Method Article

Izolacja pośrednich białek filamentowych z wielu tkanek myszy w celu zbadania modyfikacji potranslacyjnych związanych ze starzeniem się

DOI:

10.3791/55655

⸱

May 18th, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology and Physiology, School of Medicine, University of North Carolina at Chapel Hill

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tej metodzie prezentujemy procedury biochemiczne do szybkiej i efektywnej izolacji pośrednich białek filamentowych (IF) z wielu tkanek myszy. Izolowane IFs mogą być wykorzystywane do badania zmian w modyfikacjach potranslacyjnych za pomocą spektrometrii mas i innych testów biochemicznych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Filamenty pośrednie (IFs), wraz z filamentami aktynowymi i mikrotubulami, tworzą cytoszkielet - krytyczny element strukturalny każdej komórki. Normalnie funkcjonujące IF zapewniają komórkom odporność mechaniczną i stresową, podczas gdy dysfunkcyjny cytoszkielet IF zagraża zdrowiu komórkowemu i jest związany z wieloma chorobami ludzkimi. Modyfikacje potranslacyjne (PTM) krytycznie regulują dynamikę IF w odpowiedzi na zmiany fizjologiczne i w warunkach stresu. W związku z tym możliwość monitorowania zmian w sygnaturze PTM IF może przyczynić się do lepszego funkcjonalnego zrozumienia i ostatecznie uwarunkowania systemu IF jako reagowania na stres podczas uszkodzenia komórki. Jednak duża liczba białek IF, które są kodowane przez ponad 70 pojedynczych genów i ulegają ekspresji w sposób zależny od tkanki, stanowi poważne wyzwanie w ustaleniu względnego znaczenia różnych PTM. W tym celu metody, które umożliwiają monitorowanie PTM na białkach IF na poziomie całego organizmu, a nie dla izolowanych członków rodziny, mogą przyspieszyć postęp badań w tej dziedzinie. W tym miejscu przedstawiamy biochemiczne metody izolacji całkowitej, rozpuszczalnej w detergentach i odpornej na detergenty frakcji białek IF z 9 różnych tkanek myszy (mózgu, serca, płuc, wątroby, jelita cienkiego, jelita grubego, trzustki, nerek i śledziony). Ponadto demonstrujemy zoptymalizowany protokół szybkiej izolacji białek IF za pomocą matrycy lizy i automatycznej homogenizacji różnych tkanek myszy. Zautomatyzowany protokół jest przydatny do profilowania IFs w eksperymentach z dużą objętością próbki (np. w modelach chorób obejmujących wiele zwierząt i grup eksperymentalnych). Otrzymane próbki można wykorzystać do różnych dalszych analiz, w tym do profilowania PTM opartego na spektrometrii mas. Wykorzystując te metody, dostarczamy nowe dane, aby pokazać, że białka IF w różnych tkankach myszy (mózgu i wątroby) ulegają równoległym zmianom w odniesieniu do ich poziomów ekspresji i PTM podczas starzenia.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

IFs to rodzina białek, które u ludzi są kodowane przez 73 geny i podzielone na sześć głównych typów: typy I-IV są cytoplazmatyczne (np. keratyny nabłonkowe i włosowe (K), miocyty desminy, neurofilamenty, białko fibrylarne gleju (GFAP) i inne); typ V to laminy jądrowe; a typ VI to IF-y w soczewce oka1. Pod względem organizacji molekularnej, białka IF mają trzy wspólne domeny: wysoce konserwatywną domenę "prętową" zwiniętą cewką oraz kuliste domeny "głowy" i "ogona". Tetramery białkowe IF łączą się, tworząc prekursory krótkich włókien, które ostatecznie są włączane do dojrzałych włókien, które kształtują dynamiczne struktury cytoszkieletu i nukleoszkieletu zaangażowane w ochronę mechaniczną2, stress sensing3,4, regulacja transkrypcji5 i wzrostu oraz inne krytyczne funkcje komórkowe1,6,7.

Funkcjonalne znaczenie systemu IF jest podkreślone przez istnienie wielu chorób ludzkich spowodowanych mutacjami typu missense w genach IF, w tym neuropatii, miopatii, zaburzeń łamliwości skóry, dysfunkcji metabolicznych i zespołów przedwczesnego starzenia8. Niektóre mutacje genu IF nie powodują, ale predysponują ich nosicieli do progresji choroby, jak na przykład proste keratyny nabłonkowe w chorobach wątroby9. To ostatnie wynika z krytycznych funkcji ochronnych przed stresem IF w nabłonku. Ogólnie rzecz biorąc, IFy są jednymi z najliczniejszych białek komórkowych w warunkach podstawowych, ale są dodatkowo silnie indukowane podczas różnych rodzajów stresu10. Na przykład ostatnie badania oceniające zmiany w całym proteomie u nicienia C. elegans wykazały, że wiele IF jest silnie regulowanych w górę i podatnych na agregację podczas starzenia się organizmu11,12. Ponieważ utrzymanie prawidłowej struktury IF jest niezbędne dla odporności komórek na różne formy stresu10, agregacja IF może również przyczyniać się do pogorszenia funkcjonalności podczas starzenia. Brakuje jednak badań na poziomie organizmów analizujących wiele białek IF ssaków w różnych tkankach poddawanych stresowi.

IFs to wysoce dynamiczne struktury, które dostosowują się do wymagań komórkowych. Keratyny, na przykład, przechodzą niezależny od biosyntezy cykl między rozpuszczalną (nienitkowatą) i nierozpuszczalną (nitkowatą) pulą białek13. W normalnych warunkach fizjologicznych około 5% całkowitej puli K8/K18 można wyekstrahować w buforze bez detergentów, w porównaniu do około 20%, które można rozpuścić w niejonowym detergencie Nonidet P-40, który jest biochemicznie porównywalny z Triton-X10014,15. Podczas mitozy następuje zauważalny wzrost rozpuszczalności nabłonka prostego typu K8 i K1814, co jest mniej widoczne w keratynach naskórka, ale bardziej widoczne w wimentynie i innych białkach IF typu III15,16. Właściwości rozpuszczalności białek IF są ściśle regulowane przez fosforylację, kluczową modyfikację potranslacyjną (PTM) dla przegrupowania włókien i rozpuszczalności17,18,19,20. Większość IF-ów jest poddawana szeroko zakrojonej regulacji przez szereg PTM w miejscach chronionych, co skutkuje zmianami funkcjonalnymi17.

Celem tej metody jest zapoznanie badaczy, którzy są nowicjuszami w dziedzinie IF, z biochemicznymi metodami ekstrakcji i analiz do badania białek IF w wielu tkankach myszy. W szczególności koncentrujemy się na izolacji białek IF przy użyciu metody ekstrakcji o wysokiej zawartości soli i ocenie zmian w PTM za pomocą spektrometrii mas i przeciwciał ukierunkowanych na PTM. Metody te opierają się na wcześniej opublikowanych procedurach21, ale zawierają modyfikacje ekstrakcji różnych typów białek IF w celu odkrycia wspólnego mechanizmu regulacji w całej rodzinie IF. Na przykład acetylacja K8 przy określonej reszcie lizyny reguluje organizację włókien, podczas gdy hiperacetylacja sprzyja nierozpuszczalności K8 i tworzeniu agregatów22. Ostatnie globalne badania profilowania proteomicznego wykazały dodatkowo, że większość specyficznych tkankowo białek IF jest również celami acetylacji i że większość miejsc acetylacji IF jest ograniczona do wysoce konserwatywnej domeny pręcików. Uwypukla to potrzebę opracowania metod odpowiednich do globalnego profilowania systemu IF. Wprowadzamy również szybką metodę izolacji białek IF z wielu tkanek za pomocą automatycznej homogenizacji w zoptymalizowanej matrycy lizy. Otrzymane preparaty nadają się do dalszej analizy PTM za pomocą spektrometrii mas i innych metod.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół został zatwierdzony i wykonany zgodnie z Instytucjonalnym Komitetem ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Północnej Karoliny.

1. Przygotowania

  1. Przygotować bufor Triton-X (1% Triton X-100, 5 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), zwiększyć objętość w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), pH 7,4). Aby uzyskać 500 ml: wymieszaj po 5 ml Triton X-100 i 500 mM EDTA z 490 ml PBS o pH 7,4. Przechowywać roztwór buforowy Triton-X w temperaturze 4 °C.
  2. Przygotować bufor o wysokiej zawartości soli (10 mM Tris-HCl, pH 7,6, 140 mM NaCl, 1,5 M KCl, 5 mM EDTA, 0,5% Triton X-100, zwiększyć objętość w podwójnie destylowanym (dd) H2O). Aby przygotować 500 ml: wymieszaj 10 ml 0,5 M Tris-HCl (pH 7,6), 14 ml 5 M NaCl, 55,9 g KCl, 5 ml 0,5 M EDTA i 2,5 ml Triton X-100, dostosuj objętość do 500 ml za pomocą podwójnie destylowanej wody). Przechowywać roztwór buforowy o wysokiej zawartości soli w temperaturze 4 °C.
  3. Tuż przed użyciem należy uzupełnić odpowiednią ilość Triton-X i buforu o wysokiej zawartości soli (np. 1 ml na każdą próbkę tkanki o objętości 25 mg) koktajlem proteazy lub inhibitora proteazy/fosfatazy i wyrzucić wszelkie niewykorzystane zawierające inhibitory.
  4. Przygotuj 5 mM EDTA w 1x PBS, pH 7,4. Aby uzyskać 500 ml: wymieszaj 5 ml 0,5 M EDTA z 495 ml 1x PBS, pH 7,4.
  5. Izoluj różne narządy myszy (mózg, serce, płuca, wątrobę, trzustkę, okrężnicę, jelito, nerki, śledzionę) przy użyciu zatwierdzonych protokołów, które są zgodne z wytycznymi weterynaryjnymi i standardami instytucjonalnymi23. Procedura pobrania tkanek nie powinna trwać dłużej niż 5 minut, aby zachować integralność RNA i białek tkanek bogatych w proteazy (np. najpierw należy przetworzyć trzustkę).
  6. Wytnij niewielką ilość tkanki (~ 5-20 mg) i umieść w roztworze do przechowywania RNA w celu późniejszej ekstrakcji RNA, syntezy cDNA i ilościowej analizy PCR w czasie rzeczywistym pod kątem ekspresji genu IF. Umieścić probówki z roztworem do przechowywania RNA z tkanką w temperaturze 4 °C na noc i postępować zgodnie z protokołem producenta w celu przeprowadzenia dalszych etapów przechowywania i izolacji.
  7. Resztę tkanki pokrój na mniejsze fragmenty (np. 0,5 cm) i umieść w kriowalu. Fiolki należy zamrozić i przechowywać w temperaturze -80 °C lub ciekłym azotem w celu długotrwałego przechowywania.

2. Analiza ekspresji genów IF

  1. Ekstrahować RNA z tkanek zachowanych w odczynniku do przechowywania RNA. Użyj dowolnej odpowiedniej/preferowanej metody ekstrakcji RNA zgodnie z protokołem producenta.
  2. Określ ilościowo stężenie RNA i użyj 2 μg RNA do wygenerowania cDNA za pomocą odpowiedniego zestawu do odwrotnej transkrypcji zgodnie z protokołem producenta.
  3. Korzystając z wygenerowanego cDNA i mysich starterów specyficznych dla genu IF, przeprowadzono reakcje qPCR, w tym trzy powtórzenia techniczne każdej próbki, a także ślepą próbę kontrolną zgodnie z protokołem producenta.
  4. Określ ilościowo ekspresję genu IF jako zmianę fałdowania, porównując różne warunki (np. młoda i stara tkanka).

3. Przygotowanie całkowitych lizatów tkankowych dla immunoblot

  1. Homogenizować 25 mg tkanki w 1 ml 2x nieredukującego buforu próbki SDS. Należy pominąć niebieski barwnik bromofenolowy w buforze próbki, jeżeli ma być przeprowadzony kolorymetryczny test białka w celu ilościowego określenia stężenia białka.
  2. Dodać 5% (v/v) 2-merkaptoetanolu (2-ME) w celu uzyskania zredukowanych próbek. Do 200 μl próbek nieredukcyjnych dodać 10 μl 2-ME.
  3. Określić stężenie białka za pomocą testu białkowego kompatybilnego z detergentem i środkiem redukującym. Jeśli barwnik jest już zawarty w buforze próbki, ilość białka można oszacować po przeprowadzeniu żelu za pomocą wielu technik, w tym stain24 na bazie Coomassie.
  4. Zwirować wszystkie próbki i ogrzewać w temperaturze 95 °C przez 5 minut.
  5. Wykonuj western blot zarówno w warunkach redukcyjnych, jak i nieredukcyjnych. Błona ekspozycyjna na krótko (<1 min) w celu ujawnienia gatunków monomerycznych i dłużej (>1 min) w celu ujawnienia kompleksów o dużej masie cząsteczkowej zawierających białka IF. W przypadku monitorowania agregacji należy zbadać cały żel/membranę (w tym dna studzienek żelowych).
  6. Uruchom równoległy żel i barwnik z barwnikiem białkowym jako kontrolę ładowania24. W modelach chorób lub eksperymentach z urazami całkowite barwienie białkowe powinno być używane jako kontrola obciążenia, w przeciwieństwie do immunoblotów dla białek "porządkowych" (np. aktyny, GAPDH), ponieważ te ostatnie zmieniają się w różnych warunkach stresu.

4. Przygotowanie rozpuszczalnych w detergentach i wysokosolnych ekstraktów IFs specyficznych dla tkanek

  1. Dodaj 1 ml lodowatego buforu Triton X-100 do homogenizatora ze szklaną rurką i umieść go na lodzie.
  2. Wyjmij mały kawałek tkanki (~25 mg) z magazynu ciekłego azotu i umieść bezpośrednio w szklanym homogenizatorze. Do homogenizacji użyj tłuczka z politetrafluoroetylenu (50 pociągnięć) i unikaj tworzenia pęcherzyków. Homogenizator i lizat powinny być zawsze chłodne.
  3. Przenieść lizat do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml na lodzie i odwirować przy 20 000 x g przez 10 minut we wstępnie schłodzonej wirówce (4 °C).
  4. Zebrać frakcję sklarowanej nad osadem do osobnej probówki. Jest to frakcja rozpuszczalna w Triton X, która może być stosowana do immunoprecypitacji (i.p.) i analizy rozpuszczalnej w detergentach puli białek IF. Należy pamiętać, że kroki 4.1-4.4 można powtórzyć, aby uzyskać czystszy ekstrakt IF z tkanki mózgowej.
  5. Dodaj 1 ml buforu o wysokiej zawartości soli do osadu tkankowego, przenieś do czystego homogenizatora i wykonaj 100 uderzeń. Przenieść homogenat z powrotem do probówki do mikrowirówki i umieścić probówkę na obracającej się wytrząsarce w chłodni na 1 godzinę.
  6. Odwirować homogenaty w temperaturze 20 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
  7. Dodaj 1 ml lodowatego buforu PBS/EDTA do granulki i homogenizuj granulkę (20 cykli) w czystym homogenizatorze jako końcowy etap czyszczenia*. Przenieść do nowej probówki i odwirować przy 20 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu uzyskania bogatego w białko ekstraktu o wysokiej zawartości soli (HSE) IF.
    * Opcjonalnie wir zamiast homogenizacji na tym etapie.
  8. Odrzucić supernatant i rozpuścić granulki w 300 μl nieredukującego buforu do próbek SDS, który został wstępnie podgrzany. Najpierw rozdrobnić osad przez pipetowanie i wirowanie, a następnie podgrzewać próbki przez 5 minut w temperaturze 95 °C.
  9. Wirować i pipetować w razie potrzeby, aby upewnić się, że osad się rozpuścił. Całkowite rozpuszczenie granulek może potrwać kilka minut.
  10. Wszystkie próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu analizy.

5. Zautomatyzowana liza tkanek do ekstrakcji białka IF w eksperymentach na dużą skalę

  1. W celu ekstrakcji RNA należy umieścić bufor do lizy (600 μl buforu na 25 mg tkanki) w probówce zawierającej matrycę lizującą D (wykorzystuje małe kulki ceramiczne) i pulsować dwukrotnie przez 25 s w lizerze tkankowym. Oddzielić lizat od matrycy przez odwirowanie przy 20 000 x g i przejść do następnego etapu w izolacji.
  2. W celu ekstrakcji białek należy umieścić Triton X-100 (lub bufor próbki SDS w przypadku przygotowywania całkowitego lizatu) w probówce do lizy z matrycą lizy SS (użyć pojedynczego koralika ze stali nierdzewnej). Po przetestowaniu wielu matryc wybrano tę matrycę, ponieważ wytwarza ona ekstrakty białkowe IF, które są podobnej jakości jak tradycyjna metoda douncingu. Należy pamiętać, że metoda automatyczna nie jest optymalna dla trzustki i śledziony, a dla tych tkanek należy zastosować standardowy protokół homogenizacji.
  3. Aby przystąpić do przygotowania ekstraktu o wysokiej zawartości soli, należy usunąć kulkę ze stali nierdzewnej z rurki za pomocą magnesu i odwirować probówki o sile 20 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  4. Kontynuuj krok 4.4 (powyżej) protokołu ręcznego.
  5. Wszystkie próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu analizy.

6. Immuno-wzbogacenie potranslacyjnych zmodyfikowanych białek IF

  1. Przygotuj bufor PBST (0,02% Tween-20 w PBS). Aby uzyskać 50 ml, dodaj 10 μl Tween-20 do 50 ml PBS o pH 7,4.
  2. Przygotować roztwór przeciwciała PTM (1-10 μg przeciwciała w 200 μl PBST). Ogólnie rzecz biorąc, 3 μg przeciwciała/reakcji to dobry stan wyjściowy, który w razie potrzeby można jeszcze bardziej zoptymalizować.
  3. Dla każdej reakcji należy przelać 50 μl kulek magnetycznych do probówki mikrowirówkowej, umieścić na magnesie i zassać roztwór do przechowywania kulek.
  4. Sprzęgnij kulki z przeciwciałem immunoprecypitacyjnym, ponownie zawieszając je w roztworze przeciwciała i inkubując na rotatorze (koniec nad końcem, aby zapewnić mieszanie małych objętości) w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
  5. Umieść probówki na magnesie i odessaj roztwór przeciwciała.
  6. Przepłukać kulki sprzężone z przeciwciałami raz na 200 μl PBST i usunąć bufor do mycia.
  7. Dodać 0,6-1 ml lizatu tkankowego do kulek, wymieszać delikatnym pipetowaniem i inkubować przez 3 godziny na rotatorze w chłodnym pomieszczeniu.
  8. Umieść probówki na magnesie, usuń lizat i umyj kulki pięciokrotnie 200 μl PBST. Po ostatnim etapie mycia zbierz kulki w 100 μl PBS (bez Tween-20) i przenieś do czystej nowej probówki. Umieść rurkę na magnesie.
  9. Odessać PBS i dodać 100 μl nieredukującego buforu do próbki. Usunąć 50 μl i dodać 2-ME (5%) w celu uzyskania próbek redukcyjnych. Podgrzewać próbki do temperatury 95 °C przez 5 minut.
  10. Oddziel frakcję ip od koralików na magnesie i zbierz ją do nowej tuby.
  11. Przechowywać próbki w temperaturze -20 °C do czasu analizy.

7. Przygotowanie próbek białka IF do analizy metodą spektrometrii mas

  1. Umów się na konsultację z ekspertem w dziedzinie proteomiki przed rozpoczęciem badania, ponieważ analiza spektrometrii mas wiąże się ze znacznym czasem i kosztami.
  2. Podejmij specjalne środki ostrożności, aby uniknąć zanieczyszczenia. Ze wszystkimi żelami należy obchodzić się w czystych rękawiczkach i inkubować w czystych pojemnikach, mytych tylko przy użyciu ddH2O (unikać mydła).
  3. Przeprowadzić 20-50 μl próbki HSE (z sekcji 4 i 5) na żelu SDS-PAGE zgodnie ze standardowymi warunkami.
  4. Plamić barwnikiem białkowym przez 1 godzinę. Spłukać kilkakrotnie i usunąć plamę w ddH2O przez noc. Pasma białkowe IF powinny być dobrze widoczne po odbarwieniu.
  5. Umieść żel między plastikowymi ochraniaczami w arkuszach, zeskanuj i zaznacz pasma, które zostaną wycięte i wysłane do analizy.
  6. Wytnij pasma białkowe IF za pomocą nowej, czystej maszynki do golenia.
  7. Umieść opaski żelowe w czystych probówkach do mikrowirówek i przenieś do urządzenia do spektrometrii mas.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nowa szybka metoda ekstrakcji białek IF z wielu tkanek myszy za pomocą matrycy lizy opartej na wysokiej zawartości soli.

Tradycyjna metoda25,26 izolowania większości pośredniej frakcji białka filamentu z tkanki nabłonkowej została tutaj zmodyfikowana, aby uwzględnić 9 różnych organów i szybszą procedurę lizy tkanek...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metody, które umożliwiają biochemiczną charakterystykę białek IF, mogą być przydatne do zrozumienia wielu zjawisk patofizjologicznych w układach ssaków, ponieważ białka IF są zarówno markerami, jak i modulatorami stresu komórkowego i tkankowego29. Zasada działania obecnej metody opiera się na początkowych procedurach opracowanych w latach siedemdziesiątych i osiemdziesiątych XX wieku w celu izolacji, separacji i rekonstytucji białek IF z komórek i tkanek, zwykle przy użyciu roztworów o niskiej i w...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty NIH DK110355 R01, DK093776 [N.T.S.], DK102450 [N.T.S.] i P30 DK034987 [dla UNC-Chapel Hill]. Autorzy dziękują Deekshita Ramanarayanan za pomoc w eksperymentach z qPCR i western blot.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Dynabeads Protein GThermoFisher Scientific10009kulki immunoprecypitacyjne
PBSThermoFisher Scientific10010049do
Purelink RNA mini kitThermoFisher Scientific12183018ekstrakcja RNA z tkanek
Purelink DNAzestawThermoFisher Scientific12185010Ado mineralizacji kolumnowej DNA
Magnes Dynamag-2ThermoFisher Scientific12321Ddo stosowania z dynabeads
Odczynnik GelCode Blue StainThermoFisher Scientific24592barwnik żelowy kompatybilny ze spektrometrią mas
Pierce ECL Western Blotting SubstrateThermoFisher Scientific32106do stosowania w western blot
Zestaw do odwrotnej transkrypcji cDNA o dużej pojemnościThermoFisher Scientific4368813do stosowania w analizie ekspresji genów
Proflex 3 x 32-dołkowy system PCRThermoFisher Scientific4484073system PCR membrana
transferowa PVDF ThermoFisher Scientific88520do western blot
Power Up SYBR master mixThermoFisher ScientificA25778do analizy qPCR
RNAlaterThermoFisher ScientificAM7020roztwór do przechowywania tkanek przed izolacją RNA
Novex 4-20% Tris Glycine GelThermoFisher ScientificXP04205BOXPrefabrykowany żel białkowy
Anti-Keratin 8 przeciwciało (TS1)ThermoFisher ScientificMA514428do wykrywania Western Blot K8
Anti-VimentinThermoFisher ScientificMA511883do wykrywania western blot wimentyny
Tris Glycine Transfer Buffer (25x)ThermoFisher ScientificLC3675do mokrego transferu żeli białkowych
2x SDS Sample BufferThermoFisher ScientificLC2676do przygotowania próbki żeli białkowych
Bufor do biegania Tris Glycine SDS (10x)ThermoFisher ScientificLC26755do uruchamiania żeli białkowych
Kulki lizujące - Matrix DMP Biomedicals116913100Kulki i rurki do lizy do rozbijania tkanek i ekstrakcji RNA Koraliki
lizujące - Matrix SSMP Biomedicals116921100Kulki i rurki do lizy do rozbijania tkanek i ekstrakcji białek
Spektrofotometr NanoDrop LiteThermoFisher ScientificND-LITEpomiar białka i kwasu nukleinowego
Homogenizator Precellys 24Bertin InstrumentsEQ03119Automatyczny homogenizator tkanek

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Eriksson, J. E., et al. Introducing intermediate filaments: from discovery to disease. J Clin Invest. 119 (7), 1763-1771 (2009).
  2. Lowery, J., Kuczmarski, E. R., Herrmann, H., Goldman, R. D. Intermediate Filaments Play a Pivotal Role in Regulating Cell Architecture and Function. J Biol Chem. 290 (28), 17145-17153 (2015).
  3. Perez-Sala, D., et al. Vimentin filament organization and stress sensing depend on its single cysteine residue and zinc binding. Nat Commun. 6, 7287(2015).
  4. Dialynas, G., et al. Myopathic lamin mutations cause reductive stress and activate the nrf2/keap-1 pathway. PLoS Genet. 11 (5), e1005231(2015).
  5. Hobbs, R. P., et al. Keratin-dependent regulation of Aire and gene expression in skin tumor keratinocytes. Nat Genet. , (2015).
  6. Chung, B. M., Rotty, J. D., Coulombe, P. A. Networking galore: intermediate filaments and cell migration. Curr Opin Cell Biol. 25 (5), 600-612 (2013).
  7. Gruenbaum, Y., Aebi, U. Intermediate filaments: a dynamic network that controls cell mechanics. F1000 Prime Rep. 6, (2014).
  8. Omary, M. B. "IF-pathies": a broad spectrum of intermediate filament-associated diseases. J Clin Invest. 119 (7), 1756-1762 (2009).
  9. Omary, M. B., Ku, N. O., Strnad, P., Hanada, S. Toward unraveling the complexity of simple epithelial keratins in human disease. J Clin Invest. 119 (7), 1794-1805 (2009).
  10. Toivola, D. M., Strnad, P., Habtezion, A., Omary, M. B. Intermediate filaments take the heat as stress proteins. Trends Cell Biol. 20 (2), 79-91 (2010).
  11. Walther, D. M., et al. Widespread Proteome Remodeling and Aggregation in Aging. C. elegans. Cell. 161 (4), 919-932 (2015).
  12. David, D. C., et al. Widespread protein aggregation as an inherent part of aging in. C. elegans. PLoS Biol. 8 (8), (2010).
  13. Windoffer, R., Beil, M., Magin, T. M., Leube, R. E. Cytoskeleton in motion: the dynamics of keratin intermediate filaments in epithelia. J Cell Biol. 194 (5), 669-678 (2011).
  14. Chou, C. F., Riopel, C. L., Rott, L. S., Omary, M. B. A significant soluble keratin fraction in 'simple' epithelial cells. Lack of an apparent phosphorylation and glycosylation role in keratin solubility. J Cell Sci. 105 ( Pt. 2, 433-444 (1993).
  15. Omary, M. B., Ku, N. O., Liao, J., Price, D. Keratin modifications and solubility properties in epithelial cells and in vitro). Subcell Biochem. 31, 105-140 (1998).
  16. Lowthert, L. A., Ku, N. O., Liao, J., Coulombe, P. A., Omary, M. B. Empigen BB: a useful detergent for solubilization and biochemical analysis of keratins. Biochem Biophys Res Commun. 206 (1), 370-379 (1995).
  17. Snider, N. T., Omary, M. B. Post-translational modifications of intermediate filament proteins: mechanisms and functions. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (3), 163-177 (2014).
  18. Snider, N. T., Weerasinghe, S. V., Iniguez-Lluhi, J. A., Herrmann, H., Omary, M. B. Keratin hypersumoylation alters filament dynamics and is a marker for human liver disease and keratin mutation. J Biol Chem. 286 (3), 2273-2284 (2011).
  19. Eriksson, J. E., et al. Specific in vivo phosphorylation sites determine the assembly dynamics of vimentin intermediate filaments. J Cell Sci. 117 (Pt. 6, 919-932 (2004).
  20. Sahlgren, C. M., et al. Mitotic reorganization of the intermediate filament protein nestin involves phosphorylation by cdc2 kinase). J Biol Chem. 276 (19), 16456-16463 (2001).
  21. Snider, N. T., Omary, M. B. Assays for Posttranslational Modifications of Intermediate Filament Proteins. Methods Enzymol. 568, 113-138 (2016).
  22. Snider, N. T., et al. Glucose and SIRT2 reciprocally mediate the regulation of keratin 8 by lysine acetylation. J Cell Biol. 200 (3), 241-247 (2013).
  23. Danneman, P., Suckow, M. A., Brayton, C., Suckow, M. A. The laboratory mouse. , 2nd edn, CRC Press. (2013).
  24. Weiss, W., Weiland, F., Gorg, A. Protein detection and quantitation technologies for gel-based proteome analysis. Methods Mol Biol. 564, 59-82 (2009).
  25. Achtstaetter, T., Hatzfeld, M., Quinlan, R. A., Parmelee, D. C., Franke, W. W. Separation of cytokeratin polypeptides by gel electrophoretic and chromatographic techniques and their identification by immunoblotting. Methods Enzymol. 134, 355-371 (1986).
  26. Ku, N. O., et al. Studying simple epithelial keratins in cells and tissues. Methods Cell Biol. 78, 489-517 (2004).
  27. Julien, J. P., Mushynski, W. E. Multiple phosphorylation sites in mammalian neurofilament polypeptides. J Biol Chem. 257 (17), 10467-10470 (1982).
  28. Hubbard, B. D., Lazarides, E. Copurification of actin and desmin from chicken smooth muscle and their copolymerization in vitro to intermediate filaments. J Cell Biol. 80 (1), 166-182 (1979).
  29. Ku, N. O., Strnad, P., Bantel, H., Omary, M. B. Keratins: Biomarkers and modulators of apoptotic and necrotic cell death in the liver. Hepatology. 64 (3), 966-976 (2016).
  30. Huiatt, T. W., Robson, R. M., Arakawa, N., Stromer, M. H. Desmin from avian smooth muscle. Purification and partial characterization. J Biol Chem. 255 (14), 6981-6989 (1980).
  31. Zackroff, R. V., Goldman, R. D. In vitro assembly of intermediate filaments from baby hamster kidney (BHK-21) cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (12), 6226-6230 (1979).
  32. Franke, W. W., Schmid, E., Osborn, M., Weber, K. The intermediate-sized filaments in rat kangaroo PtK2 cells. II. Structure and composition of isolated filaments. Cytobiologie. 17 (2), 392-411 (1978).
  33. Small, J. V., Sobieszek, A. Studies on the function and composition of the 10-NM(100-A) filaments of vertebrate smooth muscle. J Cell Sci. 23, 243-268 (1977).
  34. Dahl, D., Bignami, A. Glial fibrillary acidic protein from normal human brain. Purification and properties. Brain Res. 57 (2), 343-360 (1973).
  35. Steinert, P. M., Idler, W. W., Zimmerman, S. B. Self-assembly of bovine epidermal keratin filaments in vitro. J Mol Biol. 108 (3), 547-567 (1976).
  36. Goldman, R. D., Cleland, M. M., Murthy, S. N., Mahammad, S., Kuczmarski, E. R. Inroads into the structure and function of intermediate filament networks. J Struct Biol. 177 (1), 14-23 (2012).
  37. Oshima, R. G. Intermediate filaments: a historical perspective. Exp Cell Res. 313 (10), 1981-1994 (2007).
  38. Mashukova, A., Forteza, R., Salas, P. J. Functional Analysis of Keratin-Associated Proteins in Intestinal Epithelia: Heat-Shock Protein Chaperoning and Kinase Rescue. Methods Enzymol. 569, 139-154 (2016).
  39. Schinzel, R., Dillin, A. Endocrine aspects of organelle stress-cell non-autonomous signaling of mitochondria and the ER. Curr Opin Cell Biol. 33, 102-110 (2015).
  40. Taylor, R. C., Berendzen, K. M., Dillin, A. Systemic stress signalling: understanding the cell non-autonomous control of proteostasis. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (3), 211-217 (2014).
  41. Lemieux, G. A., et al. Kynurenic acid is a nutritional cue that enables behavioral plasticity. Cell. 160 (1-2), 119-131 (2015).
  42. Oosten-Hawle, P., Porter, R. S., Morimoto, R. I. Regulation of organismal proteostasis by transcellular chaperone signaling. Cell. 153 (6), 1366-1378 (2013).
  43. Ulgherait, M., Rana, A., Rera, M., Graniel, J., Walker, D. W. AMPK modulates tissue and organismal aging in a non-cell-autonomous manner. Cell Rep. 8 (6), 1767-1780 (2014).
  44. Aynardi, M. W., Steinert, P. M., Goldman, R. D. Human epithelial cell intermediate filaments: isolation, purification, and characterization. J Cell Biol. 98 (4), 1407-1421 (1984).
  45. Shea, J. M., et al. Purification of desmin from adult mammalian skeletal muscle. Biochem J. 195 (2), 345-356 (1981).
  46. Liao, J., Lowthert, L. A., Ghori, N., Omary, M. B. The 70-kDa heat shock proteins associate with glandular intermediate filaments in an ATP-dependent manner. J Biol Chem. 270 (2), 915-922 (1995).
  47. Liao, J., Omary, M. B. 14-3-3 proteins associate with phosphorylated simple epithelial keratins during cell cycle progression and act as a solubility cofactor. J Cell Biol. 133 (2), 345-357 (1996).
  48. Ku, N. O., Fu, H., Omary, M. B. Raf-1 activation disrupts its binding to keratins during cell stress. J Cell Biol. 166 (4), 479-485 (2004).
  49. Hendriks, I. A., Vertegaal, A. C. A comprehensive compilation of SUMO proteomics. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (9), 581-595 (2016).
  50. Agnetti, G., Lindsey, M. L., Foster, D. B. Manual of cardiovascular proteomics. , Springer. (2016).
  51. Choudhary, C., Weinert, B. T., Nishida, Y., Verdin, E., Mann, M. The growing landscape of lysine acetylation links metabolism and cell signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 536-550 (2014).
  52. Herhaus, L., Dikic, I. Expanding the ubiquitin code through post-translational modification. EMBO Rep. 16 (9), 1071-1083 (2015).
  53. Dephoure, N., Gould, K. L., Gygi, S. P., Kellogg, D. R. Mapping and analysis of phosphorylation sites: a quick guide for cell biologists. Mol Biol Cell. 24 (5), 535-542 (2013).
  54. Choudhary, C., Mann, M. Decoding signalling networks by mass spectrometry-based proteomics. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (6), 427-439 (2010).
  55. Creixell, P., Linding, R. Cells, shared memory and breaking the PTM code. Mol Syst Biol. 8, 598(2012).
  56. Minguez, P., et al. Deciphering a global network of functionally associated post-translational modifications. Mol Syst Biol. 8, (2012).
  57. Snider, N. T., Park, H., Omary, M. B. A conserved rod domain phosphotyrosine that is targeted by the phosphatase PTP1B promotes keratin 8 protein insolubility and filament organization. J Biol Chem. 288 (43), 31329-31337 (2013).
  58. Gorospe, J. R., et al. Molecular findings in symptomatic and pre-symptomatic Alexander disease patients. Neurology. 58 (10), 1494-1500 (2002).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Intermediate Filament ProteinsPost translational ModificationsMouse Tissue IsolationAging associated ChangesDetergent Soluble FractionHigh Salt ExtractionAutomated Tissue HomogenizationMass Spectrometry ProfilingImmunoprecipitation AssayWestern Blot Analysis

Related Articles