$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Dochodzenie jest zgodne z Przewodnikiem do Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych opublikowanym przez Narodowe Instytuty Zdrowia USA (Publikacja NIH nr 85-23, 1985) i zostało zatwierdzone przez lokalną komisję etyki Uniwersytetu w Giessen. W badaniu wykorzystano dorosłe samce szczurów rasy Wistar o wadze 200 - 250 g.
1. Autoklawowanie
- Co najmniej jeden dzień przed planowanym zabiegiem należy przelać w autoklawie wszystkie narzędzia chirurgiczne, końcówki do pipet oraz pipety Pasteura, które mają być używane w procedurze izolacji, w temperaturze 121 °C przez 30 minut.
2. Przygotowanie mediów i rozwiązań
UWAGA: Roztwory z kroków 2.1-2.4 można przygotować do tygodnia przed izolacją i przechowywać w temperaturze 4 °C, ale roztwory w krokach 2.5-2.8 należy przygotować w dniu izolacji. Pełne receptury i pożywek podane są w tabeli 1. Przed rozpoczęciem przygotowania podgrzać wszystkie podłoża i roztwory do temperatury 37 °C w łaźni wodnej.
- Przygotować pożywkę Powella, rozpuszczając substancje chemiczne wymienione w tabeli 1 w 4,5 lH2Ow temperaturze pokojowej (RT). Doprowadzić pH do 7,4 za pomocą 2,0 N NaOH i doprowadzić objętość do 5,0 l. Sterylnie przefiltrować roztwór i przechowywać go w temperaturze 4 °C.
- Przygotować pożywkę kreatynę, L-karnitynę i taurynę (CCT), rozpuszczając pożywkę w proszku M199 w 4,5 lH2O. Do podłoża dodać proszek HEPES zgodnie z tabelą i mieszać przez 15 minut. Dodać kreatynę, karnitynę, taurynę i Ara-C zgodnie z tabelą 1. Dobrze wymieszać, dostosować pH za pomocą pH-metru do 7,4 z 2,0 N NaOH i doprowadzić objętość do 5,0 l. Sterylny filtr i przechowywać w temperaturze 4 °C.
- Przygotować pożywkę do hodowli komórkowych dla fibroblastów, dodając 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS) i 2% penicyliny/streptomycyny (Pen/Strep) do pożywki M199. DMEM jest równie odpowiedni jak M199 i może być również stosowany do hodowli komórek fibroblastów.
- Przygotować pożywkę do hodowli komórkowych MV2 dla komórek śródbłonka, dodając całą zawartość mieszanki suplementów do podstawowej pożywki MV2 zgodnie z instrukcjami producenta. Pobrać porcję o pojemności 5 ml i ogrzać ją do temperatury 37 °C w łaźni wodnej.
- Przygotować bufor do izolacji komórek śródbłonka, rozpuszczając 0,05 g albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w 50 ml zrównoważonego roztworu soli Hanksa (HBSS) i dodając do niego 0,5 ml 200 ml roztworu kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA). Przefiltruj to w sterylny sposób i przechowuj w temperaturze 4 °C.
- Przygotować bufor do przemywania komórek śródbłonka, dodając 0,1 ml 200 mM do 9,9 ml PBS i przechowywać go w temperaturze 4 °C.
- Przygotować roztwór kolagenazy, rozpuszczając 27 mg kolagenazy w 5 ml pożywki Powella i dodając do niej 12,5 μl 100 mM roztworu CaCl2. Podgrzać do temperatury 37 °C w łaźni wodnej.
- Przygotuj przyrostowe roztwory odtwórcze Ca2 + 1, 2 i 3 dla kardiomiocytów, dodając 12,5 μl, 25 μl i 120 μl 100 mM roztworu CaCl2 odpowiednio do 6 ml, 6 ml i 12 ml pożywki Powella.
- Na dzień przed izolacją należy wstępnie pokryć szalki do hodowli komórkowych kardiomiocytów, dodając 1 ml pożywki do wstępnego powlekania zawierającej lamininę do każdej 35-milimetrowej płytki do hodowli komórkowej. Inkubować je w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C przez noc.
3. Przygotowanie koralików magnetycznych
- Umieścić 0,5 ml buforu do izolacji komórek śródbłonka w probówce z próbką o pojemności 1,5 ml na lodzie.
- Dodaj 5 μl (2 x 106) kulek magnetycznych IgG myszy i dobrze wymieszaj.
- Umieść probówkę w stojaku magnetycznym na 1 minutę. Koraliki będą przylegać do ścianki rurki w kierunku magnesu. Ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipety o pojemności 1 ml.
- Powtórzyć pranie jeszcze dwa razy, a na koniec ponownie zawiesić kulki w 50 μl buforze do izolacji komórek śródbłonka i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
4. Przygotowanie systemu perfuzji Langendorffa
- Oczyść system Langendorffa przez perfuzję z 2 litrami wody destylowanej.
- Cyrkulować 50 ml pożywki Powella przez system przez 5 minut i wyrzucić pożywkę.
- Dodaj 80 ml świeżej pożywki Powella. Ciągle perfaktoruj go "karbogenem", bulgocząc szklaną pipetą Pasteura z butli gazowej. Pozwól, aby medium ponownie krążyło w systemie. System jest teraz gotowy do perfuzji serca (ryc. 1A).
5. Sekcja Szczura
- Umieść szczura w eksykatorze o pojemności 5 litrów pod wyciągiem i dodaj 1,5 ml 4-5% izofluranu przez otwór wentylacyjny i zamknij pokrywę.
UWAGA: Umieścić zwierzę na podwyższonej perforowanej płytce wewnątrz eksykatora, aby uniknąć bezpośredniego kontaktu zwierzęcia z ciekłym izofluranem.
- Poczekaj, aż szczur straci odruch pokrywy (zwykle ~5 min), a następnie wyjmij szczura z eksykatora. Poddaj szczura eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy.
- Przetnij skórę brzucha i leżący pod nią mięsień poziomo pośrodku za pomocą ostrych nożyczek. Następnie przetnij mięsień pionowo do mostka szczura i otwórz klatkę piersiową. Usuń serce wraz z płucami i natychmiast umieść narządy w lodowatym roztworze 0,9% NaCl.
- Usuń płuca za pomocą nożyczek i wyrzuć je. Oczyść serce z tkanki łącznej i przetnij aortę doogonowo na gałęzi pnia ramienno-głowowego.
6. Perfuzja serca i trawienie za pomocą kolagenazy
- Zamontuj serce przez aortę w systemie perfuzyjnym Langendorffa (sekcja 4) za pomocą dwóch par cienkich, zakrzywionych kleszczyków. Aby upewnić się, że mięsień sercowy jest perfundowany w sposób wsteczny, umieść koniec kaniuli systemu perfuzyjnego między pierwszą gałęzią aorty a zastawką aortalną. Zamocuj aortę za pomocą zacisku krokodylowego.
- Zamocuj serce za pomocą szwu chirurgicznego i usuń zacisk krokodylkowy (ryc. 1B).
- Otwórz zastawkę kaniuli, aby umożliwić przejście medium perfuzyjnego (35 ml) przez serce kroplami (60 kropli/min; 5 ml/min) w celu wypłukania resztek krwi. Na tym etapie należy odrzucić wszelkie przepływy.
UWAGA: Unikaj tworzenia się pęcherzyków powietrza na dowolnym etapie perfuzji, ponieważ spowoduje to niepełne trawienie i niepowodzenie procedury izolacji komórek.
- Umieść wiszące serce w lejku zbiorczym (komora serca; Rysunek 1B) i uruchomić pompę perystaltyczną, która będzie recyrkulować medium perfuzyjne z lejka zbiorczego do zbiornika (rysunek 1A).
- Dodać roztwór kolagenazy (z kroku 2.8) do podłoża perfuzyjnego. Perfuzja serca roztworem kolagenazy z recyrkulacją przez 30 min.
UWAGA: Ten krok jest bardzo ważny dla optymalizacji wydajności komórek. Czas perfuzji zależy od aktywności kolagenazy, która może się różnić w zależności od partii. Przetestuj 3-4 partie kolagenazy, aby znaleźć tę o optymalnej aktywności; Następnie można zakupić duże ilości najlepiej dopasowanej partii, które wystarczają na co najmniej rok, aby uzyskać powtarzalne wyniki.
- Pod koniec czasu trawienia należy przerwać perfuzję, usunąć serce z układu Langendorffa za pomocą nożyczek i umieścić je na szklanej szalce Petriego.
- Odetnij i wyrzuć oba przedsionki i usuń wszelkie resztki tkanki tłuszczowej. Ostrożnie oderwij osierdzie za pomocą dwóch par kleszczy, aby uniknąć zanieczyszczenia komórek nabłonka.
UWAGA: Osierdzie można dalej trawić kolagenazą, aby w razie potrzeby uzyskać czyste komórki nabłonka serca. W niniejszym badaniu nie podano szczegółowego protokołu, ponieważ wykracza on poza zakres niniejszego protokołu.
- Przetnij serce na środku nożyczkami i włóż je do rozdrabniacza do chusteczek. Zmielić serce 2-3 razy i ponownie zawiesić zmieloną tkankę w 12 ml buforu trawiącego z perfuzji Langendorffa.
UWAGA: Nie siekaj nadmiernie serca, ponieważ spowoduje to większy odsetek martwych kardiomiocytów.
- Przenieść zmieloną tkankę do 15 ml pożywki dysocjacyjnej zawierającej kolagenazę i pozostawić do trawienia w łaźni wodnej przez 5-10 minut, od czasu do czasu mieszając przez ponowne zawieszenie za pomocą jednorazowej plastikowej pipety o pojemności 5 ml.
- Pod koniec okresu trawienia przefiltrować zawiesinę komórkową przez sito o średnicy 100 μm. Wyrzuć resztki tkanek i niestrawiony materiał.
- Po zakończeniu perfuzji Langendorffa należy natychmiast przepłukać system perfuzyjny co najmniej 1 litrem wody destylowanej. Przepłucz system przez recyrkulację 100 ml 0,1 N NaOH przez 30 minut, a na koniec przepłucz system 2-3 litrami wody destylowanej. Osuszyć system, przepłukując powietrze i przykryć otwór parafolią.
7. Izolacja komórek serca szczura
- Izolacja i hodowla kardiomiocytów
- Odwirować zawiesinę komórkową o sile 25 x g przez 1 minutę (bez hamulców) w celu osadzenia kardiomiocytów. Kardiomiocyty można również pozostawić na 10 minut w temperaturze pokojowej bez wirowania.
- Ostrożnie usunąć supernatant zawierający komórki śródbłonka i fibroblasty za pomocą jednorazowej plastikowej pipety umieszczonej w nowej probówce o pojemności 50 ml.
- Zawiesić osad kardiomiocytów w Ca2 + 6 ml roztworu 1 (krok 2.9). Odczekać 1 minutę, aż komórki dostosują się do środowiska o niskim stężeniu Ca2+ i ponownie odwirować zawiesinę komórek przy 25 x g przez 1 minutę (bez hamulców).
- Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 6 ml roztworu Ca2+ 2 (krok 2.9). Pozwól komórkom na 1 minutę dostosować się do pośredniego stężenia Ca2+, a na koniec dodaj 12 ml roztworu Ca2+ 3 (krok 2.9) do komórek. Wymieszaj za pomocą jednorazowej plastikowej pipety.
- Odwirować zawiesinę komórkową o sile 25 x g przez 1 min.
- Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 20 ml wstępnie podgrzanej pożywki CCT. Dodać 1 ml zawiesiny komórkowej do każdego z 20 sterylnych naczyń do hodowli komórkowych o średnicy 35 mm wstępnie pokrytych lamininą (krok 2.9) i pozostawić komórki do przyłączenia się na 2 godziny w inkubatorze do hodowli komórkowych wolnych odCO2.
UWAGA: Kardiomiocyty mogą być również hodowane w środowisku CO2 ; Jednak w tym przypadku należy stosować pożywki z systemem wodorowęglanowych.
- Po 2 godzinach zastąp pożywkę nową pożywką o pojemności 2 ml CCT, aby usunąć wszelkie martwe komórki.
UWAGA: Komórki są gotowe do wszelkich planowanych eksperymentów i mogą być hodowane przez okres do 3 dni w typowym inkubatorze do hodowli komórkowych (bezCO2) bez znacznej utraty żywych komórek. Typowe zdrowe kardiomiocyty w kształcie pręcików przedstawiono na rycinie 2A.
- Izolacja komórek śródbłonka i fibroblastów
- Odwirować supernatant zawierający komórki śródbłonka i fibroblasty (od etapu 7.1.2) przy 250 x g przez 10 minut.
- Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1,5 ml buforu do izolacji komórek śródbłonka w probówce z próbką o pojemności 2 ml.
- Dodać 3 μg (1:500) mysiego przeciwciała antyszczurzego CD31 do zawiesiny komórkowej i inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 minut z rotacją od końca do końca.
UWAGA: Zaleca się miareczkowanie przeciwciała w celu optymalnego rozcieńczenia. Ten etap należy wykonać w temperaturze 4 °C, ponieważ w temperaturze pokojowej szybka internalizacja przeciwciała przez komórki śródbłonka spowoduje niską wydajność.
- Dodać wcześniej przygotowane (sekcja 3) panskie kulki anty-mysie IgG do zawiesiny komórek i inkubować przez 20 minut w temperaturze 4 °C z rotacją od końca do końca><.
UWAGA: Alternatywnie, mysie przeciwciało anty-szczurze CD31 może być wstępnie przyłączone do kulek magnetycznych, a następnie dodane do zawiesiny komórek. Wydłuży to jednak czas inkubacji kulek z zawiesiną komórkową i może skutkować zwiększonym niespecyficznym wiązaniem komórek nieśródbłonkowych, a tym samym wyższym zanieczyszczeniem innych typów komórek.
- Pod koniec czasu inkubacji przeciwciał umieść probówkę zawierającą zawiesinę komórek w stojaku magnetycznym i odczekaj 2 minuty na osadzenie kulek magnetycznych przyczepionych do komórek śródbłonka z boku probówki.
- Ostrożnie usunąć resztę zawiesiny komórkowej (zawierającej głównie fibroblasty) za pomocą pipety o pojemności 1 ml i dodać ją do 10-centymetrowego naczynia do hodowli komórkowej zawierającego 10 ml pożywki do hodowli komórek fibroblastów (krok 2.3). Umieścić go w typowym inkubatorze do hodowli komórkowych zawierającym 5% CO2 . Procedura jest kontynuowana w kroku 7.3.
- Dodaj 1 ml buforu do przemywania do probówki z kulkami magnetycznymi zawierającymi komórki śródbłonka.
- Zakręć tubę, wyjmij ją ze stojaka magnetycznego i ostrożnie ponownie zawieś koraliki, delikatnie potrząsając w górę iw dół 4-5 razy. Umieść probówkę ponownie w stojaku magnetycznym, pozwól koralikom osiąść na ściance rurki na 1 minutę i ostrożnie wyjmij bufor do mycia.
- Powtórz kroki mycia 5-7 razy, aby pozbyć się wszelkich zanieczyszczających komórek nieśródbłonkowych.
- Ponownie zawiesić komórki śródbłonka przyczepione do kulek w 1 ml pożywki do hodowli komórek śródbłonka MV2, dodać do pojedynczego dołka 12-dołkowej płytki i inkubować w inkubatorze do hodowli komórek CO2
.
- Pozwól komórkom przyczepić się przez noc i zmień pożywkę następnego dnia, a następnie co 2-3 dni, aż komórki staną się częściowo zlewające się (zwykle 5 - 7 dni).
UWAGA: Typowe niezlewające się komórki śródbłonka po 3-4 dniach i zlewające się komórki śródbłonka po 7-10 dniach izolacji pokazano odpowiednio na rycinach 3A i 3B. Komórki można następnie poddać trypsynizacji (sekcja 7.4) i wysiać do kolby do hodowli komórek T25.
- Mycie i hodowla fibroblastów (kontynuuj od kroku 7.2.6)
- Po 1 godzinie inkubacji odessać pożywkę i umyć fibroblasty przymocowane do naczynia do hodowli komórkowych, dodając odpowiednią objętość wstępnie podgrzanego PBS. Odessać PBS i powtórzyć ten krok 2-3 razy, a na koniec dodać wstępnie podgrzaną świeżą pożywkę do hodowli komórek fibroblastów.
- Następnego dnia ponownie umyj dołączone komórki wstępnie podgrzanym PBS (jak w poprzednim kroku) i dodaj wstępnie podgrzane świeże podłoże. Zmieniaj podłoże co 2-3 dni. Typowy fenotyp fibroblastów w 2 dniu izolacji pokazano na rycinie 4A.
UWAGA: Fibroblasty stają się częściowo zlewające się zwykle w ciągu 5-7 dni, a następnie są gotowe do trypsynizacji (sekcja 7.4) i wykorzystania w planowanych eksperymentach. Dzięki tej procedurze zwykle uzyskujemy 95-99% czystych fibroblastów. Typowy fenotyp fibroblastów w 7 dniu izolacji pokazano na rycinie 4B.
- Trypsyna komórek śródbłonka i fibroblastów
- Odessać pożywkę z naczynia do hodowli komórkowych i dodać tyle wstępnie podgrzanego PBS, aby pokryć komórki.
- Odessać PBS i dodać tyle roztworu trypsyny-EDTA (odpowiednio 0,05% i 0,02%), aby pokryć komórki i umieścić w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 5 minut.
- Zawiesić komórki, pipetując je w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 1 ml i zatrzymać działanie trypsyny, dodając 10% FCS.
- Zawiesinę komórkową osadzać przez odwirowanie w stężeniu 250 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
- Zawiesić komórki w odpowiedniej objętości wstępnie podgrzanej pożywki do hodowli komórkowych.
8. Charakterystyka komórek śródbłonka
UWAGA: Czystość komórek śródbłonka jest określana przez wychwyt Dil-Ac-LDL i barwienie immunologiczne czynnika von Willebranda (vWF). Komórki są wizualizowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub konfokalnej (ryc. 3C-3E).
- Wychwyt Dil-Ac-LDL przez komórki śródbłonka
- Trypsynizować komórki śródbłonka (krok 7.4) i hodować je przez noc na szklanych szkiełkach nakrywkowych na 12-dołkowej płytce (około 10 x 104 komórki/cm2).
- Odessać pożywkę i przepłukać komórki 1 ml wstępnie podgrzanego HBSS.
- Odessać HBSS i dodać 1 ml pożywki do hodowli komórek śródbłonka zawierającej 10 μg/ml Dil-Ac-LDL i pozostawić komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 4 godziny.
- Odessać pożywkę i przepłukać komórki trzykrotnie wstępnie podgrzanym PBS i utrwalić je 1 ml 4% paraformaldehydu (PFA; rozpuszczonego w PBS). Inkubować je z PFA w temperaturze 37 °C przez 20 min.
UWAGA: PFA jest; zawsze używaj rękawic kwasoodpornych podczas pracy z roztworem PFA.
- Odessać PFA, przepłukać komórki na szkiełku nakrywkowym na 12-dołkowej płytce z 1 ml PBS trzykrotnie i inkubować je z roztworem do barwienia jądrowego TO-PRO (10 μM) przez 1 godzinę w temperaturze RT.
UWAGA: Jeśli dostępny jest odpowiedni filtr do mikroskopu, można również użyć 4',6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI; 1 μg/ml). W takim przypadku czas inkubacji należy skrócić do 10 minut.
- Wypłucz komórki na szkiełku nakrywkowym na 12-dołkowej płytce z 1 ml PBS, odessać PBS i powtórzyć ten krok trzy razy.
- Wyjmij szkiełko nakrywkowe z płytki 12-dołkowej i zamontuj je na szkiełku podstawowym z kroplą podłoża montażowego. Komórki są gotowe do wizualizacji pod mikroskopem fluorescencyjnym/konfokalnym. Użyj filtra wzbudzenia 530-560 nm dla Dil-Ac-LDL, 640 nm dla TO-PRO i 340-380 nm dla DAPI.
- Barwienie von Willebranda (vWF)
- Hodować komórki śródbłonka zgodnie z opisem w kroku 8.1.1.
- Odessać pożywkę i przepłukać komórki 1 ml wstępnie podgrzanego HBSS, a następnie utrwalić 4% PFA, jak opisano w kroku 8.1.4.
- Odessać PFA, przepłukać komórki na szkiełku nakrywkowym na 12-dołkowej płytce dwukrotnie z 1 ml PBS i przepuścić komórki 1 ml 0,1% Triton X-100 (w PBS) przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
- Odessać roztwór permeabilizujący i inkubować komórki z roztworem blokującym (5% BSA/5% FCS w PBS) przez 1 godzinę.
- Inkubować komórki z króliczym przeciwciałem anty-vWF (1:100) w temperaturze 4 °C przez noc w wilgotnej komorze. Dodać jedno szkiełko nakrywkowe bez przeciwciała pierwszorzędowego jako kontrolę ujemną.
- Wypłukać komórki na szkiełku nakrywkowym na 12-dołkowej płytce z 1 ml PBS trzykrotnie i inkubować komórki z przeciwciałem anty-króliczym Alexa Fluor-488 (1:500) i roztworem do barwienia jądrowego TO-PRO (10 μM) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
- Wypłukać komórki na szkiełku nakrywkowym na 12-dołkowej płytce z 1 ml PBS, odessać PBS i powtórzyć ten krok trzy razy.
- Wyjąć szkiełko nakrywkowe z płytki 12-dołkowej i zamontować je na szkiełku podstawowym z kroplą podłoża mocującego. Komórki są gotowe do wizualizacji pod mikroskopem fluorescencyjnym/konfokalnym. Użyć filtra wzbudzenia o długości fali 490 nm dla vWF i 640 nm dla barwienia jądrowego.