Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Kompleksowa metoda do szybkiej analizy chemotaksji neutrofili bezpośrednio z kropli krwi

16.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55615

⸱

23 czerwca 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Applied Technology, Hefei Institutes of Physical Science, Chinese Academy of Sciences, 2University of Science and Technology of China, 3Department of Physics and Astronomy, University of Manitoba, 4Department of Biosystems Engineering, University of Manitoba, 5Seven Oaks General Hospital, 6Department of Immunology, University of Manitoba, 7Department of Biological Sciences, University of Manitoba

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł przedstawia szczegółową metodę przeprowadzania szybkiego testu chemotaksji neutrofili poprzez integrację wbudowanej izolacji neutrofili z krwi pełnej oraz testu chemotaksji na pojedynczym chipie mikroprzepływowym.

Streszczenie

Migracja neutrofili i chemotaksja są kluczowe dla układu odpornościowego naszego organizmu. Urządzenia mikroprzepływowe są coraz częściej wykorzystywane do badania migracji neutrofili i chemotaksji ze względu na ich zalety w wizualizacji w czasie rzeczywistym, precyzyjną kontrolę generowania gradientu stężeń chemicznych oraz zmniejszone zużycie odczynników i próbek. W ostatnim czasie naukowcy zajmujący się mikroprzepływami podjęli coraz większe wysiłki w kierunku opracowania zintegrowanych i łatwych w obsłudze systemów analizy chemotaksji mikroprzepływowej, bezpośrednio z krwi pełnej. W tym kierunku opracowano pierwszą metodę typu "wszystko na chipie" do integracji magnetycznego oczyszczania neutrofili z testem chemotaksji z próbek o małej objętości krwi. Ta nowa metoda pozwala na szybkie przeprowadzenie testu chemotaksji neutrofili od próbki do wyniku w ciągu 25 minut. W tym artykule przedstawiamy szczegółową budowę, działanie i metodę analizy danych dla tego kompleksowego testu chemotaksji na chipie wraz z dyskusją na temat strategii rozwiązywania problemów, ograniczeń i przyszłych kierunków. Przedstawiono reprezentatywne wyniki testu chemotaksji granulocytów obojętnochłonnych, w którym badano zdefiniowany chemoatraktant, N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP), oraz plwocinę od pacjenta z przewlekłą obturacyjną chorobą płuc (POChP), przy użyciu tej metody all-on-chip. Metoda ta ma zastosowanie w wielu badaniach związanych z migracją komórek i zastosowaniach klinicznych.

Wprowadzenie

Chemotaksja, proces ukierunkowanej migracji komórek do rozpuszczalnego gradientu stężeń chemicznych, jest krytycznie zaangażowana w wiele procesów biologicznych, w tym odpowiedź immunologiczną1,2,3, rozwój tkanek4 i przerzuty do raka5. Neutrofile są najliczniejszym podzbiorem białych krwinek i odgrywają kluczową rolę w umożliwianiu wrodzonych funkcji obronnych gospodarza organizmu, a także w pośredniczeniu w adaptacyjnych odpowiedziach immunologicznych6,7. Neutrofile są wyposażone w wysoce regulowaną maszynerię chemotaktyczną, dzięki której te ruchliwe komórki odpornościowe reagują zarówno na chemoatraktanty pochodzące z patogenów (np. fMLP), jak i chemoatraktanty pochodzące od gospodarza (np. interleukinę-8) przezchemotaksję8. Migracja neutrofili i chemotaksja pośredniczą w różnych fizjologicznych problemach i chorobach, takich jak stany zapalne i nowotwory1,9. W związku z tym dokładna ocena chemotaksji neutrofili stanowi ważny odczyt funkcjonalny dla badania biologii neutrofili i związanych z nią chorób.

W porównaniu do powszechnie stosowanych konwencjonalnych testów chemotaksji (np. test transwell10), urządzenia mikroprzepływowe są bardzo obiecujące dla ilościowej oceny migracji komórek i chemotaksji dzięki precyzyjnie kontrolowanemu generowaniu i miniaturyzacji gradientów chemicznych11,12,13. W ciągu ostatnich dwóch dekad opracowano różne urządzenia mikroprzepływowe do badania chemotaksji różnych typów komórek biologicznych, zwłaszcza neutrofili11. Wiele wysiłku włożono w scharakteryzowanie migracji neutrofili w przestrzennie złożonych gradientach chemicznych, które zostały skonfigurowane w urządzeniach mikroprzepływowych14,15. Opracowano również interesujące strategie badania kierunkowego podejmowania decyzji przez neutrofile za pomocą urządzeń mikroprzepływowych16. Oprócz badań zorientowanych biologicznie, zastosowania urządzeń mikroprzepływowych zostały rozszerzone o testowanie próbek klinicznych do oceny choroby17,18,19. Jednak stosowanie wielu urządzeń mikroprzepływowych jest ograniczone do specjalistycznych laboratoriów badawczych i wymaga długotrwałej izolacji neutrofili z dużej objętości próbek krwi. W związku z tym obserwuje się rosnący trend opracowywania zintegrowanych urządzeń mikroprzepływowych do szybkiej analizy chemotaksji neutrofili bezpośrednio z kropli krwi pełnej20,21,22,23,24.

W tym kierunku opracowano metodę all-on-chip, która integruje magnetyczne oczyszczanie neutrofili ujemnych i późniejszy test chemotaksji na pojedynczym urządzeniu mikroprzepływowym25. Ta metoda typu "wszystko na chipie" ma następujące nowatorskie cechy: 1) w przeciwieństwie do poprzednich strategii na chipie, które izolują neutrofile z krwi za pomocą wychwytywania komórek na podstawie adhezji lub filtrowania opartego na wielkości komórki20,22, ta nowa metoda pozwala na magnetyczną separację neutrofili o wysokiej czystości na chipie od małych objętości krwi pełnej, a także pomiar chemotaksji po stymulacji chemoatraktantem; 2) struktura dokowania komórek pomaga wyrównać początkowe pozycje neutrofili blisko kanału gradientu chemicznego i umożliwia prostą analizę chemotaksji bez śledzenia pojedynczych komórek; 3) Integracja izolacji neutrofili i testu chemotaksji na jednym urządzeniu mikroprzepływowym pozwala na szybką analizę chemotaksji próbki do wyniku w ciągu 25 minut, gdy nie ma przerwy między etapami eksperymentalnymi.

Ten artykuł zawiera szczegółowy protokół budowy, działania i metody analizy danych tego testu chemotaksji typu all-on-chip. W artykule przedstawiono efektywne wykorzystanie opracowanej metody do przeprowadzania chemotaksji neutrofili poprzez testowanie znanego rekombinowanego chemoatraktantu i złożonych próbek chemotaktycznych od pacjentów, a następnie omówiono strategie rozwiązywania problemów, ograniczenia i przyszłe kierunki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie protokoły pobierania próbek od ludzi zostały zatwierdzone przez Wspólną Radę Etyki Badań Naukowych na Uniwersytecie Manitoba w Winnipeg.

1. Produkcja urządzeń mikroprzepływowych (Rysunek 1A)

  1. Zaprojektuj i wydrukuj maskę przezroczystości.
    1. Zaprojektuj urządzenie zgodnie z wcześniejszymi opisami25. Zobacz Rysunek 1A.
      UWAGA: Urządzenie składa się z dwóch warstw. Pierwsza warstwa (o wysokości 4 μm) definiuje kanał bariery dokowania komórek, aby uwięzić komórki obok kanału gradientu. Druga warstwa (o wysokości 60 μm) określa kanał generujący gradient, port i kanał do ładowania komórek, zbiorniki wlotowe chemikaliów i wylot odpadów. Znaczniki wyrównania są zaprojektowane dla dwóch warstw. W przypadku drugiej warstwy długość i szerokość kanału wejściowego serpentyny przed warstwą wynosi odpowiednio 60 mm i 200 μm; Długość i szerokość znajdującego się za nim kanału wejściowego serpentyny wynosi odpowiednio 6 mm i 280 μm.
    2. Drukowanie elementów pierwszej i drugiej warstwy na masce przezroczystości za pomocą drukarki o wysokiej rozdzielczości.
      UWAGA: Rozdzielczość drukowania zależy od minimalnych cech projektu. W obecnym projekcie wybrano rozdzielczość 32 000 dpi dla minimalnej rozdzielczości 10 μm.
  2. Wyczyść wafel silikonowy.
    1. Umieść 3-calową płytkę krzemową w myjce plazmowej. Stosować próżnię przez 3 minuty.
    2. Włącz zasilanie plazmy i ustaw poziom na WYSOKI. Użyj plazmy tlenowej do obróbki płytki krzemowej przez 30 minut.
    3. Wyłącz myjkę plazmową i wyjmij płytkę krzemową; płytka krzemowa jest gotowa do wykonania formy urządzenia.
  3. Wykonaj pierwszą warstwę za pomocą fotolitografii w pomieszczeniu czystym.
    UWAGA: Dokładne parametry produkcyjne mogą się różnić w zależności od zakładu produkcyjnego.
    1. Rozcieńczyć 10 ml SU-8 2025 z 10 ml SU-8 2000 w zbijaku do szkła, aby przygotować zaprojektowany fotorezyst. Pozostaw mieszaninę w dygestorii na 10 minut, aż bąbelki znikną.
    2. Ostrożnie umieść oczyszczoną płytkę silikonową na przędzarce za pomocą odpowiedniego uchwytu i zastosuj podciśnienie, aby unieruchomić płytkę silikonową.
    3. Ostrożnie wlej 3 ml mieszaniny fotorezystu na środek płytki krzemowej. Wiruj z prędkością 500 obr./min przez 5 s. Następnie wiruj z prędkością 3,000 obr./min przez 30 s, aby uzyskać ostateczną powłokę fotorezystu o grubości 4 μm na płytce krzemowej.
    4. Ostrożnie wyjmij wafel silikonowy z wirówki i piecz wafel silikonowy na płycie grzejnej przez 4 minuty w temperaturze 95 °C.
    5. Ostrożnie umieść wafel silikonowy na wyrównywaczu maski i ustaw czas ekspozycji na promieniowanie UV na 6 s. Ostrożnie przymocuj maskę przezroczystą pierwszej warstwy na przezroczystej szklanej płytce za pomocą taśmy klejącej.
    6. Delikatnie umieść przezroczystą szklaną płytkę z dołączoną maską do nakładki i wyrównaj maskę z waflem silikonowym. Wystaw płytkę krzemową na działanie promieniowania UV, aby nadać wzór strukturze dokowania komórki.
    7. Ostrożnie zdejmij szklaną płytkę i wyjmij odsłoniętą płytkę silikonową. Piecz wafel silikonowy na płycie grzejnej przez 4 minuty w temperaturze 95 °C.
    8. Przenieś wafel krzemowy do dygestorium i umieść go w szklanej patelni zawierającej wywoływacz SU-8. Delikatnie potrząsaj tym przez 30 sekund.
    9. Wyczyść płytkę krzemową za pomocą świeżego wywoływacza SU-8, a następnie alkoholu izopropylowego (IPA) wewnątrz okapu wyciągowego. Wysuszyć wafel krzemowy za pomocą gazowego azotu wewnątrz dygestorium; Pierwsza warstwa jest gotowa.
  4. Ułóż drugą warstwę na pierwszej warstwie.
    1. Użyj taśmy klejącej, aby zakryć znaki wyrównania na pierwszej warstwie. Ostrożnie umieść wafel silikonowy z pierwszą warstwą na uchwycie próżniowym przędzarki i zastosuj podciśnienie, aby unieruchomić płytkę silikonową.
    2. Wlej 3 ml fotorezystu SU-8 2025 na płytkę krzemową. Wiruj wafel krzemowy z prędkością 500 obr./min przez 5 s. Następnie wiruj z prędkością 2000 obr./min przez 30 s, aby uzyskać ostateczną powłokę fotorezystu o grubości 60 μm na płytce krzemowej.
    3. Ostrożnie wyjmij wafel silikonowy z wirówki i przenieś go na płytę grzejną; piecz w temperaturze 65 °C przez 2 minuty.
    4. Delikatnie usuń taśmę samoprzylepną, aby odsłonić ślady wyrównania na pierwszej warstwie. Umieść wafel silikonowy na płycie grzejnej i piecz w temperaturze 95 °C przez 6 minut.
    5. Ostrożnie umieść wafel silikonowy na nakładce maski i ustaw czas ekspozycji na promieniowanie UV na 18 s.
    6. Ostrożnie przymocuj maskę przezroczystości drugiej warstwy do przezroczystej szklanej płytki za pomocą taśmy klejącej.
    7. Ostrożnie umieść szklaną płytkę z dołączoną maską do nakładki i wyrównaj maskę i pierwszą warstwę na płytce krzemowej za pomocą krzyżujących się znaków wyrównania za pomocą mikroskopu kontrolnego nakładki.
    8. Wystaw płytkę krzemową pokrytą fotorezystem na działanie promieniowania UV, aby nadać wzór obciążeniu komórek i kanałom gradientowym.
    9. Ostrożnie zdejmij szklaną płytkę i wyjmij wafel silikonowy. Piecz wafel silikonowy na płycie grzejnej w temperaturze 65 °C przez 2 minuty, a następnie przenieś wafel silikonowy na inną płytę grzejną o temperaturze 95 °C i piecz przez 6 minut.
    10. Przenieś wafel krzemowy do dygestorium i umieść go w szklanej patelni zawierającej wywoływacz SU-8. Delikatnie potrząsaj tym przez 6 minut.
    11. Wyczyść płytkę silikonową za pomocą świeżego wywoływacza SU-8, a następnie IPA wewnątrz dygestorium.
    12. Wysuszyć wafel krzemowy za pomocą azotu gazowego wewnątrz dygestorium. Umieść wafel silikonowy na płycie grzejnej i piecz na twardo formę w temperaturze 150 °C przez 30 minut; Druga warstwa jest gotowa.
  5. Modyfikacja powierzchni formy głównej.
    UWAGA: Etap modyfikacji powierzchni silanizacji jest stosowany do formy SU-8 w celu ułatwienia uwalniania polidimetylosiloksanu (PDMS) z formy w miękkiej litografii.
    1. Pobrać 10 μl roztworu tridekafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooktylu (trichlorosilanu) w końcówce do mikropipet. Umieść końcówkę mikropipety w plastikowej probówce o pojemności 15 ml i poluzuj nakrętkę probówki.
    2. Umieścić probówkę i wafel krzemowy z wzorem SU-8 w eksykatorze i stosować próżnię przez 1 godzinę; forma maski jest gotowa do produkcji urządzenia PDMS.
  6. Wyprodukuj urządzenie PDMS.
    1. Przygotować roztwór PDMS, mieszając 40 g bazy PDMS i 4 g utwardzacza w plastikowej zlewce. Umieść przygotowaną formę wzorcową SU-8 na szalce Petriego i ostrożnie wlej 44 g roztworu PDMS na formę.
    2. Umieścić szalkę Petriego w eksykatorze i zastosować próżnię, aby odgazować roztwór PDMS przez 20 minut. Następnie umieścić szalkę Petriego w piekarniku i utwardzić PDMS w temperaturze 80 °C przez 2 godziny.
    3. Po upieczeniu wyjmij szalkę Petriego i połóż ją na czystej ławce. Ostrożnie odetnij i oderwij płytę PDMS od formy SU-8.
    4. Wybij otwór ładowania ogniw za pomocą dziurkacza o średnicy 3 mm. Wybij zbiorniki wlotowe chemikaliów i wylot odpadów za pomocą dziurkacza o średnicy 6 mm.
    5. Usuń kurz z powierzchni płyty PDMS za pomocą taśmy klejącej. Umieść płytę PDMS i czysty szkiełko w maszynie plazmowej. Zastosuj próżnię na 3 minuty.
    6. Włącz zasilanie plazmy i ustaw poziom na WYSOKI. Delikatnie wyreguluj zawór powietrza i poddaj plazmie płytę PDMS i szkiełko przez 3 minuty.
    7. Wyłącz zasilanie plazmy i zwolnij podciśnienie. Ostrożnie wyjmij płytę PDMS i szkiełko za pomocą pęsety.
    8. Natychmiast umieść płytę PDMS (ze strukturami kanałów skierowanymi w dół) na szklanym szkiełku; delikatnie dociśnij płytę PDMS, aby przymocować ją do szkła. Natychmiast napełnij kanał mikroprzepływowy wodą dejonizowaną; Produkcja i montaż urządzenia mikroprzepływowego zostały zakończone.

2. Przygotowanie testu migracji komórek mikroprzepływowych

  1. Przygotowanie urządzenia mikroprzepływowego.
    1. Przygotować 50 μg/ml roztworu fibronektyny, rozcieńczając 50 μl podstawowego roztworu fibronektyny (1 mg/ml) do 950 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
    2. Przygotować pożywkę migracyjną, mieszając 9 ml pożywki Roswell Park Memorial Institute (RPMI-1640) i 1 ml RPMI-1640 z 4% albuminą surowicy bydlęcej (BSA).
    3. Usuń wodę dejonizowaną z urządzenia.
    4. Dodaj 100 μl roztworu fibronektyny do urządzenia z wylotu. Odczekaj 3 minuty, aby upewnić się, że wszystkie kanały są wypełnione roztworem fibronektyny. Umieścić urządzenie mikroprzepływowe na przykrytej szalce Petriego na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    5. Usuń roztwór fibronektyny z urządzenia. Dodać 100 μl pożywki migracyjnej z wylotu. Odczekaj 3 minuty, aby upewnić się, że wszystkie kanały są wypełnione medium migracyjnym.
    6. Inkubować urządzenie przez kolejne 1 godzinę w temperaturze pokojowej; następnie urządzenie jest gotowe do eksperymentu chemotaksji.
  2. Przygotowanie roztworu chemoatraktantu do eksperymentu z chemotaksją.
    1. Przygotować 100 nM roztwór fMLP w łącznej objętości 1 ml pożywki migracyjnej. Wymieszaj 5 μl podstawowego FITC-Dekstranu (10 kDa, 1 mM) z roztworem fMLP w probówce o pojemności 1,5 ml.
      UWAGA: FITC-Dextran służy do pomiaru gradientu. Alternatywnie użyj rodaminy jako wskaźnika gradientu. Roztwór chemoatraktantu fMLP jest następnie gotowy do eksperymentu z chemotaksją.
  3. Przygotowanie próbki plwociny.
    UWAGA: Chemotaksja neutrofili indukowana gradientem próbki plwociny od pacjentów z POChP została przetestowana jako kliniczne zastosowanie diagnostyczne tej metody all-on-chip.
    1. Uzyskaj protokół etyczny dla ludzi, aby pobrać próbki plwociny od pacjentów z POChP.
      UWAGA: Uzyskaliśmy zgody na pobieranie próbek w Seven Oaks General Hospital w Winnipeg (zatwierdzone przez University of Manitoba).
    2. Uzyskaj formularze świadomej pisemnej zgody od wszystkich uczestników.
    3. Pobieranie spontanicznych próbek plwociny od pacjentów z POChP. Umieść próbkę plwociny o pojemności 500 μl w probówce o pojemności 1,5 ml.
    4. Dodaj 500 μl 0,1% ditiotreitolu do probówki o pojemności 1,5 ml i delikatnie wymieszaj. Umieścić probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 15 minut.
    5. Odwirować próbkę o sile 753 x g przez 10 minut, a następnie zebrać supernatant. Odwirować sklarowany stężeń 865 x g przez 5 minut, a następnie zebrać końcowy supernatant. Zebrany supernatant należy przechowywać w zamrażarce o temperaturze -80 °C przed użyciem.
    6. Gdy będziesz gotowy do eksperymentu z chemotaksją, rozmrozić roztwór plwociny; przenieść 900 μl pożywki migracyjnej do probówki o pojemności 1,5 ml i wymieszać ze 100 μl roztworu plwociny w komorze bezpieczeństwa biologicznego; roztwór plwociny jest następnie gotowy do eksperymentu z chemotaksją.
  4. Pobranie próbki krwi.
    1. Uzyskaj protokół etyki ludzkiej, aby pobrać próbki krwi od zdrowych dawców. Należy uzyskać formularze świadomej pisemnej zgody od wszystkich dawców krwi.
      UWAGA: Tutaj próbki zostały pobrane w Victoria General Hospital w Winnipeg (zatwierdzone przez Wspólną Wydziałową Radę ds. Etyki Badań na Uniwersytecie Manitoba).
    2. Pobrać próbkę krwi przez nakłucie żyły i umieścić próbkę w probówce pokrytej EDTA. Przed eksperymentem należy przechowywać probówkę w komorze bezpieczeństwa biologicznego.

3. Operacja testu chemotaksji w całości na chipie

  1. Izolacja komórek w układzie scalonym (Rysunek 1B).
    1. Umieść 10 μl krwi pełnej w probówce o pojemności 1,5 ml w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
      UWAGA: Szczegółowe informacje na temat pobierania próbek krwi znajdują się w punkcie 2.4.
    2. Dodać 2 μl koktajlu przeciwciał (Ab) i 2 μl cząstek magnetycznych (MP) z zestawu do izolacji neutrofili (patrz tabela materiałów) do probówki o pojemności 1,5 ml i delikatnie wymieszać, co spowoduje oznaczenie komórek we krwi z wyjątkiem neutrofili.
    3. Inkubować mieszaninę krew-Ab-MP przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Spowoduje to magnetyczne oznakowanie komórek znakowanych przeciwciałami we krwi.
    4. Podłącz dwa małe dyski magnetyczne po obu stronach portu ładowania ogniw urządzenia. Zassać pożywkę ze wszystkich portów urządzenia.
    5. Powoli pipetować 2 μl mieszaniny krwi-Ab-MP do urządzenia mikroprzepływowego z portu ładowania ogniwa.
      UWAGA: Magnetycznie znakowane komórki są uwięzione w bocznych ściankach portu ładowania ogniw, podczas gdy neutrofile wpłyną do urządzenia i zostaną uwięzione w strukturze dokowania ogniw.
    6. Poczekaj kilka minut, aż wystarczająca liczba neutrofili zostanie uwięziona w obszarze dokowania komórki.
  2. Test chemotaksji (Rysunek 1C).
    1. Umieścić urządzenie mikroprzepływowe na stoliku mikroskopu o kontrolowanej temperaturze w temperaturze 37 °C.
    2. Dodać 100 μl roztworu chemoatraktantu (fMLP lub roztwór plwociny) i 100 μl pożywki migracyjnej do wyznaczonych zbiorników wlotowych za pomocą dwóch pipetorów; spowoduje to wytworzenie gradientu chemoatraktantu w kanale gradientowym przez ciągłe mieszanie chemiczne oparte na przepływie laminarnym wspomagane przez strukturę równoważącą ciśnienie.
      UWAGA: Szczegółowe informacje na temat pobierania plwociny od pacjentów z POChP znajdują się w punkcie 2.3.
      1. W eksperymencie kontrolnym pożywki należy dodać pożywkę migracyjną tylko do obu zbiorników wlotowych.
    3. Uzyskaj obraz fluorescencyjny FITC-Dekstranu w kanale gradientowym.
    4. Zaimportuj obraz do oprogramowania ImageJ za pomocą polecenia "Plik|Otwórz".
    5. Zmierz profil intensywności fluorescencji w całym kanale gradientu za pomocą polecenia "Analizuj|Profil działki".
    6. Eksportuj dane pomiarowe do arkusza kalkulacyjnego w celu dalszego kreślenia.
    7. Inkubować urządzenie na stoliku mikroskopu z kontrolowaną temperaturą lub w konwencjonalnym inkubatorze do hodowli komórkowych przez 15 minut.
    8. Zobrazuj kanał gradientu za pomocą obiektywu 10X, aby zarejestrować końcowe pozycje komórek do analizy danych.
    9. W razie potrzeby zarejestruj migrację komórek w urządzeniu za pomocą mikroskopii poklatkowej.

4. Analiza danych migracji komórek (Rysunek 1C)

  1. Przeanalizuj test chemotaksji, obliczając odległość migracji komórek od struktury dokowania, jak opisano poniżej. Zobacz Rysunek 1C.
  2. Zaimportuj obraz do oprogramowania NIH ImageJ (wer. 1.45).
  3. Zaznacz środek każdej komórki, która została przeniesiona do kanału gradientu.
  4. Zmierz współrzędne wybranych komórek dla ich ostatecznych pozycji. Zmierz współrzędną punktu na krawędzi konstrukcji dokowania jako początkową pozycję odniesienia.
  5. Eksportuj zmierzone dane współrzędnych do arkusza kalkulacyjnego (np. Excel). Oblicz odległość migracji komórek jako różnicę między końcowym położeniem komórki a początkowym położeniem odniesienia wzdłuż kierunku gradientu.
  6. Skalibruj odległość z dokładnością do mikrometra. Oblicz średnią i odchylenie odległości migracji wszystkich komórek jako miarę chemotaksji.
  7. Porównaj odległość migracji w obecności gradientu chemoatraktantu z eksperymentem kontrolnym pożywki za pomocą testu t-Studenta.
  8. Jeśli zostaną zarejestrowane obrazy poklatkowe migracji komórek, migracja komórek i chemotaksja mogą być dalej analizowane przez analizę śledzenia komórek15.
    UWAGA: Materiały wymagane do skonstruowania i przeprowadzenia testu chemotaksji typu "wszystko na chipie" są wyszczególnione w tabeli materiałów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Neutrofile zostają wyselekcjonowane negatywnie z kropli krwi pełnej bezpośrednio w urządzeniu mikroprzepływowym. Czystość wyizolowanych neutrofilli zweryfikowano za pomocą barwienia metodą Giemsy bezpośrednio na chipie, a wyniki wykazały typowe pierścieńcowate i wielopłatowe jądra neutrofilli (Rysunek 2A)25. Wskazuje to na skuteczną izolację neutrofilli na chipie przy wysokiej czystości z niewielkiej objętości krwi pełnej. Ponadto stru...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W niniejszej pracy opisano szczegółowy protokół bezpośredniego izolowania neutrofili z krwi pełnej, a następnie testu chemotaksji, a wszystko to na jednym chipie mikroprzepływowym. Metoda ta oferuje przydatne funkcje, takie jak łatwa obsługa, negatywna selekcja neutrofili o wysokiej czystości, szybki test chemotaksji od próbki do wyniku, zmniejszone zużycie odczynników i próbek oraz dokładna analiza danych migracji komórek. Z grubsza szacuje się, że co najmniej 25% neutrofili z wejściowej próbki krwi pełnej skutecznie we...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie ma żadnych konfliktów interesów, które można by ujawnić.

Podziękowania

Ta praca jest częściowo wspierana przez granty z Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) oraz Canadian Institutes of Health Research (CIHR). Dziękujemy Instytutowi Klinicznemu Badań Stosowanych i Edukacji w Victoria General Hospital w Winnipeg oraz Seven Oaks General Hospital w Winnipeg za zarządzanie próbkami klinicznymi od ludzi. Dziękujemy dr Hagit Peretz-Soroka za pomocną dyskusję na temat strategii operacji testowych. Dziękujemy profesor Carolyn Ren i dr Xiaoming (Cody) Chen z Uniwersytetu Waterloo za ich hojne wsparcie w procesie filmowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Produkcja urządzeń
Mask alignerABMN/A
SpinnerSolitec5000
Płyta grzejnaVWR11301-022
Myjka plazmowaHarrick PlasmaPDC-001
Eksykator próżniowyFisher Scientific08-594-15A
Waga cyfrowaOhausCS200
SU-8 2000 rozcieńczalnikMicrochemSU-8 2000
SU-8 2025 fotorezystorMicrochemSU-8 2025
SU-8 deweloperMicrochemSU-8 wywoływacz
Si wafel, IncLG2065
Alkohol izopropylowyFisher ScientificA416-4
(tridekafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooktylo)trichlorosilanGelest78560-45-9
Polidimetylosiloksan
(PDMS)		Ellsworth Kleje2065622
szalka PetriegoFisher ScientificFB0875714
Szkiełka szklaneFisher Scientific12-544-4
Podkładka do cięciaN/A/AZamówienie
DziurkaczeNieNie dotyczy Wykonane na zamówienie
NazwaŹródłoNumer katalogowyUwagi
Izolacja komórek na chipie i test chemotaksji
RPMI 1640Fisher ScientificSH3025502
DPBSFisher Scientific SH3002802
Albumina surowicy bydlęcej
(BSA)		Sigma-AldrichSH3057402
FibronektynaVWRCACB356008
fMLPSigma-AldrichF3506-10MG
Dyski magnetyczneIndigo Instruments44202-1Średnica 5 mm,
grubość
1 mmFITC-DekstranSigma-AldrichFD10S
Rodamina
Sigma-Aldrich		R4127-5G
Roztwór barwienia GiemsaRowley Biochemical Inc.G-472-1-8OZ
EasySep Bezpośredni zestaw do izolacji neutrofili <
STEMCELL
/> Technologies Inc		19666
DithiothreitolSigma-AldrichD0632
Mikroskop fluorescencyjny odwrócony Nikon Ti-UKomoraTi-U
.Kamera CCD InVivo ScientificNikon
DS-Fi1
krzemowy N dotyczy środowiskowa mikroskopu Nikon

Bibliografia

  1. Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13 (13), 159-175 (2013).
  2. Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nat Immunol. 6 (12), 1182-1190 (2005).
  3. Griffith, J. W., Luster, A. D. Targeting cells in motion: migrating toward improved therapies. Eur. J. Immunol. 43 (6), 1430-1435 (2013).
  4. Laird, D. J., von Andrian, U. H., Wagers, A. J. Stem cell trafficking in tissue development, growth, and disease. Cell. 132 (4), 612-630 (2008).
  5. Condeelis, J., Segall, J. E. Intravital imaging of cell movement in tumours. Nat Rev Cancer. 3 (12), 921-930 (2003).
  6. Kruger, P., et al. Neutrophils: between host defence, immune modulation, and tissue injury. PLoS Pathog. 11 (3), e1004651(2015).
  7. Mócsai, A. Diverse novel functions of neutrophils in immunity, inflammation, and beyond. J Exp Med. 210 (7), 1283-1299 (2013).
  8. Foxman, E. F., Campbell, J. J., Butcher, E. C. Multistep navigation and the combinatorial control of leukocyte chemotaxis. J Cell Biol. 139 (7), 1349-1360 (1997).
  9. Tazzyman, S., Niaz, H., Murdoch, C. Neutrophil-mediated tumour angiogenesis: subversion of immune responses to promote tumour growth. Semin Cancer Biol. 23 (3), 149-158 (2013).
  10. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J Exp Med. 115 (3), 453-466 (1962).
  11. Wu, J., Wu, X., Lin, F. Recent developments in microfluidics-based chemotaxis studies. Lab Chip. 13 (13), 2484-2499 (2013).
  12. Sackmann, E. K., Fulton, A. L., Beebe, D. J. The present and future role of microfluidics in biomedical research. Nature. 507 (7491), 181-189 (2014).
  13. Kim, S., Kim, H. J., Jeon, N. L. Biological applications of microfluidic gradient devices. Integr Biol. 2 (11-12), 584-603 (2010).
  14. Irimia, D., et al. Microfluidic system for measuring neutrophil migratory responses to fast switches of chemical gradients. Lab Chip. 6 (2), 191-198 (2006).
  15. Lin, F., et al. Neutrophil migration in opposing chemoattractant gradients using microfluidic chemotaxis devices. Ann Biomed Eng. 33 (4), 475-482 (2005).
  16. Ambravaneswaran, V., Wong, I. Y., Aranyosi, A. J., Toner, M., Irimia, D. Directional decisions during neutrophil chemotaxis inside bifurcating channels. Integr Biol. 2 (11-12), 639-647 (2010).
  17. Jones, C. N., et al. Spontaneous neutrophil migration patterns during sepsis after major burns. PloS One. 9 (12), e114509(2014).
  18. Butler, K. L., et al. Burn injury reduces neutrophil directional migration speed in microfluidic devices. PloS One. 5 (7), e11921(2010).
  19. Wu, J., et al. A microfluidic platform for evaluating neutrophil chemotaxis induced by sputum from COPD patients. PloS One. 10 (5), e0126523(2015).
  20. Sackmann, E. K., et al. Microfluidic kit-on-a-lid: a versatile platform for neutrophil chemotaxis assays. Blood. 120 (14), e45-e53 (2012).
  21. Agrawal, N., Toner, M., Irimia, D. Neutrophil migration assay from a drop of blood. Lab Chip. 8 (12), 2054-2061 (2008).
  22. Jones, C. N., et al. Microfluidic platform for measuring neutrophil chemotaxis from unprocessed human whole blood. J Vis Exp. (88), (2014).
  23. Jones, C. N., et al. Microfluidic assay for precise measurements of mouse, rat, and human neutrophil chemotaxis in whole-blood droplets. J Leukocyte Biol. 100 (1), 241-247 (2016).
  24. Sackmann, E. K. -H., et al. Characterizing asthma from a drop of blood using neutrophil chemotaxis. P Natl Acad Sci. 111 (16), 5813-5818 (2014).
  25. Wu, J., et al. An all-on-chip method for testing neutrophil chemotaxis induced by fMLP and COPD patient's sputum. Technology. 04 (02), 104-109 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Urz dzenie mikrofluidycznemagnetyczna izolacja neutrofilitest chemotaksjianaliza krwi pe nejprzygotowanie urz dzenia PDMSgradient chemoatraktantaanaliza migracji kom rekchemotaksja fMLPpr bka plwociny w POChP
Kompleksowa metoda do szybkiej analizy chemotaksji neutrofili bezpośrednio z kropli krwi
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.