Artykuł metodologiczny

Fluorometria zaciskowa napięcia w oocytach Xenopus przy użyciu fluorescencyjnych nienaturalnych aminokwasów

10.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55598

⸱

27 maja 2017

 , 
1Department of Pharmacology and Physiology, University of Montréal, 2Department of Physics, University of Montréal

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje ulepszenie konwencjonalnej fluorometrii zaciskowej (VCF), gdzie zamiast barwników maleimidowych stosuje się fluorescencyjne nienaturalne aminokwasy (fUAA), aby badać strukturalne przegrupowania w kanałach jonowych. Procedura obejmuje iniekcję DNA oocytów Xenopus, koiniekcję RNA/fUAA oraz jednoczesne pomiary prądu i fluorescencji.

Streszczenie

Lampometria cęgowa (VCF) była techniką z wyboru do badania struktury i funkcji elektrogenicznych białek błonowych, gdzie pomiary fluorescencji i prądów w czasie rzeczywistym jednocześnie informują o lokalnych rearanżacjach i funkcji globalnej, odpowiednio1. Podczas gdy techniki strukturalne o wysokiej rozdzielczości, takie jak mikroskopia krioelektronowa lub krystalografia rentgenowska, dostarczają statycznych obrazów białek będących przedmiotem zainteresowania, VCF dostarcza dynamicznych danych strukturalnych, które pozwalają nam powiązać przegrupowania strukturalne (fluorescencję) z dynamicznymi danymi funkcjonalnymi (elektrofizjologia). Do niedawna chemia tiolowo-reaktywna stosowana do ukierunkowanego na miejscu znakowania fluorescencyjnego białek ograniczała zakres tego podejścia, ponieważ wszystkie dostępne cysteiny, w tym endogenne, będą znakowane. W związku z tym konieczne było skonstruowanie białek wolnych od endogennych cystein. Znakowanie było również ograniczone do miejsc dostępnych od strony zewnątrzkomórkowej. Zmieniło się to dzięki zastosowaniu Fluorescent Unnatural Amino Acids (fUAA) w celu specyficznego włączenia małej sondy fluorescencyjnej w odpowiedzi na zatrzymanie supresji kodonów za pomocą ortogonalnej pary syntetazy tRNA i tRNA2. Poprawa VCF wymaga jedynie dwuetapowej procedury iniekcji DNA (para tRNA/syntetaza), a następnie jednoczesnej iniekcji RNA/fUAA. Obecnie możliwe jest znakowanie zarówno miejsc wewnątrzkomórkowych, jak i zakopanych, a zastosowanie VCF znacznie się rozszerzyło. Technika VCF staje się tym samym atrakcyjna dla badania szerokiej gamy białek i – co ważniejsze – pozwala na badanie licznych cytozolowych mechanizmów regulacyjnych.

Wprowadzenie

Ponad 200 nienaturalnych aminokwasów o różnych właściwościach chemicznych i fizycznych zostało genetycznie wbudowanych w białka w E. coli, drożdżach oraz komórkach ssaków3. Nienaturalny aminokwas jest wbudowywany w odpowiedzi na specyficzny kodon stop za pośrednictwem ortogonalnej, zmodyfikowanej pary tRNA/syntetaza. Genetyczne podejście do modyfikacji białek dostarczyło cennych informacji na temat struktury i funkcji białek. W niniejszym opracowaniu przedstawiamy protokół wykorzystania fluorometrii z blokowaniem napięcia (Voltage-Clamp Fluorometry, VCF) w połączeniu z fluorescencyjnym UAA.

W VCF jednoczesna obserwacja danych funkcjonalnych i przemieszczeń strukturalnych zlokalizowanych wokół sondy fluorescencyjnej (~5 Å) pozwala na uzyskanie informacji dynamicznych z rozdzielczością milisekundową1. Sondy fluorescencyjne zmieniają swój stan wygaszania podczas lokalnego ruchu białka. Przesunięcie o zaledwie 1-2 Å jest wystarczające, aby doprowadzić do znaczących zmian w intensywności fluorescencji4. Po zidentyfikowaniu interesującego miejsca w białku docelowym, miejsce to poddaje się mutacji punktowej. Klasycznie resydu mutowano na cysteinę, natomiast obecnie wprowadza się bursztynowy kodon stop (TAG) w celu genetycznej inkorporacji fUAA. Następnie białko jest transkrybowane in vitro.

Choć można stosować inne systemy ekspresyjne (np., komórki ssaków)5,6,7, oocyty Xenopus są preferowane w badaniach strukturalno-funkcjonalnych ze względu na ich większy rozmiar, co ułatwia manipulacje oraz zapewnia wyższą intensywność fluorescencji (więcej fluoroforów), a tym samym lepszy stosunek sygnału do szumu. Ponadto oocyty Xenopus charakteryzują się niskim tłem pochodzącym z białek endogennych2,8, a ciemna pigmentacja bieguna zwierzęcego chroni przed fluorescencją tła z cytozolu. Oocyty Xenopus są usuwane chirurgicznie, a DNA kodujące ortogonalną parę tRNA/tRNA-syntetaza specyficzną dla fUAA jest wstrzykiwane do jądra oocytów. Po czasie inkubacji wynoszącym 6-24 h, RNA białka jest współwstrzykiwane z fUAA do cytozolu oocytów, po czym następuje okres inkubacji trwający 2-3 dni. Aby zapobiec uszkodzeniu fUAA (fotobleachingowi), procedury obejmujące Anap muszą być przeprowadzane w czerwonym świetle, aby uniknąć wzbudzenia fluoroforu.

Oocyty badane są w układzie do zacisku napięciowego oocytów z nacięciem osłony, który jest zamontowany na odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym, przy jednoczesnej rejestracji zmian prądu elektrycznego i fluorescencji9,10. Alternatywnie można zastosować konfiguracje zacisku napięciowego z dwiema elektrodami1 lub metodę patch-clamp11. Fluorescencję wzbudza się odpowiednimi długościami fal o niskim poziomie szumu RMS, a emisję rejestruje za pomocą fotodiody połączonej z wysokowzmocniającym wzmacniaczem.

Stosowanie fluorescencyjnych nienaturalnych aminokwasów (fUAAs) w fluorometrii typu voltage-clamp wiąże się z kilkoma zaletami. Jedną z nich jest dostęp do strony cytozolowej białek błonowych; wiele procesów regulacyjnych ma tu swoje miejsce (np. miejsca wiązania Ca2+ lub nukleotydów, szybka inaktywacja oraz inaktywacja w stanie zamkniętym kanałów jonowych sterowanych napięciem, otwieranie porów, sprzęganie modułów). Wszystkie te procesy są obecnie dostępne do znakowania fluorescencyjnego.

Kolejną zaletą jest niewielki rozmiar sondy, co prowadzi do mniejszej perturbacji białka. Do tej pory opracowano dwie ortogonalne pary tRNA/syntetazy tRNA dla fUAA12,13, z których kwas 3-(6-acetylo-naftalen-2-yloamino)-2-aminopropanowy (Anap) jest jedynym fUAA wykorzystanym w oocytach Xenopus2,8. Anap jest fluoroforem wrażliwym na środowisko o masie cząsteczkowej 272,3 g/mol, który jest tylko nieznacznie większy od tryptofanu12 (Ryciny 1A, 1B). Dzięki niewielkiemu rozmiarowi, fluorofor ten prawdopodobnie wprowadza mniej efektów sterycznych w porównaniu do konwencjonalnych fluoroforów przyłączanych za pomocą łącznika (zazwyczaj powyżej 500 g/mol). Co więcej, w przypadku Anap fluorofor znajduje się bliżej szkieletu białkowego niż te przyłączone do cystein, w związku z czym Anap pozwala badać bardziej zlokalizowane reorganizacje. Wreszcie, usuwanie endogennych cystein w konwencjonalnym VCF w celu zapewnienia znakowania specyficznego dla miejsca nie jest już wymagane w UAA-VCF, co w rezultacie (i) pozostawia białka w (prawie) ich natywnym stanie oraz (ii) pozwala na zastosowanie VCF do badania szerszego zakresu białek, w których funkcja mogłaby zostać zmieniona przez substytucję cysteiny.

figure-introduction-1
Rycina 1: Widma absorpcyjne i fluorescencyjne Anap. (A) Struktura chemiczna Anap. (B) Znormalizowane widmo absorpcji i widma emisji dla 1 nM Anap, wykazujące wrażliwość fluorescencji Anap na hydrofobowość rozpuszczalnika. Widma emisji uzyskano przy wzbudzeniu przy 350 nm. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Wadą stosowania fluorescencyjnych UAA jest fakt, że w wyniku przeczytania kodonu stop, ponownego zainicjowania translacji, powstania białek z uciętym końcem C-terminalnym lub interferencji z endogenną aminacylacją może powstać heterogeniczna populacja białek, jeśli ilość aminacylowanych tRNA jest niewystarczająca. Taką nieszczelną ekspresję (leak expression) należy zawsze sprawdzać w obecności fUAA oraz pary tRNA/syntetazy tRNA. Kwestię ponownego zainicjowania translacji oraz sposób jej uniknięcia w przypadku miejsc insercji N-terminalnej omówiliśmy wcześniej14. Jednakże, gdy fUAA, tRNA i syntetaza tRNA są obecne w ilościach nasycających, pozostaje jedynie niskie prawdopodobieństwo nieszczelnej ekspresji.

Kluczowa różnica proceduralna między fUAA-VCF a konwencjonalnym VCF polega na wstrzykiwaniu i obchodzeniu się z oocytami; wstrzyknięciu DNA kodującego tRNA i syntetazę tRNA (pAnap) towarzyszy wprowadzenie Anap, które jest albo wstrzykiwane wspólnie z mRNA białka, albo dodawane do roztworu inkubacyjnego w formie estru acetoksymetylowego (AM).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Manipulacje z żabami przeprowadzono zgodnie z kanadyjskimi wytycznymi i zostały one zatwierdzone przez komisję etyki (CDEA, protokół nr 15-042) Uniwersytetu w Montréal.

1. Przygotowanie mRNA do inkorporacji fUAA

  1. Wybierz w białku miejsce, w którym spodziewane są zmiany konformacyjne. W tym regionie wybierz aminokwas, który zostanie zastąpiony przez fUAA.
    UWAGA: Wybór pozycji opiera się na oczekiwanych przemieszczeniach strukturalnych. Jeśli dostępna jest struktura o wysokiej rozdzielczości oraz hipoteza dotycząca spodziewanych ruchów, anap należy umieścić w taki sposób, aby zmieniło się jego otoczenie chemiczne; może to być zmiana stałej dielektrycznej (otoczenie hydrofobowe versus hydrofilowe) lub, co bardziej prawdopodobne, gaszenie fluorescencji przez inny aminokwas. Najlepszymi gaszaczami są tryptofany. Anap powinien stykać się z gaszaczem w jednym stanie (nakładanie się promieni van der Waalsa) i być od niego oddalony w drugim. W przypadku braku struktur o wysokiej rozdzielczości lub modeli, należy przeprowadzić skanowanie regionu zainteresowania. W obu przypadkach zaleca się wybranie kilku pobliskich lokalizacji, aby zwiększyć prawdopodobieństwo uzyskania ekspresji i sygnału fluorescencji. Aby zminimalizować efekty steryczne podczas dojrzewania i/lub funkcji białka, można zdecydować się na zastąpienie dużych aminokwasów aromatycznych (Phe, Trp, Tyr). Autorzy stwierdzili jednak, że bardziej produktywne jest skanowanie regionu zainteresowania pod kątem wstawienia fUAA bez względu na zastępowany aminokwas.
  2. W wybranym miejscu wprowadź bursztynowy kodon stop (TAG) za pomocą mutogenezy celowanej15. Upewnij się, że białko zainteresowania nie kończy się bursztynowym kodonem stop (TAG). Jeśli tak jest, dokonaj mutacji na inny kodon (ochrowy lub opalowy kodon stop). Namnóż, wyizoluj i zsekwencjonuj DNA. Uzyskaj mRNA białka poprzez transkrypcję in vitro16 i przechowuj mRNA w temperaturze 20 °C lub 80 °C.

2. Przygotowanie i iniekcja oocytów

  1. Chirurgicznie pobrać oocyty w stadium V lub VI od żab Xenopus laevis i przeprowadzić defolikulację za pomocą kolagenazy zgodnie z wcześniejszym opisem17.
    1. Zanurzyć żaby w odpowiednim środku znieczulającym zgodnie z zatwierdzonym protokołem dotyczącym zwierząt (w tym przypadku: ester etylowy kwasu 3-aminobenzoesowego). Znieczulenie jest wystarczające do zabiegu chirurgicznego, gdy zwierzę przestaje reagować na delikatne ściśnięcie czubka palca (utrata odruchu cofania).
    2. Niezwłocznie wyjąć żaby z roztworu znieczulającego i dokładnie opłukać skórę świeżą wodą. Płukanie to zapobiega przejściu zwierzęcia w głębsze stadia anestezji poprzez usunięcie niewchłoniętego związku chemicznego z powierzchni skóry.
    3. Chirurgicznie usunąć węzły jajnika z jednej strony i ostrożnie otworzyć węzły za pomocą dwóch pęset. Inkubować i mieszać oocyty w „standardowym roztworze do oocytów” (SOS) zawierającym 1% (w/v) kolagenazy przez 20-30 min w celu defolikulacji. Przemyć trzy razy roztworem SOS.
    4. Indywidualnie wybrać duże i zdrowe oocyty i inkubować je w roztworze Bartha uzupełnionym antybiotykami (100 U/mL penicyliny, 100 µg/mL streptomycyny, 10 mg/100 mL kanamycyny) oraz 5% surowicą końską w temperaturze 18 ͦC  przez co najmniej 4 h przed iniekcją.
      UWAGA: Po 2–4 zabiegach z zachowaniem 4-miesięcznych odstępów czasowych, żaby Xenopus laevis poddaje się eutanazji poprzez przedłużoną (>1 h) inkubację w estrze etylowym kwasu 3-aminobenzoesowego.
  2. W celu wstrzyknięcia DNA do jądra, przygotować długą i cienką igłę iniekcyjną, aby umożliwić dotarcie do jądra i uniknąć uszkodzenia oocytu. Napełnić igłę olejem i zamontować ją w nanoinjektorze.
    1. Zainstalować nanoinjektor pod mikroskopem stereoskopowym i za pomocą pęsety odłamać koniec igły. Wypychać olej, aż w końcówce igły nie pozostaną pęcherzyki powietrza.
  3. Nanieść 1 µL pAnap o stężeniu 0,1 µg/µL w wodzie wolnej od nukleaz zawierającej NaOH (1% 1 N NaOH) na kawałek parafilmu pod stereoskopem i napełnić igłę iniekcyjną DNA.
  4. Przenieść 40 oocytów do naczynia iniekcyjnego z siatką zawierającego roztwór Bartha z dodatkiem antybiotyków.
    UWAGA: Aby przygotować naczynie iniekcyjne z siatką, wyciąć odpowiednio docięty kawałek siatki nylonowej o oczkach 800 µm i dopasować go do polistyrenowej szalki Petriego. Do środka dodać chloroform, a następnie położyć na nim siatkę. Przyciskać siatkę, aż plastik stwardnieje.
  5. Ponieważ jądro oocytu znajduje się w biegunie zwierzęcym (ciemnym), skierować igłę w stronę centrum bieguna zwierzęcego i wprowadzić ją tak, aby końcówka dotarła w okolice centrum półkuli zwierzęcej (lub na głębokość 2-3 razy większą w porównaniu do iniekcji RNA). Wstrzyknąć 9,2 nL pAnap do jądra każdego oocytu. Cienka końcówka i mała objętość iniekcji mogą prowadzić do nieregularnego wstrzykiwania lub zapchania igły. Okazjonalnie sprawdzać poprawność działania iniekcji, wstrzykując ciecz w powietrze.
    UWAGA: Nie ma pewności, czy DNA zostało prawidłowo wprowadzone do jądra. Należy zatem spodziewać się, że 10–40% oocytów nie będzie wykazywać ekspresji pary tRNA/syntetaza. Więcej informacji znajduje się w sekcji Dyskusja.

figure-protocol-1
Rysunek 2: Ilustracja wstrzykiwania DNA i RNA do Xenopus oocytów w celu inkorporacji Anap.
W pierwszej kolejności pAnap jest wstrzykiwany do jądra oocytu Xenopus (1). Po 6–24 h Anap oraz RNA kanału są wstrzykiwane wspólnie do bieguna wegetatywnego (2). Anap zostanie ortogonalnie aminokacylowany przez tRNA zawierający bursztynowy antykodon stop, za pomocą syntetazy aminoacyl-tRNA kodowanej przez pAnap. W ten sposób aminokacylowane Anap-tRNA są rozpoznawane przez rybosom w miejscu wstawionego bursztynowego kodonu stop w RNA kanału, co prowadzi do supresji kodonu stop i wbudowania Anap. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Inkubować oocyty w 2 mL roztworu Bartha z dodatkiem antybiotyków i 5% surowicy konia (HS) w temperaturze 18 °C przez 6-24 h, aby umożliwić silną ekspresję specyficznych dla Anap tRNA oraz syntetaz tRNA.
    UWAGA: Inkubacja DNA może trwać kilka dni przed wstrzyknięciem RNA, ale nie zwiększa ona poziomu ekspresji.
  2. Przygotować nanowstrzykiwacz do iniekcji RNA (analogicznie do kroku 2.2, jednak końcówka do iniekcji nie musi być tak cienka, jak w przypadku iniekcji DNA). Od tego momentu pracować wyłącznie w świetle czerwonym, aby zapobiec fotobleachingowi Anap.
  3. Wymieszać 1 µL Anap o stężeniu 1 mM z 1 µL mRNA o stężeniu 1-2 µg/µL bezpośrednio na kawałku parafilmu i napełnić końcówkę do iniekcji zmieszanym roztworem. Wbić końcówkę tuż poniżej błony w biegun wegetatywny (jasny) i wstrzyknąć 46 nL do każdego oocyta poddanego iniekcji pAnap.
    UWAGA: Wymagane stężenie mRNA zależy od badanego białka.
  4. Inkubować oocyty chronione przed światłem w pudełku lub owinięte w folię aluminiową, w roztworze Bartha z dodatkiem antybiotyków i 5% surowicy konia w temperaturze 18 °C przez 2-3 dni. Codziennie wymieniać roztwór Bartha na świeży i usuwać martwe oocyty, aby uniknąć kontaminacji.

3. Konfiguracja VCF

  1. Zainstaluj zestaw do pomiarów voltage-clamp w przeciętych oocytach zgodnie z wcześniejszym opisem18.
  2. Zamontuj system do rejestracji elektrofizjologicznej na odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym, instalując komorę pomiarową na suwaku, który umożliwia przesuwanie jej między standardowym stereoskopem służącym do umieszczania oocytu a mikroskopem do przeprowadzania pomiarów fluorescencji (Rysunek 2c).
    UWAGA: Geometria komory dla przeciętych oocytów nie nadaje się do wykorzystania zwykłego światła przechodzącego do oświetlenia podczas manipulacji. Dlatego do oświetlania z boku od góry stosuje się halogenową lampę z „gęsią szyją” i czerwonym filtrem. Kondensor mikroskopu można zdjąć, aby zrobić miejsce na obniżenie stolika dla komory elektrofizjologicznej.
  3. Podłącz system detekcji fotodiodowej do wyjścia C-mount mikroskopu fluorescencyjnego (Rysunek 2a). Podłącz odczyt prądu fotonowego do drugiego kanału wejściowego w cyfrowym procesorze sygnałowym (DSP, przetwornik analogowo-cyfrowy/cyfrowo-analogowy).
  4. Jako źródło światła do wzbudzenia fluorescencji zastosuj lampę halogenową 100 W, 12 V.
    UWAGA: Alternatywnie można stosować lampy rtęciowe, jednak ich natężenie musi zostać zredukowane, aby zapobiec zbyt szybkiemu fotoblaknięciu podczas rejestracji. Oświetlenie LED jest zalecane tylko wtedy, gdy odpowiednie diody LED wykazują znaczną intensywność w zakresie wzbudzenia (np. ~350 nm dla Anap). Większość białych diod LED nie sięga daleko w widmo UV.
  5. Wstaw sterowaną elektrycznie migawkę między źródło światła wzbudzenia a mikroskop i podłącz jej sterowanie (zazwyczaj impuls TTL) do wyjścia cyfrowego DSP. Zaprogramuj czas impulsu TTL w oprogramowaniu do rejestracji (patrz dokumentacja producenta) tak, aby migawka otwierała się ok. 100 ms przed rozpoczęciem rejestracji. W ten sposób ewentualne wibracje podczas procesu otwierania nie zakłócą pomiaru. Czas ten zależy od prędkości i wibracji migawki. Zakończ impuls 5 ms przed końcem rejestracji, jak pokazano na Rysunku 4. W ten sposób zostanie zarejestrowana również wartość całkowitej fluorescencji.
  6. Wstaw odpowiednią kostkę filtrów (filtr wzbudzenia, lustro dichroiczne i filtr emisji) do obrotowej głowicy filtrów. Dla Anap zastosuj Ex: filtr pasmowy 377/50 nm, lustro dichroiczne longpass 409 nm oraz Em: filtr pasmowy 470/40 nm.

figure-protocol-2
Rysunek 3: Układ VCF. (A) Widok z boku układu VCF przedstawiający drogę światła wewnątrz mikroskopu. Kostka filtracyjna zawiera filtr wzbudzenia, lustro dichroiczne i filtr emisji. (B) Wybrane wymiary komory dla oocytów to 3,4 cm dla promienia górnej komory (1), 5,5 cm dla długości dolnej komory (2), 1,4 cm dla szerokości dolnej komory (3) oraz 1,7 cm dla szerokości środkowej komory (4). (C) Widok z przodu układu VCF. Pierwszy okular po lewej służy do montażu oocytu w rozciętej komorze clampa napięciowego oraz do permeabilizacji. Następnie komora jest przesuwana pod mikroskop do drugiego okularu po prawej. Tutaj, przy użyciu obiektywu 4X, elektroda V1 jest wprowadzana do oocytu, a fluorescencja jest rejestrowana za pomocą obiektywu imersyjnego 40X. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

4. Rejestracja VCF

  1. Postępuj zgodnie z etapami przygotowania do zacisku napięciowego w rozciętym oocycie, zgodnie z wcześniejszym opisem i wizualizacją18 (przygotowanie mostka agarowego, montaż oocytu, permeabilizacja saponiną). Należy jednak przez cały czas pracować przy czerwonym świetle, aby uniknąć wybielenia fluoroforu przed rozpoczęciem pomiarów. Podczas umieszczania oocytu upewnij się, że biegun zwierzęcy jest skierowany ku górze. Pigmentacja pod błoną bieguna zwierzęcego chroni przed autofluorescencją pochodzącą z cytozolu, co tym samym redukuje fluorescencję tła.
  2. Przesuń komorę pod mikroskop i ustaw ostrość, używając obiektywu 4X.
  3. Wprowadź do oocytu elektrodę V1 do pomiaru napięcia (3 M KCl), a następnie przełącz na obiektyw immersyjny 40X (NA 0,8 - 0,9). Ustaw ostrość na skierowanym ku górze biegunie zwierzęcym.
  4. Wyłącz czerwone światło. Wybierz odpowiednią kostkę filtracyjną, obracając wieżyczkę filtrów, oraz port wyjściowy optyki połączony z fotodiodą. Włącz lampę halogenową na maksymalną intensywność i na krótko otwórz migawkę na 2-5 s, aby odczytać natężenie fluorescencji tła pochodzącej z oocytu. Przy opisanym ustawieniu wartość dla Anap powinna wynosić około 50-200 pA.
  5. Włącz zacisk (clamp), przełącz przełącznik bath/guard w pozycję aktywną i dostosuj potencjał błonowy (V1 - V2) do potencjału sterującego, obracając pokrętło na przedwzmacniaczu I.
  6. W oprogramowaniu do rejestracji wybierz potencjał podtrzymujący, protokół skokowy, liczbę i długość impulsów itp. Zarejestruj prądy zależne od napięcia oraz natężenia fluorescencji Anap.

5. Dwukolorowa VCF

  1. Aby monitorować jednocześnie dwa miejsca w tym samym białku, należy zmutować zewnątrzkomórkowy i dostępny aminokwas na cysteinę oraz usunąć pozostałe cysteiny, aby zapewnić specyficzne znakowanie z wykorzystaniem chemii tiolowej.
  2. Wykonać kroki 2.1-2.5.
  3. Przed pomiarami VCF inkubować oocyty w 5 µM TMR-maleimidu w roztworze do znakowania przez 15 min (lub użyć innego barwnika o widmie niepokrywającym się z widmem Anap).
  4. Przepłukać oocyty roztworem do znakowania trzy razy, aby usunąć nadmiar barwnika.
  5. Wykonać kroki 4.1-4.6.
  6. Wstawić do wieżyczki filtrów odpowiedni kostkę filtru dla TMR (filtr wzbudzenia, lustro dichroiczne i filtr emisji). Przełączyć na kostkę filtru TMR, obracając wieżyczką filtrów.
  7. Odczytać fluorescencję tła dla TMR w sposób opisany dla Anap w kroku 4.4.
    UWAGA: Znakowanie z wykorzystaniem chemii tiolowej skutkuje wysoką fluorescencją tła ze względu na niespecyficzne znakowanie w błonie. W związku z tym fluorescencja tła TMR może nasycić wzmacniacz (>2,000 pA). W takim przypadku nie należy zmniejszać natężenia światła, lecz po prostu odjąć fluorescencję tła, dodając prąd offsetowy do fotodiody. W systemach dostępnych komercyjnie należy użyć funkcji „sample-and-hold” w systemie detekcji. Wartość fluorescencji tła (przy użyciu filtra neutralnego 10X) należy odnotować w dzienniku laboratoryjnym, ponieważ wartość ta nie zostanie zarejestrowana (nasycenie).
  8. Rejestrować jednocześnie prądy zależne od napięcia oraz natężenia fluorescencji TMR, zgodnie z krokiem 4.6.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 4 przedstawia przykład rejestracji VCF uzyskanych z oocytu wykazującego ekspresję kanałów Shaker z usuniętą szybką inaktywacją (IR), L382stop-W434F w obecności pAnap i Anap. Mutacja W434F blokuje jonowe prądy potasowe, co umożliwia pomiar przejściowych przemieszczeń ładunku bramkowania (prądów bramkowania). Symultaniczne rejestracje prądów bramkowania (górny ślad) i zmian natężenia fluorescencji Anap (dolny ślad) podczas depolaryzacji demonstrują pomyślną inkorpor...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Aminoacylacja in vivo tRNA, które są w sposób ciągły transkrybowane wraz z syntetazą tRNA, umożliwia uzyskanie wysokich poziomów ekspresji do pomiarów fluorescencji. Aby zapewnić skuteczne włączenie fUAA, bardzo ważne jest, aby pAnap był prawidłowo wstrzykiwany do jądra. Ze względu na niepewność co do dokładnej lokalizacji jądra, oczekuje się, że 10-40% wstrzyknięć DNA zakończy się niepowodzeniem, co spowoduje brak ekspresji (lub ekspresję przecieku) oocytów. Dlatego ważne jest, aby sprawdzić ekspresję pod nieob...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

pAnap był miłym prezentem od Dr. Petera Schultza (Scripps Research Institute). Praca ta została sfinansowana przez Canadian Institutes for Health Research Grants MOP-102689 i MOP-136894 (dla R.B.) oraz Canadian Foundation for Innovation Grant 950-225005.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Solutions
Roztwór Bartha
NaCl Sigma-AldrichS765390 mM
KClFisher ScientificBP366-5003 mM
MgSO4Sigma-AldrichM-93970,82 mM
CaCl2Sigma-AldrichC-79020,41 mM
Ca(NO3)2Sigma-AldrichC-13960,33 mM
HEPESSigma-AldrichH40345 mM
NaOH hydratBDHBDH7225-4pH 7,6
PenicilinInvitrogen15140122100 U/ml
StreptomycynaInvitrogen15140122100 &mikro; g/ml
KanamycynaInvitrogen1516005410 mg/100 ml
surowicy końskiej (HS)Invitrogen160501225%
SOS Standardowy roztwór oocytów
NaCl Sigma-Aldrich746398102 mM
KClSigma-Aldrich7464363 mM
MgCl2Sigma-AldrichM92721 mM
HEPESSigma-AldrichH40345 mM
Zewnętrzne rozwiązanie rejestrujące
N-metylo-D-glukamina (NMDG)Alfa AesarL14282115 mM
HEPESSigma-AldrichH403410 mM
Wodorotlenek wapniaSigma-Aldrich2392322 mM
Hydrat MESSigma-Aldrich258105pH 7,2
Roztwór do zapisu wewnętrznego
N-metylo-D-glukamina (NMDG)Alfa AesarL14282115 mM
HEPESSigma-AldrichH403410 mM
Kwas etylenodiamino-tetraoctowy (EDTA)Fisher ScientificE478-5002 mM
Hydrat MESSigma-Aldrich258105pH 7,2
Roztwór do znakowania
KOHFisher ScientificP250-1115 mM
HEPESSigma-AldrichH403410 mM
Wodorotlenek wapniaSigma-Aldrich2392322 mM
Hydrat MESSigma-Aldrich258105pH 7,2
TMRroztwór podstawowy
Tetramethylrodamino-5-maleimid (TMR)Sondy molekularne firmy Life TechnologiesT60275 mM w DMSO
Anap roztwór podstawowy
AnapABZENA (TCRS)Niestandardowa synteza TCRS-1701 mM w wodzie wolnej od nukleaz i 1% NaOH 1 N
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Materiał/Sprzęt
pAnapAddgene48696
Wysokowydajny zacisk oocytówDagan CorporationCA-1B
Gpatch Oprogramowanie do akwizycjiWydział Anestezjologii, Uniwersytet Kalifornijski, Los Angeles
Oprogramowanie analityczneWydział Anestezjologii, Uniwersytet Kalifornijski, Los Angeles
Komora nagraniowaSpecjalnie obrobiony
system detekcji diod fotograficznychDagan CorporationPhotoMax-200/PIN
Elektryczny sterownik migawkiUNIBLITZVCM-D1

Bibliografia

  1. Mannuzzu, L. M., Moronne, M. M., Isacoff, E. Y. Direct physical measure of conformational rearrangement underlying potassium channel gating. Science. 271 (5246), 213-216 (1996).
  2. Kalstrup, T., Blunck, R. Dynamics of internal pore opening in K(V) channels probed by a fluorescent unnatural amino acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (20), 8272-8277 (2013).
  3. Xiao, H., Schultz, P. G. At the Interface of Chemical and Biological Synthesis: An Expanded Genetic Code. Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (9), (2016).
  4. Blunck, R. Chapter 9. Handbook of Ion Channels. , CRC Press. 113-133 (2015).
  5. Chatterjee, A., Guo, J., Lee, H. S., Schultz, P. G. A genetically encoded fluorescent probe in mammalian cells. J Am Chem Soc. 135 (34), 12540-12543 (2013).
  6. DeBerg, H. A., Brzovic, P. S., Flynn, G. E., Zagotta, W. N., Stoll, S. Structure and Energetics of Allosteric Regulation of HCN2 Ion Channels by Cyclic Nucleotides. J Biol Chem. 291 (1), 371-381 (2016).
  7. Shen, B., et al. Genetically encoding unnatural amino acids in neural stem cells and optically reporting voltage-sensitive domain changes in differentiated neurons. Stem Cells. 29 (8), 1231-1240 (2011).
  8. Aman, T. K., Gordon, S. E., Zagotta, W. N. Regulation of CNGA1 Channel Gating by Interactions with the Membrane. J Biol Chem. 291 (19), 9939-9947 (2016).
  9. Haddad, G. A., Blunck, R. Mode shift of the voltage sensors in Shaker K+ channels is caused by energetic coupling to the pore domain. J Gen Physiol. 137 (5), 455-472 (2011).
  10. Batulan, Z., Haddad, G. A., Blunck, R. An intersubunit interaction between S4-S5 linker and S6 is responsible for the slow off-gating component in Shaker K+ channels. J Biol Chem. 285 (18), 14005-14019 (2010).
  11. Kusch, J., et al. How subunits cooperate in cAMP-induced activation of homotetrameric HCN2 channels. Nat Chem Biol. 8 (2), 162-169 (2012).
  12. Lee, H. S., Guo, J., Lemke, E. A., Dimla, R. D., Schultz, P. G. Genetic incorporation of a small, environmentally sensitive, fluorescent probe into proteins in Saccharomyces cerevisiae. J Am Chem Soc. 131 (36), 12921-12923 (2009).
  13. Summerer, D., et al. A genetically encoded fluorescent amino acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (26), 9785-9789 (2006).
  14. Kalstrup, T., Blunck, R. Reinitiation at non-canonical start codons leads to leak expression when incorporating unnatural amino acids. Sci Rep. 5, 11866(2015).
  15. Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnol. 8, 91(2008).
  16. Beckert, B., Masquida, B. Synthesis of RNA by in vitro transcription. Methods Mol Biol. 703, 29-41 (2011).
  17. Goldin, A. L. Maintenance of Xenopus laevis and oocyte injection. Methods Enzymol. 207, 266-279 (1992).
  18. Rudokas, M. W., Varga, Z., Schubert, A. R., Asaro, A. B., Silva, J. R. The Xenopus oocyte cut-open vaseline gap voltage-clamp technique with fluorometry. J Vis Exp. (85), (2014).
  19. Zhao, J., Blunck, R. The isolated voltage sensing domain of the Shaker potassium channel forms a voltage-gated cation channel. Elife. 5, (2016).
  20. Posson, D. J., Ge, P., Miller, C., Bezanilla, F., Selvin, P. R. Small vertical movement of a K+ channel voltage sensor measured with luminescence energy transfer. Nature. 436 (7052), 848-851 (2005).
  21. Chanda, B., Asamoah, O. K., Blunck, R., Roux, B., Bezanilla, F. Gating charge displacement in voltage-gated ion channels involves limited transmembrane movement. Nature. 436 (7052), 852-856 (2005).
  22. Taraska, J. W., Puljung, M. C., Zagotta, W. N. Short-distance probes for protein backbone structure based on energy transfer between bimane and transition metal ions. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16227-16232 (2009).
  23. Baker, B. J., et al. Genetically encoded fluorescent sensors of membrane potential. Brain Cell Biol. 36 (1-4), 53-67 (2008).
  24. Miranda, P., et al. State-dependent FRET reports calcium- and voltage-dependent gating-ring motions in BK channels. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2013).
  25. Sisido, M., Ninomiya, K., Ohtsuki, T., Hohsaka, T. Four-base codon/anticodon strategy and non-enzymatic aminoacylation for protein engineering with non-natural amino acids. Methods. 36 (3), 270-278 (2005).
  26. Hohsaka, T., Ashizuka, Y., Murakami, H., Sisido, M. Five-base codons for incorporation of nonnatural amino acids into proteins. Nucleic Acids Res. 29 (17), 3646-3651 (2001).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Etykietowanie celowanedwuetapowa iniekcjainiekcja DNAwsp iniekcja RNAmikroskopia fluorescencyjnarejestracja elektrofizjologicznadetekcja fotodiodowa

Powiązane artykuły