Artykuł metodologiczny

Wysoka precyzja FRET na poziomie pojedynczej cząsteczki do określania struktury biomolekuły

DOI:

10.3791/55623

⸱

13 maja 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Clemson University, 2Department of Physics and Astronomy, Clemson University, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, Center for Membrane Biology, Graduate School for Biomedical Sciences, University of Texas Health Science Center

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół dla wysoce precyzyjnych eksperymentów FRET na poziomie pojedynczej cząsteczki jest przedstawiony tutaj. Ponadto metodologia ta może być wykorzystana do identyfikacji trzech stanów konformacyjnych w domenie wiążącej ligand receptora N-metylo-D-asparaginianu (NMDA). Wyznaczanie precyzyjnych odległości jest pierwszym krokiem w kierunku budowy modeli konstrukcyjnych w oparciu o eksperymenty FRET.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół dotyczący wykonywania precyzyjnych pomiarów odległości między barwnikami za pomocą transferu energii rezonansu Förstera (FRET) na poziomie pojedynczej cząsteczki w trybie wieloparametrowej detekcji fluorescencji (MFD) jest przedstawiony tutaj. MFD maksymalizuje wykorzystanie wszystkich "wymiarów" fluorescencji w celu redukcji artefaktów fotofizycznych i eksperymentalnych oraz pozwala na pomiar odległości interdywu z dokładnością do ~1 A w sztywnych biomolekułach. Metodę tę zastosowano do identyfikacji trzech stanów konformacyjnych domeny wiążącej ligand receptora N-metylo-D-asparaginianu (NMDA) w celu wyjaśnienia aktywacji receptora po związaniu liganda. Porównując znane struktury krystalograficzne z pomiarami eksperymentalnymi, zgodzili się w zakresie mniej niż 3 A dla bardziej dynamicznych biomolekuł. Zebranie zestawu ograniczeń odległości, które obejmowałoby całą wymiarowość biomolekuł, umożliwiłoby stworzenie modelu strukturalnego dynamicznych biomolekuł.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podstawowym celem badań biologii strukturalnej jest odkrycie związku między strukturą a funkcją maszyn biomolekularnych. Pierwsze wizualne wrażenie biomolekuł (np. białek i kwasów nukleinowych) pojawiło się w latach pięćdziesiątych XX wieku dzięki rozwojowi krystalografii rentgenowskiej1,2. Krystalografia rentgenowska dostarcza wysokiej rozdzielczości, statycznych informacji strukturalnych ograniczonych przez upakowanie kryształów. W związku z tym nieodłączny bezruch rentgenowskich modeli strukturalnych unika dynamicznej natury biomolekuł, czynnika, który wpływa na większość funkcji biologicznych3,4,5. Magnetyczny rezonans jądrowy (NMR)6,7,8 dostarczył alternatywnego rozwiązania problemu, rozwiązując modele strukturalne w roztworach wodnych. Ogromną zaletą NMR jest jego zdolność do odzyskiwania wewnętrznej dynamicznej natury biomolekuł i zespołów konformacyjnych, co pomaga wyjaśnić wewnętrzne relacje między strukturą, dynamiką i funkcją3,4,5. Niemniej jednak NMR, ograniczony wielkością próbki i dużymi ilościami próbki, wymaga złożonych strategii etykietowania dla większych systemów. W związku z tym istnieje pilna potrzeba opracowania alternatywnych metod w biologii strukturalnej.

Historycznie, transfer energii rezonansu Förstera (FRET)9 nie odgrywał ważnej roli w biologii strukturalnej z powodu błędnego przekonania, że FRET zapewnia niskie dokładności pomiary odległości. Celem tego protokołu jest ponowne zbadanie zdolności FRET do określania odległości w skali nanometrowej, tak aby odległości te można było wykorzystać do budowy modeli strukturalnych biomolekuł. Pierwsza eksperymentalna weryfikacja zależności R-6 od wydajności FRET została przeprowadzona przez Stryera w 1967 roku10, mierząc poliproliny o różnych długościach jako "linijka spektroskopowa". Podobny eksperyment został przeprowadzony na poziomie pojedynczej cząsteczki w 2005 roku11. Cząsteczki poliproliny okazały się nieidealne, w związku z czym później zastosowano dwuniciowe cząsteczki DNA12. Otworzyło to okno do precyzyjnych pomiarów odległości i pomysłu wykorzystania FRET do identyfikacji właściwości strukturalnych biomolekuł.

FRET jest optymalny, gdy zakres odległości interdye wynosi od ~0,6-1,3 R0, gdzie R0 to odległość Förstera. Dla typowych fluoroforów stosowanych w jednocząsteczkowych eksperymentach z fretem, R0 wynosi ~50 A. Zazwyczaj FRET ma wiele zalet w porównaniu z innymi metodami pod względem zdolności do rozwiązywania i różnicowania struktur i dynamiki w układach heterogenicznych: (i) Ze względu na najwyższą czułość fluorescencji, eksperymenty z pojedynczą cząsteczką FRET13,14,15,16 potrafi rozwiązywać heterogeniczne zespoły, bezpośrednio licząc i jednocześnie charakteryzując struktury swoich poszczególnych członków. (ii) Złożone szlaki reakcji można bezpośrednio rozszyfrować w badaniach FRET na pojedynczych cząsteczkach, ponieważ nie jest potrzebna synchronizacja zespołu. (iii) FRET może uzyskać dostęp do szerokiego zakresu domen czasowych, które obejmują ponad 10 dekad w czasie, obejmując szeroki zakres biologicznie istotnych dynamik. (iv) Eksperymenty FRET mogą być przeprowadzane w dowolnych warunkach roztworu, zarówno in vitro, jak i in vivo. Połączenie FRET z mikroskopią fluorescencyjną pozwala na badanie struktur molekularnych i interakcji bezpośrednio w żywych komórkach15,16,17,18,19, nawet z dużą precyzją20. (v) FRET może być stosowany do systemów o niemal każdej wielkości (np. oligomery poliprolinowe21,22,23,24, Hsp9025, HIV reverse transcriptase26 i rybosomy27). (vi) Wreszcie, sieć odległości, która zawiera wszystkie wymiarowości biomolekuł, może być wykorzystana do wyprowadzenia modeli strukturalnych cząsteczek statycznych lub dynamicznych18,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37.

Dlatego spektroskopia FRET pojedynczej cząsteczki może być używana do wyznaczania odległości, które są na tyle precyzyjne, że można je wykorzystać do modelowania strukturalnego z ograniczeniem odległości26. Jest to możliwe dzięki wykorzystaniu wieloparametrowego wykrywania fluorescencji (MFD)28,38,39,40,41,42, który wykorzystuje osiem wymiarów informacji fluorescencyjnej (tj. widmo wzbudzenia, widmo fluorescencji, anizotropia, czas życia fluorescencji, wydajność kwantowa fluorescencji, czas makroskopowy, intensywność fluorescencji i odległość między fluoroforami), aby dokładnie i precyzyjnie zapewnić ograniczenia odległości. Dodatkowo, impulsowe wzbudzenie z przeplotem (PIE) jest połączone z MFD (PIE-MFD)42 w celu monitorowania fluorescencji akceptora bezpośredniego wzbudzenia i wyboru zdarzeń jednocząsteczkowych wynikających z próbek zawierających stechiometrię 1:1 donor-akceptor. Typowa konfiguracja PIE-MFD wykorzystuje dwuimpulsowe lasery wzbudzające z przeplotem połączone z korpusem mikroskopu konfokalnego, w którym detekcja fotonów jest podzielona na cztery różne kanały w różnych oknach spektralnych i charakterystyce polaryzacji. Więcej szczegółów można znaleźć na rysunku 1.

Ważne jest, aby pamiętać, że FRET musi być połączony z metodami obliczeniowymi, aby uzyskać atomistyczne modele strukturalne, które są zgodne z wynikami FRET26,30. Celem niniejszego protokołu nie jest omówienie powiązanej metodologii budowy modeli strukturalnych z odległościami pochodzącymi z FRET. Jednak podejścia te zostały zastosowane w połączeniu z innymi technikami (np. rozpraszaniem promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem lub elektronowym rezonansem paramagnetycznym), dając początek dziedzinie integracyjnej biologii strukturalnej43,44,45,46. Obecnym celem jest utorowanie drogi dla FRET jako narzędzia ilościowego w biologii strukturalnej. Na przykład metodologia ta została wykorzystana do identyfikacji trzech stanów konformacyjnych w domenie wiążącej ligand (LBD) receptora N-metylo-D-asparaginianu (NMDA). Ostatecznym celem jest przezwyciężenie wyżej wymienionych ograniczeń i włączenie FRET do metod integracyjnych stosowanych do oznaczania strukturalnego biomolekuł poprzez dostarczanie zmierzonych odległości z dużą precyzją.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie buforu PBS i obróbka w komorze

UWAGA: Noś fartuch laboratoryjny i jednorazowe rękawiczki podczas przeprowadzania mokrych eksperymentów chemicznych. Podczas ustawiania lasera należy stosować ochronę oczu.

  1. Przygotowanie buforu PBS
    1. Rozpuścić 4,5 g Na2HPO4, 0,44 g NaH2PO4 i 3,5 g NaCl w 400 ml wody destylowanej. Zapewnić pH 7,5 i wysterylizować roztwór przez autoklawowanie w cyklu płynnym przez 1 godzinę (w zależności od systemu autoklawu).
    2. Weź 15 ml roztworu PBS i wymieszaj go z 0,1 g węgla drzewnego. Przefiltruj mieszaninę za pomocą zwykłego filtra strzykawkowego o pojemności 20 ml i wielkości porów 0,2 μm. Zamknąć i przechowywać bufor PBS w temperaturze pokojowej.
  2. Obróbka szkła nakrywkowego w komorze mikroskopowej
    1. Dodać 500 μl wody destylowanej i 5 μl niejonowego środka powierzchniowo czynnego polisorbatu 20 (patrz Wykaz Materiałów) do komorowego systemu szkła nakrywkowego (patrz Lista Materiałów) i dobrze wymieszać. Pozostaw do namoczenia przez 30 minut. Usunąć roztwór polisorbatu 20 i dwukrotnie umyć komorę wodą destylowaną. Niech wyschnie.
      UWAGA: Komora jest teraz gotowa do użycia.

2. Przygotowanie próbki DNA

UWAGA: Użyj zaprojektowanych oznaczonych nici DNA (zobacz Listę materiałów) do tworzenia standardowych próbek dwuniciowego DNA (dsDNA). Zaprojektowane oligonukleotydy nie mogą zawierać barwników na końcu polimeru, aby uniknąć artefaktów, które mogą zagrozić wyznaczonej odległości. Sekwencja DNA powinna być tak dobrana, aby zachowywała się jak sztywne ciało.

  1. Dodać 1,5 μl nici DNA znakowanej dawcą i 4,5 μl uzupełniającej (znakowanej lub nieznakowanej) nici DNA do probówki do mikrofuge i wymieszać je z 24 μl wody wolnej od nukleaz.
    UWAGA: W zależności od mieszanki wybranych oligonukleotydów zostaną wygenerowane następujące próbki: dsDNA bez FRET, o niskiej lub wysokiej FRET lub o wysokiej FRET .
  2. Hybrydyzować DNA za pomocą mieszalnika termicznego i następującego procesu: 95 °C przez 10 min, 90 °C przez 10 min, 80 °C przez 10 min, 70 °C przez 10 min, 60 °C przez 10 min, 50 °C przez 10 min, 40 °C przez 10 min, 30 °C przez 10 min, 20 °C przez 10 min, 10 °C przez 10 min i utrzymywanie w temperaturze 5 °C.
    UWAGA: Wygenerowane wzorce dsDNA mogą być przechowywane w zamrażarce w temperaturze -20 °C do długotrwałego przechowywania lub mogą być natychmiast zużyte.

3. Przygotowanie próbki białka

Uwaga: Zaczynając od rekombinowanego DNA do ekspresji białka będącego przedmiotem zainteresowania w systemach bakteryjnych, możliwe jest zmutowanie reszt, od których mają być mierzone odległości, do cystein. Aby to zrobić, użyj standardowych technik mutagenezy skierowanej na witrynę47. Aby ułatwić oczyszczanie białka, sklonuj rekombinowane i zmutowane DNA do wektora zawierającego znacznik oczyszczający (np. znacznik His). Zastosowano podjednostkę glutaminianu 1 domenę wiążącą ligand (LBD) z receptora jonotropowego glutaminianu NMDA (GluN1) LBD (tj. NMDA GluN1 LBD sklonowany do wektora pET-22b (+).

  1. Ekspresja białek
    1. Przekształć plazmid DNA w wybrany system ekspresji48.
      UWAGA: W poniższych krokach założymy, że ekspresja rozpuszczalnego białka jest przekształcana w Escherichia coli. Możliwe jest również oczyszczanie z np. transfekowanych komórek ssaków49 lub transdukowanych komórek owadów50, a szczegółowe kroki można znaleźć w innym miejscu. Upewnij się, że wybrany szczep E. coli jest odpowiedni dla interesującego Cię białka. Na przykład ekspresja białek zawierających mostki dwusiarczkowe wymaga szczepu kompetentnych komórek z mniej redukującym się przedziałem wewnątrzkomórkowym (patrz Lista materiałów).
    2. Zaszczepij starterową kulturę E. coli, używając sterylnej końcówki pipety, aby pobrać pojedynczą przekształconą kolonię48. Wrzuć go do 100 ml selektywnej pożywki LB (patrz Lista materiałów) i pozwól kulturze rosnąć przez noc w temperaturze 37 °C.
    3. Przygotuj bulion LB (patrz Lista materiałów). Autoklaw go w celu sterylizacji.
    4. Zaszczepić wielkoskalowe kultury przekształconych bakterii E. coli, dodając kulturę na noc do 2 litrów selektywnej pożywki LB w stosunku 1:500.
    5. W ciągu następnych kilku godzin oceń wzrost kultury, monitorując odczyty absorbancji (Abs) kultury przy 600 nm, czasami określane jako gęstość optyczna przy 600 nm (OD600) lub za pomocą miernika gęstości komórek. Zwróć uwagę, że odczyty rosną z czasem.
    6. Indukować ekspresję białka o końcowym stężeniu 0,5 mM izopropylo-β-d-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG), gdy kultura osiągnie OD600 0,7. Wstrząsać wywołaną E. coli w temperaturze 20 °C przez 20-24 godziny.
    7. Po indukcji białka E. coli należy otopić przez wirowanie przez 20 minut w temperaturze 3 000 x g i temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i przechowywać osad E. coli zawierający białko wewnątrzkomórkowe w temperaturze -80 °C do czasu użycia.
  2. Oczyszczanie białek
    1. Lizuje E. coli przy użyciu wybranej metody lizy (np. sonikacja, french press, kawitacja azotu itp.)51.
    2. Odwirować błonę i resztki komórkowe, odwirowując lizat przez 1 godzinę w temperaturze 185 000 x g i 4 °C.
    3. W przypadku białka znakowanego przez Hisa, załaduj supernatant do zrównoważonej, naładowanej niklem, unieruchomionej chromatografii powinowactwa do metali (IMAC) za pomocą systemu szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC) (patrz Tabela Materiałów)52.
      UWAGA: Bufor równowagowy dla NMDA GluN1 LBD: 200 mM NaCl, 20 mM Tris i 1 mM glicyny, pH 8. Bufor elucyjny dla NMDA GluN1 LBD: 200 mM NaCl, 20 mM Tris, 1 mM glicyny i 400 mM Imidazolu, pH 8.
      1. Przemyć kolumnę IMAC buforem zawierającym niewielką ilość (~12 mM) imidazolu.
      2. Eluować białko z kolumny IMAC za pomocą liniowego gradientu imidazolu od 12 mM do 400 mM.
    4. Dializować białko przez noc w buforze równowagowym bez imidazolu53, umieszczając eluat z kroku 3.2.3.2 w rurkach dializacyjnych i zanurzając go w buforze równowagi pod ciągłym mieszaniem przez 2-3 godziny. Powtórz co najmniej jeszcze jeden raz.
      UWAGA: Kroki 3.2.3-3.2.6 zakładają oczyszczanie białka znakowanego przez Hisa. Jeśli oczyszczasz inną metodą, odpowiednio dostosuj protokół.
    5. Określ ilościowo ilość białka, biorąc absorbancję dializowanego białka przy 280 nm i stosując prawo Beera (jednostka absorbancji = ε L c, gdzie ε jest współczynnikiem ekstynkcji (M-1 cm-1), który można uzyskać tutaj54; L to długość drogi światła (cm); a c jest stężeniem białka (M)).
      UWAGA: Dostępne są różne testy ilościowe białka, w tym test Bradforda i test kwasu bicinchoninowego. Oba zapewniają dokładne wyniki.
  3. Znakowanie białek
    1. Dodać fluorofory donorowe (reaktywny barwnik cyjanowo-zielony maleimid) i akceptorowe (reaktywny barwnik dalekiej czerwieni maleimidu) do oczyszczonego białka w stosunku molowym białka 1:1:8.
    2. Mieszaninę białek i fluoroforów inkubować na lodzie przez 30 minut. Możliwe są dłuższe czasy inkubacji.
    3. Spakować 0,5 ml kolumny agarozowej kwasu Ni-nitrilotrioctowego (Ni-NTA) (patrz Wykaz materiałów) i zrównoważyć ją przy użyciu tego samego buforu równowagi, co w kroku 3.2.3, podczas inkubacji białka.
      UWAGA: Utrzymuj ilość załadowanego białka zgodnie ze zdolnością wiązania żywicy.
    4. Po 30 minutowej inkubacji załadować mieszaninę białka/fluoroforu do kolumny przygotowanej w kroku 3.3.3 i oczyścić przez przepływ grawitacyjny.
    5. Nadmiar fluoroforu zmyć 5 ml buforu równoważącego.
    6. Eluować znakowane białko grawitacyjnie z kolumny czterokrotnie za pomocą 0,5 ml buforu elucyjnego. Ponieważ białko zostało już oczyszczone z innych białek, gradient nie jest konieczny
      7. .
    7. Sprawdzić każdy eluat za pomocą spektrometru UV-Vis, aby określić, która frakcja zawiera znakowane białko. Zeskanuj absorbancję w zakresie 230-700 nm, aby upewnić się, że piki absorbancji białka (280 nm) i każdego fluoroforu (493 nm dla fluoroforu cyjanowo-zielonego i 651 nm dla fluoroforu dalekiej czerwieni) są widoczne w eluacie.
      UWAGA: Zazwyczaj białko wymywa się we frakcji 2.
    8. Zrównoważyć kolumnę odsalającą (patrz tabela materiałów) z PBS poddanym działaniu węgla drzewnego (krok 1.1).
    9. Załaduj oznakowane białko do kolumny odsalającej za pomocą przepływu grawitacyjnego.
      UWAGA: Utrzymuj ilość załadowanego białka zgodnie z wybraną pojemnością kolumny odsalającej55.
    10. Eluować za pomocą 3,5 ml PBS poddanego działaniu węgla drzewnego za pomocą przepływu grawitacyjnego i zebrać 0,5 ml frakcji eluatu.
    11. Użyj spektrometru UV-Vis, aby zeskanować absorbancję każdego eluatu w zakresie 230-700 nm, aby określić, która frakcja zawiera znakowane białko.
      UWAGA: Kroki 3.3.8-3.3.11 służą zasadniczo jako krok wymiany bufora. Możliwe są również inne protokoły, które służą temu celowi (np. intensywne dializy). Alternatywnie można przejść od razu do kroku 3.3.8 z kroku 3.3.2.

4. Pomiary potrzebne w warunkach zespołowych (w kuwecie)

  1. Wyznaczanie stałej Förstera
    1. Zeskanuj fD, emisję fluoroforu fluorescencji (cps), we fluorymetrze, wzbudzając donor przy 15 nm do maksymalnej długości fali absorbancji, aby uzyskać pełne widmo emisyjne. Monitorować emisję rozpoczynającą się 5 nm po długości fali wzbudzenia i kończącą się 150 nm później. Użyj warunków magicznego kąta, ustawiając polaryzator emisyjny na 54,7°, a polaryzatory wzbudzenia na 0°56.
      UWAGA: Dla zastosowanego tutaj fluoroforu donorowego maksimum Abs występuje przy 490 nm; Jako długość fali wzbudzenia stosuje się 475 nm, a emisja od 480-650 nm jest monitorowana. Dla akceptora maksimum Abs występuje przy długości fali 645 nm; Dla długości fali wzbudzenia stosuje się 630 nm, a emisja z zakresu 635-735 nm jest monitorowana.
    2. Użyj fluorymetru, aby wykonać skan wzbudzenia fluoroforu akceptorowego (AbsA) w zakresie 400-700 nm i użyj warunków magicznego kąta, ustawiając polaryzator emisyjny na 54.7°, a polaryzatory wzbudzenia na 0°56. Ustawić monochromator emisyjny na 15 nm po maksymalnej długości fali emisji. Normalizuj do maksymalnej wartości wzbudzenia.
    3. W opublikowanych tabelach znajdź współczynnik ekstynkcji akceptora, εA (M-1 cm-1)56 lub użyj wartości podanych przez producenta.
      UWAGA: Wartość opublikowana dla fluoroforu akceptorowego użytego w tym manuskrypcie to εA647 = 270 000 cm-1 M-1 56.
    4. Oblicz nakładanie się widma za pomocą J = ΣfD · (AbsA · εA) · λ4, gdzie fD, AbsA i εA zostały zdefiniowane powyżej λ i jest długością fali (nm). Użyj arkusza, aby wypisać w kolumnach wszystkie wartości zależne od długości fali uzyskane w krokach 4.1.1-4.1.3. Wyrównaj je zgodnie z długością fali. Przeprowadzić sumowanie od minimalnej długości fali emisji donorowej (λmin) do maksymalnej długości fali absorbancji akceptora (λmax).
    5. Obliczyć stałą Förstera (Ro) za pomocą następującego wzoru: Ro6 = 8,79 x 10-5 · J · κ2 · ΦF,D · n-4, gdzie J jest nakładaniem się widma obliczonym poprzednio w kroku 4.1.4, κ2 jest współczynnikiem orientacji, ΦF, D jest wydajnością kwantową fluorescencji fluoroforu donorowego, a n jest współczynnikiem załamania światła ośrodka, w którym znajduje się fluorofor.
      UWAGA: Użyć n = 1,33 (jeśli używany jest bufor wodny) i κ2 = 2/3.
    6. Zlokalizuj wartość wydajności kwantowej fluoroforu donorowego (ΦF, D, zależne od środowiska) w opublikowanych tabelach (patrz odniesienie 57) i użyj wartości nakładania się widma uzyskanej w kroku 4.1.4 do obliczenia końcowej wartości stałej Förstera za pomocą równania z kroku 4.1.5.
      UWAGA: Jeśli wydajność kwantowa nie jest dostępna, wykonaj krok 4.2 poniżej, aby ją obliczyć. W tym przypadku należy użyć ΦF,D = 0,8, co odpowiada okresowi życia dawcy τD,r = 4,0 ns.
  2. Oznaczanie wydajności kwantowej fluorescencji
    UWAGA: Poniższa procedura zakłada tylko hartowanie dynamiczne. Aby rozważyć hartowanie statyczne, zapoznaj się z odniesieniem 56. Jednak eksperymenty PIE-MFD są również przydatne w określaniu wydajności kwantowej, nawet w przypadku statycznego wygaszania (patrz wyniki).
    1. Należy wybrać fluorofor referencyjny o podobnych profilach absorbancji i emisji zarówno dla fluoroforów akceptorowych, jak i donorowych, dla których wyznaczono wydajność kwantową (Φr).
      UWAGA: Dla donora Φr = 0,8 i τr = 4 ns, natomiast dla akceptora Φr = 0,32 i τr = 1,17 ns, co odpowiada Φr i τr odpowiednio dla oligonukleotydów znakowanych fluoroforem cyjanowo-zielonym i far-czerwonym fluoroforem57.
    2. Zmierz czasowo-rozdzielczy rozpad fluorescencji (f(t)) przy użyciu metody zliczania pojedynczych fotonów skorelowanych w czasie (TCSPC) w warunkach magicznego kąta.
    3. Dopasuj rozpad fluorescencji do mono- lub wielowykładniczej funkcji rozpadu w postaci f(t) = Σixi e-t/τi, gdzie xi jest ułamkiem populacji, a τi jest czasem życia fluorescencji populacji.
    4. Oblicz średni czas życia gatunku, 〈τ〉x = Σxiτi, gdzie xi to ułamek populacji, a τi to czas trwania fluorescencji populacji.
    5. Użyj wzoru ΦF,D = 〈τD〉x * Φr / τr, aby obliczyć wydajność kwantową fluorescencji fluoroforu donorowego, wprowadzając czas życia fluorescencji i wydajność kwantową odniesienia, a także czas życia fluorescencji fluoroforu dawcy.
      UWAGA: Ta metoda zakłada hartowanie dynamiczne. Aby uzyskać inne oznaczenia ΦF,D, postępuj zgodnie z Lakowicz56.

5. Dostosowanie eksperymentu do wykrywania pojedynczych cząsteczek PIE-MFD (SMD)

UWAGA: Lepiej jest wyłączyć światła podczas wykonywania pomiarów.

  1. Regulacja sprzętu (rysunek 1)
    UWAGA: W tym eksperymencie użyto domowej konfiguracji MFD przedstawionej na rysunku 1, z dwoma laserami impulsowymi i 4 kanałami detekcji w odwróconym korpusie mikroskopu. Istnieją podobne systemy komercyjne.
    1. Włącz lasery 485 nm i 640 nm oraz wszystkie detektory konfiguracji MFD. Otwórz oprogramowanie sterujące akwizycją TCSPC i laserami. Upewnij się, że częstotliwość powtarzania lasera wynosi 40 MHz.
    2. Ustaw moc lasera impulsowego 485 nm na 60 μW na płaszczyźnie obrazu obiektywu 60X 1,2 N.A. zanurzonego w wodzie, a moc lasera impulsowego 640 nm na 23 μW w trybie wzbudzenia impulsowego z przeplotem (PIE-MFD)42.
      UWAGA: Aby ustawić PIE-MFD, dwa impulsy laserowe są opóźnione w oprogramowaniu sterownika lasera. W przypadku wzbudzenia laserowego 485 nm kanały detekcji TCSPC (kanały TAC) to 1-12 499 (kanał "prompt"). Dla wzbudzenia lasera 640 nm kanały detekcji TCSPC (kanały TAC) wynoszą 12 499-50 000 kanałów ("opóźnionych").
    3. Dodaj płyn do zanurzania obiektywu (kroplę podwójnie destylowanej wody) między soczewkę obiektywu mikroskopu a szkiełko nakrywkowe. Aby upewnić się, że płaszczyzna obrazu znajduje się wewnątrz roztworu i jest daleko od powierzchni szkła, przekręć pokrętło regulacyjne o półtora obrotu po znalezieniu drugiego jasnego punktu ogniskowego ze względu na odbicie laserów na granicy szkła i cieczy.
    4. Dodać 1 μl 100 nM rodaminy 110 do 50 μl wody destylowanej do środka szkła nakrywkowego. Upewnij się, że roztwór znajduje się również w środku obiektywu mikroskopu.
    5. Dostosuj pozycje otworków (rozmiar: 70 μm) (kierunek x i y pojedynczo), jednocześnie monitorując szybkość zliczania fotonów w oprogramowaniu do akwizycji, aby zmaksymalizować liczbę wykrytych fotonów.
  2. Standardowy pomiar SMD (praca w ciemnym pomieszczeniu)
    1. Użyj próbki z kroku 5.1.4 i zapisz 120 s szybkości zliczania, klikając przycisk "Start" na panelu sterowania z oznaczeniem czasowym (TTTR) w formacie "*.ht3" 58 w oprogramowaniu do akwizycji.
    2. Oblicz spektroskopię korelacji fluorescencji offline (FCS)59,60,61 (tj. pomiar FCS), aby określić charakterystyczny czas dyfuzji, liczbę cząsteczek w objętości konfokalnej, kinetykę stanu trypletowego i jasność molekularną62.
      1. Otwórz oprogramowanie dla FCS (Kristine, pakiet MFD). Wybierz ustawienia eksperymentalne, klikając "Opcje" -> "Wybierz Skonfiguruj". Wybierz plik z podobnymi ustawieniami eksperymentalnymi i kliknij "pobierz parametry z pliku", aby przeczytać informacje nagłówka w pliku.
      2. Wybierz "Operate" -> "Correlate", aby wykonać FCS.
        UWAGA: Upewnij się, że numery kanałów są prawidłowo określone i że "Bramka TAC" (kanały TCSPC) jest zaznaczona, aby wybrać odpowiednio kanały podpowiedzi lub opóźnienia.
      3. Wybierz "Operacja" -> "Globalne dopasowanie krzywych korelacji", aby otworzyć procedurę dopasowania. Użyj "równania #24" w oprogramowaniu i kliknij "start"
        UWAGA: Równanie #24 w oprogramowaniu opisuje funkcję autokorelacji (Gc) swobodnie dyfuzujących cząsteczek fluorescencyjnych w trójwymiarowym profilu oświetlenia Gaussa, takiego jak61:
        figure-protocol-1
        gdzie N jest średnią liczbą cząsteczek w objętości detekcji, xT jest frakcją cząsteczek wywierających kinetykę stanu trypletowego o charakterystycznym czasie tT, t c, jest czasem korelacji, tdiff jest czasem dyfuzji związanym z parametrem geometrycznym ω, a ω opisuje profil oświetlenia gaussowskiego. Po dopasowaniu zwróć uwagę na czas dyfuzji i liczbę cząsteczek w objętości konfokalnej.
         
    3. Dodaj 10 μl 100 nM Rhodamine 101 do 50 μl wody destylowanej i dobrze wymieszaj. Umieść tę mieszankę na wierzchu szkła nakrywkowego i upewnij się, że kropla znajduje się w środku soczewki obiektywu. Kliknij przycisk "start" na panelu sterowania TTTR, aby nagrać 120 s danych w formacie TTTR.
    4. Dodać 1 μl 100 nM far-red fluorophoru do 50 μl wody destylowanej i dobrze wymieszać. Umieść tę mieszankę na środku soczewki obiektywu. Kliknij przycisk "Start" i nagraj 120 s danych w formacie TTTR.
    5. Umieść 50 μl wody destylowanej na środku soczewki obiektywu. Kliknij przycisk "Start" i nagraj 300 s danych w formacie TTTR.
    6. Umieść 50 μl buforu PBS na środku soczewki obiektywu. Kliknij przycisk "Start" i nagraj 300 s danych w formacie TTTR.
    7. Pobrać 1 μl mieszanki z kroku 5.1.4 i wymieszać z 50 μl wody destylowanej. Umieść tę mieszankę na szkle nakrywkowym. Najpierw kliknij przycisk "Start" i zbierz 10 s danych w trybie TTTR. Następnie przeanalizuj plik trybu TTTR za pomocą oprogramowania do analizy czasu życia fluorescencji z integracją impulsów (BIFL) (Paryż, pakiet MFD), zgodnie z opisem w kroku 5.3.
      UWAGA: Sprawdź liczbę serii na sekundę w oprogramowaniu do wyboru i analizy impulsów26,61. Jeśli poziom impulsu wynosi około 35 co 10 s, nadaje się do pomiaru pojedynczej cząsteczki.
    8. Kontynuuj rejestrowanie szybkości zliczania w formacie TTTR przez 1,5 godziny (tj. TCSPC przy SMD), aby traktować jako wzorzec pomiaru pojedynczej cząsteczki.
      UWAGA: Ze względu na duży rozmiar pliku, podziel surowe pliki "*.ht3" na pliki o mniejszym rozmiarze, aby załadować i przetworzyć za pomocą BIFL.
  3. Analiza próbek wzorcowych za pomocą BIFL
    1. Otwórz oprogramowanie BIFL (Paryż).
    2. Wybierz konfigurację dla PIE w automatycznym oknie pop-up "potwierdź konfigurację" i odczytaj nagłówek, wybierając plik z podobnymi ustawieniami eksperymentalnymi. Kliknij "pobierz parametry z pliku". Kliknij "OK". Zwróć uwagę, że wyskakujące okienko zamyka się i jest zintegrowane z interfejsem paryskim. Kliknij "OK" w sekcji "Dalej".
    3. Wybierz pliki do analizy, klikając "Wybierz" na "Tablica ścieżek danych", aby wybrać pomiar do analizy.
      1. Kliknij na "Zielony rozproszenie" (do pomiaru wody), "Zielony BG" (do pomiaru bufora), "Zielony gruby" (do pomiaru 2 nM Rhodaminy 110), "Czerwony rozproszenie" (do pomiaru wody), "Czerwony BG" (do pomiaru bufora lub wody), "Czerwony gruby" (do pomiaru 20-nM Rhodaminy 101), "Żółte rozproszenie" (do pomiaru wody), "Żółte BG" (do pomiaru bufora) i "Żółte grube" (do pomiaru fluoroforu dalekiej czerwieni 2 nM).
      2. Kliknij "OK" w sekcji "Dalej."
        UWAGA: Kanał "zielony" odpowiada sygnałowi z detektorów zielonych w kanałach "prompt" TCSPC. Kanał "czerwony" odpowiada sygnałowi czerwonych detektorów w "prompt" kanałach TCSCP. Kanał "Żółty" odpowiada sygnałowi czerwonych detektorów w opóźnionych kanałach TCSPC.
    4. Kliknij "Dostosuj" obok "Data cut Burstwise", aby dostosować parametry wyboru pojedynczej cząsteczki. W nowym oknie podręcznym wybierz zdarzenia pojedynczej cząsteczki z dwoma odchyleniami standardowymi od średniego czasu nadejścia międzyfotonu ("dt"), zmieniając czas nadejścia międzyfotonu w polu "Próg" i minimalną liczbę fotonów na zdarzenie pojedynczej cząsteczki w polu "min. #". Kliknij "Powrót", aby zamknąć wyskakujące okienko. Kliknij "OK" w sekcji "Dalej."
      UWAGA: Próg, w jednostkach ms, zależy od szybkości zliczania tła. Typowa minimalna liczba używanych fotonów to 60.
    5. Dostosuj początkowy czas życia fluorescencji "Parametry dopasowania koloru" (np. od, do i konwolucja) dla wygenerowanych parametrów zaniku fluorescencji w kolorach "Zielonym", "Czerwonym" i "Żółtym". W tym samym oknie dostosuj wartości "od" i "do" dla "Monit" i "Opóźnienie". Kliknij "Powrót", aby zamknąć wyskakujące okienko. Kliknij "OK" w sekcji "Dalej."
      UWAGA: Upewnij się, że zaznaczone jest pole wyboru wzbudzenia 2-kolorowego. "Od" i "do" odpowiadają początkowemu i końcowemu zakresowi na histogramie zaniku fluorescencji (numer kanału TAC). Jeśli początkowe parametry dopasowania są odpowiednio dobrane, do zaniku fluorescencji na każdym kanale dodawana jest funkcja dopasowania.
    6. Wybierz lokalizację na dysku twardym, w której chcesz zapisać wszystkie przetworzone pliki ASCII w folderze nadrzędnym.
      UWAGA: Paris przetwarza wszystkie wybrane serie i tworzy wiele plików wyjściowych ascii, które mogą być używane przez inne programy do wizualizacji (np. pakiet Margarita MFD).

6. Wzorce dsDNA i pomiary próbek

  1. Dodać 500 μl buforu PBS do komorowego szkła nakrywkowego i umieścić kroplę wody destylowanej między komorą a soczewką obiektywu. Kliknij przycisk "Start" na pedale sterowania i zbierz 5 minut danych w trybie TTTR do wykorzystania do analizy.
  2. Weź niewielką ilość (zwykle około 0,1 μl, stężenie około 1 μM) wzorca dsDNA, dodaj ją do buforu PBS i dobrze wymieszaj. Najpierw zbierz 10 s danych, klikając "Start". Następnie sprawdź burst, aby uzyskać 35 burstów na 10 s (jak w krokach 5.2.7 i 5.3). Na koniec zbierz >2 h danych w formacie TTTR, jak opisano powyżej.
  3. Przeanalizuj zebrane dane dla próbek dsDNA, jak w kroku 5.3.3.
  4. Wizualizuj histogramy serii za pomocą zestawu MFD (Margarita) i wyświetlaj wydajność FRET w funkcji 〈τD(A)〉f lub FD/F A w porównaniu z 〈τD(A)〉f.
    1. Otwórz oprogramowanie Margarita i wybierz "Plik" -> "Importuj wszystko *.?? 4 i *.mti." Wybierz folder nadrzędny zawierający różne podfoldery.
    2. Wybierz parametry do wizualizacji, klikając obok "X" (odcięte) jednego z parametrów pochodzących z Paryża (np. zielony tau lub 〈τD(A)〉f); podobnie powtórz to dla rzędnej "Y", aby wybrać żądany parametr do wizualizacji (np. Wydajność FRET, FD / FA, lub SPIE PIE).
      UWAGA: W tym przypadku wydajność FRET, F,D/FA, A lub SPIE korygują prawidłowy współczynnik zliczania tła w kanałach zielonym, czerwonym i żółtym; dla wydajności kwantowej dawcy i akceptora; dla współczynnika skuteczności wykrywania (gG/gR); i dla przesłuchów (α). Tutaj gG/gR = 3,7 i α = 0,017, w zależności tylko od instrumentu. Szybkość zliczania tła zależy od użytego bufora, a wartości wydajności kwantowej są wcześniej określane.
    3. Dodaj linię FRET, otwierając okno "Nakładka równania", klikając "Wyświetlanie" -> "Nakładanie równania". Wybierz statyczną linię FRET z menu podręcznego. Wybierz odpowiednie czasy życia dawcy i parametry wydajności kwantowej, aby wygenerować odpowiednią linię FRET.
      UWAGA: Można wygenerować linie FRET do korelacji różnych wskaźników FRET.
  5. Określić współczynnik korekcyjny dla wzbudzenia akceptora przez źródło wzbudzenia donora (β) za pomocą parametru stechiometrii, wyświetlając wydajność FRET w funkcji stechiometrii (SPIE) w Margaricie (równanie 1, poniżej).
    UWAGA: β dobiera się w taki sposób, aby próbka dawcy miała pik na SPIE = 1,0 w skali stechiometrycznej; próbka tylko akceptora powinna mieć stechiometrię SPIE = 0,0, a dsDNA z obiema etykietami powinna mieć stechiometrię SPIE ~0,5,
    UWAGA: Przyrząd jest teraz gotowy i możliwe jest mierzenie próbek znakowanych FRET.
  6. Zmierz i przeanalizuj próbki znakowane FRET, przygotowane w sekcji 3, wykonując kroki 6.3-6.4.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W typowych eksperymentach smFRET z użyciem konfiguracji MFD (linie laserowe: 485 nm przy 60 μW i 640 nm przy 23 μW, sekcja 5.1), próbka fluorescencji jest rozcieńczana do niskiego stężenia pikomolarnego (10-12 M = 1 pM) i umieszczana w mikroskopie konfokalnym, gdzie sub-nanosekundowy impuls laserowy wzbudza znakowane cząsteczki, swobodnie dyfundując przez objętość wzbudzenia. Typowa objętość konfokalna wynosi <4 femtolitry (fL). Przy tak niskich stężeniach wykrywane są tylko...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszej pracy przedstawiono protokół wyrównywania, kalibracji i pomiaru odległości między barwnikami z dużą precyzją przy użyciu eksperymentów z jednocząsteczkowymi cząsteczkami FRET PIE-MFD. Poprzez staranną kalibrację wszystkich parametrów instrumentu można zwiększyć dokładność mierzonych odległości i osiągnąć dokładność angstrema. W tym celu wykorzystuje się różne wielowymiarowe histogramy do analizy i identyfikacji populacji w celu dalszej charakterystyki. Wykorzystując średni czas makro do weryfikacji stabilnoś...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszyscy autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych w stosunku do treści tego artykułu.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

VJ i HS potwierdzają wsparcie od NIH R01 GM094246 do VJ. HS docenia fundusze na rozpoczęcie działalności z Clemson University Creative Inquiry Program oraz Center for Optical Materials Science and Engineering Technologies na Clemson University. Projekt ten był również wspierany przez stypendium szkoleniowe z Keck Center for Interdisciplinary Bioscience Training of the Gulf Coast Consortia (grant NIGMS nr 1 T32GM089657-05) oraz stypendium Fundacji Schisslera na badania translacyjne nad powszechnymi chorobami człowieka do DD. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
węgiel węglowyMerck KGaAK42964486 320
filtr strzykawkowyFisherbrand09-719Crozmiar: 0,20 i mikro; m
komorowe szkło nakrywkoweFisher Scientific 1554091,5 szkło borokrzemianowe, 8-dołkowe szkło osłonowe
mikroskopuFisher Scientific063014-9rozmiar: 24 x 60-1,5
Woda wolna od nukleazFisher Scientific148859nukleaz
tween-20Thermo Scientific28320polisorbatu 20
( Wysoka FRET)Zintegrowane technologie DNA1781248955´-d (CGG, CCT, ATT TCT, GAG, TTG, TAA, ACA, GAG AT(Cy5)C, GCC, TTA, AAC, GTT, CGC, CTA GAC, TAC, TCC, AAG, TAT TGC)
akceptor nici DNA (Low FRET)Zintegrowane technologie DNA1779564245´-d(CGG, CCT, ATT, TCG, GAG, TTG, TAA, ACA, GAG, ATC, GCC, TT(Cy5)A, AAC, GTT, CGC, CTA, GAC, TAG, TCC, AAG, TAT TGC)
Zintegrowana nić DNA dawcy DNA Technologies1779514375´ -d(GCA ATA CTT GGA CTA GTC TAG GCG AAC GTT TAA GGC GAT CTC TGT TT(Alexa488)A CAA CTC CGA AAT AGG CCG)
nić DNA (bez FRET)Zintegrowane technologie5´ -d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)
termocyklerEppendorfE6331000025gradient
nexusAlexa Fluor 488 C5  MaleimideThermo ScientificA10254określany jako cyjanowo-zielony fluorofor w manuskrypcie
Alexa Fluor 647 C2  MaleimideThermo ScientificA20347określany w manuskrypcie jako far-czerwony fluorofor
Rodamina 110Sigma-Aldrich83695-250MG
Rodamina 101Sigma-Aldrich83694-500MG
LB Rosół, MillerFisher ScientificBP1426Do hodowli E. coli
AmpicillinSigma-AldrichA0166Używany przy 100 &mikro; g/ml stężenie końcowe w selektywnej pożywce LB w celu utrzymania selekcji plazmidu
Tetracylina Calbiochem58346Używany przy 12,5 &mikro; g / ml końcowe stężenie w selektywnej pożywce LB w celu utrzymania mutacji gor (reduktazy flutationu) w szczepach Origami B (DE3) w celu ułatwienia utleniania wiązań dwusiarczkowych
KanamycynaFisher ScientificBP906-5Używany przy 15 &mikro; g / ml końcowe stężenie w selektywnej pożywce LB w celu utrzymania mutacji trxB (reduktazy ryoretoksyny) w barwieniu B(DE3) w celu ułatwienia utleniania wiązań dwusiarczkowych
Origami B(DE3) Kompetentne komórkiMillipore70837-3Kompetentne E. Komórki coli do ekspresji białka z mostkami dwusiarczkowymi
Izopropylo-β-D-tiogalaktopiranozyd (IPTG)Fisher ScientificBP1755Do indukcji ekspresji białka E. coli
Chelatacja HiTrap HPGE Life Sciences17-0409-01Do oczyszczania na dużą skalę FPLC białka znakowanego Hisem
ImidazolSigma-Aldrich56749
Ni-NTA Agaroza Qiagen30210
PD-10 Kolumna odsalającaGE Nauki Przyrodnicze17-0851-01
AktaPurifierGE Nauki Przyrodnicze28406264FPLC
Rurki do dializySpectrum labs13256215 kD MWCO 24 mm Szerokość klapy, 10 metrów / rolka
DichroikaSemrockFF500/646-Di01-25x36500/646 BrightLight
50/50 Rozdzielacz wiązki polaryzacyjnyQioptiq Linos G33 5743 00010 x 10
Filtr Green PassChromaET525/50mET525/50m Mocowanie o średnicy 25 mm
Filtr czerwonoprzepustowyChromaET720/150mET720/150m Średnica 25 mm Miernik
mocyThorLabdPM200
Spektrofotometr UV-VisVarianCary300Bio
Fluorolog 3 fluorometrHoribaFL3-22-R3
Sterownik Fluorohub TCSPCHoribaFluorohub-BElektronika TCSPC do pomiarów zespołowych
NanoLed 485LHoriba485LLaser diodowy niebieski
NanoLed 635LHoriba635LLaser diodowy czerwony
Olympus IX73OlympusIX73P2FRamka mikroskopu
PMA 40 Detektor hybrydowyPicoQuant GmbH932200, PMA 40Zoptymalizowany do wykrywania zieleni
Detektor hybrydowy PMA 50PicoQuant GmbH932201, PMA 50Zoptymalizowany pod kątem czułości dźwigni zmiany biegów ed
Laser 485 nmPicoQuant GmbHLDH-D-C-485
Laser 640 nmPicoQuant GmbHLDH-D-C-640
Oprogramowanie do pozyskiwania energii Hydraharp 400 i TTTRPicoQuant930021Zegar zdarzeń pikosekundowych i skorelowana w czasie jednostka kodowania pojedynczych fotonów, zawiera oprogramowanie do akwizycji TTTR
SEPIA II SLM 828 i oprogramowanie SEPIAPicoQuant910028sterownik laserowy dla impulsów pikosekundowych, zawiera kontroler oprogramowania SEPIA.
komputerProcesor DellOptiplex 7010: i7-3770 ram: 16 GB
Oprogramowanie do pozycjonowania i ekranowania (FPS) FRETHeinrich Heine UnviersityZawiera klikulator Accesibel Volume dostępny w
pakiecie http://www.mpc.hhu.de/software/fps.html MFDHeinrich Heine UnviersityZawiera pakiet oprogramowania BIFL Paris; Margarita do wizualizacji historii wieloparametrowych oraz oprogramowanie do analizy rozkładu prawdopodobieństwa dostępne na stronie http://www.mpc.hhu.de/software/software-package.html
bez 10% roztwór nici DNA akceptora DNA Polaryzator foliowy

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kendrew, J. C. Architecture of a protein molecule. Nature. 182 (4638), 764-767 (1958).
  2. Kendrew, J. C., et al. A three-dimensional model of the myoglobin molecule obtained by x-ray analysis. Nature. 181 (4610), 662-666 (1958).
  3. Henzler-Wildman, K., Kern, D. Dynamic personalities of proteins. Nature. 450 (7172), 964-972 (2007).
  4. Henzler-Wildman, K. A., et al. A hierarchy of timescales in protein dynamics is linked to enzyme catalysis. Nature. 450 (7171), 913-927 (2007).
  5. Henzler-Wildman, K. A., et al. Intrinsic motions along an enzymatic reaction trajectory. Nature. 450 (7171), 838(2007).
  6. Kline, A. D., Wuthrich, K. Secondary structure of the alpha-amylase polypeptide inhibitor tendamistat from Streptomyces tendae determined in solution by 1H nuclear magnetic resonance. J. Mol. Biol. 183 (3), 503-507 (1985).
  7. Williamson, M. P., Havel, T. F., Wuthrich, K. Solution conformation of proteinase inhibitor IIA from bull seminal plasma by 1H nuclear magnetic resonance and distance geometry. J. Mol. Biol. 182 (2), 295-315 (1985).
  8. Havel, T. F., Wuthrich, K. An evaluation of the combined use of nuclear magnetic resonance and distance geometry for the determination of protein conformations in solution. J. Mol. Biol. 182 (2), 281-294 (1985).
  9. Förster, T. Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz. Ann.Phys. 437 (1), 55-75 (1948).
  10. Stryer, L., Haugland, R. P. Energy transfer: a spectroscopic ruler. Proc Natl Acad Sci U S A. 58 (2), 719-726 (1967).
  11. Schuler, B., Lipman, E. A., Steinbach, P. J., Kumke, M., Eaton, W. A. Polyproline and the "spectroscopic ruler" revisited with single-molecule fluorescence. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (8), 2754-2759 (2005).
  12. Wozniak, A. K., Schroder, G. F., Grubmuller, H., Seidel, C. A., Oesterhelt, F. Single-molecule FRET measures bends and kinks in DNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18337-18342 (2008).
  13. Orrit, M., Bernard, J. Single Pentacene Molecules Detected by Fluorescence Excitation in a p-Terphenyl Crystal. Phys. Rev. Lett. 65 (21), 2716-2719 (1990).
  14. Weiss, S. Fluorescence spectroscopy of single biomolecules. Science. 283 (5408), 1676-1683 (1999).
  15. Ha, T., et al. Probing the interaction between two single molecules: Fluorescence resonance energy transfer between a single donor and a single acceptor. Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 93, 6264-6268 (1996).
  16. Michalet, X., Weiss, S., Jager, M. Single-molecule fluorescence studies of protein folding and conformational dynamics. Chem. Rev. 106 (5), 1785-1813 (2006).
  17. Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. FRET imaging. Nat. Biotechnol. 21 (11), 1387-1395 (2003).
  18. Sakon, J. J., Weninger, K. R. Detecting the conformation of individual proteins in live cells. Nat Methods. 7 (3), 203-205 (2010).
  19. Stahl, Y., et al. Moderation of Arabidopsis root stemness by CLAVATA1 and ARABIDOPSIS CRINKLY4 receptor kinase complexes. Curr. Biol. 23 (5), 362-371 (2013).
  20. Fessl, T., et al. Towards characterization of DNA structure under physiological conditions in vivo at the single-molecule level using single-pair FRET. Nucleic Acids Res. 40 (16), e121(2012).
  21. Stryer, L. Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler. Annu. Rev. Biochem. 47, 819-846 (1978).
  22. Schuler, B., Lipman, E. A., Steinbach, P. J., Kumke, M., Eaton, W. A. Polyproline and the "spectroscopic ruler" revisited with single-molecule fluorescence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102 (8), 2754-2759 (2005).
  23. Best, R. B., et al. Effect of flexibility and cis residues in single-molecule FRET studies of polyproline. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (48), 18964-18969 (2007).
  24. Hoefling, M., et al. Structural heterogeneity and quantitative FRET efficiency distributions of polyprolines through a hybrid atomistic simulation and Monte Carlo approach. PLoS One. 6 (5), e19791(2011).
  25. Hellenkamp, B., Wortmann, P., Kandzia, F., Zacharias, M., Hugel, T. Multidomain structure and correlated dynamics determined by self-consistent FRET networks. Nat Methods. , (2016).
  26. Kalinin, S., et al. A toolkit and benchmark study for FRET-restrained high-precision structural modeling. Nat. Meth. 9 (12), 1218-1225 (2012).
  27. Hickerson, R., Majumdar, Z. K., Baucom, A., Clegg, R. M., Noller, H. F. Measurement of internal movements within the 30 S ribosomal subunit using Forster resonance energy transfer. J. Mol. Biol. 354 (2), 459-472 (2005).
  28. Margittai, M., et al. Single-molecule fluorescence resonance energy transfer reveals a dynamic equilibrium between closed and open conformations of syntaxin 1. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (26), 15516-15521 (2003).
  29. Weninger, K., Bowen, M. E., Chu, S., Brunger, A. T. Single-molecule studies of SNARE complex assembly reveal parallel and antiparallel configurations. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (25), 14800-14805 (2003).
  30. Brunger, A. T., Strop, P., Vrljic, M., Chu, S., Weninger, K. R. Three-dimensional molecular modeling with single molecule FRET. J. Struct. Biol. 173 (3), 497-505 (2011).
  31. Choi, U. B., et al. Single-molecule FRET-derived model of the synaptotagmin 1-SNARE fusion complex. Nat. Struct. Mol. Biol. 17 (3), 318-324 (2010).
  32. DeRocco, V., Anderson, T., Piehler, J., Erie, D. A., Weninger, K. Four-color single-molecule fluorescence with noncovalent dye labeling to monitor dynamic multimolecular complexes. BioTechniques. 49 (5), 807-816 (2010).
  33. McCann, J. J., Zheng, L., Chiantia, S., Bowen, M. E. Domain orientation in the N-Terminal PDZ tandem from PSD-95 is maintained in the full-length protein. Structure. 19 (6), 810-820 (2011).
  34. McCann, J. J., et al. Supertertiary structure of the synaptic MAGuK scaffold proteins is conserved. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (39), 15775-15780 (2012).
  35. Andrecka, J., et al. Nano positioning system reveals the course of upstream and nontemplate DNA within the RNA polymerase II elongation complex. Nucleic Acids Res. 37 (17), 5803-5809 (2009).
  36. Muschielok, A., et al. A nano-positioning system for macromolecular structural analysis. Nat Methods. 5 (11), 965-971 (2008).
  37. Muschielok, A., Michaelis, J. Application of the Nano-Positioning System to the Analysis of Fluorescence Resonance Energy Transfer Networks. J. Phys. Chem. B. 115 (41), 11927-11937 (2011).
  38. Renner, A., et al. High Precision FRET Reveals Dynamic Structures in the Drosophila Scaffold Protein Complex Stardust-DPATJ-DLin-7 Mediated by L27 Domains. Biophys. J. 106 (2), 256(2014).
  39. Antonik, M., Felekyan, S., Gaiduk, A., Seidel, C. A. Separating structural heterogeneities from stochastic variations in fluorescence resonance energy transfer distributions via photon distribution analysis. The Journal of Physical Chemistry B. 110 (13), 6970-6978 (2006).
  40. Gaiduk, A., Kühnemuth, R., Antonik, M., Seidel, C. A. Optical Characteristics of Atomic Force Microscopy Tips for Single-Molecule Fluorescence Applications. ChemPhysChem. 6 (5), 976-983 (2005).
  41. Eggeling, C., Fries, J., Brand, L., Günther, R., Seidel, C. Monitoring conformational dynamics of a single molecule by selective fluorescence spectroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (4), 1556-1561 (1998).
  42. Kudryavtsev, V., et al. Combining MFD and PIE for Accurate Single-Pair Förster Resonance Energy Transfer Measurements. ChemPhysChem. 13 (4), 1060-1078 (2012).
  43. Steven, A. C., Baumeister, W. The future is hybrid. J. Struct. Biol. 163 (3), 186-195 (2008).
  44. Cowieson, N. P., Kobe, B., Martin, J. L. United we stand: combining structural methods. Curr. Opin. Struct. Biol. 18 (5), 617-622 (2008).
  45. Boura, E., et al. Solution structure of the ESCRT-I complex by small-angle X-ray scattering, EPR, and FRET spectroscopy. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (23), 9437-9442 (2011).
  46. Dominguez, C., Boelens, R., Bonvin, A. M. HADDOCK: a protein-protein docking approach based on biochemical or biophysical information. J. Am. Chem. Soc. 125 (7), 1731-1737 (2003).
  47. Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. J Vis Exp. (27), (2009).
  48. Barker, K. At the Bench: A Laboratory Navigator. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).
  49. Coleman, J. A., Green, E. M., Gouaux, E. Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram. J Vis Exp. (117), e54792(2016).
  50. Yates, L. A., Gilbert, R. J. C. Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies. J Vis Exp. (85), e51206(2014).
  51. Protein Sample Preparation, Handbook. GE Healthcare. , Available from: http://www.gelifesciences.com/file_source/GELS/Service%20and%20Support/Documents%20and%20Downloads/Handbooks/Protein_sample_preparation_handbook.pdf (2016).
  52. Li, Q., Richard, C. -A., Moudjou, M., Vidic, J. Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of (His)6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli. J Vis Exp. (106), e53432(2015).
  53. Scopes, R. K. Protein Purification: Principles and Practice. , Springer. New York. (1993).
  54. Protein Extiction Coefficient Calculator. , Available from: http://www.biomol.net/en/tools/proteinextinction.htm (2016).
  55. Desalting Column Product booklet. GE. , Available from: https://www.gelifesciences.com/gehcls_images/GELS/Related%20Content/Files/1478781880316/litdoc52130800_20161110134421.pdf (2016).
  56. Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. , Springer. (2007).
  57. Sindbert, S., et al. Accurate distance determination of nucleic acids via Forster resonance energy transfer: implications of dye linker length and rigidity. J. Am. Chem. Soc. 133 (8), 2463-2480 (2011).
  58. Wahl, M. Technical Note. Time Tagged Time-Resolved Fluorescence Data Collection in Life Sciences. PicoQuant. , Available from: https://www.picoquant.com/images/uploads/page/files/14528/technote_tttr.pdf (2010).
  59. Elson, E. L., Magde, D. Fluorescence correlation spectroscopy. I. Conceptual basis and theory. Biopolymers. 13 (1), 1-27 (1974).
  60. Magde, D., Elson, E. L., Webb, W. W. Fluorescence correlation spectroscopy. II. An experimental realization. Biopolymers. 13 (1), 29-61 (1974).
  61. Felekyan, S., et al. Full correlation from picoseconds to seconds by time-resolved and time-correlated single photon detection. Rev. Sci. Instrum. 76 (8), 083104(2005).
  62. Iyer, V., Rossow, M. J., Waxham, M. N. Peak two-photon molecular brightness of fluorophores is a robust measure of quantum efficiency and photostability. JOSA B. 23 (7), 1420-1433 (2006).
  63. Böhmer, M., Wahl, M., Rahn, H. -J., Erdmann, R., Enderlein, J. Time-resolved fluorescence correlation spectroscopy. Chem. Phys. Lett. 353 (5), 439-445 (2002).
  64. Fries, J. R., Brand, L., Eggeling, C., Köllner, M., Seidel, C. A. M. Quantitative identification of different single molecules by selective time-resolved confocal fluorescence spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry A. 102 (33), 6601-6613 (1998).
  65. Kühnemuth, R., Seidel, C. A. M. Principles of Single Molecule Multiparameter Fluorescence Spectroscopy. Single Mol. 2 (4), 251-254 (2001).
  66. Widengren, J., et al. Single-molecule detection and identification of multiple species by multiparameter fluorescence detection. Anal. Chem. 78 (6), 2039-2050 (2006).
  67. Sisamakis, E., Valeri, A., Kalinin, S., Rothwell, P. J., Seidel, C. A. Accurate single-molecule FRET studies using multiparameter fluorescence detection. Methods Enzymol. 475, 455-514 (2010).
  68. Kalinin, S., Felekyan, S., Antonik, M., Seidel, C. A. Probability distribution analysis of single-molecule fluorescence anisotropy and resonance energy transfer. The Journal of Physical Chemistry B. 111 (34), 10253-10262 (2007).
  69. Kask, P., et al. Two-dimensional fluorescence intensity distribution analysis: theory and applications. Biophys. J. 78 (4), 1703-1713 (2000).
  70. Traynelis, S. F., et al. Glutamate Receptor Ion Channels: Structure, Regulation, and Function. Pharmacol. Rev. 62 (3), 405-496 (2010).
  71. Furukawa, H., Gouaux, E. Mechanisms of activation, inhibition and specificity: crystal structures of the NMDA receptor NR1 ligand-binding core. EMBO J. 22 (12), 2873-2885 (2003).
  72. Furukawa, H., Singh, S. K., Mancusso, R., Gouaux, E. Subunit arrangement and function in NMDA receptors. Nature. 438 (7065), 185-192 (2005).
  73. Dolino, D. M., Rezaei Adariani,, Shaikh, S., A, S., Jayaraman, V., Sanabria, H. Conformational Selection and Submillisecond Dynamics of the Ligand-binding Domain of the N-Methyl-d-aspartate Receptor. J. Biol. Chem. 291 (31), 16175-16185 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

FRET pojedynczych cz steczekwieloparametryczna detekcja fluorescencjipomiar odleg o ci mi dzy barwnikamireceptor NMDAdomena wi ca ligandstany konformacyjnefluorescencyjny transfer energii rezonansowejprecyzyjne pomiary odleg o ci

Powiązane artykuły