Tutaj prezentujemy efektywną hydrolizę i późniejszą ochronę Fmoc aminokwasu wyizolowanego z kompleksu zasad Ni-Schiffa. Przedstawione tutaj warunki hydrolizy są odpowiednie do stosowania, gdy wymagane jest zachowanie kwasowo-labilnych grup ochronnych łańcucha bocznego. Technika ta może być dostosowana do różnych nienaturalnych substratów aminokwasowych.
Artykuł metodologiczny
Hydroliza kompleksu zasad Ni-Schiffa w warunkach odpowiednich do zachowania kwasowo-labilnych grup ochronnych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Nienaturalne aminokwasy, aminokwasy zawierające funkcje łańcucha bocznego rzadko spotykane w naturze, są coraz częściej spotykane w syntetycznych sekwencjach peptydowych. Synteza niektórych nienaturalnych aminokwasów często obejmuje użycie prekursora składającego się z zasady Schiffa stabilizowanej kationem niklu. Nienaturalne łańcuchy boczne mogą być zainstalowane na szkielecie aminokwasowym znajdującym się w tym kompleksie zasad Schiffa. Powstały w ten sposób nienaturalny aminokwas można następnie wyizolować z tego kompleksu za pomocą hydrolizy zasady Schiffa, zwykle przez zastosowanie refluksu w silnie kwaśnym roztworze. Te wysoce kwaśne warunki mogą usuwać labilne jak kwasowość grupy ochronne łańcucha bocznego niezbędne do wykorzystania nienaturalnych aminokwasów w syntezie peptydów w fazie stałej wspomaganej mikrofalami. W niniejszej pracy przedstawiono efektywną hydrolizę, a następnie ochronę Fmoc aminokwasu wyizolowanego z kompleksu zasad Ni-Schiffa. Warunki hydrolizy przedstawione w tej pracy są odpowiednie do zachowania kwasowo-labilnych grup ochronnych łańcucha bocznego i mogą być przystosowane do różnych nienaturalnych substratów aminokwasowych.
Wprowadzenie
Nienaturalne aminokwasy (UAA), posiadające łańcuchy boczne różniące się od dwudziestu naturalnie występujących aminokwasów, znajdują zastosowanie w szerokim zakresie aplikacji. Synteza tych UAA może być jednak trudna, w zależności od struktury łańcuchów bocznych i stereochemii szkieletu aminokwasu. Aktywacja wiązania C-H glicyny w kontekście kompleksu niklu z zasadą Schiffa była wykorzystywana do otrzymywania różnych pochodnych aminokwasów, w tym kwasów α,β-diaminowych1 oraz UAA posiadających fluorowane2 lub heterocykliczne łańcuchy boczne.3
Po dodaniu nienaturalnych łańcuchów bocznych, funkcjonalizowane UAA są zazwyczaj usuwane z kompleksu zasady Schiffa poprzez cofanie w kwasie solnym4, a następnie izolowane za pomocą chromatografii wymiany jonowej. Mimo że protokół ten jest zazwyczaj wydajny, prowadzi do powstania aminokwasów, które mogą nie nadawać się do zastosowania w syntezie peptydów na fazie stałej (SPPS). Specyfika SPPS wymaga obecności kwasolabilnych grup ochronnych łańcuchów bocznych, a silnie kwasowy charakter typowych warunków rozkładu kompleksu Ni-zasada Schiffa uniemożliwia izolację UAA z nienaruszonymi grupami ochronnymi. Z tego, co wiemy, opisano tylko jedną alternatywną metodę rozkładu: zastosowanie kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i hydrazyny w podwyższonych temperaturach,5 których warunki same w sobie mogą nie być odpowiednie dla niektórych grup ochronnych łańcuchów bocznych, takich jak ftalimidy.
Rycina 1: Synteza Ni-PBP-Gly z Ni2+, PBP i glicyny (Gly). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
W niniejszym opracowaniu przedstawiamy metodę hydrolizy kompleksu Ni-Schiff-base, Ni-PBP-Gly (Rysunek 1). Kompleks ten, pochodny Ni2+, glicyny oraz amidu kwasu pyridine-2-karboksylowego (2-benzoilo-fenylowego) (PBP),6 okazał się być użyteczną platformą do syntezy różnorodnych nienaturalnych aminokwasów (UAA) i jest łatwo dostępny dzięki dwuetapowej ścieżce syntezy.7 Synteza tego kompleksu została opisana w literaturze jako proces o wysokiej wydajności.6 Przedstawione poniżej wyniki demonstrują przydatność warunków hydrolizy z wykorzystaniem EDTA w lekko kwasowym lub neutralnym pH, co jest odpowiednie dla UAA posiadających kwasolabilne grupy ochronne łańcuchów bocznych. Po hydrolizie otrzymany roztwór wodny można wyizolować i poddać bezpośrednio standardowym warunkom ochrony Fmoc, aby otrzymać aminokwas chroniony grupą Fmoc (Rysunek 2).
Rysunek 2: Hydroliza i ochrona grupą Fmoc aminokwasu wyizolowanego z Ni-PBP-Gly. Warunki reakcji: i. EDTA (12 ekwiwalentów), pH 4.5; ii. płukanie octanem etylu i dostosowanie pH do 7; iii. Fmoc-OSu (1 ekwiwalent), NaHCO3 (2 ekwiwalenty). Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Hydroliza kompleksu Ni-Schiff-Base
- Rozpuścić 1 mmol kompleksu zasady Ni-PBP-Schiff w 40 ml N,N-dimetyloformamidu (DMF), mieszając w kolbie okrągłodennej o pojemności 250 ml w temperaturze pokojowej.
- Dodać 60 ml 0,2 M wodnego roztworu EDTA o pH 4,5.
- Za pomocą mieszadła magnetycznego i płytki mieszającej mieszaj połączony roztwór przez noc. Gdy kompleks zasad Schiffa zostanie zhydrolizowany, kolor zmieni się z głębokiej czerwieni na biel.
- Po zakończeniu reakcji, na co wskazuje brak czerwonego zabarwienia, przenieść reakcję do rozdzielacza o pojemności 250 ml.
- Dodać 50 ml dichlorometanu, zakryć rozdzielacz i wymieszać. Odcedź organiczne płyny do zlewki na odpady. Powtórz ten proces trzy razy, aby usunąć PBP i wszelkie pozostałości kompleksu zasad Ni-PBP-Schiffa. Zebrać pozostałą warstwę wodną do kolby okrągłodennej o pojemności 250 ml.
2. Ochrona hydrolizowanego aminokwasu Fmoc
- Dostosować izolowaną warstwę wodną z kroku 1.5 opisanego powyżej do pH 7 przy użyciu stałego wodorowęglanu sodu. Okresowo sprawdzaj pH za pomocą pasków testowych pH.
- Dodać 168 mg wodorowęglanu sodu (2,00 mmol, 2 ekwiwalenty) do roztworu i wymieszać za pomocą mieszadła magnetycznego i płytki mieszającej.
- Rozpuścić 337 mg estru N-hydroksysukcynimidu Fmoc (1,00 mmol, 1 ekwiwalent) w minimalnej ilości dioksanu (około 4 lub 5 ml) w fiolce o pojemności 10 ml. Przenieś ten roztwór do roztworu wodnego i mieszaj przez noc.
- Po pozostawieniu reakcji na wymieszanie przez noc, powstały roztwór zakwasić do pH 2 za pomocą 1 M kwasu solnego. Okresowo sprawdzaj pH za pomocą pasków testowych pH.
- Przenieść reakcję do rozdzielacza o pojemności 250 ml i dodać 50 ml octanu etylu. Zakryć rozdzielacz separatora, dobrze wymieszać i zebrać warstwę organiczną w kolbie Erlenmeyera o pojemności 250 ml. Powtórz ten proces jeszcze dwa razy, łącząc ekstrakty organiczne. Wysuszyć połączone ekstrakty organiczne około 3 g siarczanu magnezu.
- Skoncentrować połączone ekstrakty organiczne za pomocą wyparki obrotowej, aby uzyskać surowy aminokwas chroniony przez Fmoc.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Postawiliśmy hipotezę, że usunięcie Ni2+ z kompleksu Ni-PBP-Gly mogłoby umożliwić wydajną hydrolizę wodną zasady Schiffa bez konieczności stosowania drastycznych wartości pH. Ponieważ EDTA jest niedrogim i dobrze przebadanym czynnikiem chelatującym,10 założyliśmy, że dodanie EDTA do roztworu Ni-PBP-Gly ułatwi chelatowanie jonów Ni2+, promując tym samym hydrolizę kompleksu.
Aby przete...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisany powyżej protokół jest przydatny ze względu na jego zdolność do ułatwiania izolacji szkieletu aminokwasowego z kompleksu zasad Ni-Schiffa w łagodnych warunkach pH, a następnie ochrony Fmoc tego wyizolowanego aminokwasu poprzez dwa krytyczne etapy. Pierwszy krok polega na wymieszaniu roztworu DMF/wody zawierającego EDTA, aby ułatwić uwalnianie aminokwasu z kompleksu. Pozostałości złożonych lub organicznych produktów ubocznych można łatwo usunąć za pomocą ekstrakcji. Drugi etap tego protokołu polega na ochronie Fmoc...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Finansowanie zapewnione przez Uniwersytet Slippery Rock. Chcielibyśmy podziękować T. Boronowi III (Slippery Rock University) i C. Haneyowi (University of Pennsylvania) za ich spostrzeżenia.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Ni-PBP-Gly | Zsyntetyzowany z opublikowanego protokołu | ||
| DMF | Fisher | D119-4 | |
| EDTA | Fisher | S311-100 | |
| Dichlorometan | Acros | AC610050040 | |
| Wodorowęglan sodu | Fisher | S233-500 | |
| Fmoc-OSu | Chem-Impex | "00147" | |
| Dioksan | Fisher | D111-500 | |
| Kwas solny | Fisher | A144-500 | |
| Octan etylu | Acros | AC610060040 | |
| Siarczan magnezu | Fisher | M65-500 | |
| ZEOPrep 60ECO Żel krzemionkowy | ZEOChem | ||
| Heksany | Fisher | 3200250.650.443 | |
| chromatograficzna | |||
| Paski | |||
| Parownik | |||
| 250 ml Lejek | |||
| 250 ml Kolba | |||
| Mieszadło | |||
| Płytka |
Bibliografia
- Wang, J., Shi, T., Deng, G., Jiang, H., Liu, H. Highly Enantio- and Diastereoselective Mannich Reactions of Chiral Ni(II) Glycinates with amino sulfones. Efficient asymmetric synthesis of aromatic α,β-diamino acids. J. Org. Chem. 73 (21), 8563-8570 (2011).
- Wang, J., Lin, D., Zhou, S., Ding, X., Soloshonok, V. A., Liu, H. Asymmetric synthesis of sterically and electronically demanding linear ω,-trifluoromethyl containing amino acids via alkylation of chiral equivalents of nucleophilic glycine and alanine. J. Org. Chem. 76 (2), 684-687 (2011).
- Wang, J., Zhou, S., Lin, D., Ding, X., Jiang, H., Liu, H. Highly diastereo- and enantioselective synthesis of syn-β,-substituted tryptophans via asymmetric Michael addition of a chiral equivalent of nucleophilic glycine and sulfonylindoles. Chem. Commun. 47 (29), 8355-8357 (2011).
- Belokon, Y. N. Highly efficient catalytic synthesis of α,-amino acids under phase-transfer conditions with a novel catalyst/substrate pair. Angew. Chem. Int. Ed. 40 (10), 1948-1951 (2001).
- Zhou, S., Wang, J., Lin, D., Zhao, F., Liu, H. Enantioselective synthesis of 2-substituted-tetrahydroisoquinolin-1-yl glycine derivatives via oxidative cross-dehydrogenative coupling of tertiary amines and chiral nickel(II) glycinate. J. Org. Chem. 78 (22), 11204-11212 (2013).
- Belokon, Y. N. Synthesis of α,-amino acids via asymmetric phase transfer-catalyzed alkylation of achiral nickel(II) complexes of glycine-derived Schiff bases. J. Am. Chem. Soc. 125 (42), 12860-12871 (2003).
- Ueki, H., Ellis, T. K., Martin, C. H., Soloshonok, V. A. Efficient large-scale synthesis of picolinic acid-derived nickel(II) complexes of glycine. Eur. J. Org. Chem. 2003 (10), 1954-1957 (2003).
- Dener, J. M., Fantauzzi, P. P., Kshirsagar, T. A., Kelly, D. E., Wolfe, A. B. Large-scale syntheses of Fmoc-protected non-proteogenic amino acids: useful building blocks for combinatorial libraries. Org. Process Res. Dev. 5 (4), 445-449 (2001).
- Cruz, L. J., Beteta, N. G., Ewenson, A., Albericio, F. "One-pot", preparation of N-carbamate protected amino acids via the azide. Org Process Res. Dev. 8 (6), 920-924 (2004).
- Hart, J. R. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry. , Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. (2000).
- Adamson, J. G., Blaskovich, M. A., Groenevelt, H., Lajoie, G. A. Simple and convenient synthesis of tert-butyl ethers of Fmoc-serine, Fmoc-threonine, and Fmoc-tyrosine. J. Org. Chem. 56 (10), 3447-3449 (1991).
- Seyfried, M. S., Lauber, B. S., Luedtke, N. W. Multiple-turnover isotopic labeling of Fmoc- and Boc-protected amino acids with oxygen isotopes. Org. Lett. 12 (1), 104-106 (2010).
- Bonke, G., Vedel, L., Witt, M., Jaroszewski, J. W., Olsen, C. A., Franzyk, H. Dimeric building blocks for solid-phase synthesis of α,-peptide-β,-peptoid chimeras. Synthesis. 2008 (15), 2381-2390 (2008).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE
Poproś o pozwolenie