Test ablacji chirurgicznej do badania regeneracji oka u wypławków

Podsumowanie

Ten protokół pokazuje, jak konsekwentnie wycinać wypławki oczu (panewki wzrokowe) bez naruszania otaczających tkanek. Za pomocą igły insulinowej i strzykawki można dokonać ablacji jednego lub obu oczu, aby ułatwić badania nad mechanizmami regulującymi regenerację oczu, ewolucją regeneracji wzroku i neuronalnymi podstawami zachowań wywołanych światłem.

Streszczenie

W badaniach nad dorosłymi komórkami macierzystymi i mechanizmami regeneracyjnymi, płazińce płaskie są podstawowym systemem modelowym in vivo. Wynika to w dużej mierze z ich obfitej populacji pluripotencjalnych komórek macierzystych i zdolności do regeneracji wszystkich typów komórek i tkanek po urazach, które byłyby katastrofalne dla większości zwierząt. W ostatnim czasie wypławki zyskały popularność jako model do regeneracji oczu. Ich zdolność do regeneracji całego oka (składającego się z dwóch typów tkanek: komórek barwnikowych i fotoreceptorów) pozwala na rozebranie mechanizmów regulujących regenerację układu wzrokowego. Ablacja oka ma kilka zalet w porównaniu z innymi technikami (takimi jak dekapitacja lub dziurkowanie) do badania ścieżek i mechanizmów specyficznych dla oka, z których najważniejszą jest to, że regeneracja jest w dużej mierze ograniczona do samych tkanek oka. Celem tego artykułu wideo jest pokazanie, jak niezawodnie usunąć wypławkową miseczkę nerwu wzrokowego bez naruszania mózgu lub otaczających tkanek. Opisano również postępowanie z robakami i utrzymanie założonej kolonii. Technika ta wykorzystuje igłę insulinową o gramaturze 31 G, 5/16 cala do chirurgicznego nabierania miseczki optycznej wypławków unieruchomionych na zimnej płytce. Metoda ta obejmuje zarówno ablację pojedynczego, jak i podwójnego oka, przy czym oczy regenerują się w ciągu 1-2 tygodni, co pozwala na szeroki zakres zastosowań. W szczególności tę technikę ablacji można łatwo połączyć z farmakologicznymi i genetycznymi (interferencja RNA) badaniami przesiewowymi w celu lepszego zrozumienia mechanizmów regeneracyjnych i ich ewolucji, komórek macierzystych oka i ich utrzymania oraz fototaktycznych reakcji behawioralnych i ich podstaw neurologicznych.

Wprowadzenie

Planarianie są potężnym organizmem modelowym do badania regeneracji za pośrednictwem dorosłych komórek macierzystych. Te niepasożytnicze płazińce słodkowodne posiadają zdolność do regeneracji wszelkich brakujących tkanek, w tym ośrodkowego układu nerwowego i mózgu¹. Badane już w 1700 roku², postęp technologiczny w dziedzinie wypławków w ciągu ostatnich 10-15 lat (taki jak sekwencjonowany genom, hybrydyzacja in situ, immunohistochemia, interferencja RNA (RNAi) i transkryptomika) zaktualizowały ten historyczny organizm modelowy. W szczególności wypławki zyskały ostatnio popularność jako wyłaniający się model do ba....

Protokół

1. Hodowla zwierząt i obchodzenie się z nimi

UWAGA: Ten protokół wykorzystuje Schmidtea mediterranea, diploidalny gatunek wypławkowy o zsekwencjonowanym genomie^16,17, który jest powszechnie używany do badań nad regeneracją. Jednak test jest równie skuteczny w przypadku innych gatunków, takich jak Girardia tigrina i Girardia dorotocephala (które są dostępne w handlu).

1. Utrzymuj robaki w "wodzie robaka" wykonanej z 0,5 g/l soli morskich w ultraczystej (lub przefiltrowanej dejonizowanej) wodzie. Używaj sterylnych pojemników polipropylenowyc....

Wyniki

W ciągu pierwszych 1-2 h po operacji zwierzęta mogą wykazywać zmniejszoną ruchomość w porównaniu z nietkniętymi nicieniami (choć nadal będą się poruszać). W razie potrzeby nicienie zaczną żywić się w ciągu 24 h po operacji (na przykład w przypadku karmienia w celu RNAi). Monitorując regenerację oka u tych samych osobników w czasie, należy pamiętać o wykonaniu fotografii każdego nicienia zarówno przed operacją (w stanie nienaruszonym), jak i 1 h po ablacji (hpa). Do 4 dnia po ablacji (dpa).......

Dyskusja

Ta technika ablacji oka ulepsza obecne metody (takie jak dziurkowanie), wykluczając tkanki mózgowe i ograniczając wycinanie głównie do tkanek oka. Przy odrobinie praktyki technika ta może być wykonywana przez większość osób, od techników doświadczonych w mikrooperacjach po niedoświadczonych, ale sumiennych studentów studiów licencjackich. Zaleca się, aby technika ta była wielokrotnie praktykowana przed zastosowaniem ablacji w eksperymentach, w tym (jeśli to możliwe) potwierdzenie całkowitego usunięcia wszystkich tkanek o.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Rozpuszczalne sole morskie Ocean	Spectrum Brands	Pudełko SS15-10	"10 galonów"  (waga netto: 3 funty)
Niestrzępiąca się chusteczka Kimwipes EX-L	Kimberly-Clark	34155	4,5 x 8,5 cala
Bibuła filtracyjna Whatman #2	Sigma	WHA1002125	Kółka, średnica 125 mm, biała
Strzykawka insulinowa Easy Touch (z igłą)	Pet Health Market	17175-04	U-100 Strzykawka 1 cm³, igła 31 G 5/16 cala
szalka Petriego 100 mm	VWR	25384-342	Szalka Petriego 100 mm x 15 mm
60 mm	VWR	25384-092	60 mm x 15 mm
Dumont #5  kleszcze	Fine Science Tools	11254-20	Inox, końcówka prosta, 11 cm
Pipety transferowe	Samco Naukowe	225	Podziałka, duża żarówka, 7,5 mL, niesterylna
folia parafinowa Parafilm M	Marka	701606	Rolka 4 cale x 125 stóp
12-dołkowa nieobrobiona płytka do hodowli tkankowej	VWR	15705-059	Niepoddana obróbce, z płaskim dnem, sterylna, marki Falcon
Plastikowe pojemniki na żywność (dla kolonii)	Ziploc	Duży prostokąt	2,25 qt (2,12 L), 10" x 6 -3/4 " x 3 -3/16"
Planaria (Girardia tigrina)	Carolina Biological	132954	Sprzedawane jako "brązowe" Planaria; najczęściej są to G. tigrina (aka Dugesia tigrina), ale czasami są G. dorotocephala (alias Dugesia dorotocephala); Każdy z nich będzie działał.
Planaria (Schmidtea mediterranea)	n/a	n/a	S. mediterranea nie są dostępne w handlu. W tej chwili zwierzęta można pozyskać tylko w laboratoriach, które ich używają i mają dodatkowe zwierzęta.
Ręczniki papierowe brązowe	Grainger	2U229	9-3/16 x 9-3/8" 1-warstwowy ręcznik papierowy wielowarstwowy, NIEBIELONA
butelka do mycia (do wody z robaków), opcjonalnie	VWR	16650-275	, polietylen o niskiej gęstości, szerokie usta, 500 ml
przeciwciało antysynapsynowe, opcjonalnie	Badania rozwojowe Hybridoma Bank	3C11	Supernatant
Przeciwciało antyaresztynowe, opcjonalnie	nie	dotyczy	Niedostępne w handlu. Miły prezent od Michaela Levina, Tufts University
Nalgene Lowboy gróźb z króćcem (do przechowywania wody z robaków), opcjonalnie	Nalge Nunc International Corporation	2324-0015	15 L,  polipropylen, niski profil ułatwia napełnianie plastikowych pojemników na kolonie
Niestandardowa płytka Peltiera, opcjonalna	maszyna Williamsa, Foxboro, MA	n/a	Szczegóły projektu dzięki uprzejmości Junji Morokuma, Tufts University:  Płytka Peltiera jest zbudowana ze standardowej termoelektrycznej pompy ciepła (na przykład All Electronics Corp Catalog # PJT-1, 30 mm2).  Kwadratowa pompa ciepła pokryta jest cienką lustrzaną powierzchnią, a następnie umieszczona w kwadratowym otworze o średnicy 30 mm2 w okrągłej formie z pleksi (o średnicy ~50 mm). Ta forma ma podobną grubość do pompy ciepła i pasuje do dobrze obrobionej w środku okrągłego radiatora (o średnicy ~115 mm). Forma/pompa ciepła jest  "Zakotwiczony" do zlewu za pomocą silikonowej masy radiatora. Przewody są przewlekane przez otwory wywiercone zarówno w formie, jak i radiatorze. Dolna połowa radiatora jest wyposażona w "stopę", która pasuje do otworu płyty podstawy mikroskopu.
Źródło zasilania prądem stałym (dla płytki Peltiera), opcjonalnie	B i K Precision	1665	Regulowany niskonapięciowy zasilacz prądu stałego, 1-18 V (DC), 1-10 amperów.
Inne popularne materiały eksploatacyjne
Rękawice
Żyletka
Nożyczki
Luneta sekcyjna z oświetleniem
Podpórki pod pałeczki, opcjonalnie

Butelki do mycia na gęsiej szyi