Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

In Ovo Elektroporacja w słuchowym pniu mózgu kurczaka

8.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55628

⸱

9 czerwca 2017

 ,  , 
1Roxelyn and Richard Pepper Department of Communication Sciences and Disorders, Northwestern University, 2Knowles Hearing Research Center, Northwestern University, 3Department of Neurobiology, Northwestern University

W tym artykule

Podsumowanie

Neurony słuchowe pnia mózgu ptaków i ssaków są wyspecjalizowane w szybkim kodowaniu neuronalnym, podstawowym procesie dla normalnych funkcji słuchowych. Neurony te powstają z odrębnych prekursorów embrionalnego tyłomózgowia. Przedstawiamy techniki wykorzystujące elektroporację do ekspresji genów w tyłomózgowiu zarodków kurczaków w celu zbadania funkcji genów podczas rozwoju słuchowego.

Streszczenie

Elektroporacja to metoda, która wprowadza interesujące geny do biologicznie istotnych organizmów, takich jak zarodek kurczaka. Od dawna wiadomo, że zarodek kurczaka jest skutecznym modelem badawczym do badania podstawowych funkcji biologicznych rozwoju układu słuchowego. Ostatnio zarodek kurczaka stał się szczególnie cenny w badaniu ekspresji, regulacji i funkcji genów związanych ze słuchem. Elektroporacja in ovo może być stosowana do celowania w słuchowe obszary pnia mózgu odpowiedzialne za wysoce wyspecjalizowane funkcje słuchowe. Regiony te obejmują jądro wielkokomórkowe kurczaka (NM) i jądro blaszkowate (NL). Neurony NM i NL powstają z odrębnych prekursorów rombomerów 5 i 6 (R5 / R6). Tutaj prezentujemy elektroporację in ovo genów kodowanych plazmidem w celu zbadania właściwości związanych z genami w tych regionach. Pokazujemy metodę przestrzennej i czasowej kontroli ekspresji genów, która sprzyja wzrostowi lub utracie funkcjonalnych fenotypów. Celując w słuchowe neuronalne regiony progenitorowe związane z R5 / R6, pokazujemy transfekcję plazmidu w NM i NL. Czasową regulację ekspresji genów można osiągnąć poprzez przyjęcie systemu wektorów tet-on. Jest to procedura indukowana lekiem, która wyraża interesujące geny w obecności doksycykliny (Dox). Technika elektroporacji in ovo – wraz z testami biochemicznymi, farmakologicznymi i/lub funkcjonalnymi in vivo – zapewnia innowacyjne podejście do badania rozwoju neuronów słuchowych i związanych z tym zjawisk patofizjologicznych.

Wprowadzenie

Szybkie kodowanie neuronowe dźwięku jest niezbędne dla normalnych funkcji słuchowych. Obejmują one zdolności lokalizacji dźwięku1, mowę w hałasie, dyskryminację2, oraz rozumienie innych sygnałów komunikacyjnych istotnych dla zachowania3. Analogiczne neurony zlokalizowane w słuchowym pniu mózgu zarówno ptaków, jak i ssaków są wysoce wyspecjalizowane w szybkim kodowaniu neuronowym4. Należą do nich odpowiednio jądro magnocellularis (NM), jądro blaszkowate (NL) i ich analogi ssaków, przednio-brzuszne jądro ślimaka (AVCN) i przyśrodkowa górna oliwka (MSO), odpowiednio5. Jednak mechanizmy rozwojowe regulujące szybkie kodowanie neuronalne są słabo poznane w słuchowym pniu mózgu. Dlatego korzystne jest badanie konkretnych genów, które są odpowiedzialne za szybkie kodowanie neuronalne, aby lepiej zrozumieć ich ekspresję, regulację i funkcję w rozwoju słuchowym.

Rozwijający się zarodek kurczaka jest skutecznym i dobrze znanym narzędziem badawczym do badania podstawowych biologicznych zagadnień rozwoju układu słuchowego6,7. Ostatnie postępy molekularne pozwoliły odpowiedzieć na te pytania biologiczne w rozwijającym się zarodku kurczaka poprzez ekspresję lub obalanie genów będących przedmiotem zainteresowania w celu analizy funkcji genów in vivo8,9. Badanie regulacyjnej roli określonych genów jest znaczącym postępem w zrozumieniu patologii związanych z deficytami słuchowymi. Tutaj prezentujemy in ovo elektroporację genów kodowanych plazmidem do słuchowego pnia mózgu kurczaka, gdzie zachodzi szybkie neuronalne kodowanie dźwięku10. Celując w słuchowe neuronalne regiony progenitorowe związane z rombomerami 5 i 611,12 (R5/R6), pokazujemy kontrolę przestrzenną transfekcji plazmidu w NM i NL. Ponadto pokazujemy czasową regulację ekspresji poprzez przyjęcie systemu wektorów tet-on. Jest to procedura indukowana lekiem, która wyraża interesujące geny w obecności doksycykliny (Dox)8.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komitety ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Northwestern i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych.

1. Obchodzenie się z jajkami

  1. Kup zapłodnione jaja od lokalnego sprzedawcy. Jaja należy przechowywać w temperaturze 13 °C w lodówce nie dłużej niż 5 dni przed inkubacją. Żywotność zarodka znacznie spada po 1 tygodniu.
  2. Wymaz z każdego jajka 70% etanolu przed umieszczeniem w inkubatorze.
  3. Ustaw 1-2 tuziny jaj na boku w inkubatorze o temperaturze ustawionej na 38 °C przy wilgotności ~50%. Zapewnia to prawidłowe pozycjonowanie zarodka do elektroporacji i optymalną żywotność.
    UWAGA: Po 48-52 godzinach inkubacji jaja będą w fazie Hamburger-Hamilton (HH) ~12-13 i gotowe do elektroporacji.

2. Przygotowanie

  1. Mieszanie plazmidów
    1. Dodać 1 μl 0,1% fast green (0,1% w 18 MΩ dejonizowanego i destylowanego H2O [ddH2O]) na każde 7 μl mieszaniny DNA.
    2. W celu koelektroporacji wielu plazmidów należy wymieszać plazmidy w stosunku 1:1. Końcowe stężenie DNA powinno wynosić 5-8 μg/μL.
  2. Napełnij pipetę iniekcyjną
    1. Pociągnij pipety na ściągaczu do mikropipet. Napełnij pipetę plazmidami o pojemności 1-2 μl za pomocą igły strzykawkowej 28G.
    2. Rozbić końcówkę pipety na 10 - 20 μm za pomocą kleszczy. Użyj mikroskopu, aby pomóc w określeniu rozmiaru złamanej końcówki pipety. Przymocuj pipetę do uchwytu na pipety pikospritzera.

3. Okienka

UWAGA: Procedura okienkowania została opublikowana wcześniej13. Patrz odniesienie 13, aby uzyskać dodatkowe informacje wizualne.

  1. Przetrzyj wszystkie instrumenty i obszar roboczy 70% etanolem.
  2. Wyjmij żądaną liczbę załączonych jaj z inkubatora (między 6-10), pozostaw w temperaturze pokojowej i ponownie indywidualnie przetrzyj jajka 70% etanolem. Jaja zachowują żywotność przez co najmniej 2 godziny po wyjęciu z inkubatora.
  3. Umieść jajo na iluminatorze świetlnym, aby określić położenie zarodka. Zakreśl ołówkiem środek ciemnego obszaru (tj. zarodka).
  4. Za pomocą igły 19G zrób dziurę w końcu jajka.
  5. Zrób kolejny otwór w pobliżu narysowanego okręgu po spiczastej stronie jajka. Usuń mały kawałek zewnętrznej skorupki jajka (około 16 mm2) za pomocą igły 19G, a następnie usuń mały kawałek wewnętrznej skorupki jajka (około 8 mm2) za pomocą kleszczy.
  6. Za pomocą strzykawki o pojemności 3 ml wyposażonej w igłę 19G pobrać 1,5-2,5 ml albuminy z jaja przez otwór. Upewnij się, że igła jest ustawiona pod kątem 45°.
  7. Zakryj koniec otworu małym kawałkiem taśmy (1 cm x 1 cm). Zakryj narysowane koło i drugi otwór taśmą (2,5 cm x 4 cm).
  8. Zakrzywionymi nożyczkami (krawędź tnąca = 2,5 cm) wytnij okno w okręgu. Nożyczki powinny być równoległe do skorupki jajka, a średnica okna powinna być mniejsza niż 2 cm.

4. Wstrzyknięcie plazmidu

  1. Włącz pikospritzer. Ustaw ciśnienie na 18 psi, a czas trwania na 5 μs. Włącz zbiornik powietrza i lampę do mikroskopu preparacyjnego.
  2. Przygotować 30 ml roztworu podstawowego z rozcieńczonego w stosunku 1:10 indyjskiego atramentu zakupionego w sklepie zmieszanego ze sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS). Przechowywać w temperaturze 4 °C. Wstrzyknięcie indyjskiego atramentu jest ważnym krokiem w celu uzyskania lepszej wizualizacji zarodka kurczaka.
    1. Napełnij strzykawkę o pojemności 1 ml rozcieńczonym roztworem atramentu indyjskiego. Założyć igłę 27G i usunąć wszelkie pęcherzyki znajdujące się w strzykawce.
    2. Wbić igłę tuż pod błonę żółtka w odległości ~2 - 3 mm od zarodka i delikatnie wstrzyknąć ~0,2 ml tuszu indyjskiego pod zarodek. Nie należy wstrzykiwać więcej niż 0,5 ml tuszu indyjskiego, ponieważ może to zmniejszyć przeżywalność zarodków.
  3. Umieść jajko z okienkiem na uchwycie na jajka pod mikroskopem preparacyjnym. Użyj największego powiększenia, aby uzyskać najlepszą wizualizację miejsca wstrzyknięcia plazmidu.
  4. Za pomocą kleszczyków usunąć membranę z obszaru wstrzyknięcia. Słuchowe obszary pnia mózgu będące przedmiotem zainteresowania (tj. NM i NL) powstają z rombomerów 5 i 6 (R5/R6). R5 / R6 znajdują się w sąsiedztwie otocyst (struktura embrionalna u kręgowców, która rozwija się w ucho wewnętrzne), które służą jako punkty orientacyjne dla iniekcji plazmidu R5 / R6.
  5. Opuść pipetę wypełnioną DNA do rurki nerwowej leżącej nad regionem R5/R6 i między otocystami za pomocą mikromanipulatora. Schemat idealnego rozmieszczenia pokazano na rysunku 1A.
  6. Zastosuj ciśnienie powietrza (18 psi, czas trwania 5 μs) z pikospritzera, aby wyrzucić DNA z cewy neuronowej.

5. Elektroporacja

  1. Włączyć stymulator prądu/napięcia.
  2. Napełnij strzykawkę o pojemności 3 ml PBS i podłącz filtr strzykawkowy. Dodaj 1-2 krople PBS na zarodek.
  3. Opuść elektrodę bipolarną do zarodka za pomocą mikromanipulatora z elektrodą ujemną powyżej miejsca wstrzyknięcia (przyśrodkową), a elektrodą dodatnią bocznie do R5/R6 (ryc. 1A). Unikaj bezpośredniego kontaktu z zarodkiem. Używaj elektrod bipolarnych, w których materiałem elektrody jest platyna-iryd. Dostosuj odstęp między końcówkami do 0,5 mm za pomocą kleszczy.
  4. Za pomocą stymulatora prądu/napięcia pulsuj 20 razy przy napięciu 50 V przez 1 ms w odstępach 1 s.
  5. Po elektroporacji dodaj jedną kroplę PBS na odsłonięty obszar. Delikatnie wyjmij elektrodę i wyczyść ją chusteczką laboratoryjną i 70% etanolem. Zamknij okno, odsłaniając zarodek taśmą.
  6. Oznacz skorupkę jajka typem wstrzykniętego plazmidu i datą wylęgu.
  7. Umieść jaja z powrotem w inkubatorze oknem do góry. Inkubować w temperaturze 38 °C przy wilgotności 50%, aż do osiągnięcia pożądanego stadium rozwoju.
  8. Jeśli wektor tet-on jest elektroporowany w celu czasowej kontroli ekspresji genów, należy stosować doksycyklinę (Dox) co 24 godziny w celu wywołania ekspresji genu (patrz punkt 6).

6. Tet-on System do czasowej kontroli ekspresji genów

  1. Użyj następujących plazmidów:
    pCAGGS-T2TP: transpozaza eksprymująca plazmid.
    pT2K-CAGGS-rtTA-M2: plazmid, który stabilnie wyraża białko wiążące Dox.
    pT2K-BI-TRE-EGFP: plazmid, który zawiera dwukierunkową ekspresję reportera EGFP napędzającą tet-on promotor (TRE) i drugi gen będący przedmiotem zainteresowania.
    UWAGA: Powyższe trzy plazmidy muszą być współelektroporowane w stosunku 1:1:1.
  2. Przygotowanie roztworu podstawowego:
    1. Rozpuścić Dox w sterylnym PBS, aby otrzymać roztwór podstawowy o stężeniu 1 mg/ml. Przechowywać w temperaturze -20 °C.
  3. Aplikacja Dox:
    1. Aby wywołać ekspresję interesującego genu na określonych etapach rozwoju, należy stosować Dox co 24 godziny.
    2. Podczas aplikacji Dox należy wyjąć jajko, otworzyć okienko, odpipetować 50 μl Dox na błonę kosmomówczwo-alogonową, zamknąć okienko i włożyć jajko z powrotem do inkubatora.

7. Przygotowanie obszaru preparacyjnego dla wycinków pnia mózgu

UWAGA: Następujące sekcje (7 - 9) i procedury zostały opublikowane wcześniej14. Zapoznaj się z tymi odniesieniami, aby uzyskać dodatkowe informacje wizualne.

  1. Przygotować roztwór agaru (40 mg/ml agarozy, tj. 4% w ddH2O). Wlej roztwór agaru na szalkę Petriego i pozwól mu zestalić się w temperaturze pokojowej. Przechowuj przykrytą płytkę agarową w lodówce do wykorzystania w przyszłości podczas krojenia tkanki pnia mózgu.
  2. Ciągłe bąbelkowanie sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (ACSF) o zawartości 95%O2 i 5% CO2 (pH 7,2-7,4 i osmolarność: 295-310 mOsm/L).
  3. Oczyść obszar roboczy i wibratom 70% EtOH i opłucz ostrze wodą destylowaną.
  4. Umieść czystą podkładkę absorpcyjną płynów na obszarze roboczym za pomocą odpowiednich narzędzi preparacyjnych.
  5. Wyjmij płytkę agarową z lodówki, pokrój małą kostkę agarową (10 mm x 10 mm x 8 mm). Przyklej blok agaru do etapu komory krojenia wibratomu za pomocą dostępnego w handlu kleju superglue.

8. Izolacja słuchowego pnia mózgu kurczaka

  1. Otwórz jajko w miejscu zaklejonym taśmą okna. Nakłuć worek błonowy skalpelem i usunąć głowę zarodka kurczaka.
  2. Odetnij głowę kurczaka ostrymi nożyczkami.
  3. Umieść końcówkę żyletki nieco z tyłu od oczu. Naciąć czaszkę na linii środkowej rostralno-ogonowej. Zastosuj lekki nacisk w zależności od wieku zarodka. Starsze zarodki wymagają większego nacisku.
  4. Delikatnie odsuń na bok skórę i pióra, aby odsłonić czaszkę i sprawdzić cięcie w linii środkowej.
  5. Wywierając silny nacisk, przetnij rostralną część czaszki żyletką. Natychmiast umieść ostrze z tyłu oczu i przetnij całą czaszkę i tkankę mózgową.
  6. Wykonaj nacięcia od środkowej do bocznej nożyczkami w okolicy ogonowej czaszki, nieco przed mięśniami szyi po obu stronach głowy. Odsłoń mózg i móżdżek, odciągając czaszkę i nadmiar tkanki.
  7. Przetnij nożyczkami tkankę przyczepioną do pnia mózgu i usuń pień mózgu, który swobodnie odrywa się od czaszki.

9. Przygotowanie wycinków pnia mózgu do elektrofizjologii in vivo lub obrazowania

  1. Przypnij pień mózgu przez tektę optyczną.
  2. Usuń móżdżek, przecinając szypułki nożyczkami, odsłaniając podłogę czwartej komory.
  3. Za pomocą pęsety usuń wszelkie błoniaste tkanki i naczynia krwionośne z powierzchni pnia mózgu.
  4. Aby zablokować pień mózgu, wykonaj poziome cięcie na najbardziej rostralnym końcu podłogi czwartej komory, tuż doogonowo do kory. Wykonuj boczne nacięcia prostopadle przez tektę optyczną, aby odizolować pień mózgu.
  5. Umieść niewielką ilość super kleju na stoliku wibratomu bezpośrednio przed blokiem agaru.
  6. Podnieś pień mózgu przy rdzeniu kręgowym za pomocą pęsety i umieść go na super kleju stroną rostralną do dołu i stroną grzbietową w kierunku ostrza wibratomowego. Usuń nadmiar kleju za pomocą chusteczki laboratoryjnej lub bibuły filtracyjnej.
  7. Wlej natleniony ACSF do etapu wibratomowego. Ustaw ostrze wibratomu pod kątem 20-22°. Rozpocznij wibratomium przy oscylacji o maksymalnej amplitudzie. Przesuń stolik w górę w kierunku ostrza, tak aby górna część tkanki była równoległa do ostrza.
  8. Szybko przesuń ostrze w kierunku tkanki pnia mózgu. Znacznie zwolnij ostrze przed kontaktem ostrza z tkanką.
  9. Pokrój tkankę z najmniejszą możliwą prędkością do przodu. Gdy ostrze znajdzie się w całym przekroju tkanki koronalnej, delikatnie usuń plasterek za pomocą pipety transferowej.
  10. Obniż stopień o 200-300 μm i ponownie pokrój. Powtarzać tę czynność, aż staną się widoczne anatomiczne punkty orientacyjne jąder słuchowych, np. wyraźny grzbietowy/brzuszny obszar neuropilowy NL i przyśrodkowe położenie NM względem NL.
  11. Ostrożnie utrzymuj plasterki w ACFS. Można to zrobić w temperaturze pokojowej (22° C) lub zbliżonej do fizjologicznych (~41° C) przy użyciu ciepłej kąpieli wodnej. Zwróć uwagę na kolejność krojenia. Pierwszy wycinek odpowiada najbardziej ogonowemu obszarowi tkanki, a ostatni plasterek odpowiada najbardziej rostralnemu obszarowi. Z grubsza reprezentuje to tonotopową organizację słuchowego pnia mózgu, odpowiednio od regionów kodowania o niskiej i wysokiej częstotliwości.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wykazujemy tutaj, że elektroporacja in ovo umożliwia ekspresję genów w normalnie rozwijającym się systemie biologicznym. Geny kodowane przez plazmidy są wstrzykiwane ogniskowo do rurki neuralnej nad obszarem R5/R6. Schematyczny przykład rozmieszczenia elektrod i pipety względem ważnych markerów anatomicznych przedstawiono na Rysunku 1A. Prawidłowa lokalizacja wstrzyknięcia plazmidu zostaje potwierdzona 24 h po elektroporacji i pokazana na Rysunku 1B

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Elektroporacja in ovo jest metodą ekspresji lub obalania genów będących przedmiotem zainteresowania w celu analizy funkcji genów in vivo 8,9. W zarodku kurczaka jest to innowacyjna metoda ekspresji genów kodowanych plazmidem w różnych obszarach słuchowych pnia mózgu8. Aby zapewnić optymalną ekspresję, wymaganych jest kilka krytycznych kroków. Po pierwsze, wstrzykuj tylko zarodki, których otocysty są wyraźnie widoczne. Jeś...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować doktorom Leslayann Schecterson, Yuan Wang, Andresowi Barrii i Pani Ximenie Optiz-Araya za wstępną pomoc w ustaleniu protokołu i za dostarczenie plazmidów. Prace te były wspierane przez DC013841 grantowe NIH/NIDCD (JTS).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zapłodnione białe jaja kurze z rogamiSunnyside Inc. (Beaver Dam, WI)
PicospritzerParker Hannifin052-0500-900Picospritzer III, jedno- lub dwukanałowy
Stymulator prądu/napięciaGrass TechnologiesSD9SD9
Igły do strzykawek MicrofilWorld Precision InstrumentsMF28G67-528 Gauge, 67 mm długości, (opakowanie 5 szt.)
Uchwyt elektrodyWarner Instruments64-1280MP Seria: Zastosowania ciśnieniowe
nieelektryczne Mikroelektroda stymulującaFHCPBSA1075 PBSA1075
Zbiornik/regulator powietrzaNU UsługiSuszenie na powietrzu 300 CF
Fast greenSigma AldrichF7258-25GF7258-25G
Przezroczysta taśma plastikowaScotch191
Hyklalat doksycyklinySigma AldrichD9891-1G
Lodówka na jajkaVissani Lodówka13,3 - 16,1 ° C (56-61° F)
InkubatorHova-Bator38 ° C (100 ° F), ~50% wilgotności
Luneta preparcyjnaZeiss4.35E+15SteREO Discovery, mikroskop V8, 50,4X
Źródło zimnego światłaZeiss4.36E+15CL6000
MikromanipulatoryNarishige JaponiaModel: MM-32 Mikromanipulatory
Rurki kapilarneSutter InstrumentBF150-86-10Grubościenny borokrzemian (wymiary)
Strzykawki1 mL, 3 mL
IgłyBD Precision Glide 27 G x 1 1/4, 19 G x 1 1/2
KleszczeStoeltingNo. 5 Super Fine Dumont
Uchwyt na jajkaCustom MadeGliniana podstawa również działa
Ściągacz do mikropipetSutter InstrumentModel P-97
Filtr strzykawkowyUltra Cruzsc-358811PVDF 0,22 μ mln
laboratoryjne na wino LED

Bibliografia

  1. Grothe, B., Pecka, M., McAlpine, D. Mechanisms of sound localization in mammals. Physiol Rev. 90 (3), 983-1012 (2010).
  2. Anderson, S., et al. Neural timing is linked to speech perception in noise. J Neurosci. 30 (14), 4922-4926 (2010).
  3. Shannon, R. V., et al. Speech recognition with primarily temporal cues. Science. 270 (5234), 303-304 (1995).
  4. Carr, C. E., et al. Evolution and development of time coding systems. Curr Opin Neurobiol. 11 (6), 727-733 (2001).
  5. Carr, C. E., Soares, D. Evolutionary convergence and shared computational principles in the auditory system. Brain Behav Evol. 59 (5-6), 294-311 (2002).
  6. Rubel, E. W., Parks, T. N. Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: tonotopic organization of n. magnocellularis and n. laminaris. J Comp Neurol. 164 (4), 411-433 (1975).
  7. Rubel, E. W., Smith, D. J., Miller, L. C. Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: ontogeny of n. magnocellularis and n. laminaris. J Comp Neurol. 166 (4), 469-489 (1976).
  8. Schecterson, L. C., et al. TrkB downregulation is required for dendrite retraction in developing neurons of chicken nucleus magnocellularis. J Neurosci. 32 (40), 14000-14009 (2012).
  9. Chesnutt, C., Niswander, L. Plasmid-based short-hairpin RNA interference in the chicken embryo. Genesis. 39 (2), 73-78 (2004).
  10. Oertel, D. Encoding of timing in the brain stem auditory nuclei of vertebrates. Neuron. 19 (5), 959-962 (1997).
  11. Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. Embryonic origins of auditory brain-stem nuclei in the chick hindbrain. Dev Biol. 224 (2), 138-151 (2000).
  12. Cramer, K. S., et al. EphA4 signaling promotes axon segregation in the developing auditory system. Dev Biol. 269 (1), 26-35 (2004).
  13. Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. J Vis Exp. (8), e306(2007).
  14. Sanchez, J. T., et al. Preparation and culture of chicken auditory brainstem slices. J Vis Exp. (49), (2011).
  15. Jhaveri, S., Morest, D. K. Neuronal architecture in nucleus magnocellularis of the chicken auditory system with observations on nucleus laminaris: a light and electron microscope study. Neuroscience. 7 (4), 809-836 (1982).
  16. Matsui, R., Tanabe, Y., Watanabe, D. Avian adeno-associated virus vector efficiently transduces neurons in the embryonic and post-embryonic chicken brain. PLoS One. 7 (11), e48730(2012).
  17. Koppl, C. Auditory nerve terminals in the cochlear nucleus magnocellularis: differences between low and high frequencies. J Comp Neurol. 339 (3), 438-446 (1994).
  18. Hyson, R. L. The analysis of interaural time differences in the chick brain stem. Physiol Behav. 86 (3), 297-305 (2005).
  19. Jones, T. A., Jones, S. M., Paggett, K. C. Emergence of hearing in the chicken embryo. J Neurophysiol. 96 (1), 128-141 (2006).
  20. Saunders, J. C., Coles, R. B., Gates, G. R. The development of auditory evoked responses in the cochlea and cochlear nuclei of the chick. Brain Res. 63, 59-74 (1973).
  21. Woolf, N. K., Ryan, A. F. The development of auditory function in the cochlea of the mongolian gerbil. Hear Res. 13 (3), 277-283 (1984).
  22. Walsh, E. J., McGee, J. Postnatal development of auditory nerve and cochlear nucleus neuronal responses in kittens. Hear Res. 28 (1), 97-116 (1987).
  23. Uziel, A., Romand, R., Marot, M. Development of cochlear potentials in rats. Audiology. 20 (2), 89-100 (1981).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Kontrola ekspresji genówiniekcja plazmidujądro magnocelularnejądro laminarnerombomer 5 6system Tet Onindukcja doksycyklinąrozwój neuronów słuchowych
In Ovo Elektroporacja w słuchowym pniu mózgu kurczaka
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.