Metoda przygotowania komórek owadzie i zakażania ich bakulowirusem w celu produkcji rekombinowanego białka mCD1d oraz generowania tetramerów mCD1d.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Metoda produkcji rekombinowanego białka mCD1d w komórkach owadzych.
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Białka CD1 stanowią trzecią klasę cząsteczek prezentujących antygen. Są to glikoproteiny powierzchniowe komórek, występujące w formie glikozylowanych łańcuchów ciężkich o masie około 50 kDa, które są niewalencyjnie związane z beta2-mikroglobuliną. Wiążą one lipidy, a nie peptydy. Chociaż ich struktura potwierdza podobieństwo białek CD1 do cząsteczek prezentujących antygeny MHC klasy I i klasy II, rowek mCD1d jest stosunkowo wąski, głęboki i silnie hydrofobowy; posiada on dwie kieszenie wiążące zamiast kilku płytkich kieszeni opisanych dla klasycznych cząsteczek prezentujących antygeny kodowanych przez MHC. Biorąc pod uwagę ich sekwencje aminokwasowe, taki hydrofobowy rowek zapewnia idealne środowisko do wiązania antygenów lipidowych.
Komórki Natural Killer T (NKT) wykorzystują swój TCR do rozpoznawania glikolipidów związanych z CD1d lub prezentowanych przez to białko. Limfocyty T reagujące na lipidy prezentowane przez CD1 uczestniczą w ochronie przed chorobami autoimmunologicznymi i zakaźnymi oraz w odrzucaniu nowotworów. Z tego względu zdolność do identyfikacji, oczyszczania i śledzenia odpowiedzi komórek NKT reaktywnych wobec CD1 ma ogromne znaczenie. Generowanie tetramerów alfa-galaktocylozamidu (a-Galcer) z CD1d dostarczyło istotnych informacji na temat biologii komórek NKT. Wygenerowano również tetramery zbudowane z innych cząsteczek CD1, a te nowe odczynniki znacznie rozszerzyły wiedzę o funkcjach lipidoreaktywnych limfocytów T, z potencjalnym zastosowaniem w monitorowaniu odpowiedzi na szczepionki oparte na lipidach oraz w diagnostyce chorób autoimmunologicznych i innych metodach leczenia.
Protokół
I. Rozmrażanie komórek
Wyjąć zamrożoną fiolkę z komórkami TN5 i rozmrozić ją w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C. Do kolby T.C o powierzchni 25cm2 dodać 5ml pożywki insect Express (Invitrogen, numer katalogowy-10486). Należy pamiętać, że pożywka Express five nie zawiera glutaminy; do 1 lt pożywki należy dodać 10ml 100X glutaminy z pen-strepem lub samej glutaminy. Przenieść komórki TN5 do kolby i inkubować przez 30 minut w inkubatorze o temperaturze 27°C. Następnie delikatnie odessać pożywkę z DMSO, uważając, aby nie naruszyć komórek przytwierdzonych do dna kolby. Dodać 5ml świeżej pożywki.
II. Hodowla i namnażanie komórek
Monitoruj komórki każdego dnia. Gdy konfluencja w kolbie wyniesie blisko 70%, doprowadź do zawieszenia komórki, uderzając w oba boki kolby, a następnie przenieś je do kolby 175cm2, dodając 21 ml pożywki Insect express oraz 5ml kultury komórkowej. Każda kolba T175 powinna zawierać około 25-30ml pożywki jako objętość końcowa. W razie potrzeby rozdziel konfluentną kolbę (stężenie ok. 1 miliona/ml) w stosunku 1/4 lub 1/5. Nie dopuszczaj do nadmiernego rozrostu komórek. Odnotuj liczbę pasaży, w których rozdzielano komórki. Nie hoduj komórek powyżej 30 pasażu, ponieważ może to doprowadzić do starzenia się komórek i w konsekwencji do ich lizy. Po osiągnięciu pożądanej objętości przy stężeniu 1 miliona/ml zainfekuj komórki.
Zazwyczaj hoduję od 2 do 2,5 litra, co zazwyczaj odpowiada siedemdziesięciu kolbach o pojemności 175cm2 i ok. 25 do 30ml na kolbę, lub pięciu kolbach Erlenmeyera o pojemności 1 litra i ok. 400ml do 500 ml w każdej kolbie
Uwaga: Komórki można hodować w kolbie z korkiem T-175 lub w kolbie Erlenmeyera firmy Corning. Hodowla komórek w kolbach Erlenmeyera jest szybsza i łatwiejsza.
III. Miareczkowanie wirusa metodą rozcieńczeń końcowych
- Wysiać 3000-5000 komórek na studzienkę na płytce 96-dołkowej z płaskim dnem w 200 µL pożywki Express five SFM. Pozostawić komórki do osiadania w temperaturze 27°C przez co najmniej 30 minut.
- Przygotować rozcieńczenia seryjne zapasu bakulowirusa. Należy wykonać rozcieńczenie 1/10 w jednym rzędzie płytki 96-dołkowej z dnem w kształcie litery U, stosując 250 µL na studzienkę. Rozcieńczenia przygotowuje się w pożywce Express Five SFM.
- Za pomocą pipety wielokanałowej przenieść stałą ilość (zazwyczaj 20 µL) różnych rozcieńczeń do komórek.
- Inkubować w temperaturze 27°C przez 7 dni. Aby zapobiec odparowywaniu z krawędzi płyty, owinąć brzegi płytki parafilmem.
- Po 7 dniach sprawdzić płytkę i ustalić, które rozcieńczenie wirusa daje 50% infekcji (połowa studzienek przy tym stężeniu wirusa jest zainfekowana). Następnie zastosować wzór do obliczenia miana, wyrażonego w pfu/ml (pfu – jednostki tworzące plamy). Wzór ten znajduje się w większości instrukcji dotyczących bakulowirusów.
IV. Zakażanie komórek
Bardzo ważne jest określenie dokładnego miana wirusa. Należy dodać wymaganą ilość wirusa. W przypadku przygotowania zapasu wirusa komórki powinny zostać zainfekowane przy wielokrotności infekcji (MOI) nieprzekraczającej 1 (1pfu na 1 komórkę High Five). Wyższe MOI prowadzi do powstawania mutacji wirusowych. W celu produkcji białka zazwyczaj stosuje się MOI 5-10.
Przykład:
Miano bakulowirusa mCD1d = 1X108 pfu/ml
Dodać MOI=1 (w celu namnożenia wirusa)= 20X10^6 komórek/ kolba / 1X10^8 pfu / ml=200 ul / kolba
MOI = 5 do 10 (dla produkcji białka) = 1ml do 2ml na 20x10^6 komórek/kolbę
W 4. dniu po infekcji należy ocenić zainfekowane komórki. Powinny być one ododerwane, pływające, obrzęknięte i przybrać kształt wydłużonych pęcherzyków.
V. Odzyskiwanie nadpływów
Pobrać pożywkę z zakażonych kolb i przenieść ją do butelek wirówkowych Falcon z niebieskimi nakrętkami o pojemności 250ml. Mogą być one autoklawowane i używane ponownie. Napełnić butelki równomiernie i odwirować komórki w rotorze Sorvall GSA przy 200rpm przez 20 minut w temperaturze 4°C. Zebrać supernatant i przystąpić do dalszego oczyszczania.
VI. Oczyszczanie rekombinowanego mCD1d
- Dializa i zagęszczanie w buforze fosforanowym sodu 150mM (pH 7.4)
- Elucja białka mCD1d+b2m za pomocą chromatografii na agarozie Ni-NTA przy użyciu fosforanu sodu 150mM + imidazolu 200mM
- Przeprowadzenie odsalania na kolumnie z użyciem buforu Tris Hcl 20mM pH8 w celu usunięcia imidazolu
- Przeprowadzenie anionowymiennej chromatografii na kolumnie MonoQ w celu usunięcia pozostałych zanieczyszczeń.
- Zagęszczenie do 1mg/ml przy użyciu koncentratora YM 30 (Millipore)
- Enzymatyczna biotynylacja mCD1d za pomocą BirA zgodnie z protokołem producenta (Avidity)
- Wolna biotyna jest usuwana na kolumnie S200 (chromatografia wykluczania cząsteczkowego) z użyciem soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS), pH7.4. Z 2 litrów supernatantu można uzyskać średnio od 2 do 3 mg biotynilowanego białka
- Produkcja tetrameru a-Galcer CD1d.
Aby załadować cząsteczkę CD1d za pomocą $\alpha$-Galcer, rozpuszczalne biotynilowane CD1d-b2m inkubuje się przez noc w temperaturze pokojowej z trzykrotnym molowym nadmiarem $\alpha$-Galcer, rozpuszczonego w 0,5% Tween-20 w PBS, 0,9% NaCl. Tetramery otrzymuje się poprzez zmieszanie monomerów CD1d załadowanych $\alpha$-Galcer z czterokrotnym molowym nadmiarem streptawidyny sprzężonej z PE i inkubację przez 4 godziny w temperaturze pokojowej. Przechowywać w temperaturze 4°C.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W niniejszej procedurze przedstawiono sposób inicjowania, hodowli i infekcji komórek owadziech oraz metodę miareczkowania bakulowirusa przy użyciu tych komórek. Najważniejszymi aspektami tej procedury są utrzymanie komórek oraz dokładne określenie miana bakulowirusa. Po wygenerowaniu tetramerów CD1 mogą one służyć jako potężne narzędzie do analizy limfocytów T reagujących na glikolipidy. Systemy bakulowirusowe są również szeroko stosowane do produkcji białek rekombinowanych, w tym tetramerów MHC klasy II, dzięki czemu pr...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze | |
|---|---|---|---|---|
| Express Five SFM | Pożywka bezsurowicza | Invitrogen | 10486025 | |
| High Five TM | Komórki owadzie | Invitrogen | B855-02 | |
| Glutamine Pen strep | Antybiotyki | Invitrogen | 10378-016 | |
| Kolba TC 25 cm² | Plastikowa | Fisher Scientific | 10-126-28 | |
| Kolba TC 175 cm² | Kolba z korkiem | Fisher Scientific | 10-126-8 | |
| Kolba Erlenmeyera | Kolba do hodowli komórkowej | Fisher Scientific | 07 200 672 | |
| Koncentrator YM 30 | 30,000 MWCO | EMD Millipore | UFC 903096 | |
| Sprzęt FPLC | GE Healthcare | |||
| Enzym i bufor BrA | Zestaw do biotinylacji | Avidity | BIRA500 | |
| Kolumna Ni-NTA Agarose | Kolumna do oczyszczania białek z tagiem His | GE Healthcare | ||
| Kolumna odsalająca | Do usuwania soli z białka | GE Healthcare | ||
| Kolumna MonoQ | Chromatografia wymiany anionowej | GE Healthcare | ||
| Kolumna S200 | Chromatografia wykluczania molekularnego | GE Healthcare | ||
| alfa-Galcer | Glikolipid | |||
| PE-Streptawidyna | Do sprzęgania białek | Molecular Probes, Life Technologies | S-866 |
Bibliografia
- Benlagha, K., Weiss, A., Beavis, A., Teyton, L., Bendelac, A. In vivo identification of glycolipipd antigen-specific T cells using fluorecent CD1d tetramers. J. Exp. Med. 191, 1895-1903 (2000).
- Kinjo, Y., Wu, D., Kim, G., Xing, G. W., Poles, M. A., Ho, D. D., Tsuji, M., Kawahara, K., Wong, C. H., Kronenberg, M. Recognition of bacterial glycosphingolipids by natural killer T cells. Nature. 434, 520-525 (2005).
- Binding and antigen presentation of ceramide-containing glycolipids by soluble mouse and human CD1d molecules. J. Exp. Med. 190, 1069-1080 (1999).
- Porcelli, S. A. The CD1 family: A third lineage of antigen- presenting molecules. Adv. Immunol. 59, 1-98 (1995).
- Sidobre, S., Kronemberg, M. CD1 tetramers: A powerful tool for the analysis of glycolipid-reactive T cells. J. Immunol. 169, 1340-1348 (2002).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
