Artykuł metodologiczny

In vitro Wzrost pęcherzyków przedantralnych myszy w symulowanej mikrograwitacji

10.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55641

⸱

17 grudnia 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Reproductive Medicine Center, The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, 2Department of Orthopaedics, The Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, 3Department of Obstetrics, The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, 4School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical University, 5School of Pharmaceutical Science, Wenzhou Medical University, 6Stem Cells and Genetic Engineering Group, AgriBioscience Research Centre, Department of Economic Development, Jobs, Transport and Resources, 7Department of Histology and Embryology, Wenzhou Medical University

W tym artykule

Podsumowanie

Wysoce obiecującą techniką generowania konstruktów tkankowych bez użycia matrycy jest hodowla komórek w symulowanych warunkach mikrograwitacji. Korzystając z systemu hodowli rotacyjnej, zbadaliśmy wzrost pęcherzyków jajnikowych i dojrzewanie oocytów pod kątem przeżycia pęcherzyków, morfologii, wzrostu i funkcji oocytów w symulowanych warunkach mikrograwitacji.

Streszczenie

14-dniowa tkanka jajnikowa myszy i pęcherzyki przedantralne wyizolowane od myszy w tym samym wieku były inkubowane w symulowanym systemie hodowli mikrograwitacji. Oceniliśmy ilościowo przeżywalność pęcherzyków, zmierzyliśmy średnicę pęcherzyków i oocytów oraz zbadaliśmy ultrastrukturę oocytów wytworzonych z układu. Zaobserwowaliśmy zmniejszoną przeżywalność pęcherzyków, regulację w dół ekspresji proliferującego antygenu jądrowego komórki i czynnika różnicowania wzrostu 9, jako wskaźników rozwoju odpowiednio komórek ziarnistych i oocytów oraz nieprawidłowości ultrastrukturalne oocytów w symulowanych warunkach mikrograwitacji. Symulowany układ eksperymentalny w warunkach mikrograwitacji musi zostać zoptymalizowany, aby zapewnić model do badania mechanizmów zaangażowanych w rozwój oocytu/pęcherzyka in vitro.

Wprowadzenie

Rozwój pęcherzyków jajnikowych in vitro i dojrzewanie oocytów zostały osiągnięte przy użyciu tradycyjnych metod hodowli dwuwymiarowej, takich jak na powierzchni szalek Petriego, oraz trójwymiarowej (3D) matrycy, takiej jak alginian i hydrożel1,2,3. System hodowli 3D skutecznie utrzymywał pęcherzyki w strukturze przypominającej tkankę i utrzymywał podobne profile ekspresji genów jak w in vivo4 pęcherzykach i produkował meiotycznie kompetentne oocyty5,6. Systemy hodowli 3D mogą być również tworzone w stanie wolnym od matrycy, na przykład wiszące zawiesiny kroplowe i naczynia do toczenia. Naczynie o obrotowych ściankach (RWV) opracowane przez Narodową Agencję Aeronautyki i Przestrzeni Kosmicznej (NASA) generuje symulowaną mikrograwitację (s-μg) dla komórek hodowanych wewnątrz naczynia7. Ten symulowany stan mikrograwitacji zapewnia unikalny system hodowli do proliferacji i różnicowania komórek ze względu na brak sedymentacji do konwekcji. Wykazano, że symulowana mikrograwitacja sprzyja tworzeniu się naczyń śródbłonka z komórek śródbłonka8,9, tworzenie się tkanki tarczycy z komórek tarczycy10, oraz chondrogeneza z mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej w urządzeniach RWV11. Jednak inne badania wykazały, że symulowana apoptoza wywołana mikrograwitacją w komórkach żołądka i limfoblastach B12,13,14, co sugeruje, że wpływ symulowanej mikrograwitacji na uszkodzenie komórek może być zależny od typu komórki. Symulowana mikrograwitacja może również powodować zmiany na poziomie ultrastrukturalnym, jak stwierdzono w zaburzonej organizacji wrzeciona i indukowanym cytoplazmatycznym pęcherzykach w oocytach15. Zoptymalizowane symulowane warunki mikrograwitacji i mechanizmy, które indukują inżynierię tkankową lub uszkodzenia komórkowe w systemie, wymagają dalszych badań. Eksperymenty in vitro z hodowlą pęcherzyków jajnikowych/oocytów przy użyciu urządzeń RWV mogą dostarczyć cennych informacji na temat ekspresji genów oocytów i ultrastruktur organelli oocytów. W tym badaniu wykorzystano tkankę jajnikową zawierającą pęcherzyki przedantralne i izolowane pęcherzyki przedantralne do zbadania wpływu symulowanejmikrograwitacji na rozwój pęcherzyków i dojrzewanie oocytów.

W tym badaniu, tkanka jajnikowa zawierająca pęcherzyki przedantralne i izolowane pęcherzyki przedantralne zostały wykorzystane do zbadania wpływu symulowanej mikrograwitacji na rozwój pęcherzyków i dojrzewanie oocytów. W naszym badaniu RWV, symulowane urządzenie mikrograwitacyjne, obraca się wokół osi poziomej wewnątrz inkubatora o stężeniu 5% CO2 , zapewniając symulowane warunki mikrograwitacji z wydajnym natlenieniem i bardzo niskim naprężeniem ścinającym. Przeanalizowaliśmy ekspresję genów antygenu jądrowego proliferacji komórek (PCNA) i czynnika różnicowania wzrostu 9 (GDF-9) jako wskaźników rozwoju odpowiednio komórek ziarnistych i oocytów. Wykazaliśmy, że ekspresje PCNA i GDF-9 były tłumione odpowiednio w komórkach ziarnistych i oocytach podczas hodowli w urządzeniu RWV i pokazaliśmy wycofanie mikrokosmków oocytów z osłonki przejrzystej w pęcherzykach hodowanych w warunkach s-μg, co było podobne do tego w pęcherzykach myszy z niedoborem GDF-916.

Protokół

Etyczna aprobata dla tego badania została uzyskana od Komisji Etyki Badań na Zwierzętach Wen Zhou Medical College.

1. Przygotowanie pożywki hodowlanej i hydrożelu alginianowego

  1. Przygotuj pożywkę do obsługi tkanki jajnikowej i pęcherzyków jajnikowych za pomocą pożywki L-15 z 10% płodową surowicą bydlęcą, 100 j.m./ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny. Przechowywać w temperaturze 4 °C przez dwa tygodnie.
  2. Przygotować pożywkę do hodowli tkanek jajnikowych i pęcherzyków składającą się z pożywki niezbędnej alfa-minimalnej [α-MEM] uzupełnionej 5% płodową surowicą bydlęcą [FBS], 1% transferyną insuliny-selenu, 10 mIU/ml rFSH, 100 j.m./ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny. Przechowywać w temperaturze 4 °C przez dwa tygodnie.
  3. Przygotować hydrożel alginianowy przy użyciu 0,8% (w/v) roztworu alginianu sodu w sterylnym PBS, a następnie wrzucić 10 μl tego roztworu do roztworu do kapsułkowania (140 mM NaCl /50 mM CaCl2), aby utworzyć kulki alginianowe.
    UWAGA: Rozmiar kulki alginianowej wynosił około 3 mm średnicy.

2. Izolacja i enkapsulacja mieszków włosowych myszy

  1. Usunąć 14-dniowe samice myszy ICR przez zwichnięcie szyjki macicy, usunąć jajniki aseptycznie za pomocą nożyczek i kleszczy i umieścić jajniki w 2 ml pożywki.
  2. Przeciąć jajniki na pół za pomocą skalpela. Połowa wielkości tkanki jajnika miała grubość około 1 mm do hodowli w pożywce.
  3. Ręcznie wyizoluj pęcherzyki z jajników za pomocą 26 igieł 1/2-grubych pod mikroskopem stereoskopowym 2-4X i zbierz wybrane pęcherzyki do hodowli w pożywce.
    UWAGA: Kryteria wyboru pęcherzyków: 1) pęcherzyki były okrągłe z oocytami w środku i 2-3 warstwami komórek ziarnistych otaczających oocyty, 2) pęcherzyki miały nienaruszoną błonę podstawną połączoną z niektórymi komórkami osłonki i 3) wielkość pęcherzyka wynosiła 90-100 μm średnicy
  4. Utwórz koraliki alginianowe zgodnie z krokiem 1.3. Umyj mieszki włosowe roztworem alginianu, a następnie pipetuj pojedynczy pęcherzyk do środka każdej kulki alginianu, aby upewnić się, że każda kulka zawiera pojedynczy pęcherzyk pod mikroskopem stereoskopowym. Po wypłukaniu w pożywce hodowlanej, kulki alginianowe należy wyhodować w 150 μl pożywki hodowlanej w naczyniu hodowlanym o średnicy 35×10 mm lub w urządzeniu RWV.

3. Hodowla tkanki jajnikowej lub pęcherzyków jajnikowych w symulowanej mikrograwitacji

  1. Użyj urządzenia RWV do generowania symulowanej mikrograwitacji. Napełnij naczynie lekkim olejem parafinowym (~10 ml), umieść 150 μl pożywki hodowlanej w kropelce do oleju, a następnie przenieś jeden kawałek tkanki jajnikowej lub trzy kulki alginianowe z zamkniętymi pęcherzykami do kropelki pożywki. Zamknij zaślepkę portu naczynia i przymocuj naczynie do obrotowej podstawy urządzenia.
  2. W grupach kontrolnych umieść kulki alginianowe zawierające pęcherzyki lub tkankę jajnikową w 150 μl pożywki hodowlanej w kropelce pokrytej lekkim olejem parafinowym w szalkach hodowlanych o średnicy 35×10 mm.
  3. Inkubować zarówno szalki hodowlane, jak i urządzenie do RWV w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 w powietrzu.
  4. Aby zmienić pożywkę hodowlaną w urządzeniu RWV: wlać olej i pożywkę z naczynia do naczynia hodowlanego o średnicy 150×20 mm, przenieść tkankę jajnika lub kulki alginianowe do naczynia hodowlanego z pożywką. Przywrócić system hodowli w naczyniu zgodnie z krokiem 3.1.

4. Dekapsulacja i pobieranie pęcherzyków

  1. Po 4 dniach hodowli wlej olej i pożywkę z naczynia do naczynia hodowlanego o średnicy 150×20 mm. Pobrać kulki alginianowe i zdekapsulować pęcherzyki z kulek alginianowych przez inkubację w pożywce manipulacyjnej uzupełnionej 10 j./ml liazy alginianowej przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
  2. Zebrać mieszki włosowe, a następnie umyć je w podłożu pod mikroskopem stereoskopowym.

5. Ocena tkanki jajnikowej i pęcherzyków jajnikowych

  1. Test żywotności komórek
    1. Przemyć zdekapsulowane pęcherzyki trzykrotnie w D-PBS, a następnie inkubować je w 150 μl połączonych odczynników do oznaczania żywotności komórek (2 μM kalceiny AM i 4 μM EthD-1) w temperaturze pokojowej przez 45 minut.
    2. Przenieś mieszki włosowe na czyste szkiełko mikroskopowe z 10 μL D-PBS, przykryj szkiełkiem nakrywkowym, a następnie zamknij przezroczystym lakierem do paznokci
      3. .
    3. Policz zielone i czerwone krwinki na szkiełkach pod konfokalnym mikroskopem fluorescencyjnym (400X).
      UWAGA: W tym teście żywotności zielone komórki są żywymi komórkami, a czerwone są martwymi komórkami. Mieszki włosowe z mniej niż 10% krwinek czerwonych (martwych) uważa się za pęcherzyki, które przeżyły.
  2. Barwienie hematoksyliny i eozyny (H&E) w tkance jajnika i pęcherzyku jajnikowym
    1. Napraw świeże 14-dniowe jajniki myszy i pęcherzyki przedantralne wyizolowane od 14-dniowych myszy w roztworze Bouina jako próbki dnia 0. Utrwal wyhodowaną tkankę jajnika po 2-dniowej lub 4-dniowej hodowli, a pojedyncze pęcherzyki wewnątrz kulek alginianowych po 4-dniowej hodowli jako próbki eksperymentalne.
    2. Wszystkie próbki należy zatopić w parafinie, przeciąć szeregowo na grubość 5 μm, a następnie wybarwić H&E zgodnie z instrukcjami producenta.
  3. Zliczanie mieszków włosowych i pomiar średnicy
    1. W skrawkach tkanki jajnikowej barwionych H&E należy policzyć pod mikroskopem wszystkie pęcherzyki i zdrowe pęcherzyki przedantralne w obrębie obszaru przekroju tkanki (powiększenie 400X). Obliczać gęstość pęcherzyków, dzieląc liczbę pęcherzyków przedantralnych przez całkowitą liczbę pęcherzyków.
      UWAGA: zdrowe pęcherzyki przedantralne to te, które mają co najmniej dwie warstwy komórek ziarnistych.
    2. Zmierz średnicę pęcherzyków i oocytów pęcherzyków dnia 0 i pęcherzyków hodowlanych dnia 4.
  4. Immunohistochemia
    1. Utrwalić tkankę jajnika w 4% paraformaldehydzie, zatopić w parafinie, przeciąć na grubość 5 μm i zamontować skrawki tkanki na szkiełkach. Odparafinować skrawki, ponownie się nawodnić i inkubować je w buforze cytrynianowym przez 15 minut. Zablokuj endogenną peroksydazę w 3% nadtlenku wodoru, zdemaskuj antygen w 5% koziej surowicy, a następnie inkubuj z pierwszorzędowymi przeciwciałami w temperaturze pokojowej przez 3 godziny.
      1. Myć w PBS przez 3 minuty, a następnie inkubować szkiełka z 1:500 rozcieńczoną kozią peroksydazą chrzanową (HRP) anty-króliczą IgG (H+L) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
        UWAGA: Podstawowymi przeciwciałami stosowanymi w badaniu były królicze przeciwciało anty-GDF-9 (rozcieńczenie 1:500) i przeciwciało królika anty-PCNA (rozcieńczenie 1:200).
    2. Inkubować szkiełka do cięcia jajników z 3,3'-diaminobenzydyną [DAB] w celu wykrycia aktywności peroksydazy i zamontować na szkiełkach z wodnym podłożem montażowym.
    3. Obserwuj preparaty z wycinkiem jajnika pod mikroskopem w powiększeniu 400x.
  5. Transmisyjna mikroskopia elektronowa [TEM]
    1. Utrwalić mieszki włosowe w 2,5% aldehydzie glutarowym przez 3 godziny w temperaturze pokojowej, a następnie utrwalić w 1% tetratlenku osmu przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Przemyć PBS, a następnie potraktować mieszki włosowe 1% kwasem fosfowolframowym i 1% octanem uranylu sodu przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Odwodnić mieszki włosowe za pomocą acetonu Seria: 25, 50, 75, 95 i 100% (3 razy) oraz mieszanina żywicy epoksydowej i acetonu po końcowym 100% etapie acetonu w temperaturze 37 °C, a następnie zatopić w żywicy epoksydowej w temperaturze 45 °C.
    2. Pokrój osadzone bloki na półcienkie sekcje o grubości 1,0 μm i zabarwij je 1% błękitem metylenowym przez 1-2 minuty, aby zlokalizować mieszki włosowe w blokach. Pokrój osadzone bloki na ultracienkie sekcje 50 nm i zamontuj je na siatkach do TEM.

6. Analiza statystyczna

  1. Przedstaw wszystkie dane w formacie średniej ± SEM. Określ różnice między grupami za pomocą jednokierunkowej analizy wariancji (ANOVA), a następnie testu wielokrotnego porównania Tukeya. Próg α istotności wyniku badania ustalono na poziomie p < 0,05.

Wyniki


Rycina 1A przedstawia RWV z olejem wewnątrz naczynia. Kroplę 150 µL pożywki zawierającą jeden fragment tkanki jajnika lub trzy kuleczki alginianowe z enkapsulowanymi pęcherzykami umieszczono w oleju. Kropla pożywki została utrzymana w stanie prędkości granicznej dzięki oporowi płynu działającemu na krople w obracającym się oleju przy prędkości 25 obrotów na minutę, co wygenerowało warunki symulowanej mikrograwitacji (s-µg). W eksperymencie kontrolnym tkankę jajnika lub enkapsulowane pęcherzyki hodowano w kropli 150 µL pożywki przykrytej olejem mineralnym w szalkach 35×10mm (Rycina 1B), co wygenerowało warunki 1-g.

Aby zbadać wpływ symulowanej mikrograwitacji na rozwój pęcherzyków przedantralnych in vitro, hodowaliśmy tkankę jajnika myszy w 14. dniu życia w warunkach 1-g (eksperyment kontrolny) lub s-µg. Policzyliśmy liczbę zdrowych pęcherzyków w przekrojach barwionych H&E w obu warunkach po 0, 2 i 4 dniach hodowli (Rysunek 2). Stwierdzono, że przeżywalność pęcherzyków w tkance jajnika poddanej warunkom s-µg była istotnie niższa niż w warunkach 1-g w 2. i 4. dniu hodowli (p <0,05, ANOVA). Ponadto stwierdzono, że w tkance jajnika w warunkach s-µg nie wykryto sygnałów pozytywnych dla PCNA (Rysunek 3). W hodowli izolowanych pęcherzyków przedantralnych zamkniętych w kuleczkach alginianowych wykazaliśmy, że w 4. dniu hodowli istotnie więcej pęcherzyków przetrwało w warunkach 1-g (76,8% ± 5,3%, n = 227) niż w warunkach s-µg (54,4% ± 6,7%, n = 249). Ponadto wielkość oocytu nie uległa istotnemu zwiększeniu po 4 dniach hodowli, mimo że wielkość pęcherzyka znacząco wzrosła w obu warunkach grawitacyjnych (Rysunek 4). Jednak liczba pęcherzyków z mniej niż 10% martwych komórek ziarnistych (Rysunek 5) była istotnie niższa w warunkach 1-g (81,5 ± 5%, n = 10) niż w warunkach s-µg (90 ± 8%, n = 10) (p <0,05).

Aby zbadać wpływ symulowanej mikrograwitacji na funkcjonalność oocytów, przeanalizowano ekspresję swoistego dla oocytów markera GDF-9. Wykazano, że ekspresja GDF-9 była wyraźnie obniżona w tkance jajnika w warunkach s-µg (Rycina 6). Ponadto wykazano częste nieprawidłowości ultrastrukturalne organelli oocytów w enkapsulowanych pęcherzykach w 4. dniu hodowli w warunkach s-µg (Rycina 7).

Układ mikroprzepływowy; hodowla tkanek; aparatura eksperymentalna, badanie wzrostu komórek, szalka Petriego, próbka.
Rycina 1Konfiguracja s-µg oraz 1-g warunki hodowli (A) s-µg został stworzony przez rotacyjny zbiornik ścienny (rotating wall vessel), który utrzymuje badane kultury w stanie ciągłego swobodnego spadku w poruszającej się oliwie.B) A 1-g warunki uzyskano poprzez hodowlę tkanki jajnika lub pęcherzyków na powierzchni szalki Petriego pokrytej olejem mineralnym. Strzałka wskazuje kroplę pożywki. Pasek skali = 1 cm. Rysunek zmodyfikowano na podstawie pracy Zhang i wsp.17 Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza gęstości mieszyków; obrazy histologiczne i wykres słupkowy przedstawiający grupę kontrolną w porównaniu z S-µg przez 4 dni.
Rysunek 2: Wpływ s-µg na hodowlę tkanki jajnika. (A) Przekroje tkanki jajnika hodowanej w warunkach 1-g lub s-µg przez 0, 2 i 4 dni. Pasek skali = 50 µm. (B) Gęstość mieszyków w przekrojach tkanki jajnika. Słupek błędu reprezentuje 1 SEM, *: p <0.05. Rysunek zmodyfikowano na podstawie pracy Zhang et al.17 Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Porównanie histologiczne, kontrola vs S-μg, w dniach 0, 2, 4; obraz mikroskopowy, analiza badania komórek.
Rysunek 3: Immunohistochemia PCNA. Ekspresję białka PCNA badano w komórkach granulacyjnych w tkance jajnika hodowanej w warunkach 1-g lub s-µg przez 0, 2 i 4 dni. Pasek skali = 50 µm. Rysunek zmodyfikowano na podstawie pracy Zhang et al.17 Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Porównanie średnicy oocytów i pęcherzyków; obrazy mikroskopowe i wykresy słupkowe przedstawiające wyniki grupy kontrolnej oraz S-µg.
Rycina 4: Wpływ s-µg na hodowlę inkapsulowanych pęcherzyków przedantralnych w kuleczkach alginianowych. (A) Morfologia pęcherzyków przedantralnych hodowanych w warunkach 1-g lub s-µg przez 0 dni oraz 4 dni. Pasek skali = 50 µm. (B) Porównanie średnicy oocytów oraz (C) średnicy pęcherzyków w warunkach 1 g i s-µg. Słupek błędu reprezentuje 1 SEM, *: p <0.05. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Zhang et al.17 Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Mikroskopia fluorescencyjna, sferoidy z testem żywotności komórek, kolor zielony dla komórek żywych, czerwony dla martwych.
Rycina 5: Test żywotności komórek. Przedstawiono reprezentatywne obrazy wykonane pod mikroskopem przy powiększeniu 400X. W teście wykorzystano Calcein AM do wizualizacji żywych komórek barwionych na zielono oraz EthD-1 do wizualizacji jąder martwych komórek barwionych na czerwono. (A): Męchewka z ~100% żywych komórek ziarnistych (zielone). (B): Męchewka z żywymi komórkami ziarnistymi (zielone), a także z ponad 10% martwych komórek (czerwone). Pasek skali = 50 µm. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Zhang et al.17 Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Porównanie histologiczne próbek kontrolnych i S-μg w ciągu czterech dni; wyniki analizy mikroskopowej.
Rycina 6: Immunohistochemia GDF-9. Ekspresję białka GDF-9 badano w oocytach w tkance jajnika hodowanej w warunkach 1-g lub s-µg przez 0, 2 i 4 dni. Pasek skali = 50 µm. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Zhang et al.17 Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Obrazy z mikroskopii elektronowej ukazujące ultrastrukturę komórkową przy różnych powiększeniach; dołączono paski skali.
Rycina 7: Analiza ultrastrukturalna izolowanych pęcherzyków przedantralnych hodowanych w warunkach 1-g lub s-µg w 4. dniu hodowli. (A) Oocyt z mikrokosmami (strzałki) rozciągającymi się do strefy błonistej (warunki 1-g ). (B-F) Oocyty z dużymi wakuolami (*), ciałami wielolaminarnymi (#), kroplami lipidowymi (strzałki), wakuolizowanymi mitochondriami pozbawionymi grzebieni (strzałka) oraz rozproszonym aparatem Golgiego (strzałka), odpowiednio (warunki s-µg ). O: oocyt; ZP: zona pellucida. Rycina została zmodyfikowana na podstawie Zhang et al.17 Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Dyskusja

Kluczowymi etapami udanej hodowli pęcherzyków przedantralnych są: 1) prawidłowy wybór pęcherzyków przedantralnych zgodnie z kryteriami selekcji, które zostały opisane w tekście protokołu 2.1); 2) wykonywanie wszystkich zabiegów w stanie sceptycznym i utrzymywanie sterylnego posiewu; oraz 3) prawidłowe ustawienie systemu hodowli RWV.

Zapewnienie spójności obserwacji eksperymentalnych w powtórzonych eksperymentach polega na użyciu podobnych lub identycznych materiałów. Kryteria wyboru pęcherzyków przedantralnych myszy wykazały, że pęcherzyki miały 1) zdrowe oocyty na etapie rozpadu pęcherzyków rozrodczych (GVBD) otoczone cienką osłonką przejrzystą; 2) 2-3 warstwy komórek ziarnistych otoczone błoną podstawną; i 3) niektóre komórki tekcalowe przyczepione do błony podstawnej. W ten sposób wybrane pęcherzyki miały nie tylko wszystkie trzy funkcjonalne przedziały pęcherzyka jajnikowego wspomagające wzrost oocytów, ale także podobną identyfikację morfologiczną o średnicy 90 - 100 μm.

Jest to pierwsza próba wyhodowania mysich pęcherzyków przedantralnych w sposób hodowli 3D w symulowanej mikrograwitacji. Opracowano kilka systemów hodowli pęcherzyków przedantralnych myszy. Oocyty uzyskane z pęcherzyka wyhodowanego na płaskiej powierzchni szalek Petriego, tzw. kultura 2D, mogły zostać zapłodnione i wyprodukować żywe potomstwo. Co więcej, hodowle 3D, takie jak hodowle pęcherzyków w kulkach alginianowych, utrzymują strukturę tkankową podobną do tej, którą organizm wytwarza w wysokim procencie komórek jajowych kompetentnych mejotycznie. Jednak proces rozwoju pęcherzyków jajnikowych/oocytów w polu zerowej grawitacji jest nieznany. RWV, urządzenie, które przyciąga dużą uwagę w inżynierii tkankowej, może generować symulowane środowisko mikrograwitacji i stanowić idealne środowisko do badania wpływu symulowanej mikrograwitacji na wzrost pęcherzyków jajnikowych/oocytów in vitro.

Ważne jest, aby odpowiednio ustawić aparat RWV do hodowli komórkowej. Pęcherzyki powietrza w naczyniu muszą zostać usunięte. Metoda usuwania pęcherzyków powietrza, jeśli powstają w naczyniu, jest następująca: Umieścić dwie strzykawki z 0,5 ml oleju w każdym z dwóch portów strzykawki. Otwórz zawory sterujące portami strzykawki. Manewruj pęcherzykami powietrza pod portem strzykawki. Wciągnąć pęcherzyki do strzykawki, jednocześnie wstrzykując mniej więcej taką samą objętość pożywki przez drugi port strzykawki. Po usunięciu wszystkich pęcherzyków zamknij zawory, wyjmij strzykawki i załóż zaślepki portu strzykawki. Bardzo ważne jest również ustalenie prawidłowej prędkości obrotowej, która zapobiega osiadaniu komórek poprzez ciągły obrót. Optymalizacja prędkości obrotowej zależy od ciężaru właściwego ogniw, gęstości płynu i lepkości.

Profile ekspresji PCNA i GDF-9, które były podobne do tych w pęcherzykach myszy z niedoborem GDF-916, ujawniły, że symulowana mikrograwitacja miała szkodliwy wpływ na rozwój komórek ziarnistych i oocytów. Naczynie urządzenia RWV obracało się wokół osi poziomej wewnątrz inkubatora o stężeniu 5%CO2 , co pozwalało na przenikanie tlenu i dwutlenku węgla przez membranę z tyłu, zapewniając skuteczne natlenienie i bardzo niskie naprężenia ścinające, co było mało prawdopodobne, aby było przyczyną uszkodzenia pęcherzyków/oocytów. Konieczna jest optymalizacja konfiguracji eksperymentalnej i dalsze analizy w celu zbadania mechanizmu szkodliwych skutków.

Potrzebne są dalsze badania w celu zbadania potencjału rozwojowego oocytów in vitro pochodzących z systemu hodowli RWV. Obecnie prowadzone jest dojrzewanie komórek jajowych in vitro do stadium MII. Ostateczna walidacja tego systemu hodowli zostanie zbadana na podstawie zdolności do zapłodnienia pobranych oocytów.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Yilong Wang i Yanlin Zhao za pomoc w utrzymaniu zwierząt, Chan Zhang za pomoc w przygotowaniu próbek histologicznych oraz dr Songtao He za krytyczne przeczytanie tego rękopisu. Prace te były wspierane przez Fundację Nauk Przyrodniczych Prowincji Zhejiang (numer grantu: LY13C120002).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Myszy ICRSLRC Laoratory14-dniowe samice myszy
L-15 mediumSigmaL1518Z L-glutaminą, płynny, sterylnie filtrowany, odpowiedni do hodowli komórkowych
płodowej surowicy bydlęcejGibco10100147Pochodzenie: Australia
Penicylina V potasSigma1504503Farmakopea Stanów Zjednoczonych (USP) Wzorzec referencyjny (USP)
Hydrat sesquisulfate streptomycynySigma46754Wzorzec analityczny
Uniwersalny  Kliknij  Igły do długopisówPenfine12 razy; 1/2" 0,33 razy; 12 mm
AlginateSigmaW201502
alfa-minimalna pożywka niezbędnaSigmaM0894Alpha Modification, z L-glutaminą, bez rybonukleozydów, dezoksyrybonukleozydów i wodorowęglanu sodu, w proszku, odpowiednia do hodowli komórkowych
Insulina-selen-transferynaInvitrogen51500056Płynny, sterylnie filtrowany, BioReagent, odpowiedni do hodowli komórkowych
GONAL-FMerck SeronoRekombinowana folitropina alfa do wstrzykiwań
Jednorazowe naczynie obrotowe o wysokim współczynniku kształtuSynthecon10 mL
Olej hodowlanyVitrolifeSterylny lekki olej
parafinowy Lizja alginianowaProszek SigmaA1603, >10 000 jednostek/g stała
igła 26 1/2-gaugeBecton Dickinson
35 i razy; Szalka 10 mmBecton Dickinson
Test żywotności/cytotoksyczności ZestawInvitrogenL3224
Bouin' s roztwórSigmaHT10132
Peroksydaza chrzanowa (HRP)-sprzężona kozia anty-królicza IgG (H+L)Jackson Immuno-Research Laboratories111-035-003
3,3N-diaminobenzydyna TertrahydrochlorowodorekBeyotimeP0203
Wodne podłoże montażoweDakoC0563
Królicze przeciwciało anty-GDF-9Biosynteza pekińska BiotechnologiaBS-175R
Królicze przeciwciało anty-PCNAProteintech24036-1-AP
Błękit metylenowySigmaM9140
Transmisyjny mikroskop elektronowyHitachiH-7500

Bibliografia

  1. Eppig, J. J., Schroeder, A. C. Capacity of mouse oocytes from preantral follicles to undergo embryogenesis and development to live young after growth, maturation, and fertilization in vitro. Biol Reprod. 41, 268-276 (1989).
  2. O'Brien, M. J., Pendola, J. K., Eppig, J. J. A revised protocol for in vitro development of mouse oocytes from primordial follicles dramatically improves their developmental competence. Biol Reprod. 68, 1682-1686 (2003).
  3. Liu, J., Van der Elst, J., Van den Broecke, R., Dhont, M. Live offspring by in vitro fertilization of oocytes from cryopreserved primordial mouse follicles after sequential in vivo transplantation and in vitro maturation. Biology of Reproduction. 64, 171-178 (2001).
  4. Parrish, E. M., Siletz, A., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. Gene expression in mouse ovarian follicle development in vivo versus an ex vivo alginate culture system. Reproduction. 142, 309-318 (2011).
  5. Xu, M., Kreeger, P. K., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Tissue-engineered follicles produce live, fertile offspring. Tissue Eng. 12, 2739-2746 (2006).
  6. Xu, M., West, E., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Identification of a stage-specific permissive in vitro culture environment for follicle growth and oocyte development. Biol Reprod. 75, 916-923 (2006).
  7. Grimm, D., et al. Growing tissues in real and simulated microgravity: new methods for tissue engineering. Tissue engineering. Part B, Reviews. 20, 555-566 (2014).
  8. Grimm, D., et al. Different responsiveness of endothelial cells to vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor added to culture media under gravity and simulated microgravity. Tissue engineering Part A. 16, 1559-1573 (2010).
  9. Grimm, D., et al. A delayed type of three-dimensional growth of human endothelial cells under simulated weightlessness. Tissue engineering. Part A. 15, 2267-2275 (2009).
  10. Pietsch, J., et al. Interaction of proteins identified in human thyroid cells. International journal of molecular sciences. 14, 1164-1178 (2013).
  11. Yu, B., et al. Simulated microgravity using a rotary cell culture system promotes chondrogenesis of human adipose-derived mesenchymal stem cells via the p38 MAPK pathway. Biochem Biophys Res Commun. 414, 412-418 (2011).
  12. Maier, J. A., Cialdai, F., Monici, M., Morbidelli, L. The impact of microgravity and hypergravity on endothelial cells. Biomed Res Int. 2015, 434803(2015).
  13. Zhu, M., Jin, X. W., Wu, B. Y., Nie, J. L., Li, Y. H. Effects of simulated weightlessness on cellular morphology and biological characteristics of cell lines SGC-7901 and HFE-145. Genet Mol Res. 13, 6060-6069 (2014).
  14. Dang, B., et al. Simulated microgravity increases heavy ion radiation-induced apoptosis in human B lymphoblasts. Life Sci. 97, 123-128 (2014).
  15. Wu, C., et al. Simulated microgravity compromises mouse oocyte maturation by disrupting meiotic spindle organization and inducing cytoplasmic blebbing. PLoS One. 6, e22214(2011).
  16. Dong, J., et al. Growth differentiation factor-9 is required during early ovarian folliculogenesis. Nature. 383, 531-535 (1996).
  17. Zhang, S., et al. Simulated Microgravity Using a Rotary Culture System Compromises the In Vitro Development of Mouse Preantral Follicles. PLoS One. 11, e0151062(2016).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kultura p cherzyk w przedantralnychwzrost p cherzyk w in vitrotkanka jajnika myszyizolacja p cherzyk wenkapsulacja w alginianierotacyjny system hodowliultrastruktura oocyt wkom rki granulozytest ywotno ci kom rek

Powiązane artykuły