Test ablacji chirurgicznej do badania regeneracji oka u wypławków

Planarianie są potężnym organizmem modelowym do badania regeneracji za pośrednictwem dorosłych komórek macierzystych. Te niepasożytnicze płazińce słodkowodne posiadają zdolność do regeneracji wszelkich brakujących tkanek, w tym ośrodkowego układu nerwowego i mózgu¹. Badane już w 1700 roku², postęp technologiczny w dziedzinie wypławków w ciągu ostatnich 10-15 lat (taki jak sekwencjonowany genom, hybrydyzacja in situ, immunohistochemia, interferencja RNA (RNAi) i transkryptomika) zaktualizowały ten historyczny organizm modelowy. W szczególności wypławki zyskały ostatnio popularność jako wyłaniający się model do badań nad wzrokiem³.

Planarianie mają prototypowe oczy z tylko dwoma typami tkanek, neuronami fotoreceptorowymi i komórkami pigmentowymi; umożliwiło to scharakteryzowanie populacji komórek macierzystych oka i pokazało, że wiele z tych samych genów regulujących rozwój oczu kręgowców jest zachowanych u wypławków^4,5. Miseczki wzrokowe są zlokalizowane grzbietowo i składają się z białych, niepigmentowanych dendrytów neuronów fotoreceptorowych i półksiężycowych czarnych komórek pigmentowych, a oczy unerwiają mózg poprzez skrzyżowanie wzrokowe. Oprócz tego, że jest modelem do wyjaśniania procesów regeneracyjnych⁶, oko wypławkowe doskonale nadaje się do badania ewolucji mechanizmów wzrokowych⁷, reakcji behawioralnych na światło (wypławki wykazują ujemne fototaksje)⁸, oraz neurologicznych podstaw zachowania⁹.

Regeneracja oczu u wypławków była szeroko badana w dwóch głównych kontekstach: jako część regeneracji głowy po dekapitacji^4,10, oraz po wycięciu samych tkanek oka^11,12. Większość badań wypławkowych dotyczących regeneracji oczu wykorzystywała metodę dekapitacji, ponieważ jest ona prosta i nieskomplikowana. Do tej pory najpowszechniejszą metodą wycinania wypławki oka było przebijanie dziurki za pomocą cienkiej szklanej rurki kapilarnej^13,14, chociaż niektóre badania wykonywały również amputacje tuż za oczami (częściowa dekapitacja)¹⁵. Jednak wszystkie te metody wiążą się z utratą wielu tkanek innych niż tylko oko (takich jak mózg, jelita i nerwy), co potencjalnie komplikuje interpretację wyników. Przedstawiony tutaj protokół ablacji oka ogranicza wycięcie do tkanek oka (w szczególności z wyłączeniem mózgu), w wyniku czego dane są bardziej specyficzne dla oka. Dodatkowo, w przeciwieństwie do robaków pozbawionych głów, które potrzebują 7-14 dni, aby rozpocząć żerowanie, robaki z ablacją oczu będą żywić się w ciągu 24 godzin od ablacji¹², co pozwala na jednoczesne przeprowadzanie eksperymentów z RNAi (w których RNAi jest dostarczane z pożywieniem).

Chociaż ablacja oczu jest technicznie trudniejsza do skutecznego przeprowadzenia niż dekapitacja, obecne badania dotyczące wycinania oczu nie zawierają szczegółowych instrukcji dotyczących ich procedur. Celem tego artykułu wideo jest umożliwienie naukowcom konsekwentnego usuwania wypławki nerwu wzrokowego bez naruszania leżących pod spodem tkanek mózgowych i usuwania jak najmniejszej liczby innych tkanek. Metoda ta może być stosowana zarówno do ablacji pojedynczego, jak i podwójnego oka i ma zastosowanie w szerokim zakresie badań. Podobnie jak większość testów regeneracji, ablacja oka dobrze nadaje się do łączenia zarówno z badaniami farmakologicznymi, jak i genetycznymi (RNAi), a także badaniami behawioralnymi. Tutaj opisujemy metody obchodzenia się z robakami, utrzymywania kolonii wypławków oraz samej techniki ablacji oczu.

1. Hodowla zwierząt i obchodzenie się z nimi

UWAGA: Ten protokół wykorzystuje Schmidtea mediterranea, diploidalny gatunek wypławkowy o zsekwencjonowanym genomie^16,17, który jest powszechnie używany do badań nad regeneracją. Jednak test jest równie skuteczny w przypadku innych gatunków, takich jak Girardia tigrina i Girardia dorotocephala (które są dostępne w handlu).

1. Utrzymuj robaki w "wodzie robaka" wykonanej z 0,5 g/l soli morskich w ultraczystej (lub przefiltrowanej dejonizowanej) wodzie. Używaj sterylnych pojemników polipropylenowych lub szklanych do przechowywania wody z robaków. Zobacz Plik uzupełniający 1, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat przygotowania wody z robaków.
   UWAGA: Nigdy nie używaj mydła do czyszczenia pojemników (lub innych materiałów), ponieważ mydło jest toksyczne dla robaków; Zamiast tego przetrzyj 70% etanolem i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.
   1. Podczas pracy z planariami należy nosić rękawice, aby chronić je przed zanieczyszczeniem.
      UWAGA: Robaki są bardzo wrażliwe na toksyny środowiskowe i chemikalia, w tym mydło, wybielacz, szampon, odżywkę i balsam do rąk.
2. Trzymaj kolonie w polipropylenowych pojemnikach na żywność, z częściowo otwartą pokrywą w celu wymiany powietrza w temperaturze ~20 °C (temperatura pokojowa). Przechowuj eksperymentalne robaki na szalkach Petriego (20 robaków na 100 mm szalkach) lub na płytkach do hodowli tkankowych niepoddanych działaniu substancji (1 robak na studzienkę, dla płytek 12-dołkowych). Aby zmniejszyć stres, trzymaj zarówno kolonie, jak i eksperymenty w ciemności.
   UWAGA: Kolonie nie powinny mieć więcej niż 500-1,000 robaków na litr wody z robaków. W przypadku eksperymentów pozostaw pokrywki całkowicie na miejscu, ponieważ przepływ powietrza jest zaprojektowany w tych naczyniach.
3. Karm nieeksperymentalne robaki raz w tygodniu puree z ekologicznej wołowiny lub wątroby drobiowej, upuszczając puree z pipety transferowej, umieszczając krople jedzenia w pojemniku. Pozwól robakom na 2 godziny spożyć pokarm w ciemności przed czyszczeniem pojemnika (patrz krok 1.4). Przed użyciem przechowywać puree w temperaturze -20 °C przez krótki okres (tygodnie) lub -80 °C przez długi czas (miesiące); Nie zamrażaj ponownie puree do ponownego użycia (ponieważ bakterie mogą zakwitnąć i uszkodzić robaki).
   UWAGA: Wątroba nie powinna zawierać hormonów ani antybiotyków i najlepiej, aby nie była wcześniej zamrożona. Odwiruj puree przed zamrożeniem (lub przed karmieniem), aby usunąć powietrze i zapobiec unoszeniu się pokarmu. Jedzenie powinno opadać na dno pojemnika. 1 ml puree wystarcza na 500-1,000 robaków.
4. Wymieniaj wodę raz w tygodniu ze świeżą wodą z robaków zarówno dla kolonii, jak i eksperymentów. Pojemniki kolonijne należy również przecierać niebielonym ręcznikiem papierowym (w celu usunięcia resztek śluzu, które zatrzymują odpady) raz w tygodniu w przypadku głodujących robaków lub dwa razy w tygodniu w przypadku karmienia robaków (2 godziny po karmieniu i ponownie 2 dni później). Aby zachować biofilm, nie należy wycierać więcej niż 80% pojemnika.
5. Przenoś robaki między pojemnikami (lub zestawem chirurgicznym) za pomocą pipety transferowej. Aby uwolnić robaki przyklejone do powierzchni pojemnika, spryskaj robaka / za robakiem, aby uwolnić go z powierzchni. Następnie zassaj robaka do pipety, starając się utrzymać robaka w dolnej calowej (cieńszej) części pipety.
   1. Napełnij pipety niewielką ilością wody z robaków przed ich zassaniem.
   2. Staraj się przesuwać wodę wokół robaka, a nie samego robaka, aby zapobiec rozdarciu miękkich robaków poprzez dotykanie ich pipetą.
   3. Naczynia eksperymentalne należy przykryć, chyba że przenosisz robaki lub wymieniasz wodę.

2. Przygotowanie

1. Przestań karmić robaki co najmniej tydzień przed eksperymentami.
   1. Wybierz robaki, które nie były karmione przez ≥1 tydzień i mają co najmniej 5-7 mm długości. Przenieś robaki na szalkę Petriego w 2/3 wypełnioną wodą z robaków i potwierdź długość robaka, wsuwając linijkę pod szalkę. Mierz robaki, gdy są w pełni wysunięte i w ruchu.
      UWAGA: Podczas gdy mniejsze (5-7 mm) robaki działają lepiej podczas wykonywania późniejszych analiz immunofluorescencyjnych i hybrydyzacji in situ, większe robaki (8-10 mm) są łatwiejsze w obsłudze – zwłaszcza podczas nauki ablacji.
   2. Upewnij się, że robaki są całe, nieuszkodzone i nie regenerują się niedawno.
      UWAGA: Regenerujące się robaki będą miały znacznie jaśniejszy (lub żadny) pigment w okolicy głowy i/lub ogona w porównaniu z normalnymi robakami.
   3. Jeśli wykonujesz zabiegi RNAi lub farmakologiczne na robakach, zrób to w tym momencie. Jeśli robaki były karmione w ramach leczenia (jak w przypadku RNAi), odczekaj co najmniej 7 dni po ostatnim karmieniu przed kontynuowaniem kroku 2.2.
2. Oczyść przestrzeń roboczą i podstawę mikroskopu preparacyjnego 70% etanolem i pozostaw do całkowitego wyschnięcia. Umieść miskę z wybranymi robakami po lewej stronie lunety. Po prawej stronie lunety umieść parę kleszczy #5, igłę do insuliny 31 G 5/16 cala ze strzykawką o pojemności 1 ml i czystą pipetę do przenoszenia.
   1. Upewnij się, że instrumenty nie dotykają stołu (co może spowodować wprowadzenie zanieczyszczeń). Użyj sztywnego przedmiotu (takiego jak podpórka pod pałeczki), aby utrzymać kleszcze, igłę i pipetę w czystości. Alternatywnie, umieść instrumenty na wierzchu świeżego brązowego (niebielonego) ręcznika papierowego.
      UWAGA: Te i kolejne instrukcje są napisane tak, jak odnoszą się do osób praworęcznych. Osoby leworęczne powinny odwrócić kierunek prawo/lewo.
3. Obok miejsca pracy umieść pudełko z niestrzępiącymi się chusteczkami higienicznymi, źródło świeżej wody z robakami i kilka dodatkowych pipet transferowych (chronionych od blatu). Umieść wodę z robaków w plastikowej butelce do mycia, aby ułatwić dozowanie. Umieść również oznakowaną 12-dołkową płytkę (lub 100-milimetrową szalkę Petriego) po prawej stronie lunety do zbierania zwierząt, którym poddano ablację.
4. W przypadku używania niestandardowej płytki Peltiera do unieruchamiania robaków, umieść płytkę Peltiera w zagłębieniu w podstawie mikroskopu preparacyjnego i wyreguluj moc wyjściową na źródle zasilania prądem stałym, aż powierzchnia robocza płytki Peltiera będzie wystarczająco chłodna (zwykle ~5 V). Alternatywnie przygotuj zimną płytę, napełniając 100-milimetrową szalkę Petriego do 1/2 objętości wodą i zamrażaj przez co najmniej 24 godziny. Odrzuć pokrywkę i umieść spód szalki o średnicy 100 mm na podstawie lunety sekparcyjnej, a następnie umieść pokrywkę szalki Petriego o średnicy 60 mm do góry nogami bezpośrednio na powierzchni lodu (Rysunek 1A).
   1. Po zamarznięciu wody w naczyniu o średnicy 100 mm na środku talerza może pojawić się "wulkan" lodu. Jeśli tak się stanie, użyj żyletki, aby zeskrobać lód na płasko, aby usunąć wszelkie nierówności z powierzchni.
      UWAGA: Podczas operacji lód topi się, co znacznie utrudnia ablację. Przygotuj wcześniej kilka naczyń z lodem i zastąp zamrożone na topniejące podczas próby, gdy tylko pokrywka naczynia o średnicy 60 mm zacznie się unosić.
5. Przygotuj powierzchnię operowaną. Wytnij kawałek plastikowej folii parafinowej o wymiarach 5 cm x 10 cm (4^cm2 w przypadku zimnej płyty na szalce Petriego) i umieść go na środku urządzenia unieruchamiającego. Złóż niestrzępiącą się chusteczkę w kwadrat o boku około 2^cm2 i umieść ją na folii. Wytnij kawałek białej bibuły filtracyjnej o grubości 1,5-2 cm² i umieść go na wierzchu chusteczki. Patrz rysunek 1B-1E.
   1. Przytrzymaj złożoną chusteczkę na miejscu palcem w rękawiczce i użyj wody z robaka, aby lekko zwilżyć chusteczkę, aby upewnić się, że pozostaje złożona. Użyj boku pipety transferowej, aby przetoczyć chusteczkę na płasko.
      UWAGA: Niska temperatura pomaga zapobiegać poruszaniu się robaków. Praca "na sucho" pomaga również w unieruchomieniu. Chusteczka do tkanek działa w celu odprowadzania wody przez bibułę filtracyjną, utrzymując robaka wilgotnego podczas operacji, nie dopuszczając do całkowitego wyschnięcia robaków (co jest śmiertelne).

3. Ablacja chirurgiczna

1. Użyj pipety transferowej, aby umieścić jeden robak grzbietową stroną do góry na bibule filtracyjnej. Włącz źródło światła i skieruj gęsią szyję tak, aby światło skupiało się na robaku. Dostosuj ostrość i powiększenie lunety sekcyjnej tak, aby oczy były wyraźnie widoczne (cały robak nie musi być w zasięgu wzroku); 5-krotne powiększenie to dobry punkt wyjścia. Zorientuj robaka, obracając film parafinowy tak, aby głowa była skierowana w stronę badacza (w kierunku przodu mikroskopu), pod kątem 30-40 stopni w prawo.
   1. Unikaj używania jasnego światła, aby zapobiec nadmiernemu ruchowi robaków. Wypławki wykazują negatywne fototaksje i będą próbowały unikać jasnego światła.
   2. Jeśli robak jest umieszczony brzuszną stroną do góry (z widocznym otworem gardłowym), użyj strony kleszczy, aby delikatnie przestawić robaka grzbietową stroną do góry (z widocznymi oczami). Unikaj zbliżania się do zwierzęcia z ostrą końcówką kleszczy, aby zminimalizować ryzyko rozerwania tkanek miękkich podczas zmiany pozycji zwierzęcia.
   3. Dostosuj ostrość mikroskopu tak, aby oczy były wyraźnie ostre. Upewnij się również, że zarówno oczy, jak i otaczające tkanki głowy są w zasięgu wzroku.
2. Trzymać świeżą igłę/strzykawkę w prawej ręce tak, jakby to był długopis (między kciukiem a palcem wskazującym). Oparć lewy kciuk o płytkę Peltiera (lub zimną płytkę na szalce Petriego) i użyć lewego kciuka jako punktu podparcia, na którym będzie spoczywać dolna część strzykawki (Rysunek 2A). Spójrz przez mikroskop i upewnij się, że skos igły jest widoczny.
   UWAGA: Igły są bardzo ostre. Zachowaj ostrożność podczas obchodzenia się z nimi. Noszenie rękawic lateksowych lub nitrylowych może zapewnić pewną ochronę.
   1. Użyj lewego kciuka, aby utrzymać igłę/strzykawkę stabilnie przez cały zabieg i unikać drżenia rąk.
   2. Ustaw kąt około 40° lewym kciukiem i lewym palcem wskazującym (z palcem wskazującym na powierzchni operacyjnej), aby utrzymać stabilną powierzchnię operacyjną.
3. Ze skosem igły skierowanym do góry (jak łyżka), ustaw igłę pod kątem prostym do oka (Rysunek 2B). Czubkiem igły delikatnie wbić się w cienką warstwę tkanki pokrywającej miseczkę optykową (biały, niepigmentowany obszar) oka, nabierając od prawej do lewej. Bardzo delikatnie usuń wszelkie tkanki pigmentowe znajdujące się w miseczce optycznej, uważając, aby nie przebić dna ani nie zniszczyć granic muszli optycznej.
   1. Jeśli robak znajdował się na bibule filtracyjnej przez >1-2 minuty w dowolnym momencie zabiegu, dodaj jedną kroplę wody z robaków, aby ponownie nawodnić robaka.
      UWAGA: Odwodnienie zwiększy podatność robaka na zranienia związane z rozerwaniem.
4. Powtarzać krok 3.3 aż do usunięcia wszystkich czarnych tkanek barwnikowych (komórek barwnikowych), jak również wszystkich białych tkanek gałki wzrokowej (dendrytów komórek fotoreceptorowych). Usunąć wycięte tkanki przyklejone do końca igły, ostrożnie wycierając je chusteczką higieniczną. Jeśli pożądana jest ablacja podwójnego oka, w tym momencie należy przeprowadzić ablację drugiego oka.
   UWAGA: Aby uniknąć obrażeń, igły można czyścić, chwytając igłę czystą chusteczką chustową trzymaną kciukiem i palcem wskazującym, a następnie drugą ręką przeciągając igłę przez chusteczkę z dala od kciuka i palca wskazującego. Alternatywnie igłę można wytrzeć o powierzchnię wilgotnej chusteczki higienicznej i sprawdzić pod kątem czystości.
5. Po zakończeniu użyj pipety transferowej, aby przenieść robaka do oznaczonego naczynia zawierającego świeżą wodę z robaków. Jeśli analizujesz dane grupowe, umieść do 20 robaków na jednej szalce Petriego o średnicy 100 mm. Jeśli śledzisz regenerację u tych samych osobników w czasie, umieść 1 robaka w każdym dołku 12-dołkowej płytki. Po przeniesieniu wszystkich robaków spłucz robaki, usuwając całą wodę z robaków z naczyń/studzienek i zastępując ją bardziej świeżą wodą z robaków.
   1. Aby usunąć robaki z filtra, napełnij pipetę niewielką ilością wody z robaków i wypuść wodę na robaka. Powinno to zdjąć robaka z bibuły filtracyjnej i natychmiast zassać go do pipety w celu przeniesienia.
6. Inkubuj eksperymenty w temperaturze ~20 °C (temperatura pokojowa) chroniąc przed światłem i postępuj zgodnie z procesem regeneracji.
   UWAGA: Robaki można przechowywać w inkubatorze z kontrolowaną temperaturą, aby utrzymać stałą temperaturę, ale nie jest to absolutnie konieczne. Większość temperatur w pomieszczeniach zmienia się tylko o +5 °C, co nie wpływa na zdolność robaka do regeneracji.
7. W razie potrzeby należy ustalić robaki do immunohistochemii (patrz ryc. 3-4) i/lub analizy hybrydyzacji in situ ekspresji genów. Istnieją różne metody utrwalania dla immunohistochemii wypławkowej^18,19,20 i hybrydyzacji in situ^21,22,23.
8. Po zakończeniu eksperymentów należy złożyć w ofierze żywe robaki, usuwając wodę z robaków z naczynia i zastępując ją 70% etanolem. Wysiaduj robaki przez 3-5 minut, sprawdzając, czy robaki uległy lizie i zmieniły kolor na szarawy.
9. Po uśmierceniu należy umieścić nieprzetworzone robaki w normalnym strumieniu odpadów. Unikaj wprowadzania do środowiska żywych robaków, zwłaszcza gatunków obcych.

Przez pierwsze 1-2 godziny po operacji, zwierzęta mogą wykazywać zmniejszony ruch w porównaniu do nienaruszonych robaków (jednak nadal będą się poruszać). W razie potrzeby robaki zjadają w ciągu 24 godzin od zabiegu (na przykład w celu karmienia RNAi). Obserwując regenerację oczu u tych samych osób w czasie, należy zrobić zdjęcie każdego robaka zarówno przed zabiegiem (nienaruszony), jak i po 1 godzinie od ablacji (hpa). Po 4 dniach od ablacji (dpa) powinny być widoczne regenerujące się komórki pigmentowe, a po 14 dpa całe oko będzie w pełni zregenerowane (ryc. 3A-B). Obejmuje to neurony fotoreceptorowe i ich unerwienie do mózgu (ryc. 3C), a także funkcjonalne odzyskiwanie układu wzrokowego (ryc. 4A-C). Udane ablacje nie naruszą leżących poniżej tkanek mózgu (ryc. 4D-E) ani nie wprowadzą innych obrażeń do zwierzęcia (ryc. 5A). Nieudane ablacje obejmują zwierzęta z: zbyt dużym wycięciem łączącym dwoje oczu (ryc. 5B), rozdarciami na bocznym brzegu zwierzęcia (ryc. 5C) i/lub miejscami ran przebijającymi się przez naskórek brzuszny (ryc. 5D). Ponadto nieudane ablacje obejmują niecałkowite usunięcie całej miseczki wzrokowej, składającej się zarówno z białych, niepigmentowanych tkanek, jak i czarnych komórek pigmentowych (ryc. 5E-F).

Rycina 1: Przygotowanie do zabiegu. (A) Schemat budowy zimnej płyty, wykorzystujący spód płytki Petriego o średnicy 100 mm (wypełnionej lodem) i pokrywę płytki Petriego o średnicy 60 mm (umieszczoną do góry nogami na powierzchni lodu). (B) Schemat powierzchni operacyjnej, wykonany ze stosu (od góry do dołu) białej bibuły filtracyjnej, wilgotnej, złożonej chusteczki higienicznej i kawałka folii parafinowej. (C) Przygotowana operacja (dla praworęcznych). A: luneta sekcyjna, B: oświetlenie na gęsiej szyi, C: powierzchnia operacyjna, D: płytka Peltiera, E: naczynie z robakami 5-7 mm gotowymi do ablacji, F: butelka do mycia wodą z robaków, G: podpórka pod pałeczki trzymająca czystą pipetę transferową, H: podpórka pod pałeczkę trzymająca igłę/strzykawkę, I: podpórka pod pałeczkę przytrzymująca kleszcze, J: pojemnik z dodatkowymi pipetami do przenoszenia. (D) Niestandardowa konfiguracja płytki Peltiera. (E) Konfiguracja zimnej płyty na szalce Petriego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 2: Ułożenie rąk i igły/strzykawki podczas ablacji. (A) Ułożenie rąk (dla praworęcznych). Należy pamiętać, że lewy kciuk służy do podparcia strzykawki (trzymanej w prawej ręce) w celu zminimalizowania ruchu. (B) Umieszczenie igły w stosunku do oka robaka. Zwróć uwagę, że skośna powierzchnia igły jest skierowana do góry. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 3: Zregenerowane oczy wypławkowe po ablacji. Morfologia wypławków Schmidtea mediterranea odrastających w oczach po (A) podwójnej ablacji oka i (B) ablacji pojedynczego oka. (C) Immunohistochemia wykazująca regenerację neuronów fotoreceptorowych (antyaresztyna) po ablacji pojedynczego oka. Nienaruszone robaki są pokazane przed operacją, a regeneracja jest pokazana w 4 i 14 dniu po ablacji. W przypadku ablacji jednego oka lewe oko zostało poddane ablacji, a prawe oko służy jako wewnętrzna (nieuszkodzona) kontrola. Czerwone groty: oczy z ablacją. Podziałka = 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 4: Funkcjonalna regeneracja układu wzrokowego po ablacji. (A-C) Test funkcjonalny do badania światłowstrętu wypławkowego. (A) Nienaruszone robaki unikają przemieszczania się przez obszary światła, takie jak plamka z zielonego wskaźnika laserowego. (B) Po 24 godzinach od ablacji, "ślepe" robaki z podwójnym okiem, poddane ablacji, przemieszczają się przez jasne plamy. (C) Po 7 dniach od ablacji robaki z podwójnym okiem, którym poddano ablację, zregenerowały swój układ wzrokowy na tyle, aby odzyskać zdolność unikania światła. Żółty grot strzałki: nieprawidłowa reakcja behawioralna. (D-E) Ablacja oka jest ograniczona do tkanek miseczki wzrokowej i nie narusza leżących poniżej tkanek mózgowych. (D) Immunohistochemia wykazująca architekturę mózgu (antysynapsynana) pozostaje niezmieniona od czasu przed ablacją do 1 godziny po ablacji. (E) Barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E) w ciągu 1 godziny po ablacji w przekroju poprzecznym wykazującym uszkodzenie jest w dużej mierze ograniczone do miejsca ablowanej muszli wzrokowej. Prawe oko (z czarnymi komórkami pigmentowymi) służy jako kontrola wewnętrzna. Czerwone groty: oczy z ablacją. Podziałka = 1 mm w (A-C) 1 mm, 100 μm w (DE). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 5: Cechy charakterystyczne udanych i nieudanych ablacji. (A) Udane ablacje pojedynczego i podwójnego oka (po 5 minutach od ablacji) mają rany, które są mniej więcej podobnej wielkości do oryginalnej muszli optycznej. (B-E) Nieudane ablacje: (B) usuwa się zbyt dużo tkanki lub rana łączy oba oczy, (C) miejsce rany rozrywa się i rozciąga do brzegu, (D) rana jest zbyt głęboka i przebija się od strony grzbietowej (D) do brzusznej (D') oraz (E-F) nie wszystkie tkanki panewki wzrokowej są usuwane, uwidocznione zarówno morfologicznie (E), jak i przez barwienie antyaresztynowe neuronów fotoreceptorowych (F). Żółte groty strzał: nieprawidłowe ablacje. Żółte kółka: miejsce ablacji. Podziałka = 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.