Artykuł metodologiczny

Obrazowanie i analiza w wysokiej rozdzielczości dynamiki poszczególnych mikrotubul astralnych u pączkujących drożdży

9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55610

⸱

20 kwietnia 2017

 ,  , 
1Department of Cell and Developmental Biology, University of Colorado School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Drożdże pączkujące są korzystnym modelem do badania dynamiki mikrotubul in vivo ze względu na ich potężną genetykę i prostotę cytoszkieletu mikrotubul. Poniższy protokół opisuje, w jaki sposób przekształcać i hodować komórki drożdży, uzyskiwać obrazy mikroskopii konfokalnej i ilościowo analizować dynamikę mikrotubul w żywych komórkach drożdży.

Streszczenie

Dynamiczne mikrotubule są podstawą wielu procesów komórkowych, a dokładne pomiary dynamiki mikrotubul mogą dostarczyć wglądu w to, jak komórki regulują te procesy i jak mutacje genetyczne wpływają na regulację. Kwantyfikacja dynamiki mikrotubul w modelach metazoanów wiąże się z szeregiem powiązanych wyzwań, w tym z dużą gęstością mikrotubul i ograniczeniami w manipulacjach genetycznych. W przeciwieństwie do tego, model drożdży pączkujących oferuje zalety, które przezwyciężają te wyzwania. Protokół ten opisuje metodę pomiaru dynamiki pojedynczych mikrotubul w żywych komórkach drożdży. Komórki wykazujące ekspresję fluorescencyjnie znakowanej tubuliny są przyklejane do zmontowanych komór szkiełkowych, co pozwala na stabilną akwizycję obrazu poklatkowego. Dostępny jest również szczegółowy przewodnik dotyczący szybkiej, czterowymiarowej akwizycji obrazu, a także protokół ilościowego określania właściwości dynamicznych mikrotubul w konfokalnych stosach obrazów. Ta metoda, w połączeniu z konwencjonalną genetyką drożdży, zapewnia podejście, które jest wyjątkowo odpowiednie do ilościowej oceny wpływu regulatorów mikrotubul lub mutacji, które zmieniają aktywność podjednostek tubuliny.

Wprowadzenie

Mikrotubule są polimerami cytoszkieletu zbudowanymi z podjednostek białka αβ-tubuliny i są używane w wielu różnych kontekstach komórkowych, w tym w transporcie wewnątrzkomórkowym, podziale komórek, morfogenezie i ruchliwości. Aby zbudować sieci mikrotubul dla tych różnorodnych ról, komórki muszą dokładnie regulować, gdzie i kiedy tworzą się mikrotubule. Regulacja ta odbywa się poprzez kontrolowanie reakcji, które albo składają podjednostki αβ-tubuliny w polimery mikrotubul, albo rozkładają mikrotubule na wolne podjednostki; Jest to znane jako dynamika mikrotubul.

Głównym celem pola mikrotubul jest wyjaśnienie mechanizmów molekularnych regulujących dynamikę mikrotubul, w tym badania podjednostek αβ-tubuliny i zewnętrznych regulatorów, które wiążą się z tubuliną i/lub mikrotubulami. Ugruntowanym podejściem eksperymentalnym jest odtworzenie tego układu in vitro przy użyciu oczyszczonego białka αβ-tubuliny, często w połączeniu z oczyszczonymi regulatorami zewnętrznymi. Chociaż jest to użyteczne podejście, jasne jest, że dynamika mikrotubul w odtworzonych układach znacznie różni się od tej obserwowanej w żywych komórkach. Na przykład mikrotubule rosną szybciej i kurczą się wolniej in vivo niż in vitro. Różnice te można przypisać dostępności znanych regulatorów zewnętrznych1, a także jeszcze niezdefiniowanym czynnikom w komórkach. Dlatego tak ważne jest określenie aktywności regulatorów mikrotubul i mutantów, które zakłócają dynamikę w natywnym kontekście komórkowym.

Chociaż modele metazoan okazały się dominującymi systemami do badania funkcji mikrotubul i organizacji wyższego rzędu, kilka praktycznych problemów poważnie ogranicza użyteczność tych modeli do precyzyjnego pomiaru dynamiki mikrotubul. Po pierwsze, duża liczba mikrotubul, wahająca się od kilkudziesięciu do tysięcy na komórkę, utrudnia pewne śledzenie pojedynczych mikrotubul w czasie. Wiele badań zajmuje się tym wyzwaniem, obrazując białka, które selektywnie lokalizują się na końcach mikrotubul, takie jak białka z rodziny wiążących końcówki (EB). Wiadomo jednak, że białka te lokalizują się tylko na końcach rosnących mikrotubul w metazoans2. W związku z tym użyteczność tych białek ogranicza się do bezpośredniego pomiaru tempa wzrostu, podczas gdy tylko pośrednio mierzy inne aspekty dynamiki, takie jak częstotliwość katastrof. Po drugie, pomimo postępów w technologii edycji genomu, tworzenie komórek, które stabilnie wyrażają tubulinę znakowaną fluorescencyjnie lub wprowadzanie mutacji w celu selektywnego manipulowania tubuliną lub regulatorami mikrotubul, pozostaje poważnym wyzwaniem. Co więcej, obecność wielu izotypów tubuliny w metazoanach utrudnia badanie, w jaki sposób mutacje wpływają na poszczególne geny tubuliny.

System pączkujących drożdży zapewnia kilka ważnych zalet do pomiaru dynamiki mikrotubul in vivo. Drożdże mają uproszczoną sieć mikrotubul, która umożliwia wizualizację pojedynczych mikrotubul. W drożdżach mikrotubule emanują z centrów organizacyjnych znanych jako ciała wrzecionowate (SPB), które są osadzone w otoczce jądrowej3. SPB służą jako rusztowania dla małych kompleksów γ-tubuliny, które nukleują mikrotubule4,5. SPB nukleizują dwie klasy mikrotubul, mikrotubule wrzecionowe i mikrotubule astralne. Mikrotubule wrzeciona rzutują do nukleoplazmy i są ważne dla przyłączania się do chromosomów za pomocą mikrotubul kinetochorowych oraz dla stabilizacji wrzeciona za pomocą nakładających się mikrotubul międzybiegunowych6. W przeciwieństwie do tego, mikrotubule astralne wystają na zewnątrz do cytozolu i są stosunkowo rzadkie w porównaniu z gęstą siecią mikrotubul wrzecionowych. Podczas mitozy komórki przed anafazą mają tylko 1-2 mikrotubule astralne emanujące z dowolnego SPB; Istnieją one jako pojedyncze mikrotubule, a nie jako wiązki7. Rolą mikrotubul astralnych podczas mitozy jest przemieszczanie jądra i wrzeciona do połączenia między przedziałami matki i pąka, znanego jako szyjka pąka. Ruch ten obejmuje dobrze zdefiniowane ścieżki, które generują siłę na mikrotubule astralne, ciągnąc jądro i wrzeciono w kierunku i ostatecznie do szyjki pąka8.

Kolejną zaletą systemu drożdżowego jest użyteczność jego genetyki, która może być wykorzystana do badania regulatorów mikrotubul i podjednostek tubuliny z niezrównaną precyzją. Drożdże posiadają również uproszczony repertuar izotypów tubuliny: pojedynczy gen β-tubuliny (TUB2) i dwa geny α-tubuliny (TUB1 i TUB3). Mutacje mogą być łatwo wprowadzane do tych genów i w ten sposób badane w jednorodnej populacji tubuliny9,10. Istnieje wiele powszechnie dostępnych konstruktów do znakowania mikrotubul, które mogą być przeznaczone do integracji w loci chromosomów w celu stabilnej ekspresji (patrz Dyskusja).

Ogólnym celem tej metody jest obrazowanie pojedynczych mikrotubul w żywych komórkach drożdży w czterech wymiarach (X, Y, Z i T) w celu uzyskania wysokiej rozdzielczości pomiarów dynamiki mikrotubul. Opisano metody całkowania konstruktów dla konstytutywnej, niskopoziomowej ekspresji tubuliny znakowanej fluorescencyjnie w komórkach drożdży. Przed obrazowaniem żywe komórki są umieszczane w komorach szkiełkowych pokrytych lektyną Concanavalin A w celu ustabilizowania komórek do długotrwałego obrazowania. Opisano również optymalne parametry akwizycji obrazu, a także przepływ pracy do analizy danych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie płyt dropout -LEU

  1. Dodać 800 ml sterylnej, dejonizowanej wody (DiH2O) do kolby o pojemności 2 l. Dodać 26,71 g proszku na bazie dropout (DOB), 0,69 g CSM-Leu i 20 g agaru. Wymieszaj z mieszadłem magnetycznym. Doprowadzić do 1 l za pomocą DiH2O.
  2. Autoklaw w temperaturze 121 °C i ciśnieniu 19 psi przez 30 min.
  3. Wyjąć kolbę z autoklawu i pozostawić do ostygnięcia do temperatury ~65 °C, delikatnie mieszając.
  4. Wlać 30 ml/płytkę do płytek o średnicy 100 mm. Pozostaw je w temperaturze pokojowej na 36-48 godzin przed przechowywaniem w temperaturze 4 °C.

2. Integracja GFP-Tub1 dla konstytutywnej ekspresji tubuliny znakowanej GFP

  1. Gotować roztwór o stężeniu podstawowym 10 mg/ml jednoniciowego DNA (ssDNA) przez 3 minuty.
  2. Połącz 2 μl ugotowanego ssDNA z 400 ng oczyszczonego plazmidu GFP-Tub1 DNA11.
    UWAGA: Istnieje wiele plazmidów, które można wykorzystać do stabilnego, fluorescencyjnego znakowania mikrotubul w drożdżach, które wykorzystują alternatywne fluorofory i wybieralne markery. Niektóre z tych alternatyw są opisane w sekcji Dyskusja.
  3. Dodać mieszaninę DNA do 50 μl porcji kompetentnych komórek drożdży.
    UWAGA: Przygotować kompetentne komórki drożdży z roztworem sorbitolu (SORB; 100 mM LiOAc, 10 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA pH 8 i 1 M sorbitol, dostosowany rozcieńczonym kwasem octowym do pH 8). Szczegółowy opis tworzenia kompetentnych komórek drożdży znajduje się w reference12.
  4. Dokładnie wymieszaj.
  5. Do mieszaniny DNA-komórka dodać 6 razy większą objętość całkowitego roztworu glikolu polietylenowego (PEG) (100 mM LiOAc, 10 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA/NaOH pH 8 i 40% PEG3350).
  6. Dokładnie wymieszaj.
  7. Inkubować przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze 30 °C, delikatnie mieszając.
  8. Dodaj dimetylosulfotlenek (DMSO) do 10% całkowitej objętości i wiruj.
  9. Inkubować w temperaturze 42 °C przez 15 minut.
  10. Wirować przy 2.500 x g przez 5 min.
  11. Usunąć supernatant i zawiesić komórki w 100 μl DiH2O.
  12. Komórki płytkowe na płytce dropout -LEU.
    UWAGA: Konstrukt GFP-Tub1 zawiera marker auksotroficzny leucyny, podczas gdy inne konstrukty mogą używać alternatywnego markera. Pożywka dropout powinna być specyficzna dla markera auksotroficznego konstruktu.
  13. Pozwól przekształconym komórkom rosnąć przez 3-5 dni w temperaturze 30 °C.
  14. Ponownie rozrysuj pojedyncze kolonie transformacyjne na świeżej płytce dropout -LEU, przenosząc kolonie za pomocą autoklawowanej wykałaczki. Inkubować płytkę przez noc w temperaturze 30 °C.
  15. Przeprowadź wizualne badanie przesiewowe każdego transformantu pod kątem sygnału GFP, zawieszając około 1 μl komórek z pojedynczej kolonii na płytce w kroku 2.14 w 2 μl wody na czystym szkiełku. Przykryj zawieszone komórki szkiełkiem nakrywkowym i obserwuj za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
    1. Wzbudz transformanty światłem o długości fali 488 nm i poszukaj obecności sygnału GFP.
      UWAGA: W tym kroku można użyć mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem, ale wystarczy mikroskop szerokokątny wyposażony w obiektyw 100X i odpowiednią optykę do obrazowania GFP. Komórki bez widocznych mikrotubul znakowanych GFP lub te o nienormalnie wysokiej fluorescencji należy odrzucić. Następnie szczepy drożdży są gotowe do hodowli w celu obrazowania.

3. Uprawa płynnych kultur drożdży

  1. Zaszczepić ~ 1 μl komórek drożdży z pojedynczej kolonii na płytce w 3 ml syntetycznej kompletnej pożywki. Pozostawić komórki do wzrostu przez noc w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem przy 250 obr./min.
  2. Rozcieńczyć nasyconą kulturę następnego dnia do OD600 <0,1 w pożywce. Umieścić rozcieńczoną kulturę z powrotem w wytrząsarce o temperaturze 30 °C na 3-4 godziny lub do momentu, gdy OD600 znajdzie się między 0,4 a 0,8, kiedy komórki są gotowe do umieszczenia w komorach do obrazowania.

4. Przygotowanie szkiełek z komorą przepływową

  1. Pokrój arkusz folii parafinowej na kawałek o szerokości 4 cali i długości 7 cali.
  2. Umieść standardowe szkiełko mikroskopowe wzdłuż na szerokości 4 cali folii parafinowej i owiń folię wokół szkiełka 3-4 razy, tak aby szkiełko było pokryte folią o grubości 3-4 warstw. Dociśnij warstwy do siebie, aby zapewnić rozsądne uszczelnienie; Ułatwi to cięcie. Unikaj zbyt mocnego naciskania lub powodowania marszczenia folii.
  3. Wytnij folię parafinową wzdłuż zewnętrznych krawędzi szkiełka za pomocą czystej maszynki do golenia do pudełek. Użyj innego suwaka, aby zapewnić prostą krawędź do cięcia.
  4. Oderwij nadmiar folii od szkiełka roboczego i wyrzuć. Pozostałe stosy folii pokryją jedną powierzchnię szkiełka i zostaną wykorzystane do wykonania ścianek między komorami obrazowania.
  5. Używając drugiego suwaka jako prostej krawędzi, pokrój ułożone warstwy folii wzdłuż długiej osi szkiełka na około dziesięć pasków, każdy o szerokości 2-4 mm każdy.
  6. Ułożone warstwy folii parafinowej należy przeciąć prostopadle do nacięć wykonanych w kroku 4.5, wzdłuż krótkiej osi szkiełka, aby utworzyć paski o szerokości 2-4 mm, długości 23-24 mm i grubości 3-4 warstw.
  7. Obierz pocięte paski za pomocą brzytwy pod kątem 45°. Za pomocą kleszczyków równomiernie rozprowadź pocięte paski folii na czystym szkiełku mikroskopowym, aby uzyskać pożądaną liczbę komór. Na jednym szkiełku można stworzyć do 3 komór (wykonanych z 4 pasków folii parafinowej).
  8. Umieść pojedyncze szkiełko nakrywkowe na paskach folii i przesuń je na miejsce za pomocą kleszczy.
  9. Umieść przygotowane szkiełko nakrywkowe do góry na płycie grzejnej ustawionej na ~95 °C (jest to w przybliżeniu ustawienie niska-średnia na większości płyt grzewczych). Podgrzej szkiełko, aż paski folii staną się przezroczyste (około 3 min), a następnie zgrzej szkiełko podstawowe i szkiełko nakrywkowe, delikatnie naciskając szkiełko nakrywkowe pęsetą.
    UWAGA: Ważne jest, aby naciskać tylko te obszary szkiełka nakrywkowego, które znajdują się bezpośrednio nad paskami folii parafinowej, ponieważ zarysowanie obszarów nad komorami może pogorszyć jakość obrazu. Uważaj, aby nie przegrzać zjeżdżalni; Odparowana folia pokryje wnętrze komory hydrofobowym filmem, który zapobiega przywieraniu komórek.
  10. Użyj kleszczyków, aby wyjąć szkiełko z płyty grzejnej (szkiełko będzie gorące) i odłóż je na bok do ostygnięcia stroną nakrywkową skierowaną do góry; gdy szkiełko ostygnie, folia powróci do białego, nieprzezroczystego zabarwienia.
    UWAGA: W tym momencie szkiełka są gotowe do załadowania hodowanymi komórkami drożdży. Do tego miejsca można wykonać dodatkowe zjeżdżalnie i przechowywać je w czystym i suchym miejscu przez nieokreślony czas.

5. Ładowanie komórek drożdży do przygotowanych szkiełek komory przepływowej

  1. Rozmrozić zamrożoną 200 μl podwielokrotności konkanawaliny A (2 mg/ml w sterylnym DiH2O).
  2. Dodać około 100 μl rozmrożonej konkanawaliny A do każdej komory przygotowanego szkiełka, pipetując do jednego z otwartych końców. Dodaj tyle konkanawaliny A, aby wypełnić komorę. Na tym etapie konkanawalina A zostanie przeciągnięta przez komorę poprzez działanie kapilarne.
  3. Zawieś szkiełko nakrywkowe w dół między dwoma stojakami na probówki do mikrofug lub pisakami na 5 minut, aby Concanavalin A mógł przylgnąć do szkiełka nakrywkowego (tj. komory).
  4. Przywróć szkiełko do pozycji ślizgu nakrywkowego. Przemyć komorę 2-krotnością objętości komory (oznaczonej w kroku 5.2 powyżej; około 200 μl) syntetycznego kompletnego podłoża w celu usunięcia konkanawaliny A.
    1. Przepuścić pożywkę przez komorę, używając rogu ręcznika papierowego lub bibuły filtracyjnej złożonej na pół, aby wyciągnąć płyn z jednego końca komory, jednocześnie pipetując świeży płyn do drugiego. Alternatywnie użyj aspiratora próżniowego, aby ostrożnie wyciągnąć płyn z jednego końca, jednocześnie pipetując świeży płyn do drugiego.
  5. Obciążyć ogniwa, przepływając 2-krotność objętości komory (około 200 μl) zawiesiny komórek (od kroku 3.4) przy użyciu metody przepływu ukierunkowanego opisanej w kroku 5.4.1.
    UWAGA: Celem jest zobrazowanie pojedynczej warstwy komórek na szkiełku nakrywkowym. Dlatego ważne jest, aby załadować koncentrację komórek na tyle małą, aby nie nakładały się jedna na drugą, ale na tyle dużą, aby w terenie znajdowała się wystarczająca liczba komórek, aby zebrać maksymalną ilość danych na akwizycję obrazu. Optymalne stężenie komórek w komorze może być różne i powinno być określone empirycznie. Aby zwiększyć stężenie komórek w komorze przepływowej, delikatnie granulować hodowlę komórkową w temperaturze 1 000 x g przez 2 minuty i usunąć część supernatantu. Aby zmniejszyć stężenie komórek, dodaj świeżą syntetyczną kompletną pożywkę do zawiesiny komórek. Stężenie komórek można ocenić po kroku 5.7 (poniżej), sprawdzając komorę pod mikroskopem z kontrastem fazowym. W tym momencie do komory można dodać dodatkowe komórki, przepływając w większej ilości zawiesiny komórek. Jednak zmniejszenie gęstości komórek w tym momencie nie jest wykonalne i najlepiej osiągnąć je poprzez załadowanie nowej komory rozcieńczoną zawiesiną komórek.
  6. Zawieś szkiełko nakrywkowe w dół, jak opisano w kroku 5.3, na 10 minut, aby komórki przylgnęły do szkiełka nakrywkowego.
  7. Wypłukać wszelkie niezatłuszczone komórki, przepuszczając przez 4-krotność objętości komory (około 400 μl) syntetycznego kompletnego podłoża. Wyeliminuje to swobodnie unoszące się komórki w komorze, które mogą zanieczyścić akwizycję obrazu.
  8. Ostrożnie osusz każdy koniec komory czystym rogiem ręcznika papierowego, doprowadzając menisk do krawędzi szkiełka nakrywkowego.
  9. Uszczelnij każdy koniec komory ciepłym (75 °C) uszczelniaczem (np. VALAP; równe części wazeliny, wosku wełnianego i wosku parafinowego).
    UWAGA: W tym momencie slajd jest gotowy do tworzenia obrazu. Komory mogą być obrazowane przez okres do 9 godzin, w zależności od gęstości komórek w każdej komorze. Komórki z czasem będą wytwarzać dwutlenek węgla (CO2 ), który stopniowo będzie tworzył pęcherzyki, które przemieszczają komórki.

6. Akwizycja obrazu

  1. Przynieś szkiełko do odwróconego mikroskopu wyposażonego w obiektyw 1.45 NA 100X CFI Plan Apo, stolik piezoelektryczny, skaner konfokalny z wirującym dyskiem, laser oświetleniowy i kamerę EMCCD. Podczas akwizycji należy utrzymywać temperaturę stolika na poziomie pokojowej (25 °C).
    UWAGA: Duża apertura numeryczna pozwala na uzyskanie większej rozdzielczości obrazu, a stopień piezoelektryczny umożliwia szybką akwizycję stosu z. Minimalne wymagania mikroskopowe to obiektyw 100X, laser oświetleniowy i kamera EMCCD.
  2. Ustaw ostrość komórek. Upewnij się, że pole pozyskiwania zawiera co najmniej 5–6 komórek zgrupowanych razem, przeszukując slajd w poszukiwaniu komórek zgrupowanych razem.
    UWAGA: Chociaż nie jest konieczne obrazowanie więcej niż jednej komórki naraz, obrazowanie wielu komórek w tym samym polu poprawia wydajność pozyskiwania danych bez pogarszania jakości danych. Jednak bardzo ważne jest, aby komórki znajdowały się na tej samej płaszczyźnie ogniskowej i nie były ułożone jedna na drugiej.
  3. Zaprogramuj wielowymiarową akwizycję, aby zebrać wiele serii Z w czasie.
    1. Dostosuj ustawienia w ustawieniach aktywnej akwizycji do następujących: całkowita głębokość Z = 6 μm, aby objąć całą komórkę drożdży; Wielkość kroku Z = 300 nm, aby zmaksymalizować zbieranie światła bez nadmiernego próbkowania; całkowity czas trwania = 10 min; przedziały czasowe = seria Z co 4 s; i czas naświetlania = 90 ms dla każdej płaszczyzny z.
      UWAGA: Optymalny czas ekspozycji będzie się różnić w zależności od aparatu, źródła światła wzbudzenia i innych czynników. Ogólnie rzecz biorąc, optymalny czas ekspozycji będzie minimalnym czasem niezbędnym do osiągnięcia stosunku 3:1 sygnału z mikrotubul astralnych znakowanych GFP do sygnału z cytoplazmy w oparciu o wartości pikseli zmierzone przez EMCCD.
  4. Rozpocznij pobieranie, klikając "Uruchom". Pozwól mu działać przez pełne 10 minut. Zapisz dane jako serię obrazów (.tiff lub .nd2).
  5. Wybierz nowe pole do zobrazowania w komorze i powtórz kroki 6.2-6.4.
    UWAGA: Pojedyncza komora powinna dawać od 15 do 20 pól komórek, w zależności od gęstości komórek w komorze. Wyższe zagęszczenie komórek spowoduje uzyskanie niższych pól całkowitych, ponieważ CO2 w komorze będzie się szybciej gromadzić.

7. Analiza obrazu

  1. Otwórz plik obrazu w ImageJ (https://imagej.nih.gov) jako hyperstack za pomocą wtyczki importera bioformatów.
    1. Otwórz ImageJ i przeciągnij pobrany stos obrazów z sekcji 6 bezpośrednio na panel sterowania. Importer formatów biologicznych uruchomi się automatycznie. Wybierz "OK", aby załadować stos obrazów jako hyperstack.
      UWAGA: Otworzy się monit "Opcje importu formatów biologicznych" i upewnij się, że w sekcji "Przeglądanie stosu" opcja "Wyświetl stos z:" jest ustawiona na "Hyperstack", a "Kolejność stosu:" jest ustawiona na "XYCZT".
  2. Zwiń każdą serię Z do 2-wymiarowej projekcji o maksymalnej intensywności za pomocą funkcji Z-project.
    1. Wybierz menu "Obraz", podmenu "Stos" i funkcję "Z-project". Wybierz "Maksymalna projekcja" z listy rozwijanej i kliknij "OK".
  3. Zastosuj filtr mediany do stosu obrazów, aby zredukować szum plamkowania, wybierając menu "Proces", podmenu "Filtry" i funkcję "Mediana". Wprowadź 2,0 pikseli w polu promienia i kliknij "OK".
  4. Zidentyfikuj komórki przed anafazą w terenie.
    UWAGA: Charakteryzują się one średniej wielkości pąkami i krótkim wrzecionem mitotycznym o długości 1-1,5 μm (ryc. 1; grot strzałki wskazuje na krótkie wrzeciono mitotyczne). Komórki na tym etapie są idealne do analizy dynamiki mikrotubul, ponieważ zazwyczaj wykazują tylko kilka mikrotubul astralnych emanujących z biegunów wrzeciona7. Mikrotubule astralne można zidentyfikować jako włókna liniowe, które wykazują jednolitą intensywność sygnału GFP od końca ujemnego, w SPB, do końca dodatniego, w cytoplazmie.
  5. Zaczynając od pierwszego punktu czasowego serii obrazów, użyj narzędzia linii segmentowej, aby narysować linię wzdłuż pojedynczej mikrotubuli astralnej, od końca ujemnego, znajdującego się na styku mikrotubuli astralnej i intensywniej znakowanych mikrotubul wrzeciona, do końca dodatniego, który znajduje się w cytoplazmie (patrz czerwone linie na rysunku 1). Kliknij dwukrotnie koniec mikrotubuli, aby zakończyć linię segmentową.
  6. Zapisz pomiar w tabeli wyników za pomocą funkcji "zmierz", naciskając przycisk "M" na klawiaturze.
    UWAGA: Dodatkowe funkcje, takie jak intensywność szarości, można rejestrować, ustawiając pomiary w menu "Analizuj" i podmenu "Ustaw pomiary".
  7. Przejdź do następnego punktu czasu, klikając strzałkę w prawo na pasku suwaka Z lub naciskając "./>" na klawiaturze. Powtórz kroki 7.5 i 7.6 dla wszystkich punktów czasowych w sekwencji obrazu.
  8. Skopiuj dane z tabeli wyników i wklej je do arkusza kalkulacyjnego. Zapisz dane, wybierając opcję "Zapisz jako"
    UWAGA: Pomiary te będą zawierały kilka wartości, ale najważniejsze wartości to wycinek, który wskazuje punkt czasowy w serii, oraz długość, która wskazuje długość linii (tj. mikrotubula astralna). Kolumny zawierające inne wymiary (np. powierzchnię, średnią wartość piksela, kąt itp.) mogą zostać zachowane lub odrzucone.
  9. Utwórz nową kolumnę w arkuszu kalkulacyjnym, klikając prawym przyciskiem myszy i używając funkcji "Wstaw". Wprowadź czas (s) każdego punktu czasowego.
  10. Utwórz wykres punktowy XY długości mikrotubul (μm) w funkcji czasu (s) za pomocą funkcji "Wstaw wykres liniowy"; wybierz pomiary długości jako "Y", a kolumnę czasu jako "X".
    1. Zidentyfikuj obszary polimeryzacji, depolimeryzacji i pauzy, szukając pozytywnych i ujemnych zmian długości w czasie na wykresie punktowym z kroku 7.10.
      UWAGA: Zdarzenia polimeryzacji zwiększają długość mikrotubul o co najmniej 0,5 μm w co najmniej 3 punktach czasowych i pasują do regresji liniowej z R2 ≥ 0,9 i wartością R > 0 (Rysunek 1B i D, zielone punkty). Zdarzenia depolimeryzacji zmniejszają długość mikrotubul o co najmniej 0,5 μm w co najmniej 3 punktach czasowych i pasują do regresji liniowej z R2 ≥ 0,9 i wartością R < 0 (Rysunek 1B i D, różowe punkty). Zdarzenia pauzy są niezależne od polimeryzacji i depolimeryzacji. Pauzy definiuje się jako zmiany netto długości mikrotubul mniejsze niż 0,5 μm w co najmniej 3 punktach czasowych; dopasować regresję liniową o wartości R z zakresu od -0,4 do 0,4; i mają nachylenie, które nie różni się statystycznie od zera, zgodnie z testem F.
    2. Korzystając z wykresu punktowego jako przewodnika, zidentyfikuj odcinki czasu, w których zmiana długości jest dodatnia, i wyróżnij je kolorem zielonym. Podświetl na różowo obszary czasu, w których zmiana długości jest ujemna.
    3. Oblicz regresję liniową każdej wyróżnionej sekcji i zapisz wartość R i R2 dla każdej sekcji w kolumnach proksymalnych do regionów. Sklasyfikuj każdy kolorowy obszar jako zdarzenie polimeryzacji lub zdarzenie depolimeryzacji.
  11. Oblicz szybkość polimeryzacji, dzieląc zmianę długości netto przez zmianę czasu dla każdego zdarzenia wzrostu. Zapisz te wyniki w kolumnie sąsiadującej z wartościami regresji liniowej z kroku 7.10.3.
  12. Obliczyć szybkość depolimeryzacji, dzieląc zmianę długości netto przez zmianę czasu dla każdego zdarzenia kurczenia się. Zapisz te wyniki w kolumnie sąsiadującej z wartościami szybkości polimeryzacji z kroku 7.11.
  13. Oblicz częstotliwość katastrof, dzieląc liczbę przejść od polimeryzacji do depolimeryzacji przez całkowity czas wszystkich zdarzeń wzrostu13. Zapisz te wyniki w kolumnie obok wartości szybkości depolimeryzacji z kroku 7.12.
  14. Oblicz częstotliwość ratowania, dzieląc liczbę przejść między depolimeryzacją a polimeryzacją przez całkowity czas wszystkich zdarzeń skurczu13. Zapisz te wyniki w kolumnie przylegającej do wartości częstotliwości katastrof z kroku 7.13.
  15. Oblicz dynamikę, dzieląc sumę wartości bezwzględnej wszystkich zmian długości przez całkowity czas trwania akwizycji obrazu, obliczony w kroku 7.10.1, i mnożąc przez 27,0833, aby uzyskać podjednostki tubuliny na sekundę14. Zapisz te wyniki w kolumnie obok wartości częstotliwości akcji ratunkowej z kroku 7.14 i zapisz tabelę wyników.
    UWAGA: Możliwe jest zautomatyzowanie procesu analizy opisanego w krokach 7.10-7.15 za pomocą specjalnego programu (Estrem, et al., złożony manuskrypt). Program przeznaczony jest do identyfikacji okresów polimeryzacji i depolimeryzacji w pomiarach długości zgodnie z parametrami opisanymi powyżej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Pomiar dynamiki mikrotubul w żywych komórkach drożdży stanowi skuteczne narzędzie do oceny, w jaki sposób mutacje w genach kodujących regulatory mikrotubul lub podjednostki tubuliny wpływają na szybkość polimeryzacji i depolimeryzacji, a także na częstotliwość przejść między tymi stanami. Rysunek 1 przedstawia serię czasową dynamiki mikrotubul astralnych w komórce typu dzikiego oraz w komórce mutanta z mutacją w β-tubulinie (tub2-430Δ). Mikrotubule zostały oznako...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Model pączkujących drożdży oferuje znaczne korzyści w zakresie gromadzenia pomiarów dynamiki mikrotubul w wysokiej rozdzielczości w warunkach in vivo , w tym możliwość obrazowania pojedynczych mikrotubul w czasie oraz możliwość manipulowania tubulinami i regulatorami mikrotubul przy użyciu narzędzi genetyki drożdży.

Komory z powłoką Concanavalin A zapewniają szereg zalet w porównaniu z poprzednio opisanymi aparatami, w tym stopionymi podkładkami agarowymi. Szkiełka z komorami mogą być...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Dziękujemy Kerry Bloom (University of North Carolina), Kyung Lee (NCI), Stevenowi Markusowi (Colorado State University) i Elmarowi Schiebelowi (Universität Heidelberg) za udostępnienie różnych plazmidów FP-TUB1. Jesteśmy wdzięczni Melissie Gardner (University of Minnesota) za przeszkolenie nas w zakresie metody przygotowania komory szkiełkowej. Praca ta była wspierana przez grant National Institutes of Health (NIH) R01GM112893-01A1 (dla J.K.M.) i T32GM008730 (dla CE).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Data urodzenia (bazy dropoutów)Nauka o wschodzie słońca 1650
CSM-LeuWschód słońca nauka 1005
AgarAmerescoN833
100 mm płytki polistyrenoweFisher ScientificFB0875713
ssDNA (Samon Sperm)  w sterylnym DiH2OSigma-Aldrich   Ponowne zawieszenie D7656w stężeniu 10 mg/ml w DiH2O. Przechowuj podwielokrotności na poziomie -20 º C
Syntetyczne kompletne media Nauka o wschodzie słońca 1459-100
Concanavalin ASigma-Aldrich L7647zawiesić w stężeniu 2 mg/ml w DiH2O. Przechowuj podwielokrotności na poziomie -20 º C
Szkiełka mikroskopoweFisher Scientific12-544-1
Szkiełka nakrywkowe mikroskopuFisher Scientific12-541-B
ParafilmFisher Scientific13-374-12film parafinowy
VALAP (równe części wazeliny, lanoliny i parafiny)topią się w temperaturze 75 º C przed użyciem
kleszczy Fisher Scientific16-100-106
Glikol poyetylenowy (PEG) 3350Sigma-Aldrich 202444
Nazwa<strong>FirmaNumer katalogowyKomentarze
mikroskop
Ti E odwrócony mikroskop Perfect FocusInstrumenty Nikon MEA53100
Obiektyw 1,45 NA 100X CFI Plan ApoNikon InstrumentsMRD01905
Piezoelektryczny przedwzmacniacz elektryczny Physik InstrumenteP-736
Skaner wirujących dyskówYokogawaCSU10
Moduł sumatora laserowegoAgilent TechnologiesMCL400B
Kamera EMCCDAndor TechnologyiXon Ultra 897 
NazwaFirma>Numer katalogowyKomentarze
Software
NIS OprogramowanieNikon InstrumentsMQS31100
Microsoft Excel oprogramowanieMicrosoft
Oprogramowanie MATLABMathWorks, Inc
ImageJ64NIHRasband, WS, ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016.
Wtyczka Bio-Formats ImporterOpen Microscopy Environment
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Plasmids
pUC19-LEU2::GFP-TUB1pSK1050odniesienie: Song, S. i Lee, K. S. Nowa funkcja Saccharomyces cerevisiae CDC5 w cytokinezie. J Cell Biol. 152 (3), 451-469 (2001)

Bibliografia

  1. Zanic, M., Widlund, P. O., Hyman, A. A., Howard, J. Synergy between XMAP215 and EB1 increases microtubule growth rates to physiological levels. Nat Cell Biol. 15 (6), 688-693 (2013).
  2. Mimori-Kiyosue, Y., Shiina, N., Tsukita, S. The dynamic behavior of the APC-binding protein EB1 on the distal ends of microtubules. Curr Biol. 10 (14), 865-868 (2000).
  3. Byers, B., Goetsch, L. Behavior of spindles and spindle plaques in the cell cycle and conjugation of Saccharomyces cerevisiae. J Bacteriol. 124 (1), 511-523 (1975).
  4. Marschall, L. G., Jeng, R. L., Mulholland, J., Stearns, T. Analysis of Tub4p, a yeast gamma-tubulin-like protein: implications for microtubule-organizing center function. J Cell Biol. 134 (2), 443-454 (1996).
  5. Spang, A., Geissler, S., Grein, K., Schiebel, E. gamma-Tubulin-like Tub4p of Saccharomyces cerevisiae is associated with the spindle pole body substructures that organize microtubules and is required for mitotic spindle formation. J Cell Biol. 134 (2), 429-441 (1996).
  6. Winey, M., Bloom, K. Mitotic spindle form and function. Genetics. 190 (4), 1197-1224 (2012).
  7. Gupta, M. L. J., et al. beta-Tubulin C354 mutations that severely decrease microtubule dynamics do not prevent nuclear migration in yeast. Mol Biol Cell. 13 (8), 2919-2932 (2002).
  8. Moore, J. K., Cooper, J. A. Coordinating mitosis with cell polarity: Molecular motors at the cell cortex. Semin Cell Dev Biol. 21 (3), 283-289 (2010).
  9. Gartz Hanson, M., et al. Novel alpha-tubulin mutation disrupts neural development and tubulin proteostasis. Dev Biol. 409 (2), 406-419 (2016).
  10. Fees, C. P., Aiken, J., O'Toole, E. T., Giddings, T. H. J., Moore, J. K. The negatively charged carboxy-terminal tail of beta-tubulin promotes proper chromosome segregation. Mol Biol Cell. 27 (11), 1786-1796 (2016).
  11. Song, S., Lee, K. S. A novel function of Saccharomyces cerevisiae CDC5 in cytokinesis. J Cell Biol. 152 (3), 451-469 (2001).
  12. Knop, M., et al. Epitope tagging of yeast genes using a PCR-based strategy: more tags and improved practical routines. Yeast. 15 (10B), 963-972 (1999).
  13. Kosco, K. A., et al. Control of microtubule dynamics by Stu2p is essential for spindle orientation and metaphase chromosome alignment in yeast. Mol Biol Cell. 12 (9), 2870-2880 (2001).
  14. Toso, R. J., Jordan, M. A., Farrell, K. W., Matsumoto, B., Wilson, L. Kinetic stabilization of microtubule dynamic instability in vitro by vinblastine. Biochemistry. 32 (5), 1285-1293 (1993).
  15. Aiken, J., Sept, D., Costanzo, M., Boone, C., Cooper, J. A., Moore, J. K. Genome-wide analysis reveals novel and discrete functions for tubulin carboxy-terminal tails. Curr Biol. 24 (12), 1295-1303 (2014).
  16. Straight, A. F., Marshall, W. F., Sedat, J. W., Murray, A. W. Mitosis in living budding yeast: anaphase A but no metaphase plate. Science. 277 (5325), 574-578 (1997).
  17. Khmelinskii, A., Lawrence, C., Roostalu, J., Schiebel, E. Cdc14-regulated midzone assembly controls anaphase B. J Cell Biol. 177 (6), 981-993 (2007).
  18. Markus, S. M., Omer, S., Baranowski, K., Lee, W. L. Improved Plasmids for Fluorescent Protein Tagging of Microtubules in Saccharomyces cerevisiae. Traffic. 16 (7), 773-786 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Obrazowanie kom rek dro d ypomiar d ugo ci mikrotubulanaliza obraz w konfokalnychmikroskopia poklatkowatubulina z tagiem GFPgenetyka dro d yprzygotowanie komory na szkie kuadhezja za pomoc konkanawaliny Atempo polimeryzacji mikrotubul

Powiązane artykuły