Artykuł metodologiczny

Metoda elektrofizjologiczna dla zapisów cęgów napięcia w całej komórce z fotoreceptorów Drosophila

17K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55627

⸱

13 czerwca 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Neurobiology, Faculty of Medicine and the Edmond and Lily Safra Center for Brain Sciences (ELSC), Hebrew University, 2Department of Physiology, Development and Neuroscience, University of Cambridge

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Zapisy całokomórkowe z fotoreceptorów Drosophila melanogaster umożliwiają pomiar spontanicznych ciemnych guzków, wybrzuszeń kwantowych, makroskopowych reakcji na światło i zależności prąd-napięcie w różnych warunkach. W połączeniu z narzędziami manipulacji genetycznej D. melanogaster, metoda ta umożliwia badanie wszechobecnego szlaku sygnałowego inozytol-lipid i jego celu, czyli kanału TRP.

Streszczenie

Zapisy cęgów napięcia całej komórki z fotoreceptorów Drosophila melanogaster zrewolucjonizowały dziedzinę transdukcji wzrokowej u bezkręgowców, umożliwiając wykorzystanie genetyki molekularnej D. melanogaster do badania sygnalizacji inozytolowo-lipidowej i kanałów Przejściowego Potencjału Receptora (TRP) na poziomie pojedynczej cząsteczki. Kilka laboratoriów opanowało tę potężną technikę, która umożliwia analizę fizjologicznych reakcji na światło w ściśle kontrolowanych warunkach. Technika ta umożliwia kontrolę nad pożywkami wewnątrzkomórkowymi i zewnątrzkomórkowymi; napięcie membrany; oraz szybkie stosowanie związków farmakologicznych, takich jak różne wskaźniki jonowe lub pH, do pożywek wewnątrz- i zewnątrzkomórkowych. Dzięki wyjątkowo wysokiemu stosunkowi sygnału do szumu, metoda ta umożliwia pomiar ciemnych prądów jednostkowych spontanicznych i indukowanych światłem (tj. spontanicznych i kwantowych wybrzuszeń) oraz makroskopowych prądów indukowanych światłem (LIC) z pojedynczych fotoreceptorów D. melanogaster. Protokół ten bardzo szczegółowo określa wszystkie kluczowe kroki niezbędne do wykonania tej techniki, która obejmuje zarówno zapisy elektrofizjologiczne, jak i optyczne. Opisano procedurę preparowania siatkówki muchy w celu uzyskania nienaruszonej i żywotnej ommatydii izolowanej ex vivo w komorze kąpielowej. Szczegółowo opisano również sprzęt potrzebny do wykonywania pomiarów obrazowania całych komórek i fluorescencji. Na koniec wyjaśnione są pułapki związane ze stosowaniem tego delikatnego preparatu podczas dłuższych eksperymentów.

Wprowadzenie

Szeroko zakrojone badania genetyczne muszki owocowej, Drosophila melanogaster (D. melanogaster), rozpoczęte ponad 100 lat temu, ustaliły, że mucha D. melanogaster jest niezwykle użytecznym modelem eksperymentalnym do genetycznej analizy złożonych procesów biologicznych. Opisana poniżej metodologia łączy skumulowaną moc genetyki molekularnej D. melanogaster z wysokim stosunkiem sygnału do szumu w nagraniach z użyciem klamer krosowych całych komórek. Połączenie to pozwala na badanie fototransdukcji D. melanogaster jako modelu sygnalizacji inozytolowo-lipidowej oraz regulacji i aktywacji kanału TRP, zarówno w środowisku natywnym, jak i przy najwyższej rozdzielczości pojedynczych cząsteczek.

Zastosowanie metody zapisu całej komórki do fotoreceptorów D. melanogaster zrewolucjonizowało badania nad fototransdukcją u bezkręgowców. Metoda ta została opracowana przez Hardie1 i niezależnie przez Ranganathana i współpracowników2 ~26 lat temu i została zaprojektowana w celu wykorzystania obszernych narzędzi manipulacji genetycznej D. melanogaster i wykorzystania ich do odkrycia mechanizmów fototransdukcji i sygnalizacji inozytolowo-lipidowej. Początkowo technika ta cierpiała z powodu szybkiego zmniejszenia wrażliwości na światło i niskiej wydajności ommatidiów podczas procesu sekcji, co uniemożliwiało przeprowadzenie szczegółowych badań ilościowych. Później dodanie ATP i NAD do pipety punktowej znacznie zwiększyło przydatność preparatu do długotrwałych zapisów ilościowych. Następnie przeprowadzono obszerną charakterystykę mechanizmu transdukcji sygnału na poziomie molekularnym.

Obecnie, fototransdukcja D. melanogaster jest jednym z niewielu systemów, w których sygnalizacja fosfoinozytydu i kanały TRP mogą być badane ex vivo w rozdzielczości pojedynczej cząsteczki. To sprawia, że fototransdukcja D. melanogaster i metodologia opracowana do badania tego mechanizmu są bardzo czułym systemem modelowym. Protokół ten opisuje, jak wypreparować siatkówkę D. melanogaster i mechanicznie usunąć izolowaną ommatydię z otaczających komórek barwnikowych (glejowych). Umożliwia to utworzenie giga-seal i klamry krosowej całej komórki na ciałach komórek fotoreceptorów. Na szczęście większość białek sygnałowych jest ograniczona do rabdomeru i nie ulega dyfuzji. Ponadto istnieje nieruchomy bufor Ca2+ o nazwie kalfotyna, znajdujący się między przedziałem sygnalizacyjnym a ciałem komórki3,4, oraz wysoki poziom ekspresji wymiennika Na+/Ca2+ (CalX) w microvilli5. Łącznie uwięzienie białek w rabdomerze, buforze kalfotyny i wysoka ekspresja CalX pozwalają na stosunkowo wydłużone (tj. do ~20 min) zapisy całych komórek, bez utraty istotnych składników procesu fototransdukcji i przy zachowaniu wysokiej wrażliwości na światło. Poniższy protokół opisuje, w jaki sposób uzyskać izolowaną ommatydię i wykonać zapisy całych komórek, które wydają się zachowywać natywne właściwości kaskady fototransdukcji. Eksperymenty z klamrą całokomórkową na zdysocjowanym karaluchu (Periplaneta americana)6 i świerszczu (Gryllus bimaculatus)7 ommatidia przeprowadzono podobnie jak opisano dla D. melanogaster. Ponadto, eksperymenty z klamrą łatową na zdysocjowanych fotoreceptorach małża (scabra) i przegrzebka (Pecten irradians) zostały przeprowadzone w nieco inny sposób niż te przeprowadzone na D. melanogaster, umożliwiając zarówno pomiary całokomórkowe8, jak i jednokanałowe9. W tym miejscu opisano główne osiągnięcia uzyskane u D. melanogaster przy użyciu tej techniki. Dyskusja zawiera opis niektórych pułapek i ograniczeń tej techniki.

Protokół

1. Przygotowanie odczynników

UWAGA: Wszystkie roztwory należy przygotować zgodnie z instrukcjami zawartymi w Tabelach 1-4.

  1. Napełnić strzykawkę o pojemności 10 mL roztworem zewnątrzkomórkowym (ES lub ES-0Ca)2+; zgodnie z potrzebą; patrz Tabela 1) i przechowywać w lodu.
  2. Przygotuj jedną fiolkę roztworu do tryturacji (TS; patrz Tabela 2; t. j. ES lub ES-0Ca2+ + FBS i sacharoza) i przechowywać na lodzie.
  3. Przygotować odpowiednią ilość ES do eksperymentu i przechowywać w lodzie do momentu użycia.
    UWAGA: Ciągła perfuzja kąpieli nie jest wymagana, zatem objętość ES nie musi przekraczać kilkudziesięciu ml.
  4. Używając 22 µm filtr PVDF, nanieś roztwór wewnątrzkomórkowy (patrz Tabela 3 lub Tabela 4) do strzykawki o pojemności 1 ml z wydłużoną końcówką do napełniania elektrod. Przechowywać w lodzie.

2. Ogólne przygotowanie narzędzi do sekcji

Konfiguracja do mikroiniekcji laboratoryjnych: pipety, narzędzia, mikroskop stereoskopowy, sprzęt do zadań precyzyjnych.
Rysunek 1: Narzędzia i urządzenia potrzebne do przygotowania izolowanych ommatidii. Na zdjęciach przedstawiono poszczególne urządzenia niezbędne do przygotowania izolowanych ommatidiów, zgodnie z opisem w powyższym szczegółowym protokole. Dwa zlewki, jeden wypełniony wodą (A) i drugiej wypełnionej etanolem (B) do czyszczenia pipet miarowych (D), które są połączone z przewodami (C). Narzędzia do sekcji obejmują: 2 pary pęset precyzyjnych i 1 parę pęsety grubszą (F) oraz łyżeczka do siatkówki (E). W celu przygotowania łyżki do usuwania siatkówki należy użyć igły do mikrodysekcji (H) zostaje dociśnięte między dwoma narzędziami tokarskimi pełniącymi funkcję imadła (G) aby spłaszczyć górną część igły (I). Następnie zostaje on połączony z wydłużonym elementem metalowym za pomocą kleju (J) i zamocowany na uchwycie do igieł (E). Odłamek i uchwyt ostrza brzytwy: Odłam i zamocuj niewielki trójkątny fragment ostrza brzytwy, używając uchwytu do ostrzy brzytwy (K). Obszar roboczy do sekcji składa się ze stereomikroskopu (L) oraz chłodne czerwone źródło światła ((M),) z dwoma światłowodami (N). Narzędzia do sekcji, w tym pęsety (F), łyżka do siatkówki (E), zlewki (A i B), latarka z czerwonym filtrem (Q), oraz delikatnych ściereczek (R) zostają umieszczone po obu stronach mikroskopu binokularnego. Wiadro z lodem z ES, FBS-ES, strzykawkami z roztworem wewnątrzkomórkowym oraz szalką Petriego o średnicy 60 mm (S), a także uchwyt elektrody (P) zostają również umieszczone na stole. Elektrody rejestrujące są wysuwane za pomocą poziomego wysuwacza (T). Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Zbuduj łyżeczkę do siatkówki w celu wyizolowania siatkówek.
    1. Wprowadź końcówkę (1–4 mm) igły do mikrosekcji (igła entomologiczna, długość 12 mm, średnica 0,1 mm) pomiędzy dwa szczęki imadła i spłaszcz ją, uderzając małym młotkiem.
    2. Zamocuj spłaszczoną igłę w uchwycie do mikroigieł sekcyjnych (patrz na Tabela materiałów).
    3. Używając pęsety, wygnij spłaszczony koniec igły, aby utworzyć haczyk o krzywiźnie około 2,5 mm.
  2. Przygotowanie pipet do tryturacji w celu separacji ommatidiów.
    1. Umieść szklaną kapilarę o wymiarach 1,2 x 0,68 mm (średnica zewnętrzna x wewnętrzna) nad otwartym płomieniem i poddaj ją wypalaniu w celu zwężenia otworu.
    2. Zmierz pod mikroskopem wielkość otworu kapilary. Podziel przygotowane pipety do trituracji ommatidiów na siedem grup, zgodnie z wielkością ich otworów (t. j. 0,2-0,5 mm). Przechowywać je w oddzielnych, odpowiednich pojemnikach (np. probówki).
    3. Napełnij jeden mały zlew z wodą dwukrotnie destylowaną (DDW), a drugi mały zlew etanolem 70%. Przykryj każdy zlew arkuszem folii parafinowej.
    4. Wykonaj jeden mały otwór w arkuszu folii parafinowej pokrywającej zlewkę z DDW (patrz Rysunek 1A).
    5. Wykonaj siedem małych otworów w arkuszu folii parafinowej pokrywającej zlewkę z etanolem i ponumeruj otwory od 0 do 6 (patrz Rycina 1B).
    6. Umieść jedną pipetę do tryturacji ommatidiów z każdej grupy rozmiarów w każdym otworze w folii parafinowej, tak aby pipeta z największym otworem znajdowała się w 0th otwór, a pipeta z najmniejszym otworem znajduje się w 6th otwór
    7. Podłączyć plastikowy 200 µL końcówkę pipety do kawałka rurki polietylenowej o długości 35 cm i wymiarach 1,57 x 1,14 mm (średnica zewnętrzna x średnica wewnętrzna). Drugi koniec rurki należy połączyć z jedną z pipet do trituracji ommatidiów o największym otworze (t. j. 0,46–0,5 mm), upewniając się, że zaostrzony koniec pipety do homogenizacji nie jest skierowany do wnętrza rurki.
  3. Przygotować pipety do rejestracji z całej komórki (whole-cell recording), wyciągając pipety do patch-clampu z włókna borokrzemianowego o wymiarach 1 x 0,58 mm (średnica zewnętrzna x średnica wewnętrzna) zawierającego kapilary szklane.
    UWAGA: Rezystancja pipet powinna wynosić 8–15 MΩ przy zastosowaniu wewnątrzkomórkowego roztworu opartego na glukonianie potasu (IS1). Można użyć dowolnego odpowiedniego wyciągacza pipet do patch-clampu (przykłady znajdują się w części Tabela materiałów). Wypalanie krawędzi nie jest konieczne.
  4. Przygotuj komorę rejestracyjną (patrz Rysunek 2) poprzez przymocowanie szkiełka nakrywki (patrz) Tabela materiałów) do dna komory kąpieli, używając roztopionej parafiny lub wysokopróżniowego smaru silikonowego. Należy użyć dowolnej odpowiedniej komory, wykonanej samodzielnie lub zakupionej komercyjnie, która umożliwia dostęp do elektrod oraz perfuzję.
  5. Zamocuj komorę na stole mikroskopu odwróconego. Umieść rurkę systemu perfuzyjnego, system ssący oraz uziemienie (t. j. drut/pelet Ag-AgCl) w kąpieli (patrz na Tabela materiałów i Rysunek 2).
  6. Umieść dwie pary precyzyjnych pęset nr 5 (Rycina 1) na powierzchni roboczej do wykorzystania podczas etapów dyssekcji siatkówki oraz izolacji ommatidiów.

3. Hodowla D. melanogaster

  1. Podnieść D. melanogaster muchy przy niskiej gęstości populacji (t. j. ~20 much w butelce o pojemności 6 uncji) w butelkach zawierających standardową pożywkę kukurydzianą w temperaturze 19-24 °C.
    UWAGA: Zaleca się pracę na muchach zaadaptowanych do ciemności. W celu utrzymania wysokiej wrażliwości na światło należy ograniczyć różnorodność i zapobiegać degeneracji siatkówki u much mutantów.
  2. Przechowywać muchy w ciemności przez co najmniej 24 h przed rozpoczęciem eksperymentu.
    UWAGA: Muchy wykorzystywane w eksperymentach powinny być niedawno wyklute (<2 h) i są nadal miękkie, blade oraz wykazują obecność mekonium. Ommatidia można również łatwo przygotować z pociorek, choć ich wrażliwość na światło jest wtedy silnie zależna od wieku10.

4. Disekcja siatkówki i izolacja ommatidiów: Opcja 1

UWAGA: Wszystkie poniższe kroki należy wykonać pod stereomikroskopem z odpowiednim powiększeniem, umożliwiającym prawidłową obserwację preparatu (patrz Rysunek 1).

  1. Nanieś cztery krople roztworu ES-0Ca2+ oraz jedną kroplę roztworu TS na odwróconą płytkę Petriego o średnicy 60 mm.
  2. Używając grubych pęset, chwyć nowo wykluwaną muchę (<2 h po wykluciu) za skrzydła lub ciało. Od tego momentu wszystkie procedury należy wykonywać szybko, przy słabym czerwonym oświetleniu w temperaturze 20 ±1 °C.
  3. Trzymając muchę grubą pęsetą, użyj pierwszej pary pęset precyzyjnych, aby oddzielić głowę muchy od ciała. Zanurz głowę w pierwszej kropli ES-0Ca2+.
  4. Przeciąć głowę na pół wzdłuż płaszczyzny strzałkowej, używając drugiej pary pęset precyzyjnych. Upewnij się, że po zakończeniu tego etapu oba oczy pozostały nienaruszone.
  5. Przenieś jedną połowę głowy do drugiej kropli ES-0Ca2+, a drugą połowę do trzeciej kropli ES-0Ca2+.
  6. Za pomocą pęsety precyzyjnej usuń jak najwięcej tkanki otaczającej oko, dbając o to, aby nie uszkodzić siatkówki.
  7. Mocno chwyć krawędź jednej rogówki pęsetą precyzyjną i wybierz siatkówkę za pomocą łyżeczki (scooper).
    UWAGA: Po zakończeniu tego kroku rogówka pozostanie pusta i nienaruszona, oddzielona od nienaruszonej siatkówki.
  8. Wypłucz pipetę do trituracji połączoną z rurką wodą DDW i napełnij ją niewielką ilością ES-0Ca2+ z czwartej kropli.
    UWAGA: Krok ten musi być wykonywany za każdym razem, gdy używana jest nowa pipeta do separacji ommatidiów i zostaje ona wyjęta zlewki z etanolem (roztwór wypełniający pipetę powinien być taki sam jak roztwór, w którym zanurzona jest siatkówka).
  9. Delikatnie aspiruj ustami, aby wciągnąć wyizolowaną siatkówkę do pipety. Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie wciągnąć pęcherzyków powietrza do pipety.
  10. Przenieś wyizolowaną siatkówkę do kropli TS. Powtórz kroki 4.6-4.10 dla drugiego oka.
  11. Zetrzyj krople ES-0Ca2+ za pomocą delikatnych chusteczek, pozostawiając na płytce Petriego tylko kroplę TS zawierającą obie siatkówki. Dodaj sześć kolejnych kropli TS na górną stronę płytki Petriego. Przenieś obie siatkówki do jednej z pozostałych kropli TS.
  12. Zastąp pipetę do trituracji pipetą o mniejszej średnicy otworu. Wypłucz ją zgodnie z opisem w kroku 4.8, używając roztworu TS do napełnienia pipety.
  13. Szybko i wielokrotnie aspiruj i wydmuchuj obie siatkówki w roztworze, aby rozpocząć separację wyizolowanych ommatidiów pozbawionych komórek pigmentowych z całej siatkówki.
    UWAGA: Wyizolowane ommatidia są widoczne w kropli TS, a w miarę postępu procesu izolacji kropla TS staje się mniej przezroczysta.
  14. Przenieś pozostałe fragmenty siatkówki do następnej kropli TS. Napełnij pipetę całością poprzedniej kropli TS (zawierającej wyizolowane ommatidia) i wydmuchaj kroplę do komory kąpielowej.
  15. Powtórz kroki 4.12-4.14, aby uzyskać maksymalną liczbę wyizolowanych ommatidiów. Odczekaj około 1 min, aby wyizolowane ommatidia opadły i przywarły do dna komory kąpielowej.
  16. Za pomocą systemu perfuzyjnego rozpocznij przepływ ES-0Ca2+ z 1,5 mM Ca2+ do komory kąpielowej. Upewnij się, że komora jest całkowicie wypełniona roztworem, od dołu do góry, a dno jest całkowicie zanurzone w roztworze. Kontynuuj płukanie kąpieli 4-5 razy.

5. Disekcja siatkówki i izolacja ommatidiów: Opcja 2

Uwaga: Wszystkie poniższe kroki należy przeprowadzić pod stereomikroskopem, stosując powiększenie umożliwiające prawidłowy ogląd preparatu (patrz Rysunek 1).

  1. Przygotować odłamek żyletki oraz uchwyt. Odłamać i zamontować mały trójkątny fragment żyletki w uchwycie do żyletki (Rysunek 1).
  2. Przygotować silikonową płytkę/blok do sekcji zgodnie z instrukcją producenta (patrz Tabela materiałów).
  3. Do sekcji przygotować dużą kroplę (<0,5 mL) roztworu ES na silikonowym bloku sekcyjnym. Do szalki Petriego o średnicy 60 mm dodać dwie krople „rezerwuarowe” (~50 µL każda) roztworu TS.
  4. Unieruchomić świeżo wyklutą muchę (<2 h po wykluciu) w szklanej probówce na lodzie i chwycić ją za skrzydła za pomocą pęsety. Od tego momentu wszystkie procedury należy wykonywać szybko, przy słabym czerwonym oświetleniu w temperaturze 20 ±1 °C.
  5. Trzymając muchę pęsetą, odciąć głowę za pomocą zamontowanego w uchwycie odłamka żyletki. Chwycić pęsetą szpilkę entomologiczną (długość 12 mm, średnica 0,1 mm) i przebić głowę między oczami.
  6. Krótko zanurzyć głowę w 70% etanolu; zapobiega to tworzeniu się pęcherzyków powietrza na powierzchni głowy/oka. Przypiąć głowę szpilką pod kroplą ES na silikonowej płytce sekcyjnej.
  7. Odciąć oba oczy za pomocą odłamka żyletki, wykonując ruchy piłujące wzdłuż linii marginesu czołowego oka.
  8. Mocno chwycić krawędź jednej rogówki za pomocą pęsety precyzyjnej.
  9. Wyjąć siatkówkę za pomocą skrobaka.
    UWAGA: Po wykonaniu tego kroku rogówka pozostanie pusta i nienaruszona, oddzielona od nienaruszonej siatkówki.
  10. Bez uszkadzania siatkówki, za pomocą pęsety i skrobaka, delikatnie usunąć przylegające worki powietrzne oraz nadmiar tkanki mózgowej.
    UWAGA: Preparaty wyizolowanych siatkówek są przydatne również do analiz Western blot niespecyficznych białek siatkówki1, histologii całych preparatów oraz obrazowania całej siatkówki. Rejestrację patch-clamp można również przeprowadzać na fotoreceptorach z całej siatkówki12.
  11. Wziąć pipetę do tryturacji o największej średnicy, podłączyć ją do wężyka i napełnić pipetę niewielką ilością TS z jednej z kropli rezerwuarowych w szalce Petriego poprzez delikatne zassanie (tzn. ustami). Krok ten należy powtarzać przy każdym użyciu nowej pipety do tryturacji ommatidiów.
  12. Delikatnie wydmuchać TS na obie siatkówki ustami, a następnie zassać wyizolowane siatkówki do pipety, stosując delikatne ssanie. Należy zachować ostrożność, aby do pipety nie dostały się pęcherzyki powietrza.
  13. Przenieść wyizolowane siatkówki do szalki Petriego, tworząc małą kroplę (~20 µL), i przemyć je raz lub dwa razy roztworem TS z jednej z kropli rezerwuarowych.
  14. Inkubować siatkówki w ciemności przez 20-25 min.
  15. Zastąpić pipetę do tryturacji ommatidiów pipetą o mniejszej średnicy otworu (napełniając ją świeżym TS z jednej z kropli rezerwuarowych, analogicznie do kroku 4.6).
  16. Szybko zasysać i wydmuchiwać obie siatkówki w małej kropli (~20 µL), aby rozpocząć rozdzielanie wyizolowanych ommatidiów.
    UWAGA: W pierwszej fazie otaczająca pigmentowa glej powinna ulec rozpadowi, pozostawiając widoczne drobne resztki w roztworze.
  17. Po nagromadzeniu znacznej ilości drobnych resztek, ale przed rozdzieleniem wielu ommatidiów, użyć świeżego TS z jednej z kropli rezerwuarowych i przenieść siatkówki do nowej małej kropli.
  18. Wybrać pipetę do tryturacji o mniejszej średnicy, napełnić ją i kontynuować tryturację.
    UWAGA: W miarę jak ommatidia zaczynają się rozdzielać, ich wydłużone formy powinny być wyraźnie widoczne przy dużym powiększeniu stereomikroskopu. W razie potrzeby należy sukcesywnie zmieniać pipety do tryturacji na coraz mniejsze średnice, aż do uzyskania dobrej wydajności ommatidiów.
  19. Gdy widoczna będzie odpowiednia ilość ommatidiów, a kropla przestanie być przezroczysta, zassać pipetą całą kroplę z wyizolowanymi ommatidiami i delikatnie wydmuchać ją na dno komory kąpielowej uprzednio napełnionej roztworem ES.
  20. Odczekać około 1 min, aby wyizolowane ommatidia opadły i osiadły na dnie komory kąpielowej.
  21. Za pomocą systemu perfuzyjnego rozpocząć przepływ ES do komory kąpielowej. Upewnić się, że komora jest całkowicie wypełniona roztworem, od dołu do góry, a dno jest całkowicie zanurzone w roztworze. Kontynuować przemywanie kąpieli 4-5 razy.
    UWAGA: Następnie ciągła perfuzja nie jest wymagana, choć kąpiel należy krótko przepłukać przed wprowadzeniem nowej pipety do patch-clamp.

6. Rejestracja z całej komórki

Układ elektrofizjologiczny z mikroskopem i sprzętem elektronicznym do rejestracji sygnałów neuronowych.
Rysunek 2: Przegląd układu elektrofizjologicznego i optycznego. Układ zawiera żelazną, pomalowaną na czarno klatkę Faradaya (F). Przednią stronę zakryto czarną kurtyną z wbudowaną miedzianą siatką. Taka konfiguracja umożliwia całkowite odizolowanie preparatu od światła rozproszonego i jest odpowiednia do rejestracji ciemnych impulsów spontanicznych. Odwrócony mikroskop fluorescencyjny (A) jest przymocowany do stołu antywibracyjnego (E). Aparatura do rejestracji fotoreceptorów składa się z wykonanej własnym sumiałem komory kąpielowej z pleksiglasu (O) z wejściem perfuzyjnym (Q), pipetę automatyczną (S), oraz uziemienia srebrowo-chlorkowego (P). Komora kąpielowa jest zamocowana na stoliku mikroskopu (T) za pomocą własnoręcznie wykonowanego adaptera. Pipeta rejestrująca jest połączona za pomocą srebrno-chlorkowego drutu z uchwytem z akrylowego szkła, który z kolei jest podłączony do głowicy wzmacniacza (C). Następnie głowicę montuje się na grubościowym mikromanipulatorze, który z kolei jest osadzony na precyzyjnym mechanicznym mikromanipulatorze XYZ (B). System perfuzyjny (D) składa się z zestawu strzykawkowego, natomiast przepływ cieczy jest kontrolowany za pomocą zaworów zaciskowych (H). Stelaż jest elektrycznie połączony z tym samym centralnym uziemieniem, do którego podłączone są wszystkie urządzenia wewnątrz klatki Faradaya, i składa się z wzmacniacza patch-clamp (N), oscyloskop (J), generator impulsów/funkcji (K), przetwornik analogowo-cyfrowy (L), kontroler perfuzji (I), a sterownik koła filtrowego i migawki (M). Do eksperymentów obrazowania wykorzystano chłodzoną (-110 °C, patrz na Tabela materiałówKamera CCD jest podłączona przez port boczny (G). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

UWAGA: Podczas wszystkich poniższych etapów należy stosować wyłącznie słabe czerwone oświetlenie i zapewnić minimalną ekspozycję ommatidiów na światło (t. j. należy pracować szybko i wyłączać źródło światła do mikrodysekcji oraz czerwoną iluminację komory używaną do obserwacji ommatidiów podczas wykonywania czynności, które nie wymagają ich oglądania). Ponadto wszystkie poniższe kroki należy przeprowadzić zgodnie ze standardowym protokołem elektrofizjologicznym.

  1. Pod mikroskopem odwróconym (obiektyw 40X) dokładnie obejrzyj wszystkie ommatidia w kąpieli i wybierz odpowiednie ommatidium do eksperymentu.
    1. Należy upewnić się, że zewnętrzna błona ommatydium jest gładka i nieuszkodzona, a jej oś podłużna znajduje się w kącie zbliżonym do prostego względem kierunku podejścia elektrody (jak widać w Rycina 3A), oraz aby dystalna część ommatidium nie była otoczona żadną nadmiarową tkanką. Umieść wybrane ommatidium na osi optycznej obiektywu (w centrum pola widzenia), aby zapewnić jednorodne oświetlenie.
  2. Napełnić pipetę patchową roztworem wewnątrzkomórkowym (IS1 lub IS2).
    UWAGA: Do pomiaru odpowiedzi natężenia i analizy wybrzuszenia należy użyć IS1. Do pomiaru potencjału odwrócenia kanałów światłoczułych należy użyć IS2.
  3. Zamocuj pipetę do patch-clampu w uchwycie elektrody.
  4. Wdmuchnąć powietrze do pipety ustami, poprzez rurkę podłączoną do uchwytu elektrody, aby wypełnić ją pod ciśnieniem dodatnim. Zamknąć zawór rurki, aby utrzymać ciśnienie.
  5. Za pomocą mikromanipulatora wprowadź elektrodę do komory kąpielowej.
  6. Przesuń elektrodę w pobliże dystalnej części ommatidium, tak aby nie doszło do kontaktu między elektrodą a ommatidium, aż do momentu, gdy w ommatidium pojawi się niewielkie wgłębienie (wywołane dodatnim ciśnieniem w pipecie do patch-clampingu).
  7. Otwórz oprogramowanie do rejestracji (patrz na Tabela materiałów). Otwórz „moduł testowania błony” (membrane test module), aby przyłożyć ciągłe prostokątne impulsy napięcia o wartości 2 mV z częstotliwością 10 Hz.
  8. Ustaw potencjał złączowy na „zero”, regulując odpowiednie pokrętło w wzmacniaczu patch-clamp, tak aby poziom podstawowy impulsu prostokątnego odpowiadał prądowi równemu „zero”.
    UWAGA: Układ elektrofizjologiczny obejmuje moduł głowicowy (t. j. wzmocnienie pierwszego stopnia) podłączone do wzmacniacza (t. j. wzmocnienie drugiego stopnia). Wzmocniony sygnał analogowy jest przekształcany w sygnał cyfrowy za pomocą przetwornika A/C, który jest sterowany przez oprogramowanie zainstalowane na komputerze PC.
  9. Zwolnij nadciśnienie w pipecie, otwierając zawór rurki podłączonej do uchwytu elektrody. Delikatnie wytwórz podciśnienie w pipecie, zasysając powietrze z rurki, co doprowadzi do przylegnięcia pipety do błony komórkowej. Zamknij zawór rurki, aby utrzymać ciśnienie.
  10. Upewnij się, że oporność elektrody wyświetlana na ekranie komputera wzrosła do poziomu 100–150 MΩ. Zwolnij podciśnienie w pipecie, ręcznie otwierając zawór rurki podłączonej do uchwytu elektrody.
  11. Upewnij się, że rezystancja elektrody została zwiększona do co najmniej 1-2 GΩ.
    UWAGA: Na tym etapie utworzono uszczelnienie pomiędzy elektrodą a fotoreceptorem.
  12. Zniweluj prądy pojemnościowe pipety, regulując odpowiednie pokrętło w wzmacniaczu patch-clamp.
  13. Wytwórz szybkie, krótkie i silne impulsy podciśnienia w elektrodzie, zasysając ustami powietrze z rurki połączonej z uchwytem elektrody, aby „przebić się” do błony fotoreceptora i uzyskać konfigurację whole-cell. Alternatywnie można użyć przycisku „Zap”, aby przyłożyć krótkie, prostokątne impulsy elektryczne, zaczynając od czasu trwania 0,1 ms, lub zastosować kombinację obu tych metod.
    UWAGA: Uzyskanie konfiguracji całej komórki (whole-cell) objawia się gwałtownym wzrostem pojemności pipety (typowo ok. 60 pF dla fotoreceptora R1-6 typu dzikiego; pojemność wynosząca jedynie ok. 20 pF wskazuje na rejestrację z fotoreceptora R7; pojemność powyżej ok. 90 pF wskazuje na rejestrację z dwóch fotoreceptorów).
  14. Ustaw potencjał trzymający fotoreceptora na wymaganą wartość napięcia (zazwyczaj -70 mV), wykonując to ręcznie za pomocą odpowiedniego pokrętła w wzmacniaczu patch-clamp.
    UWAGA: Ten krok można przeprowadzić po uzyskaniu szczelnego połączenia (krok 6.1), a przed uzyskaniem konfiguracji whole-cell.
  15. Skompensuj prądy pojemnościowe oraz rezystancję szeregową (zmierzona wartość rezystancji szeregowej przekraczająca 25 MΩ wskazuje na zatkanie pipety elektrody) i, jeśli jest to wymagane (t. j. (w przypadku większych prądów) należy zastosować kompensację rezystancji szeregowej, korzystając z odpowiednich pokręteł w wzmacniaczu patch-clamp.
  16. Zamknąć czarną przednią kurtynę klatki Faradaya, aby uzyskać maksymalne zaciemnienie i izolację elektryczną.
  17. Rozpocznij proces rejestracji za pomocą oprogramowania i zastosuj bodźce świetlne i/lub substancje farmakologiczne zgodnie z wybraną procedurą eksperymentalną.

7. Równoczesne rejestracje metodą whole-cell i obrazowanie Ca2+

  1. W przypadku wskaźników Ca2+ kodowanych genetycznie, wyizoluj ommatidia zgodnie z powyższym opisem, wykorzystując muchy D. melanogaster wykazujące ekspresję GCaMP6f13. Do pomiaru fluorescencji użyj kamery CCD (patrz: Tabela materiałów) i upewnij się, że mikroskop jest wyposażony w odpowiednie filtry wzbudzenia i emisji oraz lustro dichroiczne (patrz: Tabela materiałów)4.
  2. W przypadku zastosowania egzogennego wskaźnika Ca2+ (Rysunek 4; patrz: Tabela materiałów), wyizoluj ommatidia zgodnie z powyższym opisem. Dodatkowo upewnij się, że roztwór w pipecie zawiera wskaźnik wapnia w stężeniu 20-10 µM.
  3. Użyj oprogramowania do obrazowania (patrz: Tabela materiałów), aby pozyskiwać obrazy z częstotliwością 40 Hz. Przeprowadź akwizycję obrazu podczas 10 s okresu ciemności, a następnie podczas intensywnej 2 s stymulacji światłem.
  4. Użyj oprogramowania do obrazowania i zdefiniuj obszar zainteresowania (ROI). Zmierz intensywność fluorescencji w ROI. Oblicz średnią fluorescencję w ciemności (FD) i odejmij ją od zapisów fluorescencji podczas stymulacji światłem (FL) (FL-FD). Znormalizuj te pomiary zgodnie z intensywnością fluorescencji na początku stymulacji światłem (FL0).

Wyniki

Opisana metoda umożliwiła dokładny zapis podstawowych prądów jednostkowych generujących spontaniczne i wywołane światłem kwantowe skoki (quantum bumps), które sumują się, tworząc makroskopową odpowiedź na światło w określonych warunkach. Pozwoliła ona również na porównanie much typu dzikiego z mutantami posiadającymi defekty w kluczowych cząsteczkach sygnałowych (Ryciny 3 i 5)14,15,16,17,18. Ponadto możliwość pomiaru potencjału odwrócenia w warunkach bi-jonowych ujawniła fundamentalne właściwości biofizyczne kanałów TRP i TRP-podobnych (TRPL)18,19. Umożliwiła ona także pomiar efektów substytucji aminokwasowych w regionie poru TRP, które zmodyfikowały jego przepuszczalność dla Ca2+20.

Odpowiedź na światło uzyskana za pomocą rejestracji metodą patch clamp w konfiguracji whole-cell zależy liniowo od natężenia światła w zakresie co najmniej 4 rzędów wielkości. Nie można było tego rozstrzygnąć, stosując ERG oraz metody rejestracji wewnątrzkomórkowej. W związku z tym seria odpowiedzi na krótkie błyski o rosnącym natężeniu oraz wykres funkcji odpowiedzi na natężenie wykazały ścisłą liniowość odpowiedzi na błysk wraz ze wzrostem natężenia światła. Ścisła liniowość utrzymuje się co najmniej do poziomu kilkuset pA, jednak kwestią sporną pozostaje, czy po tym progu następuje utrata liniowości, czy też utrata kontroli clampingu (Rysunek 6). Wyniki te sugerują, że makroskopowe odpowiedzi na światło są liniową sumą jednostkowych odpowiedzi na światło (t.j. quantum bumps).

Za pomocą pomiarów napięcia dobrze ustalono, że stymulacja słabym światłem indukuje dyskretne fluktuacje napięcia (t.j. kwantowe wypukłości, tzw. quantum bumps) u większości gatunków bezkręgowców. Kwantowe wypukłości u D. melanogaster wynikają z skoordynowanego otwarcia ok. 15 kanałów TRP i ok. 2 kanałów TRPL w szczycie wypukłości18. Każda wypukłość jest generowana przez absorpcję pojedynczego fotonu, podczas gdy odpowiedź makroskopowa na intensywniejsze światło jest sumą tych elementarnych odpowiedzi14,21. Wypukłości znacznie różnią się pod względem latencji, przebiegu czasowego i amplitudy, nawet gdy warunki stymulacji są identyczne. Generowanie wypukłości jest procesem stochastycznym opisanym statystyką Poissona, w którym każdy efektywnie zaabsorbowany foton wywołuje tylko jedną wypukłość. Relacja jeden foton – jedna wypukłość wymaga, aby każdy etap kaskady obejmował nie tylko wydajny mechanizm „włączania”, ale także równie skuteczny mechanizm „wyłączania”. Zaletą funkcjonalną jest stworzenie bardzo czułego licznika fotonów z szybką odpowiedzią przejściową, bardzo dobrze dostosowaną zarówno do czułości, jak i rozdzielczości czasowej wymaganej przez system wzrokowy. Konieczność istnienia wydajnego mechanizmu wyłączania ujawnia się, gdy albo aktywny fotopigment (t.j. metarhodopsyna, M), albo jego cel, Gqα, nie ulegają inaktywacji, co prowadzi do ciągłego generowania wypukłości długo po wyłączeniu światła (Rycina 3)15,2,23,24.

Wypukłość reprezentuje kooperatywną aktywność kanałów TRP/TRPL w mikrokosmkach. W związku z tym każda hipoteza dotycząca aktywacji kanałów powinna wyjaśniać również kooperatywną aktywację kanałów. Niedawno Hardie i współpracownicy wykazali, że światło wywołuje szybkie skurcze fotoreceptorów, co sugeruje, że kanały światłoczułe (TRP/TRPL) mogą być bramkowane mechanicznie25. Ta aktywacja mechaniczna, wraz z obserwowanymi protonami uwalnianymi podczas hydrolizy PIP2 zależnej od PLC, sprzyja otwieraniu kanałów TRP/TRPL i wyjaśnia kooperatywny charakter powstawania wypukłości26. Obecnie fotoreceptory D. melanogaster są jednym z niewielu systemów, w których sygnalizacja fosfoinozytidowa i kanały TRP mogą być badane in vivo, co czyni fototransdukcję u D. melanogaster oraz metodologię opracowaną do badania tego mechanizmu niezwykle wartościowym systemem modelowym.

Schematy odpowiedzi fotoreceptorów; elektrofizjologia, różne mutacje; porównanie aktywności synaptycznej.
Rysunek 3: inaCP209 oraz inaDP215 Mutanty ujawniają powolną terminację odpowiedzi makroskopowej na światło oraz pojedynczych skoków kwantowych. (APrezentowany jest preparat izolowanego ommatidium z pipetą patch wypełnioną fluorescencyjnym barwnikiem Lucifer Yellow CH (podbudzenie: 430 nm; emisja: 540 nm) podczas rejestracji w konfiguracji whole-cell. Należy zauważyć, że barwnik fluorescencyjny rozprzestrzenił się i oznakował ciało jednej komórki fotoreceptora oraz że ciała komórek fotoreceptorów są oddzielone od swoich wydłużonych aksonów, lecz wciąż zachowują żywotność. Preparat ten nadaje się do jednoczesnych rejestracji whole-cell i eksperymentów obrazowania.B-D) Górne panele: Odpowiedzi quantum bump w warunkach clampowania napięcia całej komórki na ciągłe słabe światło (otwarty pasek) w grupie WT, inaCP209i inaDP215 muchy mutanty. Obserwuje się powolne ustępowanie wybrzuszeń w inaCP209 i inaDP215 mutanty w stosunku do much typu dzikiego (WT). Wstawka poniżej przedstawia powiększony kształt pojedynczych wypukłości. Panele dolne: Znormalizowane makroskopowe odpowiedzi zarejestrowane metodą whole-cell w odpowiedzi na 50-msowy impuls świetlny (1,5 x 105 fotonów na sekundę) powyższych much typu dzikiego i mutantów. (E-G) Panele górne: Reakcje typu quantum bump przy zastosowaniu zaciskowego pomiaru napięcia w całej komórce w odpowiedzi na krótkie (1 ms), słabe światło wywołujące odpowiedzi jednofotonowe u osobników typu dzikiego, arr23i ninaCP235 muchy mutanty. Zwróć uwagę na szereg wybrzuszeń zaobserwowanych w arr23 i ninaCP235 much mutantów w odpowiedzi na absorpcję pojedynczego fotonu. Panele dolne: znormalizowane odpowiedzi w technice clampingu napięciowego całych komórek na impuls światła o czasie trwania 50 ms (1,5 x 104 fotony/s) w odpowiadających im mutantach. Należy zwrócić uwagę na powolne wygaszanie odpowiedzi makroskopowych zaobserwowanych w arr23 i ninaCP235 muchy mutanty w stosunku do typu dzikiego. Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Mikroskopia fluorescencyjna z rozdzielczością czasową WT w porównaniu z Cpn1% przy różnych czasach naświetlania; analiza emisji.
Rycina 4: Komórkowe Ca2+2+ Dynamika po indukowaniu sygnałem Ca2+2+ Napływ jest modyfikowany przez Calphotin.  Szereg czasowy obrazów fotoreceptorów typu dzikiego oraz Cpn1% muchy wykazujące fluorescencję Ca2+ wskaźnik podczas stymulacji światłem. Surowe obrazy intensywności przedstawiono z zastosowaniem kodowania kolorami sztucznymi (pasek = 10 µm; groty strzałek wskazują pipetę). Rycina przedrukowana za zgodą Weissa i wsp.4. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres elektrofizjologiczny zapisów prądów u much typu dzikiego w porównaniu do mutantów trp; protokół skoku napięcia.
Rysunek 5: Właściwości elektrofizjologiczne mutantów WT, trp i trpl. (ARejestracje metodą clampowania napięcia w całej komórce obrazujące skoki kwantowe w odpowiedzi na ciągłe słabe światło (otwarty pasek) w typie dzikim (WT) oraz w mutantach trpl302, oraz trpP343 muchy z mutacją null. Znacznie zredukowane amplitudy trpP343 obserwuje się wypukłości. Wstawka: Powiększone pojedyncze wypukłości kwantowe typu dzikiego i trpP343 przedstawiono muchy z mutantem null. (B) Rejestracje metodą clampowania napięcia w całej komórce w odpowiedzi na 3-sekundowy impuls światła u typu dzikiego i odpowiadających mu mutantów. Przejściowa odpowiedź stanu stacjonarnego trpP343 obserwuje się mutanty. Wstawka: Powiększone reakcje na światło typu WT i trpP343wykazano mutanty. (C) Rodzina nałożonych na siebie prądów indukowanych światłem powyższych szczepów much, wywołanych w odpowiedzi na 20 ms impuls światła, przy skokach napięcia o 3 mV, mierzonych w okolicy potencjału odwrócenia (EPrzegląd). (D) Histogram przedstawiający średnią wartość Erewizja typu dzikiego oraz różnych mutantów. Słupki błędów przedstawiają błąd standardowy średniej (S.E.M.). Potencjał odwrócenia (Erew.) typu WT znajduje się pomiędzy dodatnim Eprzegląd z trpl302, który wykazuje ekspresję wyłącznie TRP, oraz Eprzegląd z/zauważone przez/z obszaru/z zakresu trpP343 mutant null, który wykazuje ekspresję wyłącznie TRPL. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres odpowiedzi fotonowej wykazujący sumowanie liniowe, z prądem w pikoamperach oraz liczbą fotonów.
Rycina 6: Odpowiedź na błysk jest ściśle liniowa wraz ze wzrostem natężenia światła.
Seria odpowiedzi prądowych na krótkie błyski o rosnącym natężeniu światła oraz wykres zależności amplitudy szczytowej odpowiedzi świetlnej od rosnącego natężenia krótkich błysków światła. Zależność ta wykazuje ścisłą liniowość między odpowiedzią na błysk a rosnącym natężeniem światła. Ścisła liniowość ta utrzymuje się co najmniej do poziomu kilkuset pA, przy natężeniu światła obejmującym ponad 4 rzędy wielkości, podczas gdy kwestią dyskusyjną pozostaje, czy po tym zakresie następuje załamanie liniowości, czy też kontroli clampowania. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

pH7.15 (dostosować za pomocą NaOH)
OdczynnikStężenie (mM)
NaCl120
KCl5
MgCl24
TES10
Prolina25
Alanina5
Przechowywać w -20 °C.
Uwaga: Roztwór ten jest nominalnie wolny od Ca2+, ale nie dodano do niego buforów Ca2+, w związku z czym zawiera on około 5 - 10 µM śladowych ilości Ca2+. Roztwór zewnątrzkomórkowy (ES) = ES-0Ca2+ z dodatkiem 1.5 mM CaCl2, przygotowany poprzez dodanie CaCl2 z roztworu zapasowego o stężeniu 0.5 lub 1 M do ES-0Ca2+.

Tabela 1: Pozakomórkowy roztwór (ES) wolny od Ca+2.Opis chemiczny i konkretne ilości wymagane do przygotowania ES wolnego od Ca+2.

OdczynnikIlość
płytki surowicy bydlęcej15 ml
sacharoza1,5 g
Podzielić na 150 µL rozdzielić na aletikwoty w probówkach 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -20°C °C.
Roztwór do tryturacji (TS)Napełnić 1 fiolkę o pojemności 150 ml roztworem zapasowym przygotowanym z 1 350 ml ES lub ES-0Ca2+, aby dopasować go do roztworu używanego podczas sekcji.

Tabela 2: Surowica z płodu bydlęcego (FBS) + sacharoza - roztwór zapasowy. Opis chemiczny i konkretne ilości wymagane do przygotowania roztworu zapasowego surowicy z płodu bydlęcego (FBS) + sacharozy.

pH7,15 (skorygować za pomocą KOH)
OdczynnikStężenie (mM)
Gluconian potasu (Kglu)140
MgCl22
TES10
Sól magnezowa ATP (MgATP)4
Sól sodowa GTP (Na2GTP)0,4
Hydrat β-nikotynamidoadeninowych dinukleotydów (NAD)1
Przechowywać w temperaturze -20 °C.

Tabela 3: Roztwór wewnątrzkomórkowy (IS1). Opis chemiczny i konkretne ilości wymagane do przygotowania roztworu IS1, który jest stosowany głównie do pomiarów odpowiedzi intensywności oraz przesunięcia kwantowego (quantum bump).

pH7,15 (skorygować za pomocą CsOH)
OdczynnikStężenie (mM)
CsCl120
MgCl₂22
TES10
sól magnezowa ATP (MgATP)4
sód GTP (Na2GTP)0.4
β-Nikotynamidoadeninodynukleotyd hydrat (NAD)1
Chlorek tetraetyloamoniowy (TAE)15
Przechowywać w temperaturze -20 °C.

Tabela 4: Roztwór wewnątrzkomórkowy (IS2). Opis chemiczny i konkretne ilości niezbędne do przygotowania roztworu wewnątrzkomórkowego IS2, wykorzystywanego głównie do pomiarów potencjału odwrócenia prądu indukowanego światłem.

Dyskusja

Zastosowanie zapisów z całych komórek do fotoreceptorów D. melanogaster pozwoliło na odkrycie i funkcjonalne wyjaśnienie nowych białek sygnałowych, takich jak kanały TRP 27,28,29 i białko rusztowania INAD 30,31,32. Od czasu pierwszego wprowadzenia tej techniki, umożliwiła ona rozwiązanie długoterminowych podstawowych pytań dotyczących mechanizmu jonowego i zależności napięciowej odpowiedzi świetlnej. Stało się tak ze względu na przyznaną zdolność do dokładnej kontroli napięcia błony oraz zewnątrzkomórkowego i wewnątrzkomórkowego składu jonowego19,28.

Główną przeszkodą w technice zaciskania plastrów u D. melanogaster była kruchość izolowanego preparatu ommatidia. Szczegółowe badania wykazały, że integralność maszyn fototransdukcyjnych krytycznie zależy od ciągłego dostarczania ATP, zwłaszcza podczas ekspozycji na światło, co prowadzi do dużego zużycia ATP. Niestety, mechaniczne paskowanie komórek barwnikowych (tj. glejowych), które jest wymagane, aby dotrzeć do błony fotoreceptora za pomocą pipety z plastrem, eliminuje główne źródło metabolitów niezbędnych do produkcji ATP33. Zastosowanie egzogennego ATP do pipety rejestrującej tylko częściowo spełnia wymagania dotyczące dużych ilości ATP. Niedobór ATP prowadzi do spontanicznej aktywacji kanałów TRP i do dysocjacji maszynerii fototransdukcji od kanałów aktywowanych światłem, powodując duży wzrost komórkowego Ca2+ i zniesienie normalnej odpowiedzi na światło34,35. Ta sekwencja zdarzeń nie jest spowodowana uszkodzeniem fotoreceptorów przez procedurę sekcji, ale raczej zubożeniem komórek ATP. Aby zapobiec wystąpieniu tej sekwencji zdarzeń i utrzymać normalne reakcje świetlne, fotoreceptory nie powinny być wystawiane na intensywne światło, które zużywa duże ilości ATP. Ponadto, NAD musi być włączony do pipety rejestrującej, przypuszczalnie w celu ułatwienia produkcji ATP w mitochondriach18,36. W przypadku pomiarów spontanicznych i kwantowych wybrzuszeń powyższa trudność jest minimalna, ponieważ używane są tylko słabe światła. W praktyce stabilny zapis całej komórki może być utrzymany przez ~20-25 minut, chociaż istnieje tendencja do spowolnienia kinetyki odpowiedzi w tym okresie. Pojedynczy preparat zdysocjowanej ommatydii może zachować żywotność do 2 godzin.

Dodatkowym mankamentem izolowanego preparatu ommatidia jest niedostępność mikrokosmków, co przekłada się na brak dostępu kanałów TRP i TRPL do pipety rejestrującej, uniemożliwiając zapisy jednokanałowe. Korzystając z opracowanej przez siebie metody, Bacigalupo i jego współpracownikom udało się bezpośrednio zarejestrować jednokanałową aktywność rabdomeru37. Jednak ta aktywność kanału różni się od aktywności kanałów TRPL heterologicznie wyrażanych w komórkach hodowli tkankowej38 oraz od aktywności kanału TRP wynikającej z analizy szumu strzału uzyskanej z izolowanej ommatydii34. Przypuszczalnie procedura preparacji znacznie uszkodziła komórki fotoreceptorów podczas stosowania tej metody.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Eksperymentalna część tych badań była wspierana przez granty z amerykańsko-izraelskiej Bi National Science Foundation (dla B.M. i I.L.), Izraelskiej Fundacji Naukowej (ISF), Deutsch-Israelische Projektkooperation (DIP) (do B.M.) oraz Rady ds. Badań nad Biotechnologią i Naukami Biologicznymi (numery grantów BBSRC: BB/M007006/1 i BB/D007585/1) dla R.C.H.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Strzykawka 10 ml
5 ml
1 ml z wydłużoną końcówką
Szalka60 mm
Filtry strzykawkoweMillex22 µ m Filtr PVDF 
Kapilary (do separacji omatidiów)Szkło, 1,2 x 0,68 mm (~7,5 cm każda)
Rurka polietylenowaBecton Dickinson1,57 x 1,14 mm (35 cm)
  2 małe zlewki50 ml lub mniej
2 arkusze folii parafinowejParafilm M~5 x 5 cm
Komora kąpielowadomowej roboty
Szkiełka22 x 22 mm Nr 0
Paraplast PlusSigmaParafina – mieszanina poliizobutylenuDo przyklejenia szkiełka nakrywkowego na dnie komory kąpielowej
ZiemiaInstrumenty Warnera 64-1288Zespół hybrydowy Zespół drutu Ag-AgCl
Bezgłowa igła do mikropreparacjiEntomologia, 12 mm
na igłę do mikropreparacji
Imadło
2 cienkie pęsety + 1 szorstka pęsetaDumont #5, Biologia 0,05 x 0,02 mm, długość 110 mm, Inox
Mikroskop stereoskopowy z zoomem NikonSMZ-2B
Źródło zimnego światłaSchottKL1500 Filtr LCD
(kolor) do źródła zimnego światłaSchottRG620
Delikatne wycieraczkiKimtechKimwipes
Uchwyt elektrodyWarner InstrumentsQSW-T10PQ series Uchwyty kompatybilne ze wzmacniaczami Axon, prosty styl korpusu
Srebrny drutWarner Instrumentso średnicy 0,25 mm, musi być chlorowany
MikromanipulatorSutter InstrumentsMP 85Mikromanipulator Huxley-Wall Style
Klatka Faradayadomowej robotyElektromagnetyczna osłona przed hałasem i kurtyna przednia
Stół antywibracyjnyNewportVW-3036-OPT-01
OsyloskopGWGOS-622G
System perfuzyjnyWarner InstrumentsVC-8PSystem sterowania zaworem zaciskowym
Sterownik zaworu perfuzyjnegoInstrumenty naukoweBPS-8
System ssący
WzmacniaczUrządzenie molekularneAxopatch-1D
Urządzenie molekularnestopnia głównegoCV - 4Wzmocnienie: x 1/100
A / D konwerterUrządzenie molekularneDigidata 1440A
ClampexMolecular Device10oprogramowanie
pCLAMPOprogramowanie Molecular Device10
Źródło światła (lampa ksenonowa)Sutter InstrumentsLambda LS
Detektor światładomowyfototranzystor
Koło filtrów i kontroler migawkiSutter InstrumentsLambda 10-2 z migawką
Filtry (filtr o naturalnej gęstości)Filtr Chroma6,5,4,3,2,1,0.5,0.3
(Kolor)SchottOG590, Filtr
Ksenonowa lampa błyskowa System lampDr. Rapp OptoElecftronicJML-C2
Światłowódkwarcowy 
Generator impulsówAMPIMaster 8
Mikroskop OlympusIX71, Filtr podświetlenia odwróconego
czerwonego (mikroskop)RG630 / RG645 ø Obiektyw mikroskopowy 45 mm
OlympusX60/0.9 UplanFL N air lub X60/1.25 UplanFI olejowa
kamera CCDiXon DU885K
Element Oprogramowanie NikonAR
Wskaźnik Ca+2InvitrogenCalcium green 5N
Filtry wzbudzenia i emisji oraz lustro dichroiczneChroma19002 - AT - GFP/FITC Zestaw
Pionowy ściągacz do pipetNarishige Model PP83Użyj ściągacza pionowego lub poziomego, zgodnie z preferencjami.
Ściągacz do pipetpoziomych Sutter Instrument Model P-1000 Płonący / brązowy ściągacz
FilamentSutter Instrument3 mm koryto lub kwadratowe pudełko
KapilaryAparat Harvardakapilary ze szkła borokrzemianowego1 x 0,58 mm
Strzykawka Strzykawka Petriego nakrywkowe Uchwyt Uniblitzkrawędziowylongpassówdo mikropipet

Bibliografia

  1. Hardie, R. C. Whole-cell recordings of the light induced current in dissociated Drosophila photoreceptors: evidence for feedback by calcium permeating the light-sensitive channels. Proc. R. Soc. Lond. B. 245, 203-210 (1991).
  2. Ranganathan, R., Harris, G. L., Stevens, C. F., Zuker, C. S. A Drosophila mutant defective in extracellular calcium- dependent photoreceptor deactivation and rapid desensitization. Nature. 354, 230-232 (1991).
  3. Martin, J. H., Benzer, S., Rudnicka, M., Miller, C. A. Calphotin: a Drosophila photoreceptor cell calcium-binding protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (4), 1531-1535 (1993).
  4. Weiss, S., et al. Compartmentalization and Ca2+ buffering are essential for prevention of light-induced retinal degeneration. J Neurosci. 32 (42), 14696-14708 (2012).
  5. Wang, T., et al. Light activation, adaptation, and cell survival functions of the Na + /Ca 2+ exchanger CalX. Neuron. 45 (3), 367-378 (2005).
  6. Weckstrom, M., Hardie, R. C., Laughlin, S. B. Voltage-activated potassium channels in blowfly photoreceptors and their role in light adaptation. J. Physiol. Lond. 440, (1991).
  7. Frolov, R. V., Immonen, E. V., Weckström, M. Performance of blue- and green-sensitive photoreceptors of the cricket Gryllus bimaculatus. J Comp Physiol A Neuroethol Sens Neural Behav Physiol. 200 (3), 209-219 (2014).
  8. Nasi, E. Whole-cell clamp of dissociated photoreceptors from the eye of Lima scabra. J Gen Physiol. 97 (1), 35-54 (1991).
  9. Nasi, E., Gomez, M. P. Light-activated ion channels in solitary photoreceptors of the scallop Pecten irradians. J. Gen. Physiol. 99, 747-769 (1992).
  10. Hardie, R. C., Peretz, A., Pollock, J. A., Minke, B. Ca 2+ limits the development of the light response in Drosophila photoreceptors. Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 252, 223-229 (1993).
  11. Kohn, E., et al. Functional Cooperation between the IP3 Receptor and Phospholipase C Secures the High Sensitivity to Light of Drosophila Photoreceptors In Vivo. J Neurosci. 35 (6), 2530-2546 (2015).
  12. Hevers, W., Hardie, R. C. Serotonin modulates the voltage dependence of delayed rectifier and Shaker potassium channels in Drosophila photoreceptors. Neuron. 14 (4), 845-856 (1995).
  13. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  14. Henderson, S. R., Reuss, H., Hardie, R. C. Single photon responses in Drosophila photoreceptors and their regulation by Ca 2. J. Physiol. Lond. 524 (Pt 1), 179-194 (2000).
  15. Scott, K., Zuker, C. S. Assembly of the Drosophila phototransduction cascade into a signalling complex shapes elementary responses. Nature. 395 (6704), 805-808 (1998).
  16. Elia, N., Frechter, S., Gedi, Y., Minke, B., Selinger, Z. Excess of G betae over G qalphae in vivo prevents dark, spontaneous activity of Drosophila photoreceptors. J. Cell Biol. 171 (3), 517-526 (2005).
  17. Katz, B., Minke, B. Phospholipase C-Mediated Suppression of Dark Noise Enables Single-Photon Detection in Drosophila Photoreceptors. J. Neurosci. 32 (8), 2722-2733 (2012).
  18. Hardie, R. C., et al. Molecular basis of amplification in Drosophila phototransduction. Roles for G protein, phospholipase C, and diacylglycerol kinase. Neuron. 36 (4), 689-701 (2002).
  19. Reuss, H., Mojet, M. H., Chyb, S., Hardie, R. C. In vivo analysis of the Drosophila light-sensitive channels, TRP and TRPL. Neuron. 19, 1249-1259 (1997).
  20. Liu, C. H., et al. In vivo identification and manipulation of the Ca 2+ selectivity filter in the Drosophila transient receptor potential channel. J. Neurosci. 27 (3), 604-615 (2007).
  21. Ahmad, S. T., Natochin, M., Barren, B., Artemyev, N. O., O'Tousa, J. E. Heterologous expression of bovine rhodopsin in Drosophila photoreceptor cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (9), 3722-3728 (2006).
  22. Scott, K., Sun, Y., Beckingham, K., Zuker, C. S. Calmodulin regulation of Drosophila light-activated channels and receptor function mediates termination of the light response in vivo. Cell. 91 (3), 375-383 (1997).
  23. Liu, C. H., et al. Ca 2+ -dependent metarhodopsin inactivation mediated by calmodulin and NINAC myosin III. Neuron. 59 (5), 778-789 (2008).
  24. Cook, B., et al. Phospholipase C and termination of G-protein-mediated signalling in vivo. Nat. Cell Biol. 2 (5), 296-301 (2000).
  25. Hardie, R. C., Franze, K. Photomechanical responses in Drosophila photoreceptors. Science. 338 (6104), 260-263 (2012).
  26. Huang, J., et al. Activation of TRP channels by protons and phosphoinositide depletion in Drosophila photoreceptors. Curr. Biol. 20 (3), 189-197 (2010).
  27. Minke, B., Wu, C. F., Pak, W. L. Isolation of light-induce response of the central retinular cells from the electroretinogram of Drosophila. J. Comp. Physiol. 98, 345-355 (1975).
  28. Hardie, R. C., Minke, B. The trp gene is essential for a light-activated Ca2+ channel in Drosophila photoreceptors. Neuron. 8, 643-651 (1992).
  29. Niemeyer, B. A., Suzuki, E., Scott, K., Jalink, K., Zuker, C. S. The Drosophila light-activated conductance is composed of the two channels TRP and TRPL. Cell. 85 (5), 651-659 (1996).
  30. Huber, A., et al. The transient receptor potential protein (Trp), a putative store- operated Ca 2+ channel essential for phosphoinositide-mediated photoreception, forms a signaling complex with NorpA, InaC and InaD. EMBO J. 15 (24), 7036-7045 (1996).
  31. Shieh, B. H., Niemeyer, B. A novel protein encoded by the InaD gene regulates recovery of visual transduction in Drosophila. Neuron. 14 (1), 201-210 (1995).
  32. Tsunoda, S., et al. A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade. Nature. 388 (6639), 243-249 (1997).
  33. Tsacopoulos, M., Veuthey, A. L., Saravelos, S. G., Perrottet, P., Tsoupras, G. Glial cells transform glucose to alanine, which fuels the neurons in the honeybee retina. J. Neurosci. 14 (3 Pt 1), 1339-1351 (1994).
  34. Hardie, R. C., Minke, B. Spontaneous activation of light-sensitive channels in Drosophila photoreceptors. J. Gen. Physiol. 103, 389-407 (1994).
  35. Agam, K., et al. Metabolic stress reversibly activates the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL in vivo. J Neurosci. 20 (15), 5748-5755 (2000).
  36. Agam, K., Frechter, S., Minke, B. Activation of the Drosophila TRP and TRPL channels requires both Ca2+ and protein dephosphorylation. Cell Calcium. 35 (2), 87-105 (2004).
  37. Delgado, R., Muñoz, Y., Peña-Cortés, H., Giavalisco, P., Bacigalupo, J. Diacylglycerol activates the light-dependent channel TRP in the photosensitive microvilli of Drosophila melanogaster photoreceptors. J Neurosci. 34 (19), 6679-6686 (2014).
  38. Parnas, M., Katz, B., Minke, B. Open channel block by Ca2+ underlies the voltage dependence of Drosophila TRPL channel. J. Gen. Physiol. 129 (1), 17-28 (2007).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Pr dy indukowane wiat emkana y TRPsekcja siatk wkipipeta do patch clamprejestracja elektrofizjologicznaizolacja ommatidi wzewn trzny roztw r ES wolny od wapniabarwnik Lucifer Yellow

Powiązane artykuły