Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Nagrania całokomórkowe patch-clamp izolowanych pierwotnych komórek nabłonka z najądrza

10.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55700

⸱

3 sierpnia 2017

 ,  ,  ,  , 
1School of Life Science and Technology, ShanghaiTech University, 2Institute of Biochemistry and Cell Biology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, 3University of Chinese Academy of Sciences, 4Shanghai Institute for Advanced Immunochemical Studies, ShanghaiTech University

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentujemy protokół, który łączy izolację komórek i zapis z użyciem całego patch-clampu komórkowego w celu zmierzenia właściwości elektrycznych pierwotnych zdysocjowanych komórek nabłonkowych z najądrzy ogona szczura. Protokół ten pozwala na badanie właściwości funkcjonalnych pierwotnych komórek nabłonka najądrza w celu dalszego wyjaśnienia fizjologicznej roli najądrza.

Streszczenie

Najądrza jest organem niezbędnym do dojrzewania plemników i zdrowia reprodukcyjnego. Nabłonek najądrza składa się ze misternie połączonych typów komórek, które różnią się nie tylko cechami molekularnymi i morfologicznymi, ale także właściwościami fizjologicznymi. Różnice te odzwierciedlają ich różnorodne funkcje, które razem tworzą niezbędne mikrośrodowisko dla rozwoju plemników po jądrze w świetle najądrza. Zrozumienie właściwości biofizycznych komórek nabłonka najądrza ma kluczowe znaczenie dla ujawnienia ich funkcji w plemnikach i zdrowiu reprodukcyjnym, zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i patofizjologicznych. Chociaż ich właściwości funkcjonalne nie zostały jeszcze w pełni wyjaśnione, komórki nabłonka najądrza można badać za pomocą techniki patch-clamp, narzędzia do pomiaru zdarzeń komórkowych i właściwości błony pojedynczych komórek. W tym miejscu opisujemy metody izolacji komórek i zapisu krosówek całokomórkowych w celu zmierzenia właściwości elektrycznych pierwotnych zdysocjowanych komórek nabłonkowych z najądrzy ogona szczura.

Wprowadzenie

Najądrze w męskim układzie rozrodczym to organ pokryty warstwą mozaikowych komórek nabłonkowych. Podobnie jak w innych tkankach nabłonkowych, różne typy komórek nabłonka najądrza, w tym komórki główne, komórki przezroczyste, komórki podstawne oraz komórki układu immunologicznego i limfatycznego, działają w sposób skoordynowany, aby funkcjonować jako bariera na pierwszej linii kanalika oraz jako komórki podporowe dla dojrzewania i fizjologii plemników1,2,3. W związku z tym te komórki nabłonkowe odgrywają istotną rolę w zdrowiu reprodukcyjnym.

Komórki nabłonkowe są ogólnie uważane za komórki niepobudliwe, które nie są w stanie wytworzyć potencjałów czynnościowych typu "wszystko albo nic" w odpowiedzi na bodźce depolaryzujące, z powodu braku kanałów Na+ lub Ca2+ bramkowanych napięciem4,5. Jednak komórki nabłonkowe wyrażają unikalne zestawy kanałów jonowych i transporterów, które regulują ich wyspecjalizowane role fizjologiczne, takie jak wydzielanie i transport składników odżywczych6. Różne komórki nabłonkowe mają zatem charakterystyczne właściwości elektryczne. Na przykład główne komórki wyrażają CFTR do transportu płynów i chlorków oraz wyrażają TRPV6 do reabsorpcji wapnia, podczas gdy przezroczyste komórki wyrażają V-ATPazę pompy protonowej do zakwaszenia światła1,7,8,9. Opisano niektóre transportery i kanały jonowe, które regulują fizjologiczne cechy komórek nabłonka najądrza, ale właściwości funkcjonalne komórek nabłonka najądrza w dużej mierze nie są jeszcze poznane10,11,12,13.

Zapis krosówki całokomórkowej jest dobrze znaną techniką badania wewnętrznych właściwości zarówno komórek pobudliwych, jak i niepobudliwych, i jest szczególnie pomocny do badania funkcji komórek głównie zdysocjowanych w heterogenicznych próbkach komórek; zacisk napięcia służy do pomiaru właściwości membrany pasywnej i prądów jonowych pojedynczych komórek14,15. Właściwości membrany pasywnej obejmują rezystancję wejściową i pojemność. Pierwszy parametr wskazuje na wewnętrzne przewodnictwo błonowe, podczas gdy drugi oznacza powierzchnię błony komórkowej (dwuwarstwa fosfolipidowa, w której znajdują się kanały jonowe i transportery, która służy jako cienki izolator oddzielający media zewnątrzkomórkowe i wewnątrzkomórkowe). Pojemność błony jest wprost proporcjonalna do powierzchni błony komórkowej. Wraz z rezystancją błony, która jest odbijana przez rezystancję wejściową, można określić stałą czasową błony, która wskazuje, jak szybko potencjał błony komórkowej reaguje na przepływ prądów kanałów jonowych. W związku z tym, łącząc charakterystyki odpowiedzi prądowej z serii kroków napięcia przyłożonych do komórek, określa się biofizyczną kinetykę i właściwości komórek15,16,17,18.

W niniejszym artykule opisujemy procedury izolowania komórek nabłonkowych od najądrza ogona szczura oraz kroki pomiaru właściwości błony różnych typów komórek w zdysocjowanej mieszaninie komórek za pomocą klamry krosowej dla całej komórki. Pokazujemy, że główne komórki najądrza wykazują wyraźne właściwości elektrofizjologiczne błony i że przewodnictwo można łatwo zidentyfikować na podstawie innych typów komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach są przeprowadzane zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt Uniwersytetu ShanghaiTech, które spełniają lokalne i międzynarodowe wymagania.

1. Zwierzęta doświadczalne

  1. Należy użyć dorosłych samców szczurów linii Sprague-Dawley (~300-450 g) w wieku od 8 do 12 tygodni. W tym wieku plemniki u szczurów docierają do ogona najądrza.

2. Izolacja komórek nabłonkowych z ogona najądrza szczura

UWAGA: Poniższe kroki są wykonywane w warunkach nieaseptycznych, chyba że zaznaczono inaczej.

  1. Przygotowanie narzędzi do sekcji i odczynników
    1. Zdezynfekuj narzędzia do sekcji poprzez zanurzenie w 70% etanolu i pozostaw do wyschnięcia.
    2. Włącz łaźnię grzewczą (32 °C); przygotuj i podgrzej 500 mL 1x pożywki Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI) uzupełnionej o 1% (v/v) antybiotyków (stężenie końcowe 100 U/mL penicyliny i 100 µg/mL streptomycyny) i oznacz ją jako „RPMI (+P/S 1:100)”. Wykonaj ten krok w sterylnej komorze z przepływem laminarnym.
    3. Przygotuj i podgrzej 1x 500 mL zmodyfikowanej pożywki Dulbecco Iscove's (IMDM) zawierającej nieessentialne aminokwasy (0.1 mM) i pirogronian sodu (1 mM), uzupełnionej o 5-α-dihydrotestosteron (1 nM), 10% płodowej surowicy wołowej, 1% (v/v) antybiotyków (stężenie końcowe 100 U/mL penicyliny i 100 µg/mL streptomycyny) i oznacz ją jako „Full-IMDM”. Przygotuj alikwoty po 50 mL i zabezpiecz parafilmem; przechowuj w temperaturze 4 °C. Pracuj w warunkach aseptycznych.
    4. Przygotuj roztwór trawienny z kolagenazą, rozpuszczając kolagenazę typu I i kolagenazę typu II w RPMI (+P/S 1:100) tak, aby stężenie każdej z kolagenaz w roztworze wynosiło 1 mg/mL. Przefiltruj przez membranę 0.22-µm i oznacz jako „Collagenase Solution”. Przechowuj w temperaturze pokojowej (RT) do momentu użycia. Dostosuj objętość roztworu enzymu do masy enzymu; minimalna objętość wymagana dla obu ogonów najądrza z jednego szczura wynosi 2 mL.
    5. Napełnij szalkę 35 mm pożywką RPMI (+P/S 1:100).
  2. Sekcja ogonów najądrza szczura
    1. Uśmierć zwierzę, podając dożylnie 85 mg/kg pentobarbitalu sodu lub umieszczając w komorze z izofluranem, aż zwierzę przestanie reagować na bodziec uciskania ogona; następnie wykonaj zwichnięcie szyi.
    2. Zdezynfekuj dolną część brzucha, przecierając ją 70% etanolem, delikatnie przesuń oba jądra w stronę dolnej części brzucha, a następnie otwórz dolny brzuch w pobliżu moszny.
    3. Uchwyć tłuszcz najądrzowy, wypreparuj całe organy rozrodcze (jądra, najądrza i przewody nasienne) i zanurz je w szalce z RPMI (+P/S 1:100).
    4. Przenieś organy rozrodcze w szalce z RPMI (+P/S 1:100) do aseptycznej stacji roboczej.
    5. Wypreparuj ogony najądrza z tkanek łącznych, tłuszczowych oraz z torebki najądrza. Umieść jeden najądrze wraz z ~0.2 mL roztworu Collagenase Solution w probówce 1.5 mL. Wykonaj ten krok w sterylnej komorze z przepływem laminarnym.
  3. Dysocjacja pojedynczych komórek z ogonów najądrza szczura
    1. Posiekaj najądrza w roztworze Collagenase Solution za pomocą precyzyjnych nożyczek, aż tkanka zmieni się w zawiesinę o konsystencji pasty. Delikatnie wypłucz nożyczki pozostałą częścią (~0.8 mL) roztworu enzymu w probówce 1.5 mL.
    2. Umieść probówkę w metalowym termomikserze na 30 min w temperaturze 37 °C przy prędkości wytrząsania 1 000 rpm.
    3. Wirowarkuj mieszaninę enzymu i tkanki przy 30 x g w temperaturze RT przez 3 min i odlej lepki nadsącz zawierający głównie plemniki.
    4. Resuspenduj osad w 1 mL Full-IMDM, aby zatrzymać aktywność enzymatyczną. Przenieś zawiesinę komórkową do probówki 50 mL zawierającej 49 mL RPMI (+P/S 1:100).
      UWAGA: Opcjonalnie przefiltruj zawiesinę komórkową przez membranę siatkową 100 µm przy ciągłym triturowaniu, aby uniknąć dużych agregatów komórkowych. Nie używaj jednak filtra siatkowego, jeśli zawiesina komórkowa jest przeznaczona do hodowli monowarstw komórek.
    5. Wirowarkuj mieszaninę komórkową przy 30 x g w temperaturze RT przez 10 min; odlej nadsącz.
    6. Resuspenduj osad w 1 mL Full-IMDM, delikatnie triturując przez co najmniej 5 min, aby dysocjować pojedyncze komórki z mieszanin tkanki najądrza poddanej działaniu enzymów.
  4. Separacja komórek nabłonkowych od pozostałych komórek w warunkach aseptycznych
    1. Hoduj zawiesinę komórkową na szalce Petriego 10 cm zawierającej Full-IMDM przez co najmniej 8 h lub przez noc w inkubatorze w temperaturze 32 °C i 5% CO2.
    2. Przygotuj wcześniej sterylne szkiełka nakrywkowe, zanurzając je w 100% alkoholu. Pozostaw do wyschnięcia, a następnie zanurz w małej objętości pożywki hodowlanej. Umieść szkiełka w naczyniach hodowlanych 6 cm lub w pojedynczych dołkach płytki 24-dołkowej.
    3. Następnego ranka zbierz zdysocjowane komórki nabłonkowe, delikatnie pobierając zawiesinę komórkową z szalki Petriego, która składa się głównie z komórek nabłonkowych. Wirowarkuj zawiesinę komórkową przy 30 x g w temperaturze RT przez 5 min, a następnie odlej nadsącz.
    4. Resuspenduj osad komórkowy w ~2 mL Full-IMDM.
    5. Nanieś 0.2 mL zebranej zawiesiny komórkowej na środek każdego sterylnego szkiełka nakrywkowe.
    6. Pozostaw zawiesinę komórkową w kropli cieczy na co najmniej 10 min, aby komórki mogły luźno przytwierdzić się do szklanych nakrywek. Ostrożnie dodaj 1 mL Full-IMDM na krawędź szalki 10 cm lub 0.3 mL Full-IMDM do każdego dołka płytki 24-dołkowej; nie zaburzaj ułożenia komórek.
    7. Przechowuj wyizolowane pojedyncze komórki na szkiełkach nakrywkowych w inkubatorze w temperaturze 32 °C i 5% CO2 do czasu przeprowadzenia eksperymentów patch-clamp.

3. Roztwory do rejestracji i mikropipety

UWAGA: W eksperymentach z wykorzystaniem techniki patch-clamp należy używać odczynników i roztworów najwyższej jakości.

  1. Przygotowanie roztworów zapasowych
    1. Autoklawować wszystkie butelki do przechowywania roztworów zapasowych, a przed użyciem przefiltrować wszystkie roztwory zapasowe (z wyjątkiem roztworów żrących) przez membrany o rozmiarze porów 0,22 µm.
    2. Przygotować wszystkie roztwory zapasowe z wyprzedzeniem w RT i przechowywać w temperaturze 4 oC: 5 M NaCl; 1 M KCl; 100 mM MgCl2; 100 mM CaCl2; 200 mM NaH2PO4; 100 mM EGTA (pH 7,0 przy użyciu KOH). Roztwory zapasowe 5 M NaOH, 1 M HCl i 1 M KOH traktować jako roztwory żrące.
  2. Przygotowanie standardowego fizjologicznego roztworu soli do zewnętrznych pomiarów (PSS)
    1. W dniu pomiarów metodą patch-clamp ogrzać roztwory zapasowe do RT.
    2. Odmierzyć za pomocą pipety składniki z każdego roztworu zapasowego zgodnie z pożądaną objętością końcową, z wyjątkiem CaCl2, np. w celu przygotowania 500 mL PSS: 140 mM NaCl = 14 mL z 5 M; 5 mM KCl = 2,5 mL z 1 M; 1,2 mM MgCl2 = 6 mL z 100 mM; 1,2 mM NaH2PO4 = 3 mL z 200 mM.
    3. Dodać wodę dwukrotnie destylowaną (ddH2O) do objętości 400 mL i doprowadzić do stanu równowagi.
    4. Odważyć 0,9 g glukozy i 1,19 g HEPES i całkowicie rozpuścić w mieszaninie roztworów.
    5. Podczas mieszania dodać roztwór zapasowy CaCl2 (2,5 mM = 12,5 mL z 100 mM).
    6. Dopełnić do 99% objętości końcowej.
    7. Dostosować pH do 7,4 za pomocą NaOH lub HCl.
    8. Sprawdzić osmolarity i w razie potrzeby skorygować ją za pomocą 5 M NaCl lub glukozy.
    9. Dopełnić ddH2O do objętości końcowej 500 mL w cylindrze.
  3. Przygotowanie wewnętrznych roztworów do mikropipet (roztwory na bazie K+ z niską zawartością EGTA)
    1. Odważyć lub odmierzyć za pomocą pipety odpowiednią objętość odczynników z każdego roztworu zapasowego zgodnie z pożądaną objętością końcową i stężeniem, np. w celu przygotowania 50 mL wewnątrzkomórkowego roztworu na bazie K+ z niską zawartością EGTA w objętości ~ 30 mL ddH2O: 100 mM glukonianu K = 1,17 g; 35 mM KCl = 1,75 mL z 1 M; 2 mM MgCl2 = 1 mL z 100 mM; 0,1 mM EGTA = 0,05 mL z 100 mM; 10 mM HEPES = 0,072 g.
    2. Dodać odpowiednią ilość wody do ok. 95% objętości końcowej i pozostawić roztwór do wyrównania temperatury w RT. Upewnić się, że roztwór jest klarowny.
    3. Podczas ciągłego mieszania roztworu dostosować pH do 7,2 za pomocą KOH.
    4. Odważyć i dodać do roztworu 0,078 g Mg-ATP, aż do całkowitego rozpuszczenia.
    5. Umieścić roztwór na lodzie i pobrać niewielką alikwot do pomiaru osmolarity; zazwyczaj roztwory mają wartość ~290 mOsmol i nie wymagają korekty. Jeśli osmolarity znacząco odbiega od zakresu 280-295 mOsmol, przygotować nowy roztwór.
    6. Dopełnić ddH2O do objętości końcowej.
    7. Podzielić roztwór na alikwoty po 500 µL, przefiltrować za pomocą filtra strzykawkowego 0,2 µm, szczelnie zamknąć i natychmiast przechowywać w temperaturze ≤ -20 °C.
    8. W dniu eksperymentu metodą patch-clamp rozmrozić jeden alikwot roztworu wewnątrzkomórkowego na lodzie i utrzymywać go w niskiej temperaturze podczas pomiarów, aby zapobiec degradacji.
  4. Wytrawić pipety patch z kapilar szklanych (zgodnie z instrukcją obsługi wytrawiarki), aby uzyskać rozmiary mikropipet o oporności 5-10 M po napełnieniu roztworem wewnątrzkomórkowym.

4. Przygotowanie eksperymentu Patch-Clamp i ustanowienie konfiguracji Whole-Cell z komórkami

  1. Przygotowanie eksperymentu patch-clamp
    1. Włącz zestaw do techniki patch-clamp (komputer, wzmacniacz sterowany komputerowo, cyfryzator, itp.)
    2. Otwórz oprogramowanie do techniki patch-clamp (np. (AXON pCLAMP10 lub HEKA PatchMaster) i skonfigurować protokoły do rejestracji elektrofizjologicznej. Ustawić filtr sygnału na dolnoprzepustowy w zakresie 1–3 kHz, a cyfryzator na 10–20 kHz.
    3. Włącz kamerę, mikromanipulator i źródło światła.
    4. Gdy wzmacniacz sterowany komputerowo jest włączony, należy uziemić ciało eksperymentatora, dotykając dłońmi uziemionego stanowiska do patch-clampu przed dotknięciem przedwzmacniacza (headstage), aby chronić go przed wyładowaniami elektrycznymi.
    5. Przenieś hodowane komórki nabłonkowe z szkiełka podstawowego do komory pomiarowej wypełnionej ok. 1 ml standardowego roztworu PSS w temperaturze pokojowej. Przed przystąpieniem do eksperymentów metodą patch-clamp, ostrożnie wymień roztwór PSS w komorze co najmniej dwukrotnie, używając pipety.
      UWAGA: Opcjonalnie należy wypełnić system perfuzyjny standardowym PSS lub innym roztworem zewnętrznym, zgodnie z planowanym eksperymentem. Przed rozpoczęciem pomiarów patch-clamp należy kilkukrotnie przepłukać zamontowaną w mikroskopie komorę rejestracyjną (RC-26G lub RC-26GLP) roztworem PSS z prędkością ok. 2 ml/min. Należy upewnić się, że w systemie perfuzyjnym nie pozostały pęcherzyki powietrza.
    6. Obejrzyj i wybierz komórki pod mikroskopem odwróconym, używając obiektywów 10X i 40X wyposażonych w optyczny układ kontrastu interferencyjnego (DIC). Do rejestracji wyszukaj duże, pojedyncze, wyizolowane komórki. Zidentyfikuj wyizolowane komórki nabłonka najądrza po ich sferycznym kształcie z chropowatymi mikrokosmkami na jednym z końców błony oraz spolaryzowanym rozkładzie zawartości wewnątrzkomórkowej (Rysunek 1).
    7. Za pomocą strzykawki 1 ml (samodzielnie wykonanej niemetalowej igły mikrostrykawki) napełnić mikropipetę roztworem wewnętrznym (niski poziom EGTA K+).+-roztwór, patrz krok 3.3). Należy upewnić się, że w mikropipecie nie ma pęcherzyków powietrza, które mogłyby zwiększyć jej oporność. Należy użyć takiej ilości roztworu, aby roztwór wewnętrzny zanurzył elektrodę z drutu srebrnego powlekanego chlorkiem w uchwycie mikropipety.
    8. Zamocuj mikropipetę w uchwycie do elektrod i przyłóż niskie dodatnie ciśnienie (objętość strzykawki ok. 0,2 ml). Utrzymuj stałe niskie dodatnie ciśnienie aż do momentu dotknięcia błony komórkowej w późniejszych etapach.
  2. Ustanowienie konfiguracji whole-cell w celu rejestracji z komórek
    1. Zanurzyć pipetę w roztworze kąpieli, korzystając z maksymalnej prędkości mikromanipulatora. Zlokalizować końcówkę pipety na ekranie podłączonym do kamery cyfrowej, a następnie zmniejszyć prędkość mikromanipulatora do trybu średnio-wysokiego.
    2. Szybko sprawdź oporność mikropipety (5-10 MΩ), używając polecenia interfejsu akwizycji danych (np. „Test błony” (Membrane Test) w systemie AXON) poprzez przyłożenie skoku napięcia (np. 5 mV przez 100 ms) generowany przez wzmacniacz sterowany komputerowo. Należy wymienić mikropipetę na nową, jeśli rezystancja znacząco odbiega od tego zakresu.
    3. Zacznij opuszzczać obiektyw zamontowany na mikroskopie; stopniowo prowadź mikropipetę w kierunku wybranej komórki. Zawsze najpierw opuszczaj obiektyw, a następnie opuść mikropipetę do płaszczyzny ostrości, aż znajdzie się ona nad środkową powierzchnią wybranej komórki.
    4. Zredukuj potencjał złącza cieczowego między roztworem w pipecie a roztworem w kąpieli do zera, korzystając z polecenia „pipette offset” w interfejsie sterowania oprogramowania.
    5. Ustaw sterownik wzmacniacza sterowanego komputerowo w trybie clamp napięciowy (voltage-clamp), a test błony w trybie „Bath”.
    6. Użyj pokrętła ostrości precyzyjnej, aby uzyskać wyraźniejszy obraz komórki, a następnie stopniowo obniż mikropipetę za pomocą mikromanipulatora, ustawionego na niską lub średnią prędkość.
    7. Gdy mikropipeta znajduje się blisko komórki (co objawia się spadkiem natężenia prądu po wyzwoleniu polecenia testu błony), należy natychmiast usunąć niskie nadciśnienie i przyłożyć słabe podciśnienie (objętość strzykawki 0,1 ml), aby utworzyć gigauszczelnienie (gigaseal) (>1 GΩ).
    8. Monitoruj rezystancję za pomocą testu membranowego. Jeśli rezystancja wynosi >ale 500 MΩ <1 GΩ, przyłożyć potencjał ujemny (zazwyczaj jako potencjał podtrzymujący ustawiony na -60 mV), co może pomóc w utworzeniu gigauszczelnienia (gigaseal). Skompensować przejściowy prąd pojemnościowy mikropipety.
    9. Jeśli uszczelnienie jest >Przy oporności 1 GΩ i stabilnym sygnale (zgodnie z interfejsem oprogramowania), należy przyłożyć krótkie i silne ssanie w celu przerwania błony komórkowej. Nie należy stosować kompensacji oporności szeregowej ani pojemności komórkowej.
    10. Bezpośrednio po uzyskaniu prawidłowej konfiguracji whole-cell należy zastosować skok hiperpolaryzujący o wartości 10 mV (5 rejestracji z minimalnymi odstępami czasowymi, czas trwania 20 ms, próbkowanie sygnału 20 kHz) z potencjału spoczynkowego -60 mV.
    11. Przełącz tryb napięciowy na tryb zerowego prądu i zapisz odczyty z interfejsu oprogramowania lub przeprowadź ciągły pomiar (10–60 s) w celu zarejestrowania potencjału błonowego komórki.
    12. Szybko powróć do trybu napięciowego i pozostań w nim, a następnie zastosuj protokoły napięciowe zgodnie z planowanymi eksperymentami i zmierz odpowiedzi prądowe. Podczas rejestracji nie stosuje się odejmowania wewnętrznego prądu przeciekowego.
    13. Monitoruj stabilność odpowiedzi podczas rejestracji lub różne parametry komórki. Na przykład użyj interfejsu polecenia „Membrane Test”, aby sprawdzić rezystancję wejściową (Ri), rezystancji szeregowej (Rs) oraz pojemności błony komórkowej (Cm) w teście membranowym w trybie „Cell” podczas zmiany protokołów.
      UWAGA: Nagłe spadki rezystancji wejściowej zazwyczaj wskazują na poluzowanie kontaktu (patcha), natomiast gwałtowny wzrost rezystancji szeregowej może świadczyć o zatkaniu końcówki mikropipety przez organelle wewnątrzkomórkowe lub fragmenty błony. Podczas rejestracji należy regularnie monitorować położenie mikropipety, aby sprawdzić, czy nie występuje dryft, który może doprowadzić do utraty kontaktu. Jeśli dryft stanowi problem, należy ostrożnie unieść mikropipetę wraz z badaną komórką znad dna komory rejestracyjnej. Krok ten może czasami doprowadzić do utraty kontaktu, w takim przypadku konieczne jest powtórzenie procedury patch-clamp w konfiguracji whole-cell.

5. Analiza pasywnych właściwości elektrofizjologicznych komórek

  1. Po uzyskaniu danych z eksperymentów patch-clamp, otwórz dane gap-free w oprogramowaniu Clampfit i zmierz średnią wartość potencjału spoczynkowego błony dla każdej komórki. Alternatywnie można użyć wartości zapisanej jako napięcie zerowego prądu w trybie prądowym. Wartości należy skorygować o potencjał złącza cieczowego (12,4 mV w niniejszym badaniu).
  2. Otwórz dane z kroku hiperpolaryzującego o wartości 10 mV (ΔV) uzyskane z komórki, zmierz różnicę prądów przed i podczas kroku (ΔIstep) i oblicz rezystancję wejściową (Ri), korzystając z następującego równania:
    Równanie prawa Ohma R=ΔV/ΔI, ilustrujące obliczanie rezystancji elektrycznej w formie wzoru.
  3. Oblicz pojemność komórki (Cm, w jednostce pF) (wykorzystując te same dane prądowe z kroku hiperpolaryzującego 10 mV poprzez całkowanie całkowitej powierzchni pod prądem kondensatora błonowego podczas początkowego przejściowego spadku prądu wywołanego skokiem napięcia), aby uzyskać wartość całkowitego zgromadzonego ładunku (Q, w jednostce pA•ms) komórki. Użyj następującego równania:
    Wzór na pojemność \( C_m = \frac{Q}{\Delta V} \); równanie; koncepcja elektryczności statycznej.
  4. Oblicz wartość rezystancji szeregowej (Rs) dla każdej komórki, dopasowując początkowy prąd przejściowy z ujemnego kroku 10 mV do standardowego algorytmu wykładniczego w celu uzyskania stałej czasowej spadku prądu (T, w jednostce ms) i stosując następujące równanie:
    Równanie równowagi statycznej Rs=τ/Cm, wzór w analizie naukowej, koncepcja fizyczna.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Opisana procedura trawienia enzymatycznego w celu izolacji komórek nabłonkowych z ogonów najądrzy szczura jest zmodyfikowanym protokołem z naszych poprzednich badań9,12. Metoda ta pozwala na uzyskanie populacji pojedynczych komórek o żywotności przekraczającej 90%, bez pęcherzyków powierzchniowych czy obrzęku objętości komórkowej. Heterogeniczna mieszanina komórek składa się głównie z komórek głównych, komórek jasnych i komórek po...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym protokole enzymatyczna dyspersja najądrzy ogona szczura konsekwentnie dawała zdrowe komórki nabłonka. Jakość komórek nabłonka najądrza do eksperymentów z klamrą łatkową zależy od kilku krytycznych kroków w protokole. Na przykład odwirowanie mieszaniny komórek przy niskiej sile odśrodkowej (30 x g) jest ważne dla usunięcia plemników i zawartości światła najądrza; Komórki nabłonka najądrza stają się niezdrowe w obecności plemników w hodowli komórkowej. Ponadto hodowla zdysocjowanej mieszaniny komórek na szalce Petrie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Dr. Christopherowi Antosowi za pomocne komentarze do tekstu. Prace te zostały wsparte funduszami na rozpoczęcie działalności z ShanghaiTech University, które przyznano Winnie Shum oraz z funduszy Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (NNSFC nr 31471370).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Instrument systemu AXON
Wzmacniacz sterowany komputerowoUrządzenia molekularne - AxonMulticlamp 700B Wzmacniacz
Cyfrowy system akwizycjiUrządzenia molekularne - KonwerterDigidata 1550
MikroskopOlympusBX-61WI
MikromanipulatorSutter InstrumentsMPC-325
Komora nagraniowa i grzałkaliniowa Warner InstrumentsTC-324C
Instrument systemu HEKA
Patch Clampamplifier Harvard Bioscience - HEKAEPC-10 USB podwójny
mikroskopOlympusIX73
MikromanipulatorSutter InstrumentsMPC-325
Komora nagraniowa i grzałka liniowaWarner InstrumentsTC-324C
Other Instrument
Micropipette PullerSutter Instrument P-1000
Komora nagraniowaWarner InstrumentsRC-26G lub domowa komora
Borokrzemianowe szkło kapilarne z żarnikiemSutter Instrument / Harvard ApparatusBF150-86-10
Stół do izolacji drgańTMC 63544
Kamera cyfrowaHAMAMASTUORCA-Flash4.0 V2 C11440-22CU
strong>Odczynniki do izolacji
RPMI 1640 mediumGibco22400089
Penicylina/StreptomycynaGibca15140112
IMDMATCC 30-2005 
IMDMGibcoC12440500BT
Kolagenaza ISigmaC0130
Kolagenaza IISigmaC6885
5-&alfa;-dihydrotestosteronMedchemexpressHY-A0120
Płodowa surowica bydlęcaKoziorożecFBS-12A
Roztwory wewnętrzne do mikropipet (roztwór na bazie K+) (pH 7,2, 280-295 mOsm)
KCl, 35mMSigma/różneV900068
MgCl2 i middot; 6H2O, 2mMSigma/różneM2393
EGTA, 0,1mMSigma/różneE4378
HEPES, 10mMSigma/ różneV900477
K-glukonian, 100mMSigma/różneP-1847
Mg-ATP, 3mMSigma/RóżneA9187
Standardowy roztwór soli fizjologicznej z zapisem zewnętrznym (PSS) (pH 7,4, 300-310 mOsm)
NaCl, 140mMSigma/różneV900058
KCl, 4,7mMSigma/różneV900068
CaCl2, 2.5mMSigma/różneV900266
MgCl2 · 6H2O, 1.2mMSigma/różneM2393
NaH2PO4, 1.2mMSigma/różneV900060
HEPES, 10mMSigma/różneV900477
Glukoza, 10mMSigma / różneV900392
< silne > Do regulacji pH< / mocny>
NaOHSigma / różneV900797Czystość > = 97%
KOHSigma / różne60371Czystość >=99,99%
patch-clampAxon <

Bibliografia

  1. Shum, W. W. C., Ruan, Y. C., Da Silva, N., Breton, S. Establishment of Cell-Cell Cross Talk in the Epididymis: Control of Luminal Acidification. J Androl. 32 (6), 576-586 (2011).
  2. Robaire, B., Hinton, B. T. Knobil and Neill's Physiology of Reproduction. Plant, T. M., Zeleznik, A. J. , Elsevier. 691-771 (2015).
  3. Da Silva, N., et al. A dense network of dendritic cells populates the murine epididymis. Reproduction. 141 (5), 653-663 (2011).
  4. Kolb, H. A. Special Issue on Ionic Channels II. , Springer. 51-91 (1990).
  5. Clapham, D. E. Calcium Signaling. Cell. 80 (2), 259-268 (1995).
  6. Frizzell, R. A., Hanrahan, J. W. Physiology of Epithelial Chloride and Fluid Secretion. Cold Spr Harb Pers Med. 2 (6), (2012).
  7. Wong, P. Y. D. CFTR gene and male fertility. Mol Hum Reprod. 4 (2), 107-110 (1998).
  8. Shum, W. W. C., et al. Transepithelial Projections from Basal Cells Are Luminal Sensors in Pseudostratified Epithelia. Cell. 135 (6), 1108-1117 (2008).
  9. Gao, D. Y., et al. Coupling of TRPV6 and TMEM16A in epithelial principal cells of the rat epididymis. J Gen Physiol. 148 (2), 161-182 (2016).
  10. Huang, S. J., et al. Electrophysiological Studies of Anion Secretion in Cultured Human Epididymal Cells. J Physiol. 455, 455-469 (1992).
  11. Chan, H. C., Fu, W. O., Chung, Y. W., Chan, P. S. F., Wong, P. Y. D. An Atp-Activated Cation Conductance in Human Epididymal Cells. Biol Repro. 52 (3), 645-652 (1995).
  12. Cheung, K. H., et al. Cell-cell interaction underlies formation of fluid in the male reproductive tract of the rat. J Gen Physiol. 125 (5), 443-454 (2005).
  13. Pastor-Soler, N., Pietrement, C., Breton, S. Role of acid/base transporters in the male reproductive tract and potential consequences of their malfunction. Physiol. 20, 417-428 (2005).
  14. Evans, A. M., Osipenko, O. N., Haworth, S. G., Gurney, A. M. Resting potentials and potassium currents during development of pulmonary artery smooth muscle cells. Ame J Physiol-Heart Circ Physiol. 275 (3), 887-899 (1998).
  15. Golowasch, J., et al. Membrane Capacitance Measurements Revisited: Dependence of Capacitance Value on Measurement Method in Nonisopotential Neurons. J Neurophysiol. 102 (4), 2161-2175 (2009).
  16. Cole, K. S. Membranes, Ions and Impulses. A Chapter of Classical Biophysics. , University of California Press. Berkeley, Calif. (1968).
  17. Lo, C. M., Keese, C. R., Giaever, I. Impedance analysis of MDCK cells measured by electric cell-substrate impedance sensing. Biophys J. 69, 2800-2807 (1995).
  18. Solsona, C., Innocenti, B., Fernandez, J. M. Regulation of exocytotic fusion by cell inflation. Biophys J. 74 (2), 1061-1073 (1998).
  19. Robinson, D. W., Cameron, W. E. Time-dependent changes in input resistance of rat hypoglossal motoneurons associated with whole-cell recording. J Neurophysiol. 83 (5), 3160-3164 (2000).
  20. Sontheimer, H. Neuro Methods: Patch-Clamp Applications and Protocols. Boulton, A. A., Baker, G. B., Walz, W. , Humana Press. New Jersey. (1995).
  21. Cheung, Y. M., Hwang, J. C., Wong, P. Y. Epithelial membrane potentials of the epididymis in rats [proceedings]. J Physiol. 263 (2), 280(1976).
  22. Lybaert, P., et al. KATP channel subunits are expressed in the epididymal epithelium in several mammalian species. Biol Reprod. 79 (2), 253-261 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Kom rki nab onka naj drzaizolacja kom rekw a ciwo ci elektrycznenaj drze szczuratrawienie kolagenazrejestracja patch clamppierwotna hodowla kom rkowaspoczynkowy potencja b onowyfunkcja naj drza
Nagrania całokomórkowe patch-clamp izolowanych pierwotnych komórek nabłonka z najądrza
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.