoszenia.
- Upewnij się, że instrumenty nie dotykają stołu (co może spowodować wprowadzenie zanieczyszczeń). Użyj sztywnego przedmiotu (takiego jak podpórka pod pałeczki), aby utrzymać kleszcze, igłę i pipetę w czystości. Alternatywnie, umieść instrumenty na wierzchu świeżego brązowego (niebielonego) ręcznika papierowego.
UWAGA: Te i kolejne instrukcje są napisane tak, jak odnoszą się do osób praworęcznych. Osoby leworęczne powinny odwrócić kierunek prawo/lewo.
- Upewnij się, że instrumenty nie dotykają stołu (co może spowodować wprowadzenie zanieczyszczeń). Użyj sztywnego przedmiotu (takiego jak podpórka pod pałeczki), aby utrzymać kleszcze, igłę i pipetę w czystości. Alternatywnie, umieść instrumenty na wierzchu świeżego brązowego (niebielonego) ręcznika papierowego.
- Obok miejsca pracy umieść pudełko z niestrzępiącymi się chusteczkami higienicznymi, źródło świeżej wody z robakami i kilka dodatkowych pipet transferowych (chronionych od blatu). Umieść wodę z robaków w plastikowej butelce do mycia, aby ułatwić dozowanie. Umieść również oznakowaną 12-dołkową płytkę (lub 100-milimetrową szalkę Petriego) po prawej stronie lunety do zbierania zwierząt, którym poddano ablację.
- W przypadku używania niestandardowej płytki Peltiera do unieruchamiania robaków, umieść płytkę Peltiera w zagłębieniu w podstawie mikroskopu preparacyjnego i wyreguluj moc wyjściową na źródle zasilania prądem stałym, aż powierzchnia robocza płytki Peltiera będzie wystarczająco chłodna (zwykle ~5 V). Alternatywnie przygotuj zimną płytę, napełniając 100-milimetrową szalkę Petriego do 1/2 objętości wodą i zamrażaj przez co najmniej 24 godziny. Odrzuć pokrywkę i umieść spód szalki o średnicy 100 mm na podstawie lunety sekparcyjnej, a następnie umieść pokrywkę szalki Petriego o średnicy 60 mm do góry nogami bezpośrednio na powierzchni lodu (Rysunek 1A).
- Po zamarznięciu wody w naczyniu o średnicy 100 mm na środku talerza może pojawić się "wulkan" lodu. Jeśli tak się stanie, użyj żyletki, aby zeskrobać lód na płasko, aby usunąć wszelkie nierówności z powierzchni.
UWAGA: Podczas operacji lód topi się, co znacznie utrudnia ablację. Przygotuj wcześniej kilka naczyń z lodem i zastąp zamrożone na topniejące podczas próby, gdy tylko pokrywka naczynia o średnicy 60 mm zacznie się unosić.
- Po zamarznięciu wody w naczyniu o średnicy 100 mm na środku talerza może pojawić się "wulkan" lodu. Jeśli tak się stanie, użyj żyletki, aby zeskrobać lód na płasko, aby usunąć wszelkie nierówności z powierzchni.
- Przygotuj powierzchnię operowaną. Wytnij kawałek plastikowej folii parafinowej o wymiarach 5 cm x 10 cm (4cm2 w przypadku zimnej płyty na szalce Petriego) i umieść go na środku urządzenia unieruchamiającego. Złóż niestrzępiącą się chusteczkę w kwadrat o boku około 2cm2 i umieść ją na folii. Wytnij kawałek białej bibuły filtracyjnej o grubości 1,5-2 cm2 i umieść go na wierzchu chusteczki. Patrz rysunek 1B-1E.
- Przytrzymaj złożoną chusteczkę na miejscu palcem w rękawiczce i użyj wody z robaka, aby lekko zwilżyć chusteczkę, aby upewnić się, że pozostaje złożona. Użyj boku pipety transferowej, aby przetoczyć chusteczkę na płasko.
UWAGA: Niska temperatura pomaga zapobiegać poruszaniu się robaków. Praca "na sucho" pomaga również w unieruchomieniu. Chusteczka do tkanek działa w celu odprowadzania wody przez bibułę filtracyjną, utrzymując robaka wilgotnego podczas operacji, nie dopuszczając do całkowitego wyschnięcia robaków (co jest śmiertelne).
- Przytrzymaj złożoną chusteczkę na miejscu palcem w rękawiczce i użyj wody z robaka, aby lekko zwilżyć chusteczkę, aby upewnić się, że pozostaje złożona. Użyj boku pipety transferowej, aby przetoczyć chusteczkę na płasko.
3. Ablacja chirurgiczna
- Użyj pipety transferowej, aby umieścić jeden robak grzbietową stroną do góry na bibule filtracyjnej. Włącz źródło światła i skieruj gęsią szyję tak, aby światło skupiało się na robaku. Dostosuj ostrość i powiększenie lunety sekcyjnej tak, aby oczy były wyraźnie widoczne (cały robak nie musi być w zasięgu wzroku); 5-krotne powiększenie to dobry punkt wyjścia. Zorientuj robaka, obracając film parafinowy tak, aby głowa była skierowana w stronę badacza (w kierunku przodu mikroskopu), pod kątem 30-40 stopni w prawo.
- Unikaj używania jasnego światła, aby zapobiec nadmiernemu ruchowi robaków. Wypławki wykazują negatywne fototaksje i będą próbowały unikać jasnego światła.
- Jeśli robak jest umieszczony brzuszną stroną do góry (z widocznym otworem gardłowym), użyj strony kleszczy, aby delikatnie przestawić robaka grzbietową stroną do góry (z widocznymi oczami). Unikaj zbliżania się do zwierzęcia z ostrą końcówką kleszczy, aby zminimalizować ryzyko rozerwania tkanek miękkich podczas zmiany pozycji zwierzęcia.
- Dostosuj ostrość mikroskopu tak, aby oczy były wyraźnie ostre. Upewnij się również, że zarówno oczy, jak i otaczające tkanki głowy są w zasięgu wzroku.
- Trzymać świeżą igłę/strzykawkę w prawej ręce tak, jakby to był długopis (między kciukiem a palcem wskazującym). Oparć lewy kciuk o płytkę Peltiera (lub zimną płytkę na szalce Petriego) i użyć lewego kciuka jako punktu podparcia, na którym będzie spoczywać dolna część strzykawki (Rysunek 2A). Spójrz przez mikroskop i upewnij się, że skos igły jest widoczny.
UWAGA: Igły są bardzo ostre. Zachowaj ostrożność podczas obchodzenia się z nimi. Noszenie rękawic lateksowych lub nitrylowych może zapewnić pewną ochronę.- Użyj lewego kciuka, aby utrzymać igłę/strzykawkę stabilnie przez cały zabieg i unikać drżenia rąk.
- Ustaw kąt około 40° lewym kciukiem i lewym palcem wskazującym (z palcem wskazującym na powierzchni operacyjnej), aby utrzymać stabilną powierzchnię operacyjną.
- Ze skosem igły skierowanym do góry (jak łyżka), ustaw igłę pod kątem prostym do oka (Rysunek 2B). Czubkiem igły delikatnie wbić się w cienką warstwę tkanki pokrywającej miseczkę optykową (biały, niepigmentowany obszar) oka, nabierając od prawej do lewej. Bardzo delikatnie usuń wszelkie tkanki pigmentowe znajdujące się w miseczce optycznej, uważając, aby nie przebić dna ani nie zniszczyć granic muszli optycznej.
- Jeśli robak znajdował się na bibule filtracyjnej przez >1-2 minuty w dowolnym momencie zabiegu, dodaj jedną kroplę wody z robaków, aby ponownie nawodnić robaka.
UWAGA: Odwodnienie zwiększy podatność robaka na zranienia związane z rozerwaniem.
- Jeśli robak znajdował się na bibule filtracyjnej przez >1-2 minuty w dowolnym momencie zabiegu, dodaj jedną kroplę wody z robaków, aby ponownie nawodnić robaka.
- Powtarzać krok 3.3 aż do usunięcia wszystkich czarnych tkanek barwnikowych (komórek barwnikowych), jak również wszystkich białych tkanek gałki wzrokowej (dendrytów komórek fotoreceptorowych). Usunąć wycięte tkanki przyklejone do końca igły, ostrożnie wycierając je chusteczką higieniczną. Jeśli pożądana jest ablacja podwójnego oka, w tym momencie należy przeprowadzić ablację drugiego oka.
UWAGA: Aby uniknąć obrażeń, igły można czyścić, chwytając igłę czystą chusteczką chustową trzymaną kciukiem i palcem wskazującym, a następnie drugą ręką przeciągając igłę przez chusteczkę z dala od kciuka i palca wskazującego. Alternatywnie igłę można wytrzeć o powierzchnię wilgotnej chusteczki higienicznej i sprawdzić pod kątem czystości. - Po zakończeniu użyj pipety transferowej, aby przenieść robaka do oznaczonego naczynia zawierającego świeżą wodę z robaków. Jeśli analizujesz dane grupowe, umieść do 20 robaków na jednej szalce Petriego o średnicy 100 mm. Jeśli śledzisz regenerację u tych samych osobników w czasie, umieść 1 robaka w każdym dołku 12-dołkowej płytki. Po przeniesieniu wszystkich robaków spłucz robaki, usuwając całą wodę z robaków z naczyń/studzienek i zastępując ją bardziej świeżą wodą z robaków.
- Aby usunąć robaki z filtra, napełnij pipetę niewielką ilością wody z robaków i wypuść wodę na robaka. Powinno to zdjąć robaka z bibuły filtracyjnej i natychmiast zassać go do pipety w celu przeniesienia.
- Inkubuj eksperymenty w temperaturze ~20 °C (temperatura pokojowa) chroniąc przed światłem i postępuj zgodnie z procesem regeneracji.
UWAGA: Robaki można przechowywać w inkubatorze z kontrolowaną temperaturą, aby utrzymać stałą temperaturę, ale nie jest to absolutnie konieczne. Większość temperatur w pomieszczeniach zmienia się tylko o +5 °C, co nie wpływa na zdolność robaka do regeneracji. - W razie potrzeby należy ustalić robaki do immunohistochemii (patrz ryc. 3-4) i/lub analizy hybrydyzacji in situ ekspresji genów. Istnieją różne metody utrwalania dla immunohistochemii wypławkowej18,19,20 i hybrydyzacji in situ21,22,23.
- Po zakończeniu eksperymentów należy złożyć w ofierze żywe robaki, usuwając wodę z robaków z naczynia i zastępując ją 70% etanolem. Wysiaduj robaki przez 3-5 minut, sprawdzając, czy robaki uległy lizie i zmieniły kolor na szarawy.
- Po uśmierceniu należy umieścić nieprzetworzone robaki w normalnym strumieniu odpadów. Unikaj wprowadzania do środowiska żywych robaków, zwłaszcza gatunków obcych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Przez pierwsze 1-2 h po operacji zwierzęta mogą wykazywać zmniejszoną ruchliwość w porównaniu do nietkniętych nicieni (choć nadal będą się poruszać). W razie potrzeby, nicienie zaczną żerować w ciągu 24 h po zabiegu (na przykład w przypadku karmienia w celu RNAi). Monitorując regenerację oka u tych samych osobników w czasie, należy pamiętać o wykonaniu fotografii każdego nicienia zarówno przed operacją (w stanie nienaruszonym), jak i 1 h po ablacji (hpa). Do 4 dnia po ablacji (dpa) widocz...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Ta technika ablacji oka ulepsza obecne metody (takie jak dziurkowanie), wykluczając tkanki mózgowe i ograniczając wycinanie głównie do tkanek oka. Przy odrobinie praktyki technika ta może być wykonywana przez większość osób, od techników doświadczonych w mikrooperacjach po niedoświadczonych, ale sumiennych studentów studiów licencjackich. Zaleca się, aby technika ta była wielokrotnie praktykowana przed zastosowaniem ablacji w eksperymentach, w tym (jeśli to możliwe) potwierdzenie całkowitego usunięcia wszystkich tkanek o...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować Michelle Deochand za doskonalenie tej techniki ablacji oka, Taylor Birkholz za pomoc w teście funkcjonalnym, Michaelowi Levinowi za przeciwciało anty-aresztynowe oraz Junji Morokuma za informacje na temat płytek Peltiera. Prace te zostały wsparte grantem SFSA z Western Michigan University dla WSB.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Rozpuszczalne sole morskie Ocean | Spectrum Brands | Pudełko SS15-10 | "10 galonów" (waga netto: 3 funty) |
| Niestrzępiąca się chusteczka Kimwipes EX-L | Kimberly-Clark | 34155 | 4,5 x 8,5 cala |
| Bibuła filtracyjna Whatman #2 | Sigma | WHA1002125 | Kółka, średnica 125 mm, biała |
| Strzykawka insulinowa Easy Touch (z igłą) | Pet Health Market | 17175-04 | U-100 Strzykawka 1 cm³, igła 31 G 5/16 cala |
| szalka Petriego 100 mm | VWR | 25384-342 | Szalka Petriego 100 mm x 15 mm |
| 60 mm | VWR | 25384-092 | 60 mm x 15 mm |
| Dumont #5 kleszcze | Fine Science Tools | 11254-20 | Inox, końcówka prosta, 11 cm |
| Pipety transferowe | Samco Naukowe | 225 | Podziałka, duża żarówka, 7,5 mL, niesterylna |
| folia parafinowa Parafilm M | Marka | 701606 | Rolka 4 cale x 125 stóp |
| 12-dołkowa nieobrobiona płytka do hodowli tkankowej | VWR | 15705-059 | Niepoddana obróbce, z płaskim dnem, sterylna, marki Falcon |
| Plastikowe pojemniki na żywność (dla kolonii) | Ziploc | Duży prostokąt | 2,25 qt (2,12 L), 10" x 6 -3/4 " x 3 -3/16" |
| Planaria (Girardia tigrina) | Carolina Biological | 132954 | Sprzedawane jako "brązowe" Planaria; najczęściej są to G. tigrina (aka Dugesia tigrina), ale czasami są G. dorotocephala (alias Dugesia dorotocephala); Każdy z nich będzie działał. |
| Planaria (Schmidtea mediterranea) | n/a | n/a | S. mediterranea nie są dostępne w handlu. W tej chwili zwierzęta można pozyskać tylko w laboratoriach, które ich używają i mają dodatkowe zwierzęta. |
| Ręczniki papierowe brązowe | Grainger | 2U229 | 9-3/16 x 9-3/8" 1-warstwowy ręcznik papierowy wielowarstwowy, NIEBIELONA |
| butelka do mycia (do wody z robaków), opcjonalnie | VWR | 16650-275 | , polietylen o niskiej gęstości, szerokie usta, 500 ml |
| przeciwciało antysynapsynowe, opcjonalnie | Badania rozwojowe Hybridoma Bank | 3C11 | Supernatant |
| Przeciwciało antyaresztynowe, opcjonalnie | nie | dotyczy | Niedostępne w handlu. Miły prezent od Michaela Levina, Tufts University |
| Nalgene Lowboy gróźb z króćcem (do przechowywania wody z robaków), opcjonalnie | Nalge Nunc International Corporation | 2324-0015 | 15 L, polipropylen, niski profil ułatwia napełnianie plastikowych pojemników na kolonie |
| Niestandardowa płytka Peltiera, opcjonalna | maszyna Williamsa, Foxboro, MA | n/a | Szczegóły projektu dzięki uprzejmości Junji Morokuma, Tufts University: Płytka Peltiera jest zbudowana ze standardowej termoelektrycznej pompy ciepła (na przykład All Electronics Corp Catalog # PJT-1, 30 mm2). Kwadratowa pompa ciepła pokryta jest cienką lustrzaną powierzchnią, a następnie umieszczona w kwadratowym otworze o średnicy 30 mm2 w okrągłej formie z pleksi (o średnicy ~50 mm). Ta forma ma podobną grubość do pompy ciepła i pasuje do dobrze obrobionej w środku okrągłego radiatora (o średnicy ~115 mm). Forma/pompa ciepła jest "Zakotwiczony" do zlewu za pomocą silikonowej masy radiatora. Przewody są przewlekane przez otwory wywiercone zarówno w formie, jak i radiatorze. Dolna połowa radiatora jest wyposażona w "stopę", która pasuje do otworu płyty podstawy mikroskopu. |
| Źródło zasilania prądem stałym (dla płytki Peltiera), opcjonalnie | B i K Precision | 1665 | Regulowany niskonapięciowy zasilacz prądu stałego, 1-18 V (DC), 1-10 amperów. |
| Inne popularne materiały eksploatacyjne | |||
| Rękawice | |||
| Żyletka | |||
| Nożyczki | |||
| Luneta sekcyjna z oświetleniem | |||
| Podpórki pod pałeczki, opcjonalnie |
Bibliografia
- Gentile, L., Cebria, F., Bartscherer, K. The planarian flatworm: an in vivo model for stem cell biology and nervous system regeneration. Dis Model Mech. 4 (1), 12-19 (2011).
- Elliott, S. A., Sanchez Alvarado, A. The history and enduring contributions of planarians to the study of animal regeneration. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (3), 301-326 (2013).
- Emili Saló, R. B. Chapter 3. Animal Models in Eye Research. Tsonis, P. A. , Academic Press. 15-26 (2008).
- Lapan, S. W., Reddien, P. W. dlx and sp6-9 Control optic cup regeneration in a prototypic eye. PLoS Genet. 7 (8), e1002226(2011).
- Lapan, S. W., Reddien, P. W. Transcriptome analysis of the planarian eye identifies ovo as a specific regulator of eye regeneration. Cell Rep. 2 (2), 294-307 (2012).
- Inoue, T., et al. Morphological and functional recovery of the planarian photosensing system during head regeneration. Zoolog Sci. 21 (3), 275-283 (2004).
- Pineda, D., et al. The genetic network of prototypic planarian eye regeneration is Pax6 independent. Development. 129 (6), 1423-1434 (2002).
- Paskin, T. R., Jellies, J., Bacher, J., Beane, W. S. Planarian Phototactic Assay Reveals Differential Behavioral Responses Based on Wavelength. PLoS One. 9 (12), e114708(2014).
- Raffa, R. B., Martley, A. F. Amphetamine-induced increase in planarian locomotor activity and block by UV light. Brain Res. 1031 (1), 138-140 (2005).
- Sandmann, T., Vogg, M. C., Owlarn, S., Boutros, M., Bartscherer, K. The head-regeneration transcriptome of the planarian Schmidtea mediterranea. Genome Biol. 12 (8), R76(2011).
- Vasquez-Doorman, C., Petersen, C. P. The NuRD complex component p66 suppresses photoreceptor neuron regeneration in planarians. Regeneration (Oxf). 3 (3), 168-178 (2016).
- Deochand, M. E., Birkholz, T. R., Beane, W. S. Temporal regulation of planarian eye regeneration. Regeneration. 3 (4), 209-221 (2016).
- Sakai, F., Agata, K., Orii, H., Watanabe, K. Organization and regeneration ability of spontaneous supernumerary eyes in planarians -eye regeneration field and pathway selection by optic nerves. Zoolog Sci. 17 (3), 375-381 (2000).
- Asano, Y., Nakamura, S., Ishida, S., Azuma, K., Shinozawa, T. Rhodopsin-like proteins in planarian eye and auricle: detection and functional analysis. J Exp Biol. 201 (Pt 9), 1263-1271 (1998).
- Cross, S. D., et al. Control of Maintenance and Regeneration of Planarian Eyes by ovo. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (12), 7604-7610 (2015).
- Robb, S. M., Gotting, K., Ross, E., Sanchez Alvarado, A. SmedGD 2.0: The Schmidtea mediterranea genome database. Genesis. 53 (8), 535-546 (2015).
- Robb, S. M., Ross, E., Sanchez Alvarado,, A, SmedGD: the Schmidtea mediterranea genome database. Nucleic Acids Res. 36, D599-D606 (2008).
- Beane, W. S., Tseng, A. S., Morokuma, J., Lemire, J. M., Levin, M. Inhibition of planar cell polarity extends neural growth during regeneration, homeostasis, and development. Stem Cells Dev. 21 (12), 2085-2094 (2012).
- Forsthoefel, D. J., Waters, F. A., Newmark, P. A. Generation of cell type-specific monoclonal antibodies for the planarian and optimization of sample processing for immunolabeling. BMC Dev Biol. 14, 45(2014).
- Ross, K. G., et al. Novel monoclonal antibodies to study tissue regeneration in planarians. BMC Dev Biol. 15, 2(2015).
- Cardona, A., Fernandez, J., Solana, J., Romero, R. An in situ hybridization protocol for planarian embryos: monitoring myosin heavy chain gene expression. Dev Genes Evol. 215 (9), 482-488 (2005).
- King, R. S., Newmark, P. A. In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea. BMC Dev Biol. 13, 8(2013).
- Pearson, B. J., et al. Formaldehyde-based whole-mount in situ hybridization method for planarians. Dev Dyn. 238 (2), 443-450 (2009).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
