Artykuł metodologiczny

Fluorometria zaciskowa napięcia w oocytach Xenopus przy użyciu fluorescencyjnych nienaturalnych aminokwasów

10.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55598

⸱

27 maja 2017

 , 
1Department of Pharmacology and Physiology, University of Montréal, 2Department of Physics, University of Montréal

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje ulepszenie konwencjonalnej fluorometrii zaciskowej (VCF), gdzie zamiast barwników maleimidowych stosuje się fluorescencyjne nienaturalne aminokwasy (fUAA), aby badać strukturalne przegrupowania w kanałach jonowych. Procedura obejmuje iniekcję DNA oocytów Xenopus, koiniekcję RNA/fUAA oraz jednoczesne pomiary prądu i fluorescencji.

Streszczenie

Lampometria cęgowa (VCF) była techniką z wyboru do badania struktury i funkcji elektrogenicznych białek błonowych, gdzie pomiary fluorescencji i prądów w czasie rzeczywistym jednocześnie informują o lokalnych rearanżacjach i funkcji globalnej, odpowiednio1. Podczas gdy techniki strukturalne o wysokiej rozdzielczości, takie jak mikroskopia krioelektronowa lub krystalografia rentgenowska, dostarczają statycznych obrazów białek będących przedmiotem zainteresowania, VCF dostarcza dynamicznych danych strukturalnych, które pozwalają nam powiązać przegrupowania strukturalne (fluorescencję) z dynamicznymi danymi funkcjonalnymi (elektrofizjologia). Do niedawna chemia tiolowo-reaktywna stosowana do ukierunkowanego na miejscu znakowania fluorescencyjnego białek ograniczała zakres tego podejścia, ponieważ wszystkie dostępne cysteiny, w tym endogenne, będą znakowane. W związku z tym konieczne było skonstruowanie białek wolnych od endogennych cystein. Znakowanie było również ograniczone do miejsc dostępnych od strony zewnątrzkomórkowej. Zmieniło się to dzięki zastosowaniu Fluorescent Unnatural Amino Acids (fUAA) w celu specyficznego włączenia małej sondy fluorescencyjnej w odpowiedzi na zatrzymanie supresji kodonów za pomocą ortogonalnej pary syntetazy tRNA i tRNA2. Poprawa VCF wymaga jedynie dwuetapowej procedury iniekcji DNA (para tRNA/syntetaza), a następnie jednoczesnej iniekcji RNA/fUAA. Obecnie możliwe jest znakowanie zarówno miejsc wewnątrzkomórkowych, jak i zakopanych, a zastosowanie VCF znacznie się rozszerzyło. Technika VCF staje się tym samym atrakcyjna dla badania szerokiej gamy białek i – co ważniejsze – pozwala na badanie licznych cytozolowych mechanizmów regulacyjnych.

Wprowadzenie

Ponad 200 nienaturalnych aminokwasów o różnych właściwościach chemicznych i fizycznych zostało genetycznie wbudowanych w białka w E. coli, drożdżach i komórkach ssaków3. Nienaturalny aminokwas jest wbudowywany w odpowiedzi na specyficzny kodon stop za pomocą ortogonalnej, zmodyfikowanej pary tRNA/syntetaza. Genetyczne podejście do modyfikacji białek dostarczyło cennych informacji na temat struktury i funkcji białek. W niniejszej pracy przedstawiamy protokół wykorzystania fluorometrii z zaciskiem napięciowym (Voltage-Clamp Fluorometry, VCF) w połączeniu z fluorescencyjnym nienaturalnym aminokwasem (UAA).

W metodzie VCF jednoczesna obserwacja danych funkcjonalnych i reorganizacji strukturalnych zlokalizowanych wokół sondy fluorescencyjnej (~5 Å) pozwala na uzyskanie informacji dynamicznych z rozdzielczością milisekundową1. Sondy fluorescencyjne zmieniają swój stan wygaszania podczas lokalnego ruchu białka. Przesunięcie o zaledwie 1-2 Å jest wystarczające, aby doprowadzić do istotnych zmian w intensywności fluorescencji4. Po zidentyfikowaniu miejsca zainteresowania w białku docelowym, miejsce to jest modyfikowane za pomocą mutacji punktowej. Klasycznie resztę mutowano na cysteinę, natomiast obecnie wprowadza się bursztynowy kodon stop (TAG) w celu genetycznej inkorporacji fUAA. Następnie białko jest transkrybowane in vitro.

Choć można stosować inne systemy ekspresji (np. komórki ssaków)5,6,7, oocyty Xenopus są preferowane w badaniach struktury i funkcji ze względu na większy rozmiar, co ułatwia manipulacje i zapewnia wyższą intensywność fluorescencji (więcej fluoroforów), a tym samym lepszy stosunek sygnału do szumu. Co więcej, oocyty Xenopus charakteryzują się niskim tłem pochodzącym od białek endogennych2,8, a ciemna pigmentacja bieguna zwierzęcego chroni przed fluorescencją tła z cytozolu. Oocyty Xenopus są usuwane chirurgicznie, a DNA kodujące ortogonalną parę tRNA/tRNA-syntetaza specyficzną dla fUAA jest wstrzykiwane do jądra oocytów. Po 6-24 h inkubacji, RNA białka jest współwstrzykiwane wraz z fUAA do cytozolu oocytów, po czym następuje okres inkubacji trwający 2-3 dni. Aby zapobiec uszkodzeniu fUAA (fotoblaknięciu), procedury obejmujące Anap muszą być przeprowadzane w czerwonym świetle, aby uniknąć wzbudzenia fluoroforu.

Oocyty badane są przy użyciu układu do zaciskania napięcia (voltage-clamp) w oocytach rozciętych, który jest zamontowany na odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym, co pozwala na jednoczesną rejestrację zmian prądu elektrycznego i fluorescencji9,10. Alternatywnie można zastosować konfiguracje dwuelektrodowego zaciskania napięcia1 lub patch-clamp11. Fluorescencja jest wzbudzana za pomocą odpowiednich długości fal o niskim szumie RMS, a emisja rejestrowana jest przy użyciu fotodiody połączonej z wzmacniaczem o wysokim stopniu wzmocnienia.

Stosowanie fluorescencyjnych nienaturalnych aminokwasów (fUAAs) w fluorometrii z zaciskiem napięcia (voltage-clamp fluorometry) niesie ze sobą szereg zalet. Jedną z nich jest dostęp do strony cytozolowej białek błonowych; tutaj zlokalizowanych jest wiele procesów regulacyjnych (np. miejsca wiązania Ca2+ lub nukleotydów, szybka i zamknięta inaktywacja potencjałowo zależnych kanałów jonowych, otwieranie porów, sprzęganie modułów). Wszystkie te procesy są obecnie dostępne do znakowania fluorescencyjnego.

Kolejną zaletą jest niewielki rozmiar sondy, co prowadzi do mniejszych zakłóceń struktury białka. Do tej pory zaprojektowano dwie ortogonalne pary tRNA/ syntetaza tRNA dla fUAA12,13, z których kwas 3-(6-acetylnaftalen-2-yloamino)-2-aminopropanowy (Anap) jest jedynym fUAA użytym w oocytach Xenopus2,8. Anap jest fluoroforem wrażliwym na środowisko o masie cząsteczkowej 272.3 g/mol i jest tylko nieznacznie większy od tryptofanu12 (ryciny 1A, 1B). Dzięki niewielkiemu rozmiarowi, fluorofor ten prawdopodobnie wprowadza mniej efektów sterycznych w porównaniu do konwencjonalnych fluoroforów przyłączanych za pomocą łącznika (zazwyczaj powyżej 500 g/mol). Co więcej, w przypadku Anap fluorofor znajduje się bliżej szkieletu białkowego niż te połączone z cysteinami, w konsekwencji Anap pozwala badać bardziej zlokalizowane przegrupowania. Wreszcie, usuwanie endogennych cystein w konwencjonalnym VCF w celu zapewnienia znakowania specyficznego dla miejsca nie jest już wymagane w UAA-VCF, co zatem (i) pozostawia białka w (niemal) ich natywnym stanie oraz (ii) pozwala na zastosowanie VCF do badania szerszego zakresu białek, których funkcja mogłaby zostać zmieniona przez substytucję cysteiny.

Schemat struktury cząsteczkowej wraz z wykresem widm absorpcji/emisji; badanie rozpuszczalników DMSO i wody.
Rycina 1: Widma Anap i fluorescencji. (A) Struktura chemiczna Anap. (B) Znormalizowane widmo absorpcji oraz widma emisji dla 1 nM Anap, wykazujące wrażliwość fluorescencji Anap na hydrofobowość rozpuszczalnika. Widma emisji uzyskano przy wzbudzeniu przy 350 nm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wadą stosowania fluorescencyjnych UAAs jest to, że w wyniku przeczytania kodonu stop, ponownej inicjacji translacji, powstania białek z uciętym końcem C lub interferencji z endogenną aminoacylacją (w przypadku niedoboru aminoacylowanych tRNA) może powstać heterogenna populacja białek. Taką nieszczelną ekspresję należy zawsze sprawdzać w warunkach braku fUAA oraz pary tRNA/syntetazy tRNA. Problem ponownej inicjacji translacji oraz sposób jego rozwiązania dla miejsc insercji N-końcowych omówiliśmy wcześniej14. Jednakże, gdy fUAA, tRNA i syntetaza tRNA są obecne w ilościach nasycających, pozostaje jedynie niskie prawdopodobieństwo wystąpienia nieszczelnej ekspresji.

Kluczową różnicą proceduralną między fUAA-VCF a konwencjonalnym VCF jest sposób iniekcji i obchodzenia się z oocytami; po iniekcji DNA kodującego tRNA i syntetazę tRNA (pAnap) następuje wprowadzenie Anap, która jest albo ko-iniekowana wraz z mRNA białka, albo alternatywnie dodawana do roztworu inkubacyjnego w postaci estru acetoksymetylowego (AM).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Manipulacje z żabami były przeprowadzane zgodnie z kanadyjskimi wytycznymi i zostały zatwierdzone przez komisję etyczną (CDEA, protokół #15-042) Uniwersytetu w Montréal.

1. Przygotowanie mRNA do inkorporacji fUAA

  1. Wybierz w białku miejsce zainteresowania, w którym oczekiwane są zmiany konformacyjne. Wybierz w tym regionie aminokwas, który zostanie zastąpiony fUAA.
    UWAGA: Wybór pozycji opiera się na oczekiwanych przemieszczeniach strukturalnych. Jeśli dostępna jest struktura o wysokiej rozdzielczości oraz hipoteza dotycząca przewidywanych ruchów, anap należy umieścić tak, aby środowisko chemiczne uległo zmianie; może to być zmiana stałej dielektrycznej (środowisko hydrofobowe względem hydrofilowego) lub, co bardziej prawdopodobne, wygaszanie przez inny aminokwas. Najlepszymi wygaszaczami są tryptofany. Anap powinien znajdować się w kontakcie z wygaszaczem w jednym stanie (nakładanie się promieni van der Waalsa) i być od niego oddalony w drugim. W przypadku braku struktur o wysokiej rozdzielczości lub modeli, należy przeprowadzić skanowanie regionu zainteresowania. W obu przypadkach zaleca się wybranie kilku pobliskich lokalizacji, aby zwiększyć prawdopodobieństwo uzyskania ekspresji i sygnału fluorescencji. Aby zminimalizować efekty steryczne podczas dojrzewania i/lub funkcjonowania białka, można zdecydować się na zastąpienie dużych aminokwasów aromatycznych (Phe, Trp, Tyr). Autorzy stwierdzili jednak, że bardziej produktywne jest skanowanie regionu zainteresowania w celu wstawienia fUAA niezależnie od zastępowanego aminokwasu.
  2. Wstaw bursztynowy kodon stop (TAG) w wybranym miejscu za pomocą mutogenezy celowanej15. Upewnij się, że białko zainteresowania nie kończy się bursztynowym kodonem stop (TAG). Jeśli tak jest, zmutuj go na inny (ochrowy lub opalowy kodon stop). Amplifikuj, izoluj i sekwencjonuj DNA. Uzyskaj mRNA białka poprzez transkrypcję in vitro16 i przechowuj mRNA w temperaturze 20 °C lub 80 °C.

2. Przygotowanie i iniekcja oocytów

  1. Chirurgicznie pobrać oocyty w stadium V lub VI od żab Xenopus laevis i przeprowadzić defolikulację z użyciem kolagenazy zgodnie z wcześniejszym opisem17.
    1. Zanurzyć żaby w odpowiednim środku znieczulającym zgodnie z zatwierdzonym protokołem dotyczącym zwierząt (w tym przypadku: ester etylowy kwasu 3-aminobenzoesowego). Zwierzęta uznaje się za odpowiednio znieczulone do operacji, gdy przestają reagować na delikatne uszczypnięcie koniuszka palca (utrata odruchu cofania).
    2. Niezwłocznie wyjąć żaby z roztworu znieczulającego i dokładnie opłukać skórę świeżą wodą. Płukanie to zapobiega zapadnięciu się zwierzęcia w głębsze stadia narkozy poprzez usunięcie niewchłoniętego związku chemicznego z powierzchni skóry.
    3. Chirurgicznie usunąć węzły jajnika z jednej strony i ostrożnie otworzyć węzły za pomocą dwóch pincet. Inkubować i mieszać oocyty w „standardowym roztworze do oocytów” (SOS) zawierającym 1% (w/v) kolagenazy przez 20-30 min w celu defolikulacji. Przemyć trzykrotnie roztworem SOS.
    4. Indywidualnie wybrać duże i zdrowe oocyty i inkubować je w roztworze Bartha uzupełnionym antybiotykami (100 U/mL penicyliny, 100 µg/mL streptomycyny, 10 mg/100 mL kanamycyny) oraz 5% surowicą końską w temperaturze 18 ͦC przez co najmniej 4 h przed iniekcją.
      UWAGA: Po 2–4 operacjach w odstępach 4-miesięcznych, osobniki Xenopus laevis są uśmiercane poprzez przedłużoną (>1 h) inkubację w estrze etylowym kwasu 3-aminobenzoesowego.
  2. W celu iniekcji DNA do jądra komórkowego przygotować długą i cienką igłę iniekcyjną, aby umożliwić dotarcie do jądra i uniknąć uszkodzenia oocytu. Napełnić igłę olejem i zamontować ją w nanoinjektorze.
    1. Zainstalować nanoinjektor pod stereomikroskopem i za pomocą pincety przełamać koniec igły. Wytłaczać olej do momentu, aż w końcówce igły nie będzie pęcherzyków powietrza.
  3. Nanieść 1 µL pAnap o stężeniu 0.1 µg/µL w wodzie wolnej od nukleaz zawierającej NaOH (1% 1 N NaOH) na fragment parafilmu pod stereoskopem i napełnić igłę iniekcyjną DNA.
  4. Przenieść 40 oocytów do naczynia iniekcyjnego z siatką zawierającego roztwór Bartha uzupełniony antybiotykami.
    UWAGA: Aby przygotować naczynie iniekcyjne z siatką, wyciąć fragment siatki nylonowej o oczkach 800 µm o odpowiednim rozmiarze, aby wypełniła ona polistyrenową szalkę Petriego. Dodać chloroform do środka, a następnie położyć na nim siatkę. Docisnąć siatkę, aż plastik stwardnieje.
  5. Ponieważ jądro oocytu znajduje się w biegunie zwierzęcym (ciemnym), skierować igłę w centrum bieguna zwierzęcego i wprowadzić ją tak, aby igła dotarła w okolice centrum półkuli zwierzęcej (lub na głębokość 2-3x większą w porównaniu do iniekcji RNA). Wstrzyknąć 9.2 nL pAnap do jądra każdego oocytu. Cienka igła i mała objętość iniekcji mogą prowadzić do nieregularnego wstrzykiwania lub zapchania igły. Okazjonalnie sprawdzać poprawność działania iniekcji, wykonując wstrzyknięcie w powietrze.
    UWAGA: Nie ma pewności, czy DNA zostało prawidłowo wstrzyknięte do jądra. Należy zatem spodziewać się, że 10–40% oocytów nie będzie wykazywać ekspresji pary tRNA/syntetaza. Więcej informacji znajduje się w sekcji Dyskusja.

Schemat procesu edycji genów z interakcją tRNA i syntetazy, jądrem komórkowym i syntezą mRNA.
Rysunek 2: Ilustracja wstrzykiwania DNA i RNA do oocytów Xenopus w celu inkorporacji Anap.
W pierwszej kolejności pAnap jest wstrzykiwany do jądra oocytu Xenopus (1). Po 6–24 h Anap oraz RNA kanału są współwstrzykiwane do bieguna wegetatywnego (2). Anap zostanie ortogonalnie acylowany do tRNA posiadającego antykodon stop amber przez aminoacyl-tRNA syntetazę kodowaną przez pAnap. W ten sposób acylowane Anap-tRNA są rozpoznawane przez rybosom w miejscu wstawionego kodonu stop amber w RNA kanału, co prowadzi do supresji kodonu stop i wbudowania Anap. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Inkubować oocyty w 2 mL roztworu Bartha z dodatkiem antybiotyków i 5% surowicy konia (HS) w temperaturze 18 °C przez 6-24 h, aby umożliwić silną ekspresję specyficznych dla Anap tRNA oraz syntetaz tRNA.
    UWAGA: Inkubacja DNA może trwać kilka dni przed iniekcją RNA, jednak nie zwiększa to poziomu ekspresji.
  2. Przygotować nanostrzykawkę do iniekcji RNA (analogicznie do kroku 2.2, jednak końcówka do iniekcji nie musi być tak cienka jak w przypadku iniekcji DNA). Od tego momentu pracować wyłącznie w czerwonym świetle, aby zapobiec fotoblaknięciu Anap.
  3. Wymieszać 1 µL 1 mM Anap z 1 µL mRNA o stężeniu 1-2 µg/µL bezpośrednio na kawałku parafilmu, a następnie napełnić końcówkę do iniekcji otrzymanym roztworem. Przebić membranę tuż poniżej bieguna wegetatywnego (jasnego) i wstrzyknąć 46 nL do każdego oocytu iniekcyjnego pAnap.
    UWAGA: Wymagane stężenie mRNA zależy od badanego białka.
  4. Inkubować oocyty chronione przed światłem w pudełku lub owinięte w folię aluminiową, w roztworze Bartha z dodatkiem antybiotyków i 5% surowicy konia w temperaturze 18 °C przez 2-3 dni. Codziennie wymieniać roztwór Bartha na świeży i usuwać martwe oocyty, aby uniknąć kontaminacji.

3. Konfiguracja VCF

  1. Zainstaluj sprzęt do pomiaru prądów w konfiguracji voltage-clamp dla rozciętych oocytów zgodnie z wcześniejszym opisem18.
  2. Zamontuj system rejestracji elektrofizjologicznej na pionowym mikroskopie fluorescencyjnym, instalując komorę pomiarową na prowadnicy umożliwiającej jej przesuwanie między standardowym stereoskopem służącym do umieszczania oocytu a mikroskopem do wykonywania pomiarów fluorescencji (Rycina 2c).
    UWAGA: Geometria komory dla rozciętych oocytów nie pozwala na wykorzystanie standardowego światła przechodzącego do oświetlenia podczas manipulacji. Dlatego do bocznego oświetlenia od góry stosuje się halogenową lampę typu „gooseneck” z czerwonym filtrem. Kondensor mikroskopu można usunąć, aby zrobić miejsce na obniżenie stolika dla komory elektrofizjologicznej.
  3. Podłącz system detekcji fotodiodowej do wyjścia C-mount mikroskopu fluorescencyjnego (Rycina 2a). Podłącz odczyt prądu fotonowego do drugiego kanału wejściowego w cyfrowym procesorze sygnałowym (DSP, przetwornik analogowo-cyfrowy/cyfrowo-analogowy).
  4. Jako źródło światła do wzbudzenia fluorescencji zastosuj lampę halogenową 100 W, 12 V.
    UWAGA: Alternatywnie można użyć lamp rtęciowych, jednak ich intensywność musi zostać zredukowana, aby zapobiec zbyt szybkiemu fotoblaknięciu podczas pomiarów. Oświetlenie LED jest zalecane tylko wtedy, gdy odpowiednie diody wykazują znaczną intensywność w zakresie wzbudzenia (np. ~350 nm dla Anap). Większość białych diod LED nie sięga głęboko w widmo UV.
  5. Umieść elektrycznie sterowaną migawkę między źródłem światła wzbudzenia a mikroskopem i podłącz jej sterowanie (zazwyczaj impuls TTL) do wyjścia cyfrowego DSP. Zsynchronizuj impuls TTL w oprogramowaniu do rejestracji (zobacz dokumentację producenta) tak, aby migawka otwierała się ok. 100 ms przed rozpoczęciem pomiaru. W ten sposób wszelkie wibracje podczas procesu otwierania nie zakłócą rejestracji. Czas ten zależy od prędkości i wibracji migawki. Zakończ impuls 5 ms przed końcem pomiaru, jak pokazano na Rycynie 4. W ten sposób rejestrowana jest również wartość całkowitej fluorescencji.
  6. Włóż odpowiednią kostkę filtrów (filtr wzbudzenia, lustro dichroiczne i filtr emisji) do obrotowej wieżyczki filtrów. Dla Anap zastosuj Ex: filtr przepustowy 377/50 nm, lustro dichroiczne długoprzepustowe 409 nm oraz Em: filtr przepustowy 470/40 nm.

Układy mikroskopu optycznego do badań spektroskopowych i elektrofizjologicznych, w tym kostka filtracyjna.
Rysunek 3: Układ VCF. (A) Widok z boku układu VCF pokazujący drogę światła wewnątrz mikroskopu. Kostka filtracyjna zawiera filtr wzbudzenia, lustro dichroiczne i filtr emisji. (B) Wybrane wymiary komory do oocytów to 3,4 cm dla promienia górnej komory (1), 5,5 cm dla długości dolnej komory (2), 1,4 cm dla szerokości dolnej komory (3) oraz 1,7 cm dla szerokości środkowej komory (4). (C) Widok z przodu układu VCF. Pierwszy okular po lewej służy do montażu oocytu w rozciętej komorze voltage clamp oraz do permeabilizacji. Następnie komora jest wsuwana pod mikroskop przy drugim okularze po prawej. Tutaj elektroda V1 jest wprowadzana do oocytu przy użyciu obiektywu 4X, a fluorescencja jest rejestrowana przy użyciu obiektywu imersyjnego w wodzie 40X. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

4. Rejestracja VCF

  1. Należy przeprowadzić etapy przygotowania do rejestracji prądów w konfiguracji voltage-clamp z rozciętym oocytem, zgodnie z wcześniejszym opisem i instrukcją wizualną18 (przygotowanie mostka agarowego, montaż oocytu, permeabilizacja saponiną). Należy jednak przez cały czas pracować przy czerwonym świetle, aby uniknąć fotobleachingu fluoroforu przed rozpoczęciem pomiarów. Podczas umieszczania oocytu należy upewnić się, że biegun zwierzęcy jest skierowany do góry. Pigmentacja pod błoną bieguna zwierzęcego chroni przed autofluorescencją pochodzącą z cytozolu, co redukuje fluorescencję tła.
  2. Przesunąć komorę pod mikroskop i ustawić ostrość, korzystając z obiektywu 4X.
  3. Wprowadzić elektrodę V1 do pomiaru napięcia (3 M KCl) do oocytu, a następnie przełączyć na obiektyw imersyjny wodny 40X (NA 0,8 - 0,9). Ustawić ostrość na skierowanym do góry biegunie zwierzęcym.
  4. Wyłączyć czerwone światło. Wybrać odpowiednią kostkę filtracyjną, obracając wieżyczkę filtrów, oraz port wyjściowy optyki połączony z fotodiodą. Włączyć lampę halogenową z maksymalną intensywnością i na krótko otworzyć migawkę na 2-5 s, aby odczytać intensywność fluorescencji tła pochodzącej z oocytu. Przy opisanym układzie wartość dla Anap powinna wynosić około 50-200 pA.
  5. Włączyć wzmacniacz clamp, przełączyć przełącznik bath/guard w tryb aktywny i dostosować potencjał błonowy (V1 - V2) do potencjału zadanego, obracając pokrętło na przedwzmacniaczu I.
  6. W oprogramowaniu do rejestracji wybrać potencjał podtrzymujący, protokół skokowy, liczbę i czas trwania impulsów itd. Zarejestrować prądy zależne od napięcia oraz intensywności fluorescencji Anap.

5. Dwukolorowe VCF

  1. Aby jednocześnie monitorować dwa miejsca w tym samym białku, zmutuj aminokwas zewnątrzkomórkowy i dostępny na cysteinę oraz usuń pozostałe cysteiny, aby zapewnić specyficzne znakowanie z wykorzystaniem chemii tioli.
  2. Wykonaj kroki 2.1-2.5.
  3. Przed pomiarami VCF inkubuj oocyty w 5 µM TMR-maleimide w roztworze do znakowania przez 15 min (lub użyj innego barwnika o widmach niezakładających się z widmem Anap).
  4. Przepłucz oocyty roztworem do znakowania trzy razy, aby usunąć nadmiar barwnika.
  5. Wykonaj kroki 4.1-4.6.
  6. Włóż do wieżyczki odpowiednią kostkę filtrów dla TMR (filtr wzbudzenia, lustro dichroiczne i filtr emisji). Przełącz na kostkę filtrów TMR, obracając wieżyczkę filtrów.
  7. Odczytaj fluorescencję tła dla TMR zgodnie z opisem dla Anap w kroku 4.4.
    UWAGA: Znakowanie z wykorzystaniem chemii tioli skutkuje wysoką fluorescencją tła ze względu na niespecyficzne znakowanie w błonie. W związku z tym fluorescencja tła TMR może nasycić wzmacniacz (>2,000 pA). W takim przypadku nie zmniejszaj natężenia światła, lecz po prostu odejmij fluorescencję tła, dodając prąd przesunięcia (offset) do fotodiody. W systemach dostępnych komercyjnie użyj funkcji „sample-and-hold” w systemie detekcji. Zapisz w dzienniku laboratoryjnym wartość fluorescencji tła (używając filtra neutralnego ND 10X), ponieważ wartość ta nie zostanie zarejestrowana (nasycenie).
  8. Rejestruj jednocześnie prądy zależne od napięcia oraz intensywności fluorescencji TMR, analogicznie do kroku 4.6.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rycina 4 przedstawia przykład zapisów VCF uzyskanych z oocytu ekspresującego kanały Shaker z usuniętą szybką inaktywacją (IR), L382stop-W434F w obecności pAnap i Anap. Mutacja W434F blokuje jonowe prądy potasowe, co umożliwia pomiar przejściowych przemieszczeń ładunków bramkowania (prądów bramkowania). Symultaniczne zapisy prądów bramkowania (górny ślad) i zmian natężenia fluorescencji Anap (dolny ślad) podczas depolaryzacji demonstrują pomyślną inkorporację Anap w pozycj...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Aminoacylacja in vivo tRNA, które są w sposób ciągły transkrybowane wraz z syntetazą tRNA, umożliwia uzyskanie wysokich poziomów ekspresji do pomiarów fluorescencji. Aby zapewnić skuteczne włączenie fUAA, bardzo ważne jest, aby pAnap był prawidłowo wstrzykiwany do jądra. Ze względu na niepewność co do dokładnej lokalizacji jądra, oczekuje się, że 10-40% wstrzyknięć DNA zakończy się niepowodzeniem, co spowoduje brak ekspresji (lub ekspresję przecieku) oocytów. Dlatego ważne jest, aby sprawdzić ekspresję pod nieob...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

pAnap był miłym prezentem od Dr. Petera Schultza (Scripps Research Institute). Praca ta została sfinansowana przez Canadian Institutes for Health Research Grants MOP-102689 i MOP-136894 (dla R.B.) oraz Canadian Foundation for Innovation Grant 950-225005.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Solutions
Roztwór Bartha
NaCl Sigma-AldrichS765390 mM
KClFisher ScientificBP366-5003 mM
MgSO4Sigma-AldrichM-93970,82 mM
CaCl2Sigma-AldrichC-79020,41 mM
Ca(NO3)2Sigma-AldrichC-13960,33 mM
HEPESSigma-AldrichH40345 mM
NaOH hydratBDHBDH7225-4pH 7,6
PenicilinInvitrogen15140122100 U/ml
StreptomycynaInvitrogen15140122100 &mikro; g/ml
KanamycynaInvitrogen1516005410 mg/100 ml
surowicy końskiej (HS)Invitrogen160501225%
SOS Standardowy roztwór oocytów
NaCl Sigma-Aldrich746398102 mM
KClSigma-Aldrich7464363 mM
MgCl2Sigma-AldrichM92721 mM
HEPESSigma-AldrichH40345 mM
Zewnętrzne rozwiązanie rejestrujące
N-metylo-D-glukamina (NMDG)Alfa AesarL14282115 mM
HEPESSigma-AldrichH403410 mM
Wodorotlenek wapniaSigma-Aldrich2392322 mM
Hydrat MESSigma-Aldrich258105pH 7,2
Roztwór do zapisu wewnętrznego
N-metylo-D-glukamina (NMDG)Alfa AesarL14282115 mM
HEPESSigma-AldrichH403410 mM
Kwas etylenodiamino-tetraoctowy (EDTA)Fisher ScientificE478-5002 mM
Hydrat MESSigma-Aldrich258105pH 7,2
Roztwór do znakowania
KOHFisher ScientificP250-1115 mM
HEPESSigma-AldrichH403410 mM
Wodorotlenek wapniaSigma-Aldrich2392322 mM
Hydrat MESSigma-Aldrich258105pH 7,2
TMRroztwór podstawowy
Tetramethylrodamino-5-maleimid (TMR)Sondy molekularne firmy Life TechnologiesT60275 mM w DMSO
Anap roztwór podstawowy
AnapABZENA (TCRS)Niestandardowa synteza TCRS-1701 mM w wodzie wolnej od nukleaz i 1% NaOH 1 N
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Materiał/Sprzęt
pAnapAddgene48696
Wysokowydajny zacisk oocytówDagan CorporationCA-1B
Gpatch Oprogramowanie do akwizycjiWydział Anestezjologii, Uniwersytet Kalifornijski, Los Angeles
Oprogramowanie analityczneWydział Anestezjologii, Uniwersytet Kalifornijski, Los Angeles
Komora nagraniowaSpecjalnie obrobiony
system detekcji diod fotograficznychDagan CorporationPhotoMax-200/PIN
Elektryczny sterownik migawkiUNIBLITZVCM-D1

Bibliografia

  1. Mannuzzu, L. M., Moronne, M. M., Isacoff, E. Y. Direct physical measure of conformational rearrangement underlying potassium channel gating. Science. 271 (5246), 213-216 (1996).
  2. Kalstrup, T., Blunck, R. Dynamics of internal pore opening in K(V) channels probed by a fluorescent unnatural amino acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (20), 8272-8277 (2013).
  3. Xiao, H., Schultz, P. G. At the Interface of Chemical and Biological Synthesis: An Expanded Genetic Code. Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (9), (2016).
  4. Blunck, R. Chapter 9. Handbook of Ion Channels. , CRC Press. 113-133 (2015).
  5. Chatterjee, A., Guo, J., Lee, H. S., Schultz, P. G. A genetically encoded fluorescent probe in mammalian cells. J Am Chem Soc. 135 (34), 12540-12543 (2013).
  6. DeBerg, H. A., Brzovic, P. S., Flynn, G. E., Zagotta, W. N., Stoll, S. Structure and Energetics of Allosteric Regulation of HCN2 Ion Channels by Cyclic Nucleotides. J Biol Chem. 291 (1), 371-381 (2016).
  7. Shen, B., et al. Genetically encoding unnatural amino acids in neural stem cells and optically reporting voltage-sensitive domain changes in differentiated neurons. Stem Cells. 29 (8), 1231-1240 (2011).
  8. Aman, T. K., Gordon, S. E., Zagotta, W. N. Regulation of CNGA1 Channel Gating by Interactions with the Membrane. J Biol Chem. 291 (19), 9939-9947 (2016).
  9. Haddad, G. A., Blunck, R. Mode shift of the voltage sensors in Shaker K+ channels is caused by energetic coupling to the pore domain. J Gen Physiol. 137 (5), 455-472 (2011).
  10. Batulan, Z., Haddad, G. A., Blunck, R. An intersubunit interaction between S4-S5 linker and S6 is responsible for the slow off-gating component in Shaker K+ channels. J Biol Chem. 285 (18), 14005-14019 (2010).
  11. Kusch, J., et al. How subunits cooperate in cAMP-induced activation of homotetrameric HCN2 channels. Nat Chem Biol. 8 (2), 162-169 (2012).
  12. Lee, H. S., Guo, J., Lemke, E. A., Dimla, R. D., Schultz, P. G. Genetic incorporation of a small, environmentally sensitive, fluorescent probe into proteins in Saccharomyces cerevisiae. J Am Chem Soc. 131 (36), 12921-12923 (2009).
  13. Summerer, D., et al. A genetically encoded fluorescent amino acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (26), 9785-9789 (2006).
  14. Kalstrup, T., Blunck, R. Reinitiation at non-canonical start codons leads to leak expression when incorporating unnatural amino acids. Sci Rep. 5, 11866(2015).
  15. Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnol. 8, 91(2008).
  16. Beckert, B., Masquida, B. Synthesis of RNA by in vitro transcription. Methods Mol Biol. 703, 29-41 (2011).
  17. Goldin, A. L. Maintenance of Xenopus laevis and oocyte injection. Methods Enzymol. 207, 266-279 (1992).
  18. Rudokas, M. W., Varga, Z., Schubert, A. R., Asaro, A. B., Silva, J. R. The Xenopus oocyte cut-open vaseline gap voltage-clamp technique with fluorometry. J Vis Exp. (85), (2014).
  19. Zhao, J., Blunck, R. The isolated voltage sensing domain of the Shaker potassium channel forms a voltage-gated cation channel. Elife. 5, (2016).
  20. Posson, D. J., Ge, P., Miller, C., Bezanilla, F., Selvin, P. R. Small vertical movement of a K+ channel voltage sensor measured with luminescence energy transfer. Nature. 436 (7052), 848-851 (2005).
  21. Chanda, B., Asamoah, O. K., Blunck, R., Roux, B., Bezanilla, F. Gating charge displacement in voltage-gated ion channels involves limited transmembrane movement. Nature. 436 (7052), 852-856 (2005).
  22. Taraska, J. W., Puljung, M. C., Zagotta, W. N. Short-distance probes for protein backbone structure based on energy transfer between bimane and transition metal ions. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16227-16232 (2009).
  23. Baker, B. J., et al. Genetically encoded fluorescent sensors of membrane potential. Brain Cell Biol. 36 (1-4), 53-67 (2008).
  24. Miranda, P., et al. State-dependent FRET reports calcium- and voltage-dependent gating-ring motions in BK channels. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2013).
  25. Sisido, M., Ninomiya, K., Ohtsuki, T., Hohsaka, T. Four-base codon/anticodon strategy and non-enzymatic aminoacylation for protein engineering with non-natural amino acids. Methods. 36 (3), 270-278 (2005).
  26. Hohsaka, T., Ashizuka, Y., Murakami, H., Sisido, M. Five-base codons for incorporation of nonnatural amino acids into proteins. Nucleic Acids Res. 29 (17), 3646-3651 (2001).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Etykietowanie celowanedwuetapowa iniekcjainiekcja DNAwsp iniekcja RNAmikroskopia fluorescencyjnarejestracja elektrofizjologicznadetekcja fotodiodowa

Powiązane artykuły