Artykuł metodologiczny

Metoda elektrofizjologiczna dla zapisów cęgów napięcia w całej komórce z fotoreceptorów Drosophila

17K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55627

⸱

13 czerwca 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Neurobiology, Faculty of Medicine and the Edmond and Lily Safra Center for Brain Sciences (ELSC), Hebrew University, 2Department of Physiology, Development and Neuroscience, University of Cambridge

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Zapisy całokomórkowe z fotoreceptorów Drosophila melanogaster umożliwiają pomiar spontanicznych ciemnych guzków, wybrzuszeń kwantowych, makroskopowych reakcji na światło i zależności prąd-napięcie w różnych warunkach. W połączeniu z narzędziami manipulacji genetycznej D. melanogaster, metoda ta umożliwia badanie wszechobecnego szlaku sygnałowego inozytol-lipid i jego celu, czyli kanału TRP.

Streszczenie

Zapisy cęgów napięcia całej komórki z fotoreceptorów Drosophila melanogaster zrewolucjonizowały dziedzinę transdukcji wzrokowej u bezkręgowców, umożliwiając wykorzystanie genetyki molekularnej D. melanogaster do badania sygnalizacji inozytolowo-lipidowej i kanałów Przejściowego Potencjału Receptora (TRP) na poziomie pojedynczej cząsteczki. Kilka laboratoriów opanowało tę potężną technikę, która umożliwia analizę fizjologicznych reakcji na światło w ściśle kontrolowanych warunkach. Technika ta umożliwia kontrolę nad pożywkami wewnątrzkomórkowymi i zewnątrzkomórkowymi; napięcie membrany; oraz szybkie stosowanie związków farmakologicznych, takich jak różne wskaźniki jonowe lub pH, do pożywek wewnątrz- i zewnątrzkomórkowych. Dzięki wyjątkowo wysokiemu stosunkowi sygnału do szumu, metoda ta umożliwia pomiar ciemnych prądów jednostkowych spontanicznych i indukowanych światłem (tj. spontanicznych i kwantowych wybrzuszeń) oraz makroskopowych prądów indukowanych światłem (LIC) z pojedynczych fotoreceptorów D. melanogaster. Protokół ten bardzo szczegółowo określa wszystkie kluczowe kroki niezbędne do wykonania tej techniki, która obejmuje zarówno zapisy elektrofizjologiczne, jak i optyczne. Opisano procedurę preparowania siatkówki muchy w celu uzyskania nienaruszonej i żywotnej ommatydii izolowanej ex vivo w komorze kąpielowej. Szczegółowo opisano również sprzęt potrzebny do wykonywania pomiarów obrazowania całych komórek i fluorescencji. Na koniec wyjaśnione są pułapki związane ze stosowaniem tego delikatnego preparatu podczas dłuższych eksperymentów.

Wprowadzenie

Szeroko zakrojone badania genetyczne muszki owocowej, Drosophila melanogaster (D. melanogaster), rozpoczęte ponad 100 lat temu, ustaliły, że mucha D. melanogaster jest niezwykle użytecznym modelem eksperymentalnym do genetycznej analizy złożonych procesów biologicznych. Opisana poniżej metodologia łączy skumulowaną moc genetyki molekularnej D. melanogaster z wysokim stosunkiem sygnału do szumu w nagraniach z użyciem klamer krosowych całych komórek. Połączenie to pozwala na badanie fototransdukcji D. melanogaster jako modelu sygnalizacji inozytolowo-lipidowej oraz regulacji i aktywacji kanału TRP, zarówno w środowisku natywnym, jak i przy najwyższej rozdzielczości pojedynczych cząsteczek.

Zastosowanie metody zapisu całej komórki do fotoreceptorów D. melanogaster zrewolucjonizowało badania nad fototransdukcją u bezkręgowców. Metoda ta została opracowana przez Hardie1 i niezależnie przez Ranganathana i współpracowników2 ~26 lat temu i została zaprojektowana w celu wykorzystania obszernych narzędzi manipulacji genetycznej D. melanogaster i wykorzystania ich do odkrycia mechanizmów fototransdukcji i sygnalizacji inozytolowo-lipidowej. Początkowo technika ta cierpiała z powodu szybkiego zmniejszenia wrażliwości na światło i niskiej wydajności ommatidiów podczas procesu sekcji, co uniemożliwiało przeprowadzenie szczegółowych badań ilościowych. Później dodanie ATP i NAD do pipety punktowej znacznie zwiększyło przydatność preparatu do długotrwałych zapisów ilościowych. Następnie przeprowadzono obszerną charakterystykę mechanizmu transdukcji sygnału na poziomie molekularnym.

Obecnie, fototransdukcja D. melanogaster jest jednym z niewielu systemów, w których sygnalizacja fosfoinozytydu i kanały TRP mogą być badane ex vivo w rozdzielczości pojedynczej cząsteczki. To sprawia, że fototransdukcja D. melanogaster i metodologia opracowana do badania tego mechanizmu są bardzo czułym systemem modelowym. Protokół ten opisuje, jak wypreparować siatkówkę D. melanogaster i mechanicznie usunąć izolowaną ommatydię z otaczających komórek barwnikowych (glejowych). Umożliwia to utworzenie giga-seal i klamry krosowej całej komórki na ciałach komórek fotoreceptorów. Na szczęście większość białek sygnałowych jest ograniczona do rabdomeru i nie ulega dyfuzji. Ponadto istnieje nieruchomy bufor Ca2+ o nazwie kalfotyna, znajdujący się między przedziałem sygnalizacyjnym a ciałem komórki3,4, oraz wysoki poziom ekspresji wymiennika Na+/Ca2+ (CalX) w microvilli5. Łącznie uwięzienie białek w rabdomerze, buforze kalfotyny i wysoka ekspresja CalX pozwalają na stosunkowo wydłużone (tj. do ~20 min) zapisy całych komórek, bez utraty istotnych składników procesu fototransdukcji i przy zachowaniu wysokiej wrażliwości na światło. Poniższy protokół opisuje, w jaki sposób uzyskać izolowaną ommatydię i wykonać zapisy całych komórek, które wydają się zachowywać natywne właściwości kaskady fototransdukcji. Eksperymenty z klamrą całokomórkową na zdysocjowanym karaluchu (Periplaneta americana)6 i świerszczu (Gryllus bimaculatus)7 ommatidia przeprowadzono podobnie jak opisano dla D. melanogaster. Ponadto, eksperymenty z klamrą łatową na zdysocjowanych fotoreceptorach małża (scabra) i przegrzebka (Pecten irradians) zostały przeprowadzone w nieco inny sposób niż te przeprowadzone na D. melanogaster, umożliwiając zarówno pomiary całokomórkowe8, jak i jednokanałowe9. W tym miejscu opisano główne osiągnięcia uzyskane u D. melanogaster przy użyciu tej techniki. Dyskusja zawiera opis niektórych pułapek i ograniczeń tej techniki.

Protokół

1. Przygotowanie odczynników

UWAGA: Przygotuj wszystkie roztwory zgodnie z instrukcjami w tabelach 1-4.

  1. Napełnić strzykawkę 10 mL roztworem zewnątrzkomórkowym (ES lub ES-0Ca2+; zależnie od potrzeb; patrz Tabela 1) i przechowywać w lodzie.
  2. Przygotować jedną fiolkę roztworu do tryturacji (TS; patrz Tabela 2; tzn. ES lub ES-0Ca2+ + FBS i sacharoza) i przechowywać w lodzie.
  3. Przygotować odpowiednią ilość ES do eksperymentu i przechowywać w lodzie do momentu użycia.
    UWAGA: Ciągła perfuzja kąpieli nie jest wymagana, zatem objętość ES nie musi przekraczać kilkudziesięciu mL.
  4. Używając filtra PVDF 22 µm, wprowadzić roztwór wewnątrzkomórkowy (patrz Tabela 3 lub Tabela 4) do strzykawki 1 mL z wydłużoną końcówką do napełniania elektrod. Przechowywać w lodzie.

2. Ogólne przygotowanie narzędzi do sekcji

figure-protocol-1
Rycina 1: Narzędzia i urządzenia niezbędne do przygotowania izolowanych ommatidiów. Zdjęcia przedstawiają różne urządzenia wymagane do przygotowania izolowanych ommatidiów, zgodnie z opisem w szczegółowym protokole powyżej. Dwa zlewki, jedna wypełniona wodą (A) i druga wypełniona etanolem (B) do czyszczenia pipet do trituracji (D), które są połączone z przewodami (C). Narzędzia do sekcji to: 2 pary precyzyjnych i 1 para grubych pincet (F) oraz łyżeczka do siatkówki (E). W celu przygotowania łyżeczki do siatkówki, mikroigła sekcyjna (H) jest dociskana między dwoma narzędziami tokarskimi pełniącymi rolę imadła (G), aby spłaszczyć wierzchołek igły (I). Następnie zostaje ona połączona z wydłużonym kawałkiem metalu za pomocą kleju (J) i zamocowana w uchwycie do igieł (E). Odłamek żyletki i uchwyt: należy odłamać i zamocować mały trójkątny odłamek żyletki za pomocą uchwytu do żyletek (K). Obszar roboczy sekcji składa się z binokulara (L) i chłodnego źródła czerwonego światła (M) z dwoma światłowodami (N). Narzędzia do sekcji, w tym pincety (F), łyżeczka do siatkówki (E), zlewki (A i B), latarka z czerwonym filtrem (Q) oraz delikatne chusteczki do wycierania (R) są rozmieszczone po obu stronach binokulara. Na stole znajdują się również wiaderko z lodem z ES, FBS-ES, strzykawki z roztworem wewnątrzkomórkowym, szalka Petriego 60 mm (S) oraz uchwyt do elektrod (P). Elektrody rejestrujące są wyciągane za pomocą poziomego wyciągacza (T). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Przygotuj łyżeczkę do siatkówki w celu izolacji siatkówek.
    1. Wprowadź końcówkę (1-4 mm) igły do mikrosekcji (igła entomologiczna, długość 12 mm, średnica 0,1 mm) pomiędzy szczęki imadła i spłaszcz ją, uderzając małym młotkiem.
    2. Zamocuj spłaszczoną igłę w uchwycie do mikroigieł sekcyjnych (patrz na Tabela materiałów).
    3. Za pomocą pęsety wygnij spłaszczony koniec igły, tworząc haczyk o promieniu krzywizny ok. 2,5 mm.
  2. Przygotowanie pipet do trituracji w celu separacji ommatidiów.
    1. Umieść 1,2 x 0,68 kapilarę szklaną o wymiarach mm (średnica zewnętrzna x średnica wewnętrzna) nad otwartym płomieniem i przeprowadź polerowanie ogniowe, aby zmniejszyć średnicę jej otworu.
    2. Zmierz rozmiar otworu kapilary pod mikroskopem. Podziel przygotowane pipety do trituracji ommatidiów na siedem grup w zależności od wielkości ich otworów (t.j. 0,2–0,5 mm). Przechowywać je w oddzielnych odpowiednich pojemnikach (np. probówki).
    3. Napełnij jeden mały zlew z wodą dwukrotnie destylowaną (DDW), a drugi mały zlew etanolem 70%. Przykryj każdy zlew arkuszem folii Parafilm.
    4. Wywierć jeden mały otwór w arkuszu folii parafinowej pokrywającej zlewkę z DDW (patrz Rysunek 1A).
    5. Wykonaj siedem małych otworów w arkuszu folii parafinowej pokrywającej zlewkę z etanolem i ponumeruj otwory od 0 do 6 (patrz Rycina 1B).
    6. Umieść jedną pipetę do trituracji ommatidiów z każdej grupy rozmiarów w każdym otworze folii parafinowej w taki sposób, aby pipeta z największym otworem znajdowała się w 0th otwór, a pipeta z najmniejszym otworem znajduje się w 6th otwór
    7. Podłącz plastikowy 200 µL końcówka pipety do 35 cm długi odcinek rurki polietylenowej o wymiarach 1,57 x 1,14 mm (średnica zewnętrzna x wewnętrzna). Drugi koniec rurki należy połączyć z jedną z pipet do trituracji ommatidiów o największym otworze (t.j. (0,46–0,5 mm), upewniając się, że zaostrzony koniec pipety do trituracji nie jest skierowany do wnętrza rurki.
  3. Przygotować pipety do rejestracji z całej komórki (whole-cell), wyciągając pipety do patch-clampu z kapilar o wymiarach 1 x 0,58 mm (średnica zewnętrzna x średnica wewnętrzna) włókno borokrzemianowe zawierające kapilary szklane.
    UWAGA: Opór pipet powinien wynosić 8–15 MΩΩ podczas stosowania roztworu wewnątrzkomórkowego na bazie gluconianu potasu (IS1). Można użyć dowolnego odpowiedniego wyciągacza pipet do patch-clampu (przykłady znajdują się w Tabela materiałów). Wypalanie krawędzi nie jest konieczne.
  4. Przygotuj komorę pomiarową (patrz Rysunek 2) poprzez przymocowanie szkiełka nakrywkowe (patrz na Tabela materiałów) do dna komory kąpielowej, używając roztopionej parafiny lub wysokopróżniowego smaru silikonowego. Należy użyć dowolnej odpowiedniej komory, wykonanej samodzielnie lub zakupionej komercyjnie, która umożliwia dostęp do elektrod oraz perfuzję.
  5. Zamontuj komorę na stole mikroskopu odwróconego. Umieść rurkę systemu perfuzyjnego, system ssący oraz uziemienie (tj. drut/pastylka Ag-AgCl) w kąpieli (patrz na Tabela materiałów i Rysunek 2).
  6. umieść dwie pary precyzyjnych pęset nr 5 (Rysunek 1) na powierzchni roboczej do wykorzystania podczas etapów sekcji siatkówki i izolacji ommatidiów.

3. Hodowla D. melanogaster

  1. Hodować muchy D. Melanogaster przy niskiej gęstości populacji (t.j. ~20 much w butelce o pojemności 6 oz.) w butelkach zawierających standardową pożywkę kukurydzianą w temperaturze 19-24 °C.
    UWAGA: Zaleca się pracę na muchach zaadaptowanych do ciemności. W celu utrzymania wysokiej wrażliwości na światło należy ograniczyć różnorodność i zapobiegać degeneracji siatkówki u much mutantów.
  2. Hodować muchy w ciemności przez co najmniej 24 h przed eksperymentem.
    UWAGA: Muchy wykorzystywane w eksperymentach powinny być świeżo wyklute (<2 h), wciąż miękkie, blade i posiadać mekonium. Ommatidia można również łatwo przygotować z poczwarek, choć ich wrażliwość na światło jest wtedy silnie zależna od wieku10.

4. Disekcja siatkówki i izolacja ommatidiów: Opcja 1

UWAGA: Wszystkie poniższe kroki należy przeprowadzić pod stereomikroskopem z odpowiednim powiększeniem, umożliwiającym prawidłową obserwację preparatu (patrz Rysunek 1).

  1. Na odwróconą szalkę Petriego o średnicy 60 mm nanieś cztery krople roztworu ES-0Ca2+ oraz jedną kroplę roztworu TS.
  2. Za pomocą pęsety chropowatej chwyć nowo wyklułą muchę (<2 h po wykluciu) za skrzydła lub odwłok. Od tego momentu wszystkie procedury należy wykonywać szybko i przy słabym czerwonym oświetleniu w temperaturze 20 ±1 °C.
  3. Trzymając muchę pęsetą chropowatą, użyj pierwszej pary pęset precyzyjnych, aby oddzielić głowę muchy od ciała. Zanurz głowę w pierwszej kropli ES-0Ca2+.
  4. Przeciąć głowę na pół wzdłuż płaszczyzny strzałkowej, używając drugiej pary pęset precyzyjnych. Upewnij się, że po zakończeniu tego etapu oba oczy pozostały nienaruszone.
  5. Przenieś jedną połowę głowy do drugiej kropli ES-0Ca2+, a drugą połowę do trzeciej kropli ES-0Ca2+.
  6. Za pomocą pęsety precyzyjnej usuń jak najwięcej tkanki otaczającej oko, dbając o to, aby nie uszkodzić siatkówki.
  7. Mocno chwyć krawędź jednej rogówki pęsetą precyzyjną i wydłub siatkówkę za pomocą łyżeczki (scooper).
    UWAGA: Po zakończeniu tego kroku rogówka pozostanie pusta i nienaruszona, oddzielona od nienaruszonej siatkówki.
  8. Przepłucz podłączoną do rurki pipetę do tryturacji wodą DDW i napełnij ją niewielką ilością ES-0Ca2+ z czwartej kropli.
    UWAGA: Krok ten należy powtórzyć za każdym razem, gdy używana jest nowa pipeta do separacji ommatidiów wyjęta z zlewki z etanolem (roztwór wypełniający pipetę powinien być zgodny z roztworem, w którym zanurzona jest siatkówka).
  9. Delikatnie zassij ustami, aby wciągnąć wyizolowaną siatkówkę do pipety. Zachowaj szczególną ostrożność, aby nie zassać pęcherzyków powietrza do pipety.
  10. Przenieś wyizolowaną siatkówkę do kropli TS. Powtórz kroki 4.6-4.10 dla drugiego oka.
  11. Zetrzyj krople ES-0Ca2+ za pomocą delikatnych chusteczek, pozostawiając na szalce Petriego jedynie kroplę TS zawierającą obie siatkówki. Dodaj sześć kolejnych kropli TS na górną część szalki Petriego. Przenieś obie siatkówki do jednej z pozostałych kropli TS.
  12. Zastąp pipetę do tryturacji pipetą o mniejszej średnicy otworu. Przepłucz ją zgodnie z opisem w kroku 4.8, używając roztworu TS do napełnienia pipety.
  13. Szybko i wielokrotnie zasysaj i wypuszczaj obie siatkówki w roztworze, aby rozpocząć separację wyizolowanych ommatidiów pozbawionych komórek pigmentowych z całej siatkówki.
    UWAGA: Wyizolowane ommatidia są widoczne w kropli TS; w miarę postępu procesu izolacji kropla TS staje się mniej przezroczysta.
  14. Przenieś pozostałe części siatkówki do następnej kropli TS. Napełnij pipetę całością poprzedniej kropli TS (zawierającej wyizolowane ommatidia) i wypuść kroplę do komory kąpielowej.
  15. Powtarzaj kroki 4.12-4.14, aby uzyskać maksymalną liczbę wyizolowanych ommatidiów. Odczekaj około 1 min, aby wyizolowane ommatidia opadły i przywarły do dna komory kąpielowej.
  16. Za pomocą systemu perfuzyjnego rozpocznij przepływ ES-0Ca2+ z 1,5 mM Ca2+ do komory kąpielowej. Upewnij się, że komora jest całkowicie wypełniona roztworem, od dna do góry, a dno jest całkowicie zanurzone w roztworze. Kontynuuj płukanie kąpieli 4-5 razy.

5. Disekcja siatkówki i izolacja ommatidiów: Opcja 2

Uwaga: Wszystkie poniższe kroki należy wykonać pod stereomikroskopem, stosując powiększenie odpowiednie do prawidłowego obejrzenia preparatu (patrz Rycina 1).

  1. Przygotuj odłamek żyletki i uchwyt. Odłam i zamontuj mały trójkątny kawałek żyletki za pomocą uchwytu do żyletek (Rycina 1).
  2. Przygotuj silikonową podstawkę/blok do sekcji zgodnie z instrukcją producenta (patrz Tabela materiałów).
  3. Do sekcji przygotuj dużą kroplę (<0.5 mL) roztworu ES na silikonowym bloku do sekcji. Dodaj dwie krople „rezerwuarowe” (~50 µL każda) roztworu TS do szalki Petriego o średnicy 60 mm.
  4. Unieruchom nowo wyklułą muchę (<2 h po wykluciu) w szklanej rurce na lodzie i chwyć ją za skrzydła za pomocą pęsety. Od tego momentu wszystkie procedury należy wykonywać szybko, przy słabym czerwonym oświetleniu, w temperaturze 20 ±1 °C.
  5. Trzymając muchę pęsetą, odetnij głowę muchy za pomocą zamontowanego w uchwycie odłamka żyletki. Chwyć pęsetą szpilkę entomologiczną (długość 12 mm, średnica 0.1 mm) i przebij głowę między oczami.
  6. Krótko zanurz głowę w 70% etanolu; zapobiega to tworzeniu się pęcherzyków powietrza na powierzchni głowy/oka. Przymocuj głowę szpilką pod kroplą ES na silikonowej podstawce do sekcji.
  7. Odetnij oba oczy za pomocą odłamka żyletki, wykonując ruchy piłujące wzdłuż linii przedniego brzegu oka.
  8. Mocno uchwyć krawędź jednej rogówki za pomocą precyzyjnej pęsety.
  9. Wydobądź siatkówkę za pomocą łyżeczki do wycierania.
    UWAGA: Po wykonaniu tego kroku rogówka pozostanie pusta i nienaruszona, oddzielona od nienaruszonej siatkówki.
  10. Nie uszkadzając siatkówki, użyj pęsety i łyżeczki, aby delikatnie usunąć przylegające worki powietrzne i nadmiar tkanki mózgowej.
    UWAGA: Preparacja izolowanych siatkówek jest przydatna również do analiz Western blot nieswoistych białek siatkówki11, histologii całych preparatów oraz obrazowania całej siatkówki. Pomiary patch-clamp można również przeprowadzać na fotoreceptorach z całej siatkówki12.
  11. Wybierz pipetę do tryturacji o największej średnicy, podłącz ją do wężyka i napełnij pipetę niewielką ilością roztworu TS z jednej z kropli rezerwuarowych w szalce Petriego poprzez delikatne ssanie (tzn. ustami). Powtarzaj ten krok za każdym razem, gdy używana jest nowa pipeta do tryturacji ommatidiów.
  12. Delikatnie wydmuchnij roztwór TS na obie siatkówki, a następnie zassij izolowane siatkówki do pipety. Zachowaj ostrożność, aby do pipety nie dostały się pęcherzyki powietrza.
  13. Przenieś izolowane siatkówki do szalki Petriego, tworząc małą kroplę (~20 µL), i przemyj je raz lub dwa razy roztworem TS z jednej z kropli rezerwuarowych.
  14. Inkubuj siatkówki w ciemności przez 20-25 min.
  15. Zastąp pipetę do tryturacji ommatidiów pipetą o mniejszej średnicy otworu (napełniając ją świeżym roztworem TS z jednej z kropli rezerwuarowych, jak w kroku 4.6).
  16. Szybko aspiruj i wydmuchuj obie siatkówki w małej kropli (~20 µL), aby rozpocząć rozdzielanie izolowanych ommatidiów.
    UWAGA: Na pierwszym etapie otaczająca pigmentowa gleja powinna ulec rozpadowi, pozostawiając w roztworze widoczne niewielkie fragmenty tkanek.
  17. Po nagromadzeniu znacznej ilości drobnych fragmentów, ale przed rozdzieleniem wielu ommatidiów, użyj świeżego roztworu TS z jednej z kropli rezerwuarowych i przenieś siatkówki do nowej małej kropli.
  18. Wybierz pipetę do tryturacji o mniejszej średnicy, napełnij ją i kontynuuj tryturację.
    UWAGA: Gdy ommatidia zaczną się rozdzielać, ich wydłużone kształty powinny być wyraźnie widoczne przy dużym powiększeniu stereomikroskopu. W razie potrzeby sukcesywnie zmieniaj pipety do tryturacji na takie o mniejszych średnicach, aż do uzyskania dobrej wydajności ommatidiów.
  19. Gdy uzyskana zostanie odpowiednia ilość ommatidiów, a kropla przestanie być przezroczysta, wciągnij do pipety całą kroplę z izolowanymi ommatidiami i delikatnie wydmuchaj ją na dno komory kąpieli uprzednio napełnionej roztworem ES.
  20. Odczekaj około 1 min, aby izolowane ommatidia opadły i osiadły na dnie komory kąpieli.
  21. Używając systemu perfuzyjnego, rozpocznij przepływ roztworu ES do komory kąpieli. Upewnij się, że komora jest całkowicie pełna roztworu, od dołu do góry, a osad jest całkowicie zanurzony. Kontynuuj płukanie kąpieli 4-5 razy.
    UWAGA: Następnie ciągła perfuzja nie jest wymagana, choć kąpiel należy krótko przepłukać przed wprowadzeniem nowej pipety do patch-clamp.

6. Rejestracja typu whole-cell

figure-protocol-2
Rysunek 2: Przegląd układu elektrofizjologicznego i optycznego. Układ zawiera żelazną, pomalowaną na czarno klatkę Faradaya (F). Przednia strona jest osłonięta czarną kurtyną z wewnętrzną siatką miedzianą. Taka konfiguracja umożliwia całkowite odizolowanie preparatu od światła rozproszonego i jest odpowiednia do rejestracji ciemnych, spontanicznych wypiętrzeń (bumps). Odwrócony mikroskop fluorescencyjny (A) jest zamocowany na stole antywibracyjnym (E). Aparatura do rejestracji fotoreceptorów składa się z wykonanej samodzielnie komory kąpielowej z pleksiglasu (O) z wlotem perfuzyjnym (Q), pipetą ssącą (S) oraz uziemieniem srebrno-chlorkowym (P). Komora kąpielowa jest zamontowana na stoliku mikroskopu (T) za pomocą własnego adaptera. Pipeta rejestrująca jest połączona za pomocą drutu srebrno-chlorkowego z uchwytem z pleksiglasu, który jest podłączony do przedwzmacniacza (head stage) (C). Przedwzmacniacz jest następnie zamontowany na grubym mikromanipulatorze, który z kolei jest osadzony na precyzyjnym mechanicznym mikromanipulatorze XYZ (B). System perfuzji (D) składa się ze zestawu strzykawek, a przepływ cieczy jest kontrolowany przez zawory zaciskowe (H). Szafka rack jest elektrycznie połączona z tym samym uziemieniem centralnym, do którego podłączony jest cały sprzęt wewnątrz klatki Faradaya; zawiera ona wzmacniacz patch-clamp (N), oscyloskop (J), generator impulsów/funkcyjny (K), przetwornik A/C (L), kontroler perfuzji (I) oraz kontroler koła filtrów i migawki (M). Do eksperymentów obrazowych, poprzez port boczny (G), podłączona jest chłodzona kamera CCD (-110 °C, patrz Tabela Materiałów). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

UWAGA: Podczas wszystkich poniższych etapów należy używać wyłącznie słabego czerwonego oświetlenia i zapewnić minimalną ekspozycję ommatidiów na światło (tj. pracować szybko i wyłączać źródło światła do mikrodissekcji oraz czerwone oświetlenie komory używane do obserwacji ommatidiów podczas wykonywania czynności, które nie wymagają ich oglądania). Ponadto wszystkie poniższe kroki należy przeprowadzić zgodnie ze standardowym protokołem elektrofizjologicznym.

  1. Pod mikroskopem odwróconym (obiektyw 40X) dokładnie obejrzyj wszystkie ommatidia w kąpieli i wybierz odpowiednie ommatidion do eksperymentu.
    1. Należy upewnić się, że błona zewnętrzna ommatidium jest gładka i nieuszkodzona, a jej oś podłużna znajduje się w przybliżeniu pod kątem prostym względem kierunku zbliżania elektrody (jak widać w Rysunek 3A), a dystalna sekcja ommatidium nie jest otoczona żadną nadmiarową tkanką. Umieść wybrany ommatidium na osi optycznej obiektywu (w centrum pola widzenia), aby zapewnić równomierne oświetlenie.
  2. Napełnić pipetę patchową roztworem wewnątrzkomórkowym (IS1 lub IS2).
    UWAGA: Do pomiaru odpowiedzi natężenia oraz analizy wypukłości (bump analysis) należy użyć IS1. Do pomiaru potencjału odwrócenia kanałów światłoczułych należy użyć IS2.
  3. Zamocuj pipetę do patch-clampu w uchwycie do elektrod.
  4. Wdmuchnij powietrze do pipety ustami, przez rurkę połączoną z uchwytem elektrody, aby wypełnić ją pod wpływem nadciśnienia. Zamknij zawór rurki, aby utrzymać ciśnienie.
  5. Za pomocą mikromanipulatora wprowadź elektrodę do komory kąpielowej.
  6. Przesuń elektrodę blisko dystalnej sekcji ommatidium, tak aby nie doszło do kontaktu między elektrodą a ommatidium, aż do momentu, gdy w ommatidium pojawi się niewielkie wgłębienie (wywołane nadciśnieniem w pipecie patch).
  7. Otwórz oprogramowanie do rejestracji (patrz na Tabela materiałów). Otwórz "moduł testowy membrany" aby zastosować ciągłe prostokątne impulsy napięcia o wartości 2 mV z częstotliwością 100 Hz.
  8. Ustaw potencjał złączowy na "zero," poprzez regulację odpowiedniego pokrętła w wzmacniaczu patch-clamp w celu ustawienia podstawy impulsu prostokątnego na "zero" bieżący
    UWAGA: Układ elektrofizjologiczny obejmuje przedwzmacniacz głowowy (t. j. pierwszy stopień wzmocnienia) podłączony do wzmacniacza (t. j. wzmacnianie drugiego stopnia). Wzmocniony sygnał analogowy jest przekształcany w sygnał cyfrowy za pomocą przetwornika A/C, który jest sterowany przez oprogramowanie zainstalowane na komputerze PC.
  9. Zwolnij nadciśnienie w pipecie, otwierając zawór rurki podłączonej do uchwytu elektrody. Delikatnie wytwórz podciśnienie w pipecie, zasysając powietrze z rurki, co doprowadzi do przylegania pipety do błony komórkowej. Zamknij zawór rurki, aby utrzymać ciśnienie.
  10. Upewnij się, że oporność elektrody wyświetlana na ekranie komputera wynosi od 100 do 150 MΩ.ΩZwolnij podciśnienie w pipecie, ręcznie otwierając zawór rurki podłączonej do uchwytu elektrody.
  11. Upewnij się, że rezystancja elektrody została podniesiona do co najmniej 1–2 GΩ.Ω.
    UWAGA: Na tym etapie utworzono uszczelnienie pomiędzy elektrodą a fotoreceptorem.
  12. Skompensuj prądy pojemnościowe pipety, regulując odpowiednie pokrętło w wzmacniaczu patch-clamp.
  13. Wytwarzaj szybkie, krótkie i silne impulsy podciśnienia w elektrodzie, zasysając ustami powietrze z rurki podłączonej do uchwytu elektrody, aby "przerwa" do błony fotoreceptora i uzyskać konfigurację whole-cell. Alternatywnie można zastosować "Przycisk Zap" w celu zastosowania krótkich, prostokątnych impulsów elektrycznych, zaczynając od czasu trwania wynoszącego "0,1 ms," lub zastosować kombinację obu metod.
    UWAGA: Uzyskanie konfiguracji whole-cell objawia się gwałtownym wzrostem pojemności pipety (zazwyczaj ~60 pF dla fotoreceptora R1-6 typu dzikiego; pojemność wynosząca zaledwie ~20 pF wskazuje na rejestrację z fotoreceptora R7; pojemność powyżej ~90 pF wskazuje na rejestrację z dwóch fotoreceptorów).
  14. Ustaw potencjał utrzymujący fotoreceptora na wymaganą wartość napięcia (zazwyczaj -70 mV), ręcznie, używając odpowiedniego pokrętła w wzmacniaczu patch-clamp.
    UWAGA: Krok ten można wykonać po uzyskaniu uszczelnienia (krok 6.11), a przed uzyskaniem konfiguracji whole-cell.
  15. Skompensuj prądy pojemnościowe i rezystancję szeregową (zmierzona wartość rezystancji szeregowej większa niż 25 MΩ wskazuje na zapchanie pipety z elektrodą) i, jeśli jest to wymagane (t. j. (dla większych prądów) zastosować kompensację rezystancji szeregowej za pomocą odpowiednich pokręteł w wzmacniaczu patch-clamp.
  16. Zamknąć czarną przednią zasłonę klatki Faradaya, aby uzyskać maksymalne zaciemnienie i izolację elektryczną.
  17. Rozpocznij proces rejestracji za pomocą oprogramowania i podaj bodźce świetlne oraz/lub substancje farmakologiczne zgodnie z wybraną procedurą eksperymentalną.

7. Jednoczesne rejestracje z całej komórki i obrazowanie Ca2+

  1. W przypadku genetycznie kodowanych wskaźników Ca2+, izoluj ommatidia zgodnie z powyższym opisem, wykorzystując muchy D. melanogaster wykazujące ekspresję GCaMP6f13. Do pomiaru fluorescencji użyj kamery CCD (patrz Tabela Materiałów) i upewnij się, że mikroskop jest wyposażony w odpowiednie filtry wzbudzenia i emisji oraz lustro dichroiczne (patrz Tabela Materiałów)4.
  2. W przypadku zastosowania egzogennego wskaźnika Ca2+ (Rysunek 4; patrz Tabela Materiałów), izoluj ommatidia zgodnie z powyższym opisem. Dodatkowo upewnij się, że roztwór w pipecie zawiera wskaźnik wapnia w stężeniu 20-100 µM.
  3. Użyj oprogramowania do obrazowania (patrz Tabela Materiałów), aby pozyskiwać obrazy z częstotliwością 40 Hz. Przeprowadź akwizycję obrazu podczas 10 s okresu ciemności, po którym następuje intensywna 2 s stymulacja światłem.
  4. Użyj oprogramowania do obrazowania i zdefiniuj obszar zainteresowania (ROI). Zmierz intensywność fluorescencji w ROI. Oblicz średnią fluorescencję w ciemności (FD) i odejmij ją od zapisów fluorescencji podczas stymulacji światłem (FL) (FL-FD). Znormalizuj te pomiary zgodnie z intensywnością fluorescencji na początku stymulacji światłem (FL0).

Wyniki

Opisana metoda umożliwiła w określonych warunkach dokładną rejestrację podstawowych prądów jednostkowych, które generują spontaniczne i wywołane światłem kwantowe skoki (quantum bumps), sumujące się do makroskopowej odpowiedzi na światło. Pozwoliła ona również na porównanie much typu dzikiego z mutantami wykazującymi defekty w kluczowych cząsteczkach sygnałowych (Ryciny 3 i 5)14,15,16,17,18Ponadto możliwość pomiaru potencjału odwrócenia w warunkach bi-jonowych ujawniła fundamentalne właściwości biofizyczne kanałów TRP i TRP-podobnych (TRPL).18,19Umożliwiło to również pomiar efektów substytucji aminokwasów w regionie pory kanału TRP, które modyfikowały jego przepuszczalność dla jonów Ca2+2+ przepuszczalność20.

Odpowiedź świetlna uzyskana za pomocą rejestracji whole-cell metodą patch-clamp zależy liniowo od natężenia światła w zakresie co najmniej 4 rzędów wielkości. Nie można było tego rozstrzygnąć przy użyciu ERG oraz metod rejestracji wewnątrzkomórkowej. W związku z tym seria odpowiedzi na krótkie błyski o rosnącym natężeniu oraz wykres funkcji odpowiedzi na natężenie ujawniły ścisłą liniowość odpowiedzi na błysk wraz ze wzrostem natężenia światła. Ścisła liniowość utrzymuje się co najmniej do poziomu kilkuset pA, jednak dyskusyjne jest, czy powyżej tej wartości następuje utrata liniowości, czy też utrata kontroli clampowania (Rycina 6). Wyniki te sugerują, że makroskopowe odpowiedzi na światło są liniową sumą jednostkowych odpowiedzi na światło (i.e. quantum bumps).

Za pomocą pomiarów napięcia dobrze ustalono, że stymulacja słabym światłem indukuje dyskretne fluktuacje napięcia (tj. skoki kwantowe) u większości gatunków bezkręgowców. Skoki kwantowe u D. melanogaster wynikają ze skoordynowanego otwarcia ~15 kanałów TRP i ~2 kanałów TRPL w szczycie skoku18. Każdy skok jest generowany przez absorpcję pojedynczego fotonu, podczas gdy odpowiedź makroskopowa na intensywniejsze światło jest sumą tych elementarnych odpowiedzi14,21. Skoki znacząco różnią się pod względem latencji, przebiegu czasowego i amplitudy, nawet przy identycznych warunkach stymulacji. Generowanie skoków jest procesem stochastycznym opisanym przez statystykę Poissona, w którym każdy efektywnie zaabsorbowany foton wywołuje tylko jeden skok. Relacja jeden foton – jeden skok wymaga, aby każdy etap kaskady obejmował nie tylko wydajny mechanizm „włączenia”, ale także równie skuteczny mechanizm „wyłączenia”. Korzyścią funkcjonalną jest stworzenie bardzo czułego licznika fotonów o szybkiej odpowiedzi przejściowej, bardzo dobrze dostosowanej zarówno do czułości, jak i rozdzielczości czasowej wymaganej przez system wzrokowy. Konieczność istnienia wydajnego mechanizmu wyłączenia ujawnia się, gdy aktywny fotopigment (tj. metarodopsyna, M) lub jego cel, Gqα, nie ulegają inaktywacji, co prowadzi do ciągłego generowania skoków długo po wyłączeniu światła (Ryc. 3)15,22,23,24.

Wypukłość reprezentuje kooperatywną aktywność kanałów TRP/TRPL w mikrokosomku. W związku z tym każda hipoteza dotycząca aktywacji kanałów powinna wyjaśniać również kooperatywną aktywację kanałów. Niedawno Hardie i współpracownicy wykazali, że światło wywołuje szybkie skurcze fotoreceptorów, co sugeruje, że kanały światłoczułe (TRP/TRPL) mogą być bramkowane mechanicznie25. Ta aktywacja mechaniczna, wraz z obserwowanym uwalnianiem protonów w wyniku hydrolizy PIP2 pośredniczonej przez PLC, promuje otwieranie kanałów TRP/TRPL i wyjaśnia kooperatywny charakter powstawania wypukłości26. Obecnie fotoreceptory D. melanogaster są jednym z niewielu systemów, w których sygnalizację fosfoinozytydową i kanały TRP można badać in vivo, co czyni fototransdukcję D. melanogaster oraz metodologię opracowaną do badania tego mechanizmu niezwykle wartościowym systemem modelowym.

figure-results-1
Rycina 3: Mutanty inaCP209 i inaDP215 wykazują spowolnione wygaszanie makroskopowej odpowiedzi na światło oraz pojedynczych skoków kwantowych. (A) Preparat izolowanego ommatidium z pipetą patch wypełnioną fluorescencyjnym barwnikiem Lucifer Yellow CH (podbudzenie: 430 nm; emisja: 540 nm) przedstawiony podczas rejestracji w konfiguracji whole-cell. Zauważono, że barwnik fluorescencyjny rozprzestrzenił się i oznakował ciało pojedynczej komórki photoreceptora; ciała komórek photoreceptorów są oddzielone od ich wydłużonych aksonów, ale nadal zachowują żywotność. Preparat ten nadaje się do jednoczesnej rejestracji whole-cell i eksperymentów obrazowych. (B-D) Panele górne: Odpowiedzi w postaci skoków kwantowych rejestrowane metodą whole-cell przy stałym potencjale membranowym (voltage clamp) na słabe światło ciągłe (otwarty słupek) u much WT, inaCP209 oraz mutantów inaDP215 . U mutantów inaCP209 i inaDP215 zaobserwowano wolniejsze wygaszanie skoków w porównaniu z muchami WT. Wstawka poniżej przedstawia powiększony kształt pojedynczych skoków. Panele dolne: Znormalizowane makroskopowe odpowiedzi rejestrowane metodą whole-cell na impuls światła o czasie trwania 500 ms (1.5 x 105 fotonów/s) u wyżej wymienionych much typu dzikiego i mutantów. (E-G) Panele górne: Odpowiedzi w postaci skoków kwantowych rejestrowane metodą whole-cell przy stałym potencjale membranowym na krótki (1 ms), słaby impuls światła wywołujący odpowiedzi jednofotonowe u much typu dzikiego, arr23 oraz mutantów ninaCP235 . Zwrócono uwagę na serię skoków zaobserwowaną u mutantów arr23 i ninaCP235 w odpowiedzi na absorpcję pojedynczego fotonu. Panele dolne: Znormalizowane odpowiedzi rejestrowane metodą whole-cell przy stałym potencjale membranowym na impuls światła o czasie trwania 500 ms (1.5 x 104 fotonów/s) u odpowiadających mutantów. Zauważono wolniejsze wygaszanie odpowiedzi makroskopowych u mutantów arr23 i ninaCP235 w porównaniu z WT. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-2
Rysunek 4: Dynamika komórkowego Ca2+  po indukowanym sygnałem napływie Ca2+  jest modyfikowana przez kalfotynę.  Seria czasowa obrazów fotoreceptorów much typu dzikiego oraz Cpn1%, przedstawiająca fluorescencję wskaźnika Ca2+ podczas stymulacji światłem. Obrazy surowej intensywności przedstawiono z użyciem kodowania fałszywych kolorów (pasek = 10 µm; groty strzałek wskazują pipetę). Rysunek przedrukowany za zgodą Weiss et al.4. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rycina 5: Właściwości elektrofizjologiczne mutantów WT, trp i trpl. (A) Rejestracje metodą voltage clamp w konfiguracji whole-cell dla skoków kwantowych w odpowiedzi na ciągłe słabe światło (otwarty słupek) u much WT, trpl302 oraz mutantów null trpP343. Zaobserwowano znacznie zredukowane amplitudy skoków u mutantów trpP343. Wstawka: Przedstawiono powiększone pojedyncze skoki kwantowe u much typu dzikiego oraz mutantów null trpP343. (B) Rejestracje metodą voltage clamp w konfiguracji whole-cell w odpowiedzi na 3 s impuls światła u typu dzikiego i odpowiadających mu mutantów. Zaobserwowano przejściową odpowiedź stanu stacjonarnego u mutanta trpP343 . Wstawka: Przedstawiono powiększone odpowiedzi świetlne u WT i mutanta trpP343. (C) Rodzina nałożonych na siebie prądów indukowanych światłem u powyższych szczepów much, wywołanych w odpowiedzi na 20 ms impuls światła, przy skokach napięcia o wartości 3 mV, mierzonych wokół potencjału odwrócenia (Erev). (D) Histogram przedstawiający średni Erev dla typu dzikiego i różnych mutantów. Słupki błędu oznaczają S.E.M. Potencjał odwrócenia (Erev) dla WT znajduje się pomiędzy dodatnim Erev dla trpl302, który wykazuje ekspresję tylko TRP, a Erev mutanta null trpP343, który wykazuje ekspresję tylko TRPL. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

figure-results-4
Rycina 6: Odpowiedź na błysk jest ściśle liniowa przy zwiększającej się intensywności światła.
Seria odpowiedzi prądowych na krótkie błyski o zwiększającej się intensywności światła oraz wykres zależności amplitudy szczytowej odpowiedzi świetlnej od rosnącej intensywności krótkich błysków światła. Zależność ta wykazuje ścisłą liniowość pomiędzy odpowiedzią na błysk a zwiększającą się intensywnością światła. Ścisła liniowość ta utrzymuje się co najmniej do poziomu kilku stu pA, przy intensywności światła obejmującej ponad 4 rzędy wielkości, podczas gdy kwestia tego, czy w dalszej części następuje załamanie liniowości, czy kontroli zacisku (clamp control), pozostaje dyskusyjna. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

pH7,15 (skorygować za pomocą NaOH)
OdczynnikStężenie (mM)
NaCl120
KCl5
MgCl₂24
TES10
Prolina25
Alanina5
Przechowywać w temperaturze -20 °C.
Uwaga: Roztwór ten jest nominalnie Ca2+ wolny, lecz pozbawiony Ca2+ dodano bufory, w związku z czym pH wyniesie około 5 - 10 µM śladowe ilości Ca2+Roztwór zewnątrzkomórkowy (ES) = ES-0Ca2+ z 1,5 mM CaCl22, przygotowany poprzez dodanie CaCl22 z roztworu stokowego o stężeniu 0,5 lub 1 M do ES-0Ca2+.

Tabela 1: Roztwór pozakomórkowy (ES) pozbawiony Ca+2.Opis chemiczny i konkretne ilości niezbędne do przygotowania ES pozbawionego Ca+2.

OdczynnikIlość
FBS (płodowa surowica bydlęca)15 ml
sacharoza1,5 g
Podzielić na 150 µL rozdzielić na aliquoty w probówkach 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -20°C °C.
Roztwór do tryturacji (TS)Napełnić 1 fiolkę o pojemności 150 ml roztworem zapasowym przygotowanym z 1350 ml ES lub ES-0Ca2+aby dopasować go do roztworu stosowanego podczas sekcji.

Tabela 2: Płowe serum wołowe (FBS) + sacharoza – roztwór zapasowy.Opis chemiczny i konkretne ilości wymagane do przygotowania roztworu zapasowego płowia serum wołowego (FBS) + sacharozy.

pH7,15 (dostosować za pomocą KOH)
OdczynnikStężenie (mM)
Gluconian potasu (Kglu)140
MgCl₂22
TES10
sól magnezowa ATP (MgATP)4
sód GTP (Na2GTP)0.4
β-Hydrat nikotynamidoadeninowej dinukleotydy (NAD)1
Przechowywać w temperaturze -20 °C.

Tabela 3: Roztwór wewnątrzkomórkowy (IS1). Opis chemiczny i konkretne ilości wymagane do przygotowania IS1, który jest głównie stosowany do pomiarów odpowiedzi intensywnościowej i skoków kwantowych.

pH7,15 (skorygować za pomocą CsOH)
OdczynnikStężenie (mM)
CsCl120
MgCl₂22
TES10
sól magnezowa ATP (MgATP)4
sól sodowa GTP  (Na+2GTP)0.4
β-Hydrat nikotynamidoadenynodynukleotydu (NAD)1
Chlorek tetraetyloamoniowy (TAE)15
Przechowywać w temperaturze -20 °C.

Tabela 4: Roztwór wewnątrzkomórkowy (IS2). Opis chemiczny i konkretne ilości wymagane do przygotowania roztworu wewnątrzkomórkowego  IS2, który jest wykorzystywany głównie do pomiarów potencjału odwrócenia prądu indukowanego światłem.

Dyskusja

Zastosowanie zapisów z całych komórek do fotoreceptorów D. melanogaster pozwoliło na odkrycie i funkcjonalne wyjaśnienie nowych białek sygnałowych, takich jak kanały TRP 27,28,29 i białko rusztowania INAD 30,31,32. Od czasu pierwszego wprowadzenia tej techniki, umożliwiła ona rozwiązanie długoterminowych podstawowych pytań dotyczących mechanizmu jonowego i zależności napięciowej odpowiedzi świetlnej. Stało się tak ze względu na przyznaną zdolność do dokładnej kontroli napięcia błony oraz zewnątrzkomórkowego i wewnątrzkomórkowego składu jonowego19,28.

Główną przeszkodą w technice zaciskania plastrów u D. melanogaster była kruchość izolowanego preparatu ommatidia. Szczegółowe badania wykazały, że integralność maszyn fototransdukcyjnych krytycznie zależy od ciągłego dostarczania ATP, zwłaszcza podczas ekspozycji na światło, co prowadzi do dużego zużycia ATP. Niestety, mechaniczne paskowanie komórek barwnikowych (tj. glejowych), które jest wymagane, aby dotrzeć do błony fotoreceptora za pomocą pipety z plastrem, eliminuje główne źródło metabolitów niezbędnych do produkcji ATP33. Zastosowanie egzogennego ATP do pipety rejestrującej tylko częściowo spełnia wymagania dotyczące dużych ilości ATP. Niedobór ATP prowadzi do spontanicznej aktywacji kanałów TRP i do dysocjacji maszynerii fototransdukcji od kanałów aktywowanych światłem, powodując duży wzrost komórkowego Ca2+ i zniesienie normalnej odpowiedzi na światło34,35. Ta sekwencja zdarzeń nie jest spowodowana uszkodzeniem fotoreceptorów przez procedurę sekcji, ale raczej zubożeniem komórek ATP. Aby zapobiec wystąpieniu tej sekwencji zdarzeń i utrzymać normalne reakcje świetlne, fotoreceptory nie powinny być wystawiane na intensywne światło, które zużywa duże ilości ATP. Ponadto, NAD musi być włączony do pipety rejestrującej, przypuszczalnie w celu ułatwienia produkcji ATP w mitochondriach18,36. W przypadku pomiarów spontanicznych i kwantowych wybrzuszeń powyższa trudność jest minimalna, ponieważ używane są tylko słabe światła. W praktyce stabilny zapis całej komórki może być utrzymany przez ~20-25 minut, chociaż istnieje tendencja do spowolnienia kinetyki odpowiedzi w tym okresie. Pojedynczy preparat zdysocjowanej ommatydii może zachować żywotność do 2 godzin.

Dodatkowym mankamentem izolowanego preparatu ommatidia jest niedostępność mikrokosmków, co przekłada się na brak dostępu kanałów TRP i TRPL do pipety rejestrującej, uniemożliwiając zapisy jednokanałowe. Korzystając z opracowanej przez siebie metody, Bacigalupo i jego współpracownikom udało się bezpośrednio zarejestrować jednokanałową aktywność rabdomeru37. Jednak ta aktywność kanału różni się od aktywności kanałów TRPL heterologicznie wyrażanych w komórkach hodowli tkankowej38 oraz od aktywności kanału TRP wynikającej z analizy szumu strzału uzyskanej z izolowanej ommatydii34. Przypuszczalnie procedura preparacji znacznie uszkodziła komórki fotoreceptorów podczas stosowania tej metody.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Eksperymentalna część tych badań była wspierana przez granty z amerykańsko-izraelskiej Bi National Science Foundation (dla B.M. i I.L.), Izraelskiej Fundacji Naukowej (ISF), Deutsch-Israelische Projektkooperation (DIP) (do B.M.) oraz Rady ds. Badań nad Biotechnologią i Naukami Biologicznymi (numery grantów BBSRC: BB/M007006/1 i BB/D007585/1) dla R.C.H.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Strzykawka 10 ml
5 ml
1 ml z wydłużoną końcówką
Szalka60 mm
Filtry strzykawkoweMillex22 µ m Filtr PVDF 
Kapilary (do separacji omatidiów)Szkło, 1,2 x 0,68 mm (~7,5 cm każda)
Rurka polietylenowaBecton Dickinson1,57 x 1,14 mm (35 cm)
  2 małe zlewki50 ml lub mniej
2 arkusze folii parafinowejParafilm M~5 x 5 cm
Komora kąpielowadomowej roboty
Szkiełka22 x 22 mm Nr 0
Paraplast PlusSigmaParafina – mieszanina poliizobutylenuDo przyklejenia szkiełka nakrywkowego na dnie komory kąpielowej
ZiemiaInstrumenty Warnera 64-1288Zespół hybrydowy Zespół drutu Ag-AgCl
Bezgłowa igła do mikropreparacjiEntomologia, 12 mm
na igłę do mikropreparacji
Imadło
2 cienkie pęsety + 1 szorstka pęsetaDumont #5, Biologia 0,05 x 0,02 mm, długość 110 mm, Inox
Mikroskop stereoskopowy z zoomem NikonSMZ-2B
Źródło zimnego światłaSchottKL1500 Filtr LCD
(kolor) do źródła zimnego światłaSchottRG620
Delikatne wycieraczkiKimtechKimwipes
Uchwyt elektrodyWarner InstrumentsQSW-T10PQ series Uchwyty kompatybilne ze wzmacniaczami Axon, prosty styl korpusu
Srebrny drutWarner Instrumentso średnicy 0,25 mm, musi być chlorowany
MikromanipulatorSutter InstrumentsMP 85Mikromanipulator Huxley-Wall Style
Klatka Faradayadomowej robotyElektromagnetyczna osłona przed hałasem i kurtyna przednia
Stół antywibracyjnyNewportVW-3036-OPT-01
OsyloskopGWGOS-622G
System perfuzyjnyWarner InstrumentsVC-8PSystem sterowania zaworem zaciskowym
Sterownik zaworu perfuzyjnegoInstrumenty naukoweBPS-8
System ssący
WzmacniaczUrządzenie molekularneAxopatch-1D
Urządzenie molekularnestopnia głównegoCV - 4Wzmocnienie: x 1/100
A / D konwerterUrządzenie molekularneDigidata 1440A
ClampexMolecular Device10oprogramowanie
pCLAMPOprogramowanie Molecular Device10
Źródło światła (lampa ksenonowa)Sutter InstrumentsLambda LS
Detektor światładomowyfototranzystor
Koło filtrów i kontroler migawkiSutter InstrumentsLambda 10-2 z migawką
Filtry (filtr o naturalnej gęstości)Filtr Chroma6,5,4,3,2,1,0.5,0.3
(Kolor)SchottOG590, Filtr
Ksenonowa lampa błyskowa System lampDr. Rapp OptoElecftronicJML-C2
Światłowódkwarcowy 
Generator impulsówAMPIMaster 8
Mikroskop OlympusIX71, Filtr podświetlenia odwróconego
czerwonego (mikroskop)RG630 / RG645 ø Obiektyw mikroskopowy 45 mm
OlympusX60/0.9 UplanFL N air lub X60/1.25 UplanFI olejowa
kamera CCDiXon DU885K
Element Oprogramowanie NikonAR
Wskaźnik Ca+2InvitrogenCalcium green 5N
Filtry wzbudzenia i emisji oraz lustro dichroiczneChroma19002 - AT - GFP/FITC Zestaw
Pionowy ściągacz do pipetNarishige Model PP83Użyj ściągacza pionowego lub poziomego, zgodnie z preferencjami.
Ściągacz do pipetpoziomych Sutter Instrument Model P-1000 Płonący / brązowy ściągacz
FilamentSutter Instrument3 mm koryto lub kwadratowe pudełko
KapilaryAparat Harvardakapilary ze szkła borokrzemianowego1 x 0,58 mm
Strzykawka Strzykawka Petriego nakrywkowe Uchwyt Uniblitzkrawędziowylongpassówdo mikropipet

Bibliografia

  1. Hardie, R. C. Whole-cell recordings of the light induced current in dissociated Drosophila photoreceptors: evidence for feedback by calcium permeating the light-sensitive channels. Proc. R. Soc. Lond. B. 245, 203-210 (1991).
  2. Ranganathan, R., Harris, G. L., Stevens, C. F., Zuker, C. S. A Drosophila mutant defective in extracellular calcium- dependent photoreceptor deactivation and rapid desensitization. Nature. 354, 230-232 (1991).
  3. Martin, J. H., Benzer, S., Rudnicka, M., Miller, C. A. Calphotin: a Drosophila photoreceptor cell calcium-binding protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (4), 1531-1535 (1993).
  4. Weiss, S., et al. Compartmentalization and Ca2+ buffering are essential for prevention of light-induced retinal degeneration. J Neurosci. 32 (42), 14696-14708 (2012).
  5. Wang, T., et al. Light activation, adaptation, and cell survival functions of the Na + /Ca 2+ exchanger CalX. Neuron. 45 (3), 367-378 (2005).
  6. Weckstrom, M., Hardie, R. C., Laughlin, S. B. Voltage-activated potassium channels in blowfly photoreceptors and their role in light adaptation. J. Physiol. Lond. 440, (1991).
  7. Frolov, R. V., Immonen, E. V., Weckström, M. Performance of blue- and green-sensitive photoreceptors of the cricket Gryllus bimaculatus. J Comp Physiol A Neuroethol Sens Neural Behav Physiol. 200 (3), 209-219 (2014).
  8. Nasi, E. Whole-cell clamp of dissociated photoreceptors from the eye of Lima scabra. J Gen Physiol. 97 (1), 35-54 (1991).
  9. Nasi, E., Gomez, M. P. Light-activated ion channels in solitary photoreceptors of the scallop Pecten irradians. J. Gen. Physiol. 99, 747-769 (1992).
  10. Hardie, R. C., Peretz, A., Pollock, J. A., Minke, B. Ca 2+ limits the development of the light response in Drosophila photoreceptors. Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 252, 223-229 (1993).
  11. Kohn, E., et al. Functional Cooperation between the IP3 Receptor and Phospholipase C Secures the High Sensitivity to Light of Drosophila Photoreceptors In Vivo. J Neurosci. 35 (6), 2530-2546 (2015).
  12. Hevers, W., Hardie, R. C. Serotonin modulates the voltage dependence of delayed rectifier and Shaker potassium channels in Drosophila photoreceptors. Neuron. 14 (4), 845-856 (1995).
  13. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  14. Henderson, S. R., Reuss, H., Hardie, R. C. Single photon responses in Drosophila photoreceptors and their regulation by Ca 2. J. Physiol. Lond. 524 (Pt 1), 179-194 (2000).
  15. Scott, K., Zuker, C. S. Assembly of the Drosophila phototransduction cascade into a signalling complex shapes elementary responses. Nature. 395 (6704), 805-808 (1998).
  16. Elia, N., Frechter, S., Gedi, Y., Minke, B., Selinger, Z. Excess of G betae over G qalphae in vivo prevents dark, spontaneous activity of Drosophila photoreceptors. J. Cell Biol. 171 (3), 517-526 (2005).
  17. Katz, B., Minke, B. Phospholipase C-Mediated Suppression of Dark Noise Enables Single-Photon Detection in Drosophila Photoreceptors. J. Neurosci. 32 (8), 2722-2733 (2012).
  18. Hardie, R. C., et al. Molecular basis of amplification in Drosophila phototransduction. Roles for G protein, phospholipase C, and diacylglycerol kinase. Neuron. 36 (4), 689-701 (2002).
  19. Reuss, H., Mojet, M. H., Chyb, S., Hardie, R. C. In vivo analysis of the Drosophila light-sensitive channels, TRP and TRPL. Neuron. 19, 1249-1259 (1997).
  20. Liu, C. H., et al. In vivo identification and manipulation of the Ca 2+ selectivity filter in the Drosophila transient receptor potential channel. J. Neurosci. 27 (3), 604-615 (2007).
  21. Ahmad, S. T., Natochin, M., Barren, B., Artemyev, N. O., O'Tousa, J. E. Heterologous expression of bovine rhodopsin in Drosophila photoreceptor cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (9), 3722-3728 (2006).
  22. Scott, K., Sun, Y., Beckingham, K., Zuker, C. S. Calmodulin regulation of Drosophila light-activated channels and receptor function mediates termination of the light response in vivo. Cell. 91 (3), 375-383 (1997).
  23. Liu, C. H., et al. Ca 2+ -dependent metarhodopsin inactivation mediated by calmodulin and NINAC myosin III. Neuron. 59 (5), 778-789 (2008).
  24. Cook, B., et al. Phospholipase C and termination of G-protein-mediated signalling in vivo. Nat. Cell Biol. 2 (5), 296-301 (2000).
  25. Hardie, R. C., Franze, K. Photomechanical responses in Drosophila photoreceptors. Science. 338 (6104), 260-263 (2012).
  26. Huang, J., et al. Activation of TRP channels by protons and phosphoinositide depletion in Drosophila photoreceptors. Curr. Biol. 20 (3), 189-197 (2010).
  27. Minke, B., Wu, C. F., Pak, W. L. Isolation of light-induce response of the central retinular cells from the electroretinogram of Drosophila. J. Comp. Physiol. 98, 345-355 (1975).
  28. Hardie, R. C., Minke, B. The trp gene is essential for a light-activated Ca2+ channel in Drosophila photoreceptors. Neuron. 8, 643-651 (1992).
  29. Niemeyer, B. A., Suzuki, E., Scott, K., Jalink, K., Zuker, C. S. The Drosophila light-activated conductance is composed of the two channels TRP and TRPL. Cell. 85 (5), 651-659 (1996).
  30. Huber, A., et al. The transient receptor potential protein (Trp), a putative store- operated Ca 2+ channel essential for phosphoinositide-mediated photoreception, forms a signaling complex with NorpA, InaC and InaD. EMBO J. 15 (24), 7036-7045 (1996).
  31. Shieh, B. H., Niemeyer, B. A novel protein encoded by the InaD gene regulates recovery of visual transduction in Drosophila. Neuron. 14 (1), 201-210 (1995).
  32. Tsunoda, S., et al. A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade. Nature. 388 (6639), 243-249 (1997).
  33. Tsacopoulos, M., Veuthey, A. L., Saravelos, S. G., Perrottet, P., Tsoupras, G. Glial cells transform glucose to alanine, which fuels the neurons in the honeybee retina. J. Neurosci. 14 (3 Pt 1), 1339-1351 (1994).
  34. Hardie, R. C., Minke, B. Spontaneous activation of light-sensitive channels in Drosophila photoreceptors. J. Gen. Physiol. 103, 389-407 (1994).
  35. Agam, K., et al. Metabolic stress reversibly activates the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL in vivo. J Neurosci. 20 (15), 5748-5755 (2000).
  36. Agam, K., Frechter, S., Minke, B. Activation of the Drosophila TRP and TRPL channels requires both Ca2+ and protein dephosphorylation. Cell Calcium. 35 (2), 87-105 (2004).
  37. Delgado, R., Muñoz, Y., Peña-Cortés, H., Giavalisco, P., Bacigalupo, J. Diacylglycerol activates the light-dependent channel TRP in the photosensitive microvilli of Drosophila melanogaster photoreceptors. J Neurosci. 34 (19), 6679-6686 (2014).
  38. Parnas, M., Katz, B., Minke, B. Open channel block by Ca2+ underlies the voltage dependence of Drosophila TRPL channel. J. Gen. Physiol. 129 (1), 17-28 (2007).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Pr dy indukowane wiat emkana y TRPsekcja siatk wkipipeta do patch clamprejestracja elektrofizjologicznaizolacja ommatidi wzewn trzny roztw r ES wolny od wapniabarwnik Lucifer Yellow

Powiązane artykuły