Artykuł metodologiczny

Mikroskopia fluorescencyjna oparta na arkuszach świetlnych żywych lub utrwalonych i barwionych zarodków Tribolium castaneum

DOI:

10.3791/55629

⸱

28 kwietnia 2017

 ,  , 
1Physical Biology, Buchmann Institute for Molecular Life Sciences (BMLS), 2Cluster of Excellence Frankfurt, Macromolecular Complexes, 3Goethe-Universität Frankfurt am Main – Campus Riedberg

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obrazowanie morfogenezy zarodków owadów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej opartej na arkuszach świetlnych stało się najnowocześniejszym rozwiązaniem. Protokół ten nakreśla i porównuje trzy techniki montażu odpowiednie dla zarodków Tribolium castaneum, wprowadza dwie nowatorskie, wykonane na zamówienie linie transgeniczne, dobrze nadające się do obrazowania na żywo, omawia podstawowe kontrole jakości i wskazuje obecne ograniczenia eksperymentalne.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Czerwony chrząszcz mączny Tribolium castaneum stał się ważnym modelowym organizmem owada w genetyce rozwojowej i ewolucyjnej biologii rozwoju. Obserwacja zarodków Tribolium za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej opartej na arkuszach świetlnych ma wiele zalet w porównaniu z konwencjonalną mikroskopią fluorescencyjną szerokokątną i konfokalną. Dzięki unikalnym właściwościom mikroskopu opartego na arkuszach świetlnych, trójwymiarowe obrazy żywych próbek mogą być rejestrowane z wysokim stosunkiem sygnału do szumu i znacznie zmniejszonym fotobieleniem, a także fototoksycznością w wielu kierunkach przez okresy trwające kilka dni. Biorąc pod uwagę ponad czteroletni rozwój metodologiczny i ciągły przyrost danych, wydaje się, że nadszedł czas, aby ustanowić standardowe procedury operacyjne dotyczące stosowania technologii arkuszy świetlnych w społeczności Tribolium, jak również w całej społeczności owadów. Protokół ten opisuje trzy techniki montażu odpowiednie do różnych celów, przedstawia dwie nowatorskie, wykonane na zamówienie transgeniczne linie tribolium odpowiednie do długoterminowego obrazowania na żywo, sugeruje pięć barwników fluorescencyjnych do oznaczania struktur wewnątrzkomórkowych utrwalonych zarodków i dostarcza informacji na temat przetwarzania końcowego danych w celu terminowej oceny zarejestrowanych danych. Reprezentatywne wyniki koncentrują się na długoterminowym obrazowaniu na żywo, sekcjach optycznych i obserwacji tego samego zarodka w wielu kierunkach. Odpowiednie zestawy danych są udostępniane jako zasób do pobrania. Wreszcie, w protokole omówiono kontrole jakości testów obrazowania na żywo, obecne ograniczenia oraz możliwość zastosowania przedstawionych procedur do innych gatunków owadów.

Ten protokół jest przeznaczony przede wszystkim dla biologów rozwojowych, którzy poszukują rozwiązań do obrazowania, które przewyższają standardowy sprzęt laboratoryjny. Promuje ona nieustanne dążenie do wypełnienia luki między laboratoriami/społecznościami zorientowanymi technicznie, które rozwijają i udoskonalają metodologię mikroskopii, a laboratoriami/społecznościami nauk przyrodniczych, które wymagają rozwiązań typu "plug-and-play" dla wyzwań technicznych. Co więcej, wspiera aksjomatyczne podejście, które przenosi pytania biologiczne w centrum uwagi.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Czerwony chrząszcz mączny Tribolium castaneum, który należy do dużej rodziny ciemników (Tenebrionidae), ma długą historię w naukach rolniczych i przyrodniczych i jest drugim najlepiej zbadanym modelowym organizmem owadów po muszce owocowej Drosophila melanogaster. W ciągu ostatnich czterech dekad stał się potężnym i popularnym modelowym organizmem owada w genetyce rozwojowej, w ewolucyjnej biologii rozwoju, a w ciągu ostatnich dwudziestu lat w morfogenezie embrionalnej z różnych powodów:

Drosophila i Tribolium należą do Holometabola, ale rozdzieliły się około 300 milionów lat temu1,2,3,4. Podczas gdy rozwój embrionalny Drosophila jest powszechnie uważany za wysoce pochodny, Tribolium wykazuje bardziej rodowy sposób rozwoju, który występuje u znacznie większej części gatunków owadów5,6,7,8,9. Po pierwsze, Tribolium wykazuje nieewolucyjny rozwój głowy, tzn. jego aparat gębowy i czułki wyłaniają się już podczas embriogenezy10,11,12,13,14,15. Po drugie, Tribolium jest zgodne z zasadami rozwoju krótkich zarodków, tj. segmenty brzuszne są dodawane sekwencyjnie z tylnej strefy wzrostu podczas wydłużania pasma zarodkowego16,17,18,19. Po trzecie, Tribolium rozwija się, a następnie degraduje dwie błony pozaembrionalne, tj. owodnię, która pokrywa zarodek tylko brzusznie, oraz błonę surowiczą, która całkowicie otacza zarodek20,21,22. Obie membrany odgrywają kluczową rolę morfogenetyczną23, a także ochronną przed mikroorganizmami24,25 i desiccation26. Po czwarte, zarodkowo rozwijające się nogi są w pełni funkcjonalne w stadium życia larwalnego i służą jako zawiązki dla dorosłych nóg podczas metamorfozy poczwarki27,28,29,30,31.

Ze względu na ich mały rozmiar i skromne wymagania, uprawa Tribolium w laboratorium jest dość prosta. Kultury szczepów typu dzikiego (WT) lub linii transgenicznych zazwyczaj składają się z około 100-300 dorosłych osobników i mogą być przechowywane w jednolitrowych szklanych butelkach (ślad 80 cm2) wypełnionych o wysokości od trzech do czterech centymetrów (około 50 g) pożywką wzrostową, która składa się z pełnoziarnistej mąki pszennej uzupełnionej nieaktywnymi suchymi drożdżami. Zaopatrzenie w wodę nie jest konieczne. Dzięki temu nawet małe laboratoria mogą przechowywać dziesiątki kultur chrząszczy w małych i średnich inkubatorach dostępnych na rynku. Późniejsze stadia rozwojowe Tribolium (larwy po około czwartym stadium rozwojowym, poczwarki i dorosłe osobniki) można łatwo oddzielić od podłoża wzrostowego przez przesiewanie. Zsynchronizowane zarodki uzyskuje się przez inkubację dorosłych osobników przez krótki czas na pożywce do składania jaj. W celu szybkiego rozwoju kultury chrząszczy są utrzymywane w temperaturze 32 °C (około czterech tygodni na pokolenie), podczas gdy hodowla jest zwykle prowadzona w temperaturze 22-25 °C (około dziesięciu tygodni na pokolenie).

W ciągu ostatniej dekady, wiele standardowych technik zostało stopniowo dostosowanych i zoptymalizowanych dla Tribolium, jak podsumowano w książkach o nowych organizmach modelowych32. Ogromne znaczenie mają zaawansowane metody genetyczne, takie jak embryonic33, larval34,35 lub parental36,37 Knockdown genu oparty na interferencji RNA, transformacja linii zarodkowej za pomocą piggyBac<sup class="xref">38,39 lub Minos40 system transpozazy i inżynieria genomu oparta na CRISPR/Cas941. Co więcej, genom Tribolium został zsekwencjonowany około dekady temu42, a obecnie jest w trzeciej rundzie edycji składania genomu43, co pozwala na efektywną i obejmującą cały genom identyfikację oraz systematyczną analizę genów44 lub innych elementów genetycznych45,46. Dodatkowo, genomy czterech innych gatunków chrząszczy (Coleoptera) są dostępne dla porównawczych podejść genetycznych47,48,49,50. W związku ze zsekwencjonowanym genomem przeprowadzono dwie analizy genetyczne na dużą skalę, tj. badanie przesiewowe mutagenezy insercyjnej51 oraz systematyczny ekran knockdown genu oparty na interferencji RNA52,53.

Obrazowanie na żywo fluorescencji za pomocą mikroskopii szerokokątnej, konfokalnej lub opartej na arkuszach świetlnych (LSFM) pozwala obserwować morfologię embrionalną Tribolium jako funkcję czasu (tj. morfogenezy) w wielowymiarowym kontekście (Tabela 1). W szerokokątnej i konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej światło wzbudzenia i emisji jest kierowane przez tę samą soczewkę obiektywu. W obu podejściach cała próbka jest oświetlona dla każdej zarejestrowanej płaszczyzny dwuwymiarowej. W związku z tym próbki są poddawane bardzo wysokim poziomom energii. W LSFM tylko fluorofory w płaszczyźnie ogniskowej są wzbudzane w wyniku rozłączenia oświetlenia i detekcji za pomocą dwóch prostopadle ułożonych soczewek obiektywowych (Rysunek 1). LSFM występuje w dwóch kanonicznych implementacjach – mikroskopie oświetlenia jednopłaszczyznowego (SPIM) i mikroskopie fluorescencyjnym opartym na arkuszach cyfrowego skanowania laserowego (DSLM, Rysunek 2) – i oferuje kilka kluczowych zalet w porównaniu z tradycyjnymi podejściami: (i) wewnętrzna zdolność do cięcia optycznego, (ii) dobra rozdzielczość osiowa, (iii) znacznie obniżony poziom fotowybielania, (iv) bardzo niska fototoksyczność, (v) wysoki stosunek sygnału do szumu, (vi) stosunkowo wysoka szybkość akwizycji, (vii) obrazowanie w wielu kierunkach oraz (viii) głębsza penetracja tkanek dzięki zastosowaniu soczewek obiektywowych o niskim oświetleniu numerycznym54,55,56.

LSFM został już z powodzeniem zastosowany w Tribolium do udokumentowania prawie całej morfogenezy embrionalnej57 oraz do analizy zasad pękania błony pozaembrionalnej na początku zamknięcia grzbietowego23. Aby zwiększyć atrakcyjność LSFM w społeczności Tribolium i ogólnie dla nauki o owadach, ogromne znaczenie ma ustanowienie standardowych procedur operacyjnych oraz ulepszenie metod, protokołów i puli zasobów do poziomu, w którym mikroskop stanie się łatwym w użyciu standardowym narzędziem w laboratoriach biologii rozwojowej, a kwestie biologiczne pozostaną w centrum uwagi.

Ten protokół zaczyna się od podstaw uprawy Tribolium, tj. utrzymania, reprodukcji i pobierania zarodków. Następnie zilustrowano dwie strategie eksperymentalne: (i) obrazowanie na żywo niestandardowych linii transgenicznych oraz (ii) obrazowanie utrwalonych zarodków, które zostały wybarwione barwnikami fluorescencyjnymi (Tabela 2). Następnie szczegółowo wyjaśniono trzy techniki montażu o nieco różnych celach (Rysunek 3 i Tabela 3): (i) kolumna agarozy, (ii) półkula agarozy i (iii) nowy uchwyt pajęczyny. Następnie protokół wyjaśnia procedurę pozyskiwania danych za pomocą LSFM. Przedstawiono metody obrazowania i kluczowe kwestie, które należy wziąć pod uwagę. Na koniec wyjaśniono proces pobierania zarodków i przedstawiono sugestie dotyczące podstawowego przetwarzania danych. W reprezentatywnych wynikach pokazano dane obrazowania na żywo z dwóch nowatorskich, niestandardowych linii i linii transgenicznych Glia-blue58, a odpowiednie zestawy danych obrazowania są udostępniane jako zasób do pobrania. Dodatkowo przedstawiono dane obrazowe utrwalonych zarodków, które zostały wybarwione różnymi barwnikami fluorescencyjnymi. Dyskusja skupia się na kontroli jakości, obecnych ograniczeniach podejścia do obrazowania na żywo oraz dostosowaniu protokołu do innych gatunków.

Protokół jest napisany dla mikroskopów fluorescencyjnych opartych na arkuszach świetlnych, które są wyposażone w komorę na próbki i obrotowy mechanizm zaciskowy dla standardowych uchwytów na próbki54,59,60, które są zazwyczaj elementami w kształcie walca wykonanymi z metalu, plastiku lub szkła o średnicy w zakresie milimetrów. Protokół nadaje się również zarówno do implementacji kanonicznych, tj. SPIM i DSLM, jak i do konfiguracji z dwoma lub więcej ramionami oświetlenia i detekcji61,62,63. Reprezentatywne wyniki pokazują dane w dwóch kanałach spektralnych, zielonym (oświetlenie laserem 488 nm, detekcja przez filtr pasmowo-przepustowy 525/50) i czerwonym (oświetlenie laserem 561 nm, detekcja przez filtr pasmowo-przepustowy 607/70), ale protokół można rozszerzyć do trzech lub czterech kanałów spektralnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hodowla kultur Tribolium

UWAGA: Standardowe warunki są zdefiniowane jako temperatura inkubacji 25 °C i 70% wilgotności względnej w 12-godzinnym cyklu jasnym/12 godzin ciemności. Więcej informacji na temat hodowli Tribolium można znaleźć w odpowiednich wytycznych64. Protokół ten wymaga dwóch różnych pożywek na bazie mąki, które można przygotować w ilościach kilogramowych i przechowywać przez kilka miesięcy.

  1. Przed przystąpieniem do pracy z mąką i nieaktywnymi suchymi drożdżami należy przechowywać nieotwarte opakowania w temperaturze -20 °C przez 24 godziny, a następnie pozostawić je do ogrzania do temperatury pokojowej. Ta procedura eliminuje potencjalne patogeny.
  2. Przełóż pełnoziarnistą mąkę pszenną i nieaktywne suche drożdże przez sito o rozmiarze oczek 710 μm, a następnie przygotuj pożywkę, uzupełniając przesianą mąkę pełnoziarnistą 5% (w/w) przesianych nieaktywnych suchych drożdży.
  3. Przełóż 405 drobnej mąki pszennej i nieaktywnych suchych drożdży przez sito o rozmiarze oczek 250 μm, a następnie przygotuj pożywkę do składania jaj, uzupełniając przesianą mąkę pszenną 405 z 5% (w/w) przesianymi nieaktywnymi suchymi drożdżami.
  4. Przepuścić odpowiednią kulturę tribolium przez sito o rozmiarze oczek 800 μm. Wyrzuć resztki podłoża wzrostowego. Przenieś larwy, poczwarki i dorosłe osobniki do dużego szklanego naczynia.
  5. Jeśli nie istnieje żadna kultura potomstwa, przenieś około 80 larw i/lub poczwarek do nowej szklanej butelki, aby stworzyć nową kulturę potomstwa. Jeśli nie ma larw i/lub poczwarek, weź około 40 dorosłych osobników. Dodać 50 g pożywki wzrostowej i inkubować w standardowych warunkach.
  6. Zbierz około 300 dorosłych (500-700 mg) w innej nowej szklanej butelce, aby ustalić kulturę obrazowania. Dodać 50 g pożywki wzrostowej i inkubować w standardowych warunkach. Pozostawić kulturę obrazowania na co najmniej 24 godziny w świeżej pożywce wzrostowej przed pobraniem zarodków.
  7. Pożywkę wzrostową w kulturze obrazowania należy wymieniać co najmniej raz na dwa tygodnie, co można zrobić w połączeniu z pobraniem zarodków (patrz ppkt 3.2). Po dwóch do trzech miesiącach należy całkowicie zastąpić posiew obrazowy nowymi dorosłymi osobnikami z kultury potomstwa.
  8. Jeśli używana jest niehomozygoyczna linia transgeniczna, często selekcjonuj kultury potomstwa, usuwając zwierzęta nietransgeniczne. Idealnie byłoby, gdyby wygenerować linie homozygotyczne, jeśli odpowiedni transgen nie jest śmiertelny lub powoduje bezpłodność, gdy jest obecny na obu chromosomach. Kultury homozygotyczne mają zazwyczaj wyższy średni poziom fluorescencji, a ogólne warunki eksperymentalne są węższe, ponieważ obecny jest tylko jeden genotyp.

2. Konfiguracja i kalibracja mikroskopu

UWAGA: Zarodek Tribolium ma długość przednio-tylną około 600-660 μm i średnicę poprzeczną około 300-330 μm. Większość nowoczesnych kamer CCD ma rozmiar matrycy około 9 mm x 7 mm, czyli średnicę 11,4 μm i odległość między pikselami 6,45 μm. W połączeniu z soczewką obiektywową o 10-krotnym powiększeniu, zarodek może być obrazowany in toto z rozstawem pikseli 0,645 μm. Większość nowoczesnych kamer sCMOS ma większy rozmiar układu czujnika wynoszący około 16 mm x 14 mm, czyli średnicę 21,3 μm, oraz odległość między pikselami wynoszącą 6,5 μm. W połączeniu z soczewką obiektywową o 20-krotnym powiększeniu, zarodek może być obrazowany in toto z rozstawem pikseli 0,325 μm.

  1. Przymocuj soczewki obiektywu oświetlającego i detekcyjnego do mikroskopu. Upewnij się, że lasery i filtry fluorescencyjne bardzo dobrze pasują do widm absorpcji i emisji fluoroforu.
  2. Przymocuj komorę na próbkę do mikroskopu. Napełnić komorę próbki PBS o pH 7,4 lub innym odpowiednim buforem do obrazowania.
  3. Włącz i skalibruj mikroskop. Kompleksowe procedury kalibracji i wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów dla niestandardowych mikroskopów opartych na arkuszach świetlnych (w szczególności dla implementacji DSLM) zostały opublikowane wcześniej65. W przypadku urządzeń komercyjnych należy bardzo dokładnie przestrzegać instrukcji producenta. Niewłaściwe obchodzenie się z pożywką może spowodować wyczerpanie komory próbki i spowodować spustoszenie zarówno w instrumencie, jak i w próbce.

3. Pobieranie embrionów transgenicznych lub WT

  1. Przepuścić obrazowaną kolonię przez sito o rozmiarze oczek 800 μm. Zbierz dorosłe chrząszcze do nowej szklanej butelki i dodaj 10 g podłoża do składania jaj. Inkubować kulturę składającą jaja przez 1 godzinę w temperaturze 25 °C i wilgotności względnej 70% w świetle.
  2. Przełóż kulturę składającą jaja przez sito o rozmiarze oczek 800 μm, aby oddzielić dorosłe osobniki od pożywki do składania jaj, która zawiera około 30-100 zarodków. Przenieś dorosłe osobniki do nowej szklanej butelki i dodaj starą lub 50 g świeżej pożywki.
  3. Jeżeli obserwacja powinna rozpocząć się na jednolitym etapie blastodermy (przykładowy zestaw danych DS0002), należy inkubować podłoże do składania jaj przez 15 godzin w temperaturze 25 °C i wilgotności względnej 70%. Aby rozpocząć od początku retrakcji prążka zarodkowego (przykładowe zestawy danych DS0001 i DS0003), należy inkubować zarodki przez 23 godziny w temperaturze 32 °C i wilgotności względnej 70%. Jeśli pożądane są inne etapy rozwoju, zapoznaj się z odpowiednią literaturą64,65 i w razie potrzeby dostosuj czas inkubacji i/lub temperaturę.

4. Dechorionacja zarodków

UWAGA: Kosmówka jest zewnętrzną warstwą skorupy jajka i składa się z białek i polisacharydów. Jest silnie absorbujący światło, ale nie jest niezbędny do prawidłowego rozwoju, dzięki czemu może być usunięty chemicznie.

  1. Przepuścić podłoże do składania jaj przez sito o rozmiarze oczek 300 μm. Zebrać zarodki do sitka do komórek o rozmiarze oczek 100 μm i wyrzucić resztki podłoża do składania jaj.
  2. Przygotować płytkę 6-dołkową w następujący sposób: napełnić studzienki A1, A2, A3 i B3 10 ml PBS pH 7,4, a studzienki B1 i B2 9 ml PBS. Następnie ostrożnie dodaj 1 ml podchlorynu sodu do witamin B1 i B2. Obserwuj postęp kroków od 4.3 do 4.8 pod mikroskopem stereoskopowym. UWAGA podchloryn sodu jest.
  3. Włóż sitko do komórek do studzienki A1 (PBS pH 7,4) i myj zarodki przez minutę pod delikatnym mieszaniem. Większe cząstki mąki powinny oderwać się od zarodków.
  4. Przenieść sitko do komórek do studzienki B1 (podchloryn sodu o pH PBS 7,4) i energicznie wstrząsać płytką przez 30 s. Pozostałe cząstki mąki powinny całkowicie oderwać się od zarodków.
  5. Przenieś sitko do komórek do dołka A2 (PBS pH 7,4) i myj zarodki przez 1 minutę pod delikatnym mieszaniem.
  6. W celu dechorionacji przenieść sitko komórkowe do studzienki B2 (podchloryn sodu o pH PBS 7,4). Energicznie wstrząsać płytką, aż kosmówka pęknie i oderwie się od zarodków. Kosmówka wygląda jak cienka, półprzezroczysta błona z poszarpanymi krawędziami, podczas gdy zarodki pozbawione chorówki mają prostą sylwetkę.
  7. Przenieś sitko do komórek do dołka A3 (PBS pH 7,4) i myj zarodki przez 1 minutę pod delikatnym mieszaniem. Jeśli po umyciu do zarodków nadal przylegają jakiekolwiek fragmenty kosmówki, należy powtórzyć krok 4.6.
  8. Przechowuj zarodki w studzience B3 (PBS pH 7,4). Przechowywanie przez kilka godzin nie szkodzi zarodkom, ale należy pamiętać, że rozwój trwa.
  9. W przypadku niehomozygotycznych linii transgenicznych, jeśli to możliwe, usuń wszelkie niefluorescencyjne zarodki. W celu utrwalenia i barwienia zarodków WT lub transgenicznych należy przejść do kroku 5. W przypadku obrazowania na żywo zarodków transgenicznych przejdź do kroku 6.

5. Przepuszczalność, utrwalanie i barwienie membrany witelinowej

UWAGA: Błona witelinowa to wewnętrzna warstwa skorupki jajka. Jest nieprzepuszczalny dla barwników fluorescencyjnych i dlatego przed barwieniem musi zostać chemicznie przesiąknięty.

  1. Napełnij fiolkę scyntylacyjną roztworem utrwalającym/przepuszczalnym (1,5 ml 4% (w/v) paraformaldehydu o pH PBS 6,9 i 1,5 ml n-heptanu). Przenieś zarodki za pomocą pędzla do fiolek. Przykryj fiolki folią aluminiową, aby chronić fluorofory przed światłem i inkubuj przez 30 minut na platformie bujanej z prędkością 50 obrotów na minutę. UWAGA paraformaldehyd jest toksyczny i, n-heptan jest łatwopalny i toksyczny.
  2. Usunąć roztwór utrwalający i traktować zarodki trzy razy przez 15 minut w 3 ml 0,1% (v/v) Triton X-100 w PBS pH 7,4, a następnie raz przez 15 minut w 3 ml 1% (v/v) Triton X-100 w PBS pH 7,4 na platformie kołyszącej z prędkością 50 obrotów na minutę. UWAGA Triton X-100 jest.
  3. Usunąć roztwór do przepuszczania i dodać 0,5 ml roztworu barwiącego do fiolki. Przykładowe roztwory barwiące przedstawiono w tabeli 2. Barwić zarodki przez noc w temperaturze 4 °C na platformie kołyszącej z prędkością 50 obrotów na minutę. W przypadku barwników zaproponowanych w tabeli 2 mycie nie jest konieczne.

6. Przygotowanie montażu agarozy

  1. Dodaj 1 g niskotopliwej agarozy do 100 ml PBS o pH 7,4 i podgrzewaj mieszaninę przez 2-3 minuty w kuchence mikrofalowej o mocy 800 W. Jeśli małe cząstki agarozy są nadal obecne, powtarzaj proces ogrzewania w odstępach 30 sekund, aż cząstki całkowicie się rozpuszczą. Agaroza montażowa nie musi być za każdym razem przygotowywana na świeżo, zestaloną agarozę można ponownie upłynnić przez ogrzewanie, jak opisano powyżej. Proces ten można powtórzyć 5-6 razy, zanim wyparuje zbyt dużo wody.
  2. Pozostawić agarozę do ostygnięcia do około 40-45 °C, a następnie napełnić dwie probówki reakcyjne o pojemności 1,5 ml podgrzaną agarozą i utrzymywać te probówki w temperaturze 35 °C w termobloku.

7. Montaż i wprowadzanie zarodków do komory na próbki

  1. Opcja 1: Kolumna agarozowa (Rysunek 3A-C, pierwsza kolumna; Tabela 3, druga kolumna)
    1. Napełnij strzykawkę o pojemności 1,0 ml wodą destylowaną i podłącz ją do jednego ze szklanych otworów kapilarnych za pomocą małego gumowego węża. Napełnij kapilatę do połowy wodą destylowaną.
    2. Wybierz zarodek pędzlem i umieść go po wewnętrznej stronie drugiego szklanego otworu kapilary. Przejdź szybko do następnego kroku, zanim zarodek wyschnie.
    3. Wbij kapilę w płynną agarozę i powoli wciągnij kilka μl płynnej agarozy wzdłuż zarodka do naczynia włosowatego. Następnie szybko zwiększ siłę ciągnącą, aby zarodek został przeciągnięty wraz z agarozą. W końcu kilka μl agarozy powinno znajdować się powyżej i poniżej zarodka. Odstaw kapilę na kilka minut i pozwól agarozie zastygnąć.
    4. Skróć kapilatę za pomocą diamentowego noża do szkła na długość około 5 mm. Pozostały fragment powinien być całkowicie wypełniony agarozą, a zarodek powinien znajdować się w drugim kwartylu.
    5. Włóż stalowy cylinder ze szpilką do komory na próbkę, a następnie przyklej fragment kapilary na górze kołka. Kolumna agarozy powinna wystawać kilka milimetrów z fragmentu naczynia włosowatego z częścią zawierającą zarodek.
  2. Opcja 2: Półkula agarozowa (Rysunek 3A-C, druga kolumna; Tabela 3, kolumna trzecia)
    1. Pobrać 200 μl płynnej agarozy do strzykawki o pojemności 1,0 ml, a następnie użyć jej do napełnienia stalowej rury od góry agarozą, aż w dolnym otworze utworzy się półkula. Średnica półkuli powinna być równa średnicy rury. Poczekaj kilka minut, aż agaroza stężeje.
    2. Wybierz zarodek pędzlem i ułóż go na czubku pędzla tak, aby przedni koniec stał się dostępny. Zanurz półkulę agarozy w płynnej agarozie, aby pokryć ją cienką warstwą.
    3. Umieść zarodek tak, aby jego przedni koniec był ustawiony pionowo na biegunie półkuli agarozy. Odwróć stalową rurkę i skoryguj położenie zarodka za pomocą szczoteczki. W razie potrzeby ustabilizuj zarodek, dodając 2 μl agarozy do granicy zarodka/półkuli. Idealnie, aby mniej niż połowa powierzchni zarodka była pokryta agarozą, a boki były jak najbardziej strome.
    4. Powoli włóż stalową rurkę z półkulą i zarodkiem do komory na próbkę.
  3. Opcja 3: Uchwyt na pajęczynę (Rysunek 3A-C, trzecia kolumna; Tabela 3, kolumna czwarta)
    1. Wybierz zarodek pędzlem i odłóż go na bok.
    2. Przykryj szczelinowy otwór w uchwycie pajęczyny 5-8 μl płynnej agarozy, a następnie usuń większość agarozy, aż pozostanie tylko cienka warstwa agarozy.
    3. Umieść zarodek na folii agarozowej i dostosuj jego położenie. Ostrożnie przesuń zarodek do środka osi x otworu szczelinowego i wyrównaj jego wydłużoną oś przednio-tylną z wydłużoną osią otworu szczelinowego.
    4. Powoli włożyć uchwyt pajęczyny z zamontowanym zarodkiem do komory na próbkę. Ustawić uchwyt pajęczyny tak, aby nie zakłócał światła wzbudzającego i emisyjnego, tj. 45° względem osi x i z.

8. Mikroskopia fluorescencyjna oparta na arkuszach świetlnych

  1. Zdecyduj, w ilu kierunkach (i w jakich orientacjach) zarodek powinien być obrazowany. Cztery kierunki (wzdłuż orientacji 0°, 90°, 180° i 270°) zazwyczaj zapewniają dobry kompromis między zasięgiem a obciążeniem energetycznym.
  2. Ustaw liczbę kanałów fluorescencyjnych. Głównymi parametrami dla każdego kanału są linia lasera, filtr fluorescencyjny, moc lasera i czas naświetlania. W przypadku długoterminowego obrazowania na żywo ważne jest, aby zintegrowane obciążenie energią nie przekraczało tolerancji zarodka. Czas naświetlania wynoszący 25-50 ms zapewnia szybkie obrazowanie, natomiast moc lasera między 100 a 300 μW nie powinna wpływać na żywotność zarodka. W przypadku próbek utrwalonych czas naświetlania i moc lasera mogą być co najmniej podwojone.
  3. W przypadku testów obrazowania na żywo skonfiguruj upływ czasu. Pełna embriogeneza Tribolium trwa około siedmiu dni w temperaturze pokojowej (23 ± 1 °C) i nieco mniej niż trzy dni w temperaturze 32-35 °C64. Określ przedział czasowy zgodnie ze zdarzeniami morfogenetycznymi, które należy zaobserwować. W przypadku krótkich interwałów czasowych należy rozważyć skrócenie czasu ekspozycji i mocy lasera (patrz 8.2).
  4. Ustaw zarodek w trybie światła transmisyjnego wzdłuż osi x i y do środka pola widzenia, nie wystawiając go na działanie lasera. Obróć zarodek o 360° w krokach co 90°, aby zbadać zarodek pod kątem uszkodzeń, które mogły wystąpić podczas procesu montowania.
  5. Obrócić zarodek odpowiednio wokół osi y, aby wyrównać osie zarodka z osiami mikroskopu, na przykład oś boczną z osią x, tj. oś grzbietowo-brzuszną z osią z. W przypadku korzystania z techniki uchwytu pajęczyny wyrównanie może nie być możliwe.
  6. W trybie fluorescencji zdefiniuj stos z dla każdego kierunku. Dodaj 25-50 μm jako bufor przestrzenny przed i za zarodkiem. Łącznie z buforem, typowy stos z obejmuje około 350-400 μm dla zarodka Tribolium. Z-spacing (Z) Z-spacing, który powinien być czterokrotny od odstępu bocznego, tj. odstępu wzdłuż osi x i y66.
  7. Jeśli dwa lub więcej zarodków jest obrazowanych równolegle, wznowić od 8.4 z następnym zarodkiem.
  8. W przypadku obrazowania długoterminowego należy upewnić się, że komora próbki jest wypełniona wystarczającą ilością PBS pH 7,4 lub innym buforem do obrazowania. Zakryj również otwór komory na próbkę.
  9. Rozpocznij proces obrazowania. W przypadku długoterminowego obrazowania na żywo należy monitorować prawidłową akwizycję we wszystkich kierunkach we wszystkich kanałach dla wszystkich zarodków. Od czasu do czasu sprawdzaj w ciągu następnych dni, czy zarodki są żywe i znajdują się w odpowiedniej pozycji.

9. Pobieranie zarodków i kontrola jakości

  1. Po zakończeniu obrazowania wyjmij uchwyt na próbkę z zarodkami z komory na próbkę. Konieczne jest pobranie tylko zarodków pochodzących z badań obrazowych na żywo. Utrwalone i barwione zarodki można wyrzucić.
  2. Jeśli wykonano test obrazowania na żywo, przenieś zarodek na szkiełko przedmiotowe. W przypadku techniki kolumny agarozowej należy wyekstrahować zarodki z otaczającej agarozy za pomocą skalpela, mikronoża lub żyletki. W przypadku techniki półkuli agarozowej przenieś półkulę płaską stroną na szkiełko obiektu. Usunięcie zarodków nie jest konieczne. W przypadku techniki chwytania pajęczyny delikatnie zdejmij zarodki z filmu agarozowego za pomocą pędzla. Inkubować szkiełko obiektowe w małym szklanym naczyniu w atmosferze nasyconej wilgotności w standardowych warunkach, aż do wyklucia się larw.
  3. Po wykluciu przenieś larwy do pojedynczych dołków 24-dołkowej płytki i dodaj 500 mg pożywki wzrostowej do każdej studzienki. Inkubować w standardowych warunkach. Porównaj całkowity czas rozwoju i morfologię obrazowanych larw z nieobrazowanymi larwami WT i larwami transgenicznymi (patrz dyskusja). W testach, które charakteryzują rozwój WT, idealnie byłoby, gdyby nie było żadnych oczywistych aberracji morfologicznych.
  4. Gdy larwy rozwiną się do zdrowych osobników dorosłych, należy zapewnić im odpowiednich partnerów WT z tego samego szczepu tła. Po dwóch tygodniach sprawdź produkcję potomstwa. Rozważ również sprawdzenie płodności potomstwa poprzez krycie ich między parami. Dopiero gdy zobrazowane zarodki rozwiną się w płodne dorosłe osobniki, które wydadzą płodne potomstwo, procedurę obrazowania można uznać za nieinwazyjną.

10. Przetwarzanie danych obrazu

UWAGA: Do przetwarzania danych obrazu zalecane jest oprogramowanie do przetwarzania obrazów o otwartym kodzie źródłowym ImageJ67 lub jego pochodna FIJI68. Obie wersje oraz obszerną dokumentację można znaleźć na stronie www.imagej.net. Standardowym formatem pliku dla danych LSFM jest format pliku obrazu ze znacznikami (TIFF). Opcja wewnętrznego kontenera umożliwia przechowywanie stosów obrazów, takich jak stosy z lub szeregi czasowe maksymalnych projekcji z w jednym pliku, który można otworzyć w formacie ImageJ lub FIJI za pomocą przeciągania i upuszczania.

  1. W razie potrzeby obróć stosy z, aby wyrównać oś przednio-tylną zarodka z osią y (Obraz → Przekształć → Obróć). Należy pamiętać, że parametry obrotu muszą być ustawione indywidualnie dla każdego kierunku, ale nie dla upływu czasu i kanałów fluorescencyjnych.
  2. Przytnij stosy z wzdłuż osi x, y i z, tak aby pozostało tylko minimalne tło (20–40 pikseli wzdłuż osi x i y, 5–10 płaszczyzn wzdłuż osi z) (w przypadku osi x i y użyj narzędzia Zaznaczanie prostokątne, a następnie opcji Obraz → Przytnij; w przypadku osi z użyj opcji Stosy obrazów → → Narzędzia → Udnień plasterków). Należy pamiętać, że parametry kadrowania należy ustawić indywidualnie dla każdego kierunku, ale nie dla punktów czasowych i kanałów fluorescencyjnych.
  3. Oblicz maksymalną projekcję z dla każdego stosu z (Obraz → Stosy → Z Project wybierz opcję Max Intensity (Maksymalna intensywność). Obliczenia projekcji intensywności to procedury upraszczające dane, które usuwają jeden wymiar przestrzenny.
  4. W przypadku długoterminowych danych obrazowania na żywo rozważ użycie skryptu ImageJ lub FIJI, który wykonuje kroki przetwarzania od 10.1 do 10.3 dla wszystkich kierunków, wszystkich punktów czasowych i wszystkich kanałów fluorescencji65. Najlepiej połączyć wszystkie maksymalne projekcje z na kanał i kierunek, a następnie zapisać je jako szeregi czasowe w jednym kontenerze TIFF. Alternatywnie, wtyczka BigDataViewer69 dla FIJI może być używana do nawigacji po zestawach danych o wielkości terabajtów.
  5. W zależności od linii transgenicznej i metod obrazowania, dynamiczne korekty intensywności stosów czasowych mogą być pożądane ze względu na fluktuacje fotowybielania i/lub ekspresji fluoroforu. Sugerowana jest funkcja korekcji wybielania ImageJ lub FIJI (Image → Dostosuj → Korekcja wybielania, wybierz Dopasowanie histogramu) lub dedykowane oprogramowanie65.
  6. Jeśli zarodek został zarejestrowany i/lub wzdłuż wielu kierunków i w wielu kanałach fluorescencyjnych, zaleca się poziome połączenie kierunków (Image → Stacks → Tools → Combine) i scalanie kanałów (Image → Color Merge → Channels).
  7. Rejestracja i fuzja stosów z uzyskanych w wielu kierunkach70, ostatecznie w połączeniu z dekonwolucją71, pozwala na obliczanie doskonałych trójwymiarowych obrazów o jednolitej jakości i rozdzielczości izotropowej. Obie wtyczki są open source i preinstalowane na FIDŻI, ale wymagają obecności punktów orientacyjnych (fluorescencyjnych mikrosfer, np. koralików) wokół próbki.
  8. Dostępne są również ramy oprogramowania typu open source do ekstrakcji i analizy danych ilościowych na dużą skalę, na przykład do segmentacji i śledzenia jąder komórkowych72 lub rozpoznawanie kształtów komórek73.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje eksperymentalne ramy obrazowania fluorescencyjnego żywych lub utrwalonych i barwionych zarodków Tribolium za pomocą LSFM. Ze względu na niski poziom fotowybielania i fototoksyczności, co jest bezpośrednią konsekwencją możliwości cięcia optycznego, LSFM szczególnie dobrze nadaje się do długoterminowego obrazowania na żywo.

Nowa linia transgeniczna AGOC{ATub'H2B-mEmerald} #1 wyraża białko fuzyjne hist...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kontrola jakości

W badaniach obrazowania na żywo procedura przygotowania i rejestrowania musi być nieinwazyjna, tj. ani mechaniczna i chemiczna obróbka (pobranie, dechorionacja, montaż na uchwycie próbki), ani zintegrowane obciążenie energią podczas obserwacji nie powinny wpływać na żywotność próbki. W przypadku badań charakteryzujących rozwój WT zaleca się stosowanie wyłącznie danych z eksperymentów, w których zarodek przeżywa proces rejestracji, jest pomyślnie pobie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wkład autora

FS i EHKS są pomysłodawcami badań. FS wygenerował transgeniczne linie AGOC. Obrazowanie fluorescencyjne oparte na arkuszach świetlnych zostało wykonane przez FS i SK. FS i EHKS napisały manuskrypt przy udziale SK.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Svenowi Plath za wsparcie techniczne. Linia transgeniczna Glia-blue była miłym prezentem od Gregora Buchera (Getynga, Niemcy). Badania zostały sfinansowane przez Klaster Doskonałości Frankfurt nad Menem ds. Kompleksów Makromolekularnych (CEF-MC, EXC 115, prelegent Volker Dötsch) przyznany częściowo EHKS w Instytucie Molekularnych Nauk Przyrodniczych im. Buchmanna (BMLS, dyrektor Enrico Schleiff) na Uniwersytecie Goethego we Frankfurcie nad Menem przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
mąka pszenna pełnoziarnistaDemeter e.V.1.13E+08USA: mąka pełnoziarnista, Wielka Brytania: mąka pełnoziarnista
405 drobna mąka pszennaDemeter e.V.1.13E+08USA: mąka cukiernicza, Wielka Brytania: miękka mąka
nieaktywne suche drożdżeFlystuff / Genesee Scientific62-106
Saine buforowana fosforanami (PBS), pH 7,4Thermo Fisher Scientific10010-023
~12% aktywny ClSigma Aldrich425044-250MLUwaga: podchloryn sodu jest
niskotopliwym agaroząCarl Roth6351.2
Płytka 6-dołkowaOrange Scientific4430500
Płytka 24-dołkowaOrangeScientific 4430300
kapilary szklane, wewnętrzne & Oslash; 0,46 mmMarka GmbH + Co KG7087 09
SYTOX GreenThermo Fisher Scientific57020Przygotowanie roztworu barwiącego wyjaśniono w Tabeli 2
JodekYOYO-1Thermo Fisher ScientificY3601Przygotowanie roztworu barwiącego wyjaśniono w Tabeli 2
BOBO-3 JodekThermo Fisher ScientificB3586Przygotowanie roztworu barwiącego wyjaśniono w Tabeli 2
Alexa Fluor 488 PhalloidinThermo Fisher ScientificA12379Przygotowanie roztworu barwiącego wyjaśniono w Tabeli 2
Alexa Fluor 546 PhalloidinThermo Fisher ScientificA22283Przygotowanie roztworu barwiącego wyjaśniono w tabeli 2
sito, 800 &mikro; m rozmiar oczekVWR International200.025.222-051
sito, 710 &mikro; m rozmiar oczekVWR International200.025.222-050do przygotowania podłoża wzrostowego (krok 1.1)
sito, 300 i mikro; m rozmiar oczekVWR International200.025.222-040
sito, 250 &mikro; m rozmiar oczekVWR International200.025.222-038do przygotowania podłoża do składania jaj (krok 1.2)
naczynie szklane, & Oslash; 100 mm & razy; 20 mmSitko komórkowe Sigma AldrichCLS70165102
, 100 &mikro; m rozmiar oczekBD Biosciences352360
pędzel, głowica i Oslash; 2 mmVWR International149-2121
, 1,0 mlB. Braun Medical AG9166017V
fiolki scyntylacyjneSigma AldrichM1152-1000EA
paraformaldehyd (PFA)Sigma Aldrich158127Uwaga: paraformaldehyd jest toksyczny i
n-heptan ≥ 99%Carl Roth8654.1Uwaga: n-heptan jest łatwopalny i toksyczny
Triton X-100Sigma AldrichX100-100MLUwaga: Trition X-100 jest
Podchloryn sodu , , Strzykawka

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brown, S. J., Denell, R. E., Beeman, R. W. Beetling around the genome. Genet. Res. 82, 155-161 (2003).
  2. Misof, B., et al. Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 346, 763-767 (2014).
  3. Tong, K. J., Duchêne, S., Ho, S. Y. W., Lo, N. INSECT PHYLOGENOMICS. Comment on "Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 349, 487(2015).
  4. Kjer, K. M., et al. INSECT PHYLOGENOMICS. Response to Comment on "Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 349, 487(2015).
  5. Klingler, M. Tribolium. Curr Biol. 14, 639-640 (2004).
  6. Savard, J., Marques-Souza, H., Aranda, M., Tautz, D. A segmentation gene in tribolium produces a polycistronic mRNA that codes for multiple conserved peptides. Cell. 126, 559-569 (2006).
  7. Yang, X., Zarinkamar, N., Bao, R., Friedrich, M. Probing the Drosophila retinal determination gene network in Tribolium (I): The early retinal genes dachshund, eyes absent and sine oculis. Dev. Biol. 333, 202-214 (2009).
  8. Peel, A. D. Forward genetics in Tribolium castaneum: opening new avenues of research in arthropod biology. J. Biol. 8, 106(2009).
  9. Lynch, J. A., El-Sherif, E., Brown, S. J. Comparisons of the embryonic development of Drosophila, Nasonia, and Tribolium. Wiley Interdiscip. Rev. Dev. Biol. 1, 16-39 (2012).
  10. Schröder, R., Jay, D. G., Tautz, D. Elimination of EVE protein by CALI in the short germ band insect Tribolium suggests a conserved pair-rule function for even skipped. Mech. Dev. 80, 191-195 (1999).
  11. Posnien, N., Schinko, J. B., Kittelmann, S., Bucher, G. Genetics, development and composition of the insect head--a beetle's view. Arthropod Struct. Dev. 39, 399-410 (2010).
  12. Posnien, N., Koniszewski, N. D. B., Hein, H. J., Bucher, G. Candidate gene screen in the red flour beetle Tribolium reveals six3 as ancient regulator of anterior median head and central complex development. PLoS Genet. 7, 1002416(2011).
  13. Angelini, D. R., Smith, F. W., Aspiras, A. C., Kikuchi, M., Jockusch, E. L. Patterning of the adult mandibulate mouthparts in the red flour beetle, Tribolium castaneum. Genetics. 190, 639-654 (2012).
  14. Coulcher, J. F., Telford, M. J. Cap'n'collar differentiates the mandible from the maxilla in the beetle Tribolium castaneum. Evodevo. 3, 25(2012).
  15. Peel, A. D., et al. Tc-knirps plays different roles in the specification of antennal and mandibular parasegment boundaries and is regulated by a pair-rule gene in the beetle Tribolium castaneum. BMC Dev. Biol. 13, 25(2013).
  16. Bucher, G., Klingler, M. Divergent segmentation mechanism in the short germ insect Tribolium revealed by giant expression and function. Development. 131, 1729-1740 (2004).
  17. Handel, K., Basal, A., Fan, X., Roth, S. Tribolium castaneum twist: gastrulation and mesoderm formation in a short-germ beetle. Dev. Genes Evol. 215, 13-31 (2005).
  18. Roth, S., Hartenstein, V. Development of Tribolium castaneum. Development Genes and Evolution. 218, 115-118 (2008).
  19. Schröder, R., Beermann, A., Wittkopp, N., Lutz, R. From development to biodiversity--Tribolium castaneum, an insect model organism for short germband development. Dev. Genes Evol. 218, 119-126 (2008).
  20. Sharma, R., Beermann, A., Schröder, R. The dynamic expression of extraembryonic marker genes in the beetle Tribolium castaneum reveals the complexity of serosa and amnion formation in a short germ insect. Gene Expr. Patterns. 13, 362-371 (2013).
  21. Benton, M. A., Pavlopoulos, A. Tribolium embryo morphogenesis: may the force be with you. Bioarchitecture. 4, 16-21 (2014).
  22. Horn, T., Hilbrant, M., Panfilio, K. A. Evolution of epithelial morphogenesis: phenotypic integration across multiple levels of biological organization. Front. Genet. 6, 303(2015).
  23. Hilbrant, M., Horn, T., Koelzer, S., Panfilio, K. A. The beetle amnion and serosa functionally interact as apposed epithelia. Elife. 5, (2016).
  24. Jacobs, C. G. C. C., vander Zee, M. Immune competence in insect eggs depends on the extraembryonic serosa. Dev. Comp. Immunol. 41, 263-269 (2013).
  25. Jacobs, C. G. C., Spaink, H. P., vander Zee, M. The extraembryonic serosa is a frontier epithelium providing the insect egg with a full-range innate immune response. Elife. 3, (2014).
  26. Jacobs, C. G. C., Rezende, G. L., Lamers, G. E. M., vander Zee, M. The extraembryonic serosa protects the insect egg against desiccation. Proc. Biol. Sci. 280, 20131082(2013).
  27. Lewis, D. L., DeCamillis, M., Bennett, R. L. Distinct roles of the homeotic genes Ubx and abd-A in beetle embryonic abdominal appendage development. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 4504-4509 (2000).
  28. Beermann, A., et al. The Short antennae gene of Tribolium is required for limb development and encodes the orthologue of the Drosophila Distal-less protein. Development. , 287-297 (2001).
  29. Grossmann, D., Scholten, J., Prpic, N. -M. Separable functions of wingless in distal and ventral patterning of the Tribolium leg. Dev. Genes Evol. 219, 469-479 (2009).
  30. Angelini, D. R., Smith, F. W., Jockusch, E. L. Extent With Modification: Leg Patterning in the Beetle Tribolium castaneum and the Evolution of Serial Homologs. G3. 2, Bethesda. 235-248 (2012).
  31. Grossmann, D., Prpic, N. -M. Egfr signaling regulates distal as well as medial fate in the embryonic leg of Tribolium castaneum. Dev. Biol. 370, 264-272 (2012).
  32. Emerging Model Organisms: A Laboratory Manual, Volume 2. , Cold Spring Harbour Laboratory Press. (2010).
  33. Brown, S. J., Mahaffey, J. P., Lorenzen, M. D., Denell, R. E., Mahaffey, J. W. Using RNAi to investigate orthologous homeotic gene function during development of distantly related insects. Evol. Dev. 1, 11-15 (1999).
  34. Tomoyasu, Y., Denell, R. E. Larval RNAi in Tribolium (Coleoptera) for analyzing adult development. Dev. Genes Evol. 214, 575-578 (2004).
  35. Linz, D. M., Clark-Hachtel, C. M., Borràs-Castells, F., Tomoyasu, Y. Larval RNA interference in the red flour beetle, Tribolium castaneum. J. Vis. Exp. , e52059(2014).
  36. Bucher, G., Scholten, J., Klingler, M. Parental RNAi in Tribolium (Coleoptera). Curr. Biol. 12, 85-86 (2002).
  37. Posnien, N., et al. RNAi in the red flour beetle (Tribolium). Cold Spring Harb. Protoc. 2009, (2009).
  38. Lorenzen, M. D., et al. piggyBac-mediated germline transformation in the beetle Tribolium castaneum. Insect Mol. Biol. 12, 433-440 (2003).
  39. Berghammer, A. J., Weber, M., Trauner, J., Klingler, M. Red flour beetle (Tribolium) germline transformation and insertional mutagenesis. Cold Spring Harb. Protoc. 2009, (2009).
  40. Pavlopoulos, A., Berghammer, A. J., Averof, M., Klingler, M. Efficient transformation of the beetle Tribolium castaneum using the Minos transposable element: quantitative and qualitative analysis of genomic integration events. Genetics. 167, 737-746 (2004).
  41. Gilles, A. F., Schinko, J. B., Averof, M. Efficient CRISPR-mediated gene targeting and transgene replacement in the beetle Tribolium castaneum. Development. 142, 2832-2839 (2015).
  42. Richards, S., et al. The genome of the model beetle and pest Tribolium castaneum. Nature. 452, 949-955 (2008).
  43. Kim, H. S., et al. BeetleBase in 2010: revisions to provide comprehensive genomic information for Tribolium castaneum. Nucleic Acids Res. 38, 437-442 (2010).
  44. Stappert, D., Frey, N., von Levetzow, C., Roth, S. Genome-wide identification of Tribolium dorsoventral patterning genes. Development. 143, 2443-2454 (2016).
  45. Pavlek, M., Gelfand, Y., Plohl, M., Meštrović, N. Genome-wide analysis of tandem repeats in Tribolium castaneum genome reveals abundant and highly dynamic tandem repeat families with satellite DNA features in euchromatic chromosomal arms. DNA Res. 22, 387-401 (2015).
  46. Vlahović, I., Glunčić, M., Rosandić, M., Ugarković, Đ, Paar, V. Regular higher order repeat structures in beetle Tribolium castaneum genome. Genome Biol. Evol. , (2016).
  47. Keeling, C. I., et al. Draft genome of the mountain pine beetle, Dendroctonus ponderosae Hopkins, a major forest pest. Genome Biol. 14, 27(2013).
  48. Vega, F. E., et al. Draft genome of the most devastating insect pest of coffee worldwide: the coffee berry borer, Hypothenemus hampei. Sci. Rep. 5, 12525(2015).
  49. Cunningham, C. B., et al. The Genome and Methylome of a Beetle with Complex Social Behavior, Nicrophorus vespilloides (Coleoptera: Silphidae). Genome Biol. Evol. 7, 3383-3396 (2015).
  50. Meyer, J. M., et al. Draft Genome of the Scarab Beetle Oryctes borbonicus on La Réunion Island. Genome Biol. Evol. 8, 2093-2105 (2016).
  51. Trauner, J., et al. Large-scale insertional mutagenesis of a coleopteran stored grain pest, the red flour beetle Tribolium castaneum, identifies embryonic lethal mutations and enhancer traps. BMC Biol. 7, 73(2009).
  52. Schmitt-Engel, C., et al. The iBeetle large-scale RNAi screen reveals gene functions for insect development and physiology. Nat. Commun. 6, 7822(2015).
  53. Dönitz, J., et al. iBeetle-Base: a database for RNAi phenotypes in the red flour beetle Tribolium castaneum. Nucleic Acids Res. 43, 720-725 (2015).
  54. Keller, P. J., Stelzer, E. H. K. Digital scanned laser light sheet fluorescence microscopy. Cold Spring Harb. Protoc. 2010, (2010).
  55. Weber, M., Huisken, J. Light sheet microscopy for real-time developmental biology. Curr. Opin. Genet. Dev. 21, 566-572 (2011).
  56. Stelzer, E. H. K. Light-sheet fluorescence microscopy for quantitative biology. Nat. Methods. 12, 23-26 (2015).
  57. Strobl, F., Stelzer, E. H. K. Non-invasive long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos. Development. , 1-8 (2014).
  58. Koniszewski, N. D. B., et al. The insect central complex as model for heterochronic brain development-background, concepts, and tools. Dev. Genes Evol. , (2016).
  59. Gualda, E. J., et al. OpenSpinMicroscopy: an open-source integrated microscopy platform. Nat. Methods. 10, 599-600 (2013).
  60. Pitrone, P. G., et al. OpenSPIM: an open-access light-sheet microscopy platform. Nat. Methods. 10, 598-599 (2013).
  61. Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview light-sheet microscopy. Nat. Methods. 9, 755-763 (2012).
  62. Krzic, U., Gunther, S., Saunders, T. E., Streichan, S. J., Hufnagel, L. Multiview light-sheet microscope for rapid in toto imaging. Nat. Methods. 9, 730-733 (2012).
  63. Chhetri, R. K., et al. Whole-animal functional and developmental imaging with isotropic spatial resolution. Nat. Methods. 12, 1171-1178 (2015).
  64. Brown, S. J., et al. The red flour beetle, Tribolium castaneum (Coleoptera): a model for studies of development and pest biology. Cold Spring Harb. Protoc. 2009, (2009).
  65. Strobl, F., Schmitz, A., Stelzer, E. H. K. Live imaging of Tribolium castaneum embryonic development using light-sheet-based fluorescence microscopy. Nat. Protoc. 10, 1486-1507 (2015).
  66. Engelbrecht, C. J., Stelzer, E. H. Resolution enhancement in a light-sheet-based microscope (SPIM). Opt. Lett. 31, 1477-1479 (2006).
  67. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
  68. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
  69. Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets. Nat. Methods. 12, 481-483 (2015).
  70. Preibisch, S., Saalfeld, S., Schindelin, J., Tomancak, P. Software for bead-based registration of selective plane illumination microscopy data. Nat. Methods. 7, 418-419 (2010).
  71. Preibisch, S., et al. Efficient Bayesian-based multiview deconvolution. Nat. Methods. 11, 645-648 (2014).
  72. Amat, F., et al. Fast, accurate reconstruction of cell lineages from large-scale fluorescence microscopy data. Nat. Methods. 11, 951-958 (2014).
  73. Stegmaier, J., et al. Real-Time Three-Dimensional Cell Segmentation in Large-Scale Microscopy Data of Developing Embryos. Dev. Cell. 36, 225-240 (2016).
  74. Siebert, K. S., Lorenzen, M. D., Brown, S. J., Park, Y., Beeman, R. W. Tubulin superfamily genes in Tribolium castaneum and the use of a Tubulin promoter to drive transgene expression. Insect Biochem. Mol. Biol. 38, 749-755 (2008).
  75. Greger, K., Swoger, J., Stelzer, E. H. K. Basic building units and properties of a fluorescence single plane illumination microscope. Rev. Sci. Instrum. 78, 23705(2007).
  76. El-Sherif, E., Averof, M., Brown, S. J. A segmentation clock operating in blastoderm and germband stages of Tribolium development. Development. , (2012).
  77. Panfilio, K. a, Oberhofer, G., Roth, S. High plasticity in epithelial morphogenesis during insect dorsal closure. Biol. Open. 2, 1108-1118 (2013).
  78. Koelzer, S., Kölsch, Y., Panfilio, K. A. Visualizing late insect embryogenesis: extraembryonic and mesodermal enhancer trap expression in the beetle Tribolium castaneum. PLoS One. 9, 103967(2014).
  79. Nakamoto, A., et al. Changing cell behaviours during beetle embryogenesis correlates with slowing of segmentation. Nat. Commun. 6, 6635(2015).
  80. Horn, T., Panfilio, K. A. Novel functions for Dorsocross in epithelial morphogenesis in the beetle Tribolium castaneum. Development. 143, 3002-3011 (2016).
  81. Benton, M. A., Akam, M., Pavlopoulos, A. Cell and tissue dynamics during Tribolium embryogenesis revealed by versatile fluorescence labeling approaches. Development. 140, 3210-3220 (2013).
  82. van der Zee, M., et al. Innexin7a forms junctions that stabilize the basal membrane during cellularization of the blastoderm in Tribolium castaneum. Development. 142, 2173-2183 (2015).
  83. Macaya, C. C., Saavedra, P. E., Cepeda, R. E., Nuñez, V. A., Sarrazin, A. F. A Tribolium castaneum whole-embryo culture protocol for studying the molecular mechanisms and morphogenetic movements involved in insect development. Dev. Genes Evol. 226, 53-61 (2016).
  84. Sarrazin, A. F., Peel, A. D., Averof, M. A Segmentation Clock with Two-Segment Periodicity in Insects. Science. 336, 338-341 (2012).
  85. Nollmann, F. I., et al. A photorhabdus natural product inhibits insect juvenile hormone epoxide hydrolase. Chembiochem. 16, 766-771 (2015).
  86. Strobl, F., Stelzer, E. H. Long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos: principles, resources, scientific challenges and the comparative approach. Curr. Opin. Insect Sci. 18, 17-26 (2016).
  87. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Digital scanned laser light-sheet fluorescence microscopy (DSLM) of zebrafish and Drosophila embryonic development. Cold Spring Harb. Protoc. 2011, 1235-1243 (2011).
  88. Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nat. Methods. 12, 30-34 (2015).
  89. Cerny, A. C., Bucher, G., Schröder, R., Klingler, M. Breakdown of abdominal patterning in the Tribolium Krüppel mutant jaws. Development. 132, (2005).
  90. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, 1065-1069 (2008).
  91. Sulston, I. A., Anderson, K. V. Embryonic patterning mutants of Tribolium castaneum. Development. 122, (1996).
  92. Berghammer, A., Bucher, G., Maderspacher, F., Klingler, M. A system to efficiently maintain embryonic lethal mutations in the flour beetle Tribolium castaneum. Dev. Genes Evol. 209, 382-389 (1999).
  93. Brown, S., et al. Implications of the Tribolium Deformed mutant phenotype for the evolution of Hox gene function. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 4510(2000).
  94. Wu, Y., et al. Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. 108, 17708-17713 (2011).
  95. Kumar, A., et al. Dual-view plane illumination microscopy for rapid and spatially isotropic imaging. Nat. Protoc. 9, 2555(2014).
  96. McGorty, R., et al. Open-top selective plane illumination microscope for conventionally mounted specimens. Opt. Express. 23, 16142-16153 (2015).
  97. Amat, F., et al. Efficient processing and analysis of large-scale light-sheet microscopy data. Nat. Protoc. 10, 1679-1696 (2015).
  98. Shcherbakova, D. M., Verkhusha, V. V. Near-infrared fluorescent proteins for multicolor in vivo imaging. Nat. Methods. 10, 751-754 (2013).
  99. Supatto, W., McMahon, A., Fraser, S. E., Stathopoulos, A. Quantitative imaging of collective cell migration during Drosophila gastrulation: multiphoton microscopy and computational analysis. Nat. Protoc. 4, 1397-1412 (2009).
  100. Royer, L. A., et al. Adaptive light-sheet microscopy for long-term, high-resolution imaging in living organisms. Nat. Biotechnol. , (2016).
  101. Keller, P. J., et al. Fast, high-contrast imaging of animal development with scanned light sheet-based structured-illumination microscopy. Nat. Methods. 7, 637-642 (2010).
  102. Caroti, F., Urbansky, S., Wosch, M., Lemke, S. Germ line transformation and in vivo labeling of nuclei in Diptera: report on Megaselia abdita (Phoridae) and Chironomus riparius (Chironomidae). Dev. Genes Evol. 225, 179-186 (2015).
  103. Handler, A. M. Use of the piggyBac transposon for germ-line transformation of insects. Insect Biochem. Mol. Biol. 32, 1211-1220 (2002).
  104. Schulte, C., Theilenberg, E., Müller-Borg, M., Gempe, T., Beye, M. Highly efficient integration and expression of piggyBac-derived cassettes in the honeybee (Apis mellifera). Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 9003-9008 (2014).
  105. Tamura, T., et al. Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nat. Biotechnol. 18, 81-84 (2000).
  106. Marcus, J. M., Ramos, D. M., Monteiro, A. Germline transformation of the butterfly Bicyclus anynana. Proc. R. Soc. B Biol. Sci. 271, 263-265 (2004).
  107. Catteruccia, F., et al. Stable germline transformation of the malaria mosquito Anopheles stephensi. Nature. 405, 959-962 (2000).
  108. Grossman, G. L., et al. Germline transformation of the malaria vector, Anopheles gambiae, with the piggyBac transposable element. Insect Mol. Biol. 10, 597-604 (2001).
  109. Labbé, G. M. C., Nimmo, D. D., Alphey, L. piggybac- and PhiC31-mediated genetic transformation of the Asian tiger mosquito Aedes albopictus (Skuse). PLoS Negl. Trop. Dis. 4, 788(2010).
  110. Patel, N. H. It's a bug's life. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 4442-4444 (2000).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mikroskopia arkusza wiat aobrazowanie fluorescencyjnemonta embrion wkolumna agarozowap kula agarozowauchwyt paj czynowyobrazowanie na ywoanaliza stosu Zbarwniki fluorescencyjne

Powiązane artykuły