Artykuł metodologiczny

Nagrania całokomórkowe patch-clamp izolowanych pierwotnych komórek nabłonka z najądrza

DOI:

10.3791/55700

⸱

3 sierpnia 2017

 ,  ,  ,  , 
1School of Life Science and Technology, ShanghaiTech University, 2Institute of Biochemistry and Cell Biology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, 3University of Chinese Academy of Sciences, 4Shanghai Institute for Advanced Immunochemical Studies, ShanghaiTech University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy protokół, który łączy izolację komórek i zapis z użyciem całego patch-clampu komórkowego w celu zmierzenia właściwości elektrycznych pierwotnych zdysocjowanych komórek nabłonkowych z najądrzy ogona szczura. Protokół ten pozwala na badanie właściwości funkcjonalnych pierwotnych komórek nabłonka najądrza w celu dalszego wyjaśnienia fizjologicznej roli najądrza.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Najądrza jest organem niezbędnym do dojrzewania plemników i zdrowia reprodukcyjnego. Nabłonek najądrza składa się ze misternie połączonych typów komórek, które różnią się nie tylko cechami molekularnymi i morfologicznymi, ale także właściwościami fizjologicznymi. Różnice te odzwierciedlają ich różnorodne funkcje, które razem tworzą niezbędne mikrośrodowisko dla rozwoju plemników po jądrze w świetle najądrza. Zrozumienie właściwości biofizycznych komórek nabłonka najądrza ma kluczowe znaczenie dla ujawnienia ich funkcji w plemnikach i zdrowiu reprodukcyjnym, zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i patofizjologicznych. Chociaż ich właściwości funkcjonalne nie zostały jeszcze w pełni wyjaśnione, komórki nabłonka najądrza można badać za pomocą techniki patch-clamp, narzędzia do pomiaru zdarzeń komórkowych i właściwości błony pojedynczych komórek. W tym miejscu opisujemy metody izolacji komórek i zapisu krosówek całokomórkowych w celu zmierzenia właściwości elektrycznych pierwotnych zdysocjowanych komórek nabłonkowych z najądrzy ogona szczura.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Najądrze w męskim układzie rozrodczym to organ pokryty warstwą mozaikowych komórek nabłonkowych. Podobnie jak w innych tkankach nabłonkowych, różne typy komórek nabłonka najądrza, w tym komórki główne, komórki przezroczyste, komórki podstawne oraz komórki układu immunologicznego i limfatycznego, działają w sposób skoordynowany, aby funkcjonować jako bariera na pierwszej linii kanalika oraz jako komórki podporowe dla dojrzewania i fizjologii plemników1,2,3. W związku z tym te komórki nabłonkowe odgrywają istotną rolę w zdrowiu reprodukcyjnym.

Komórki nabłonkowe są ogólnie uważane za komórki niepobudliwe, które nie są w stanie wytworzyć potencjałów czynnościowych typu "wszystko albo nic" w odpowiedzi na bodźce depolaryzujące, z powodu braku kanałów Na+ lub Ca2+ bramkowanych napięciem4,5. Jednak komórki nabłonkowe wyrażają unikalne zestawy kanałów jonowych i transporterów, które regulują ich wyspecjalizowane role fizjologiczne, takie jak wydzielanie i transport składników odżywczych6. Różne komórki nabłonkowe mają zatem charakterystyczne właściwości elektryczne. Na przykład główne komórki wyrażają CFTR do transportu płynów i chlorków oraz wyrażają TRPV6 do reabsorpcji wapnia, podczas gdy przezroczyste komórki wyrażają V-ATPazę pompy protonowej do zakwaszenia światła1,7,8,9. Opisano niektóre transportery i kanały jonowe, które regulują fizjologiczne cechy komórek nabłonka najądrza, ale właściwości funkcjonalne komórek nabłonka najądrza w dużej mierze nie są jeszcze poznane10,11,12,13.

Zapis krosówki całokomórkowej jest dobrze znaną techniką badania wewnętrznych właściwości zarówno komórek pobudliwych, jak i niepobudliwych, i jest szczególnie pomocny do badania funkcji komórek głównie zdysocjowanych w heterogenicznych próbkach komórek; zacisk napięcia służy do pomiaru właściwości membrany pasywnej i prądów jonowych pojedynczych komórek14,15. Właściwości membrany pasywnej obejmują rezystancję wejściową i pojemność. Pierwszy parametr wskazuje na wewnętrzne przewodnictwo błonowe, podczas gdy drugi oznacza powierzchnię błony komórkowej (dwuwarstwa fosfolipidowa, w której znajdują się kanały jonowe i transportery, która służy jako cienki izolator oddzielający media zewnątrzkomórkowe i wewnątrzkomórkowe). Pojemność błony jest wprost proporcjonalna do powierzchni błony komórkowej. Wraz z rezystancją błony, która jest odbijana przez rezystancję wejściową, można określić stałą czasową błony, która wskazuje, jak szybko potencjał błony komórkowej reaguje na przepływ prądów kanałów jonowych. W związku z tym, łącząc charakterystyki odpowiedzi prądowej z serii kroków napięcia przyłożonych do komórek, określa się biofizyczną kinetykę i właściwości komórek15,16,17,18.

W niniejszym artykule opisujemy procedury izolowania komórek nabłonkowych od najądrza ogona szczura oraz kroki pomiaru właściwości błony różnych typów komórek w zdysocjowanej mieszaninie komórek za pomocą klamry krosowej dla całej komórki. Pokazujemy, że główne komórki najądrza wykazują wyraźne właściwości elektrofizjologiczne błony i że przewodnictwo można łatwo zidentyfikować na podstawie innych typów komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach są przeprowadzane zgodnie z wytycznymi Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Technicznego w Szanghaju, które spełniają lokalne i międzynarodowe wymagania.

1. Zwierzęta doświadczalne

  1. Użyj dorosłych samców szczurów Sprague-Dawley (~300-450 g) w wieku 8-12 tygodni. W tym wieku u szczurów plemniki dotarły do najądrzy ogona.

2. Izolacja komórek nabłonkowych z najądrzy ogona szczura

UWAGA: Następujące kroki są wykonywane w warunkach nieaseptycznych, chyba że zaznaczono inaczej.

  1. Przygotowanie narzędzi i odczynników preparacyjnych
    1. Zdezynfekuj narzędzia do preparowania przez zanurzenie w 70% etanolu i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.
    2. Włączyć kąpiel rozgrzewającą (32 °C); Przygotuj i podgrzej 500 ml 1x Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium (RPMI) uzupełnionego 1% (v/v) antybiotykami (100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny final) i oznaczonych jako "RPMI (+P/S 1:100)". Wykonaj ten krok na stacji roboczej z kontrolowanym przepływem czystego powietrza.
    3. Przygotuj i podgrzej 1x 500 ml zmodyfikowanego podłoża Dulbecco's Modified Dulbecco (IMDM) firmy Iscove, zawierającego aminokwasy endogenne (0,1 mM) i pirogronian sodu (1 mM), uzupełnionego 5-α-dihydrotestosteronem (1 nM), 10% płodową surowicą bydlęcą, 1% (v/v) antybiotykami (100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny końcowej) i oznaczone jako "Full-IMDM". Utworzyć 50 ml porcji i uszczelnić parafilmem; przechowywać w temperaturze 4 °C. Stosować warunki aseptyki.
    4. Przygotować roztwór do trawienia enzymatycznego kolagenazy, rozpuszczając kolagenazę typu I i kolagenazę typu II w RPMI (+P/S 1:100), co daje 1 mg/ml każdej kolagenazy w roztworze. Przefiltruj przez membranę 0,22 μm i oznacz jako "Roztwór kolagenazy". Przechowywać w temperaturze pokojowej (RT) do czasu użycia. Dostosuj objętość roztworu enzymu w zależności od masy enzymu; minimalna objętość wymagana dla obu najądrzy ogona od jednego szczura wynosi 2 ml.
    5. Napełnij naczynie o średnicy 35 mm za pomocą RPMI (+P/S 1:100).
  2. Rozwarstwienie ogona ogona szczura
    1. Zwierzę należy uśmiercić, stosując pentobarbital sodu w dawce 85 mg/kg i.p. lub używając komory izofluranu do momentu, gdy zwierzę nie zareaguje na stymulację szczypania ogona, a następnie zwichnięcie szyjki macicy.
    2. Zdezynfekuj dolną część brzucha, przecierając 70% etanolem, delikatnie wepchnij dwa jądra do dolnej części brzucha, a następnie otwórz dolną część brzucha w pobliżu moszny.
    3. Zbierz tłuszcz z najądrza, wypreparuj całe narządy rozrodcze (jądra, najądrza i nasieniowody) i zanurz w naczyniu za pomocą RPMI (+P/S 1:100).
    4. Przenieś narządy rozrodcze w naczyniu z RPMI (+P/S 1:100) do aseptycznego stanowiska roboczego.
    5. Wypreparuj najądrza ogona z tkanki łącznej i tłuszczowej oraz torebki najądrza. Umieść jedno najądrze z ~0,2 ml roztworu kolagenazy w probówce o pojemności 1,5 ml. Wykonaj ten krok na stacji roboczej z kontrolowanym przepływem czystego powietrza.
  3. Dysocjacja pojedynczych komórek z najądrzy ogona szczura
    1. Pokrój najądrza w roztworze kolagenazy za pomocą cienkich nożyczek, aż tkanka stanie się płynem przypominającym pastę. Delikatnie opłucz nożyczki resztą (~0,8 ml) roztworu enzymu w probówce o pojemności 1,5 ml.
    2. Umieść rurkę na metalowym termomikserze na 30 minut w temperaturze 37 °C z prędkością wytrząsania 1 000 obr./min.
    3. Odwirować mieszaninę enzymatyczną i tkankową przy sile 30 x g w temperaturze pokojowej przez 3 minuty i zdekantować lepki supernatant, który zawiera głównie plemniki.
    4. Zawiesić osad w 1 ml Full-IMDM, aby ugasić całą aktywność enzymatyczną. Przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 50 ml zawierającej 49 ml RPMI (+P/S 1:100).
      UWAGA: Opcjonalnie przefiltruj zawiesinę komórek przez membranę siatkową o grubości 100 μm ze stałym rozcieraniem, aby uniknąć dużych agregatów komórkowych. Nie należy jednak używać filtra siatkowego, jeśli do hodowli monowarstw komórek potrzebna jest zawiesina komórek.
    5. Odwirować mieszaninę komórkową przy stężeniu 30 x g w temperaturze pokojowej przez 10 minut; zdekantować supernatant.
    6. Zawiesić osad w 1 ml Full-IMDM z delikatnym rozcieraniem przez co najmniej 5 minut w celu dysocjacji pojedynczych komórek od mieszanin tkanek najądrza poddanych działaniu enzymatycznie.
  4. Oddzielenie komórek nabłonka od innych komórek w warunkach aseptycznych
    1. Hodować zawiesinę komórek na 10-centymetrowej szalce Petriego zawierającej Full-IMDM przez co najmniej 8 godzin lub przez noc w inkubatorze w temperaturze 32 °C przy 5% CO2 .
    2. Przygotuj wcześniej sterylne szkiełka nakrywkowe, zanurzając je w 100% alkoholu. Wysuszyć na powietrzu i zanurzyć w niewielkiej objętości pożywki hodowlanej. Umieścić szkiełka nakrywkowe w 6-milimetrowych szalkach hodowlanych lub w pojedynczych dołkach na 24-dołkowej płytce.
    3. Następnego ranka zbierz zdysocjowane komórki nabłonkowe, delikatnie zbierając zawiesinę komórkową z szalki Petriego, która składa się głównie z komórek nabłonkowych. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 30 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut, a następnie zdekantować supernatant.
    4. Ponownie zawiesić osad komórkowy w ~2 ml Full-IMDM.
    5. Wysiewać 0,2 ml zawiesiny pobranych komórek na środek każdego sterylnego szkiełka nakrywkowego.
    6. Pozwól zawiesinie komórek osiąść w kropelce cieczy przez co najmniej 10 minut, aby komórki luźno przylegały do szklanych szkiełek nakrywkowych. Ostrożnie dodać 1 ml Full-IMDM na krawędzi 10-centymetrowej płytki lub 0,3 ml Full-IMDM do każdego dołka na 24-dołkowej płytce; Nie przeszkadzaj komórkom.
    7. Izolowane pojedyncze komórki należy przechowywać na szkiełkach nakrywkowych w inkubatorze w temperaturze 32 °C przy 5% CO2 do czasu przeprowadzenia eksperymentów z zaciskiem krosowym.

3. Roztwory do nagrywania i mikropipety

UWAGA: Do eksperymentów z zaciskami krosowymi używaj najlepszej jakości chemikaliów i roztworów.

  1. Przygotowanie roztworów podstawowych
    1. Przed użyciem należy autoklawować wszystkie butelki do przechowywania zapasów i przefiltrować wszystkie roztwory podstawowe (z wyjątkiem roztworów korozyjnych) i przefiltrować przez membrany 0,22 μm.
    2. Wszystkie roztwory podstawowe należy przygotować zawczasu w temperaturze pokojowej i przechowywać w temperaturze 4 o C: 5 M NaCl; 1 M KCl; 100 mM MgCl2; 100 mM CaCl2; 200 mM NaH2PO4; 100 mM EGTA (pH 7,0 z KOH). Materiały o natężeniu 5 M NaOH, 1 M HCl i 1 M KOH należy stosować jako roztwory korozyjne.
  2. Przygotowanie wzorcowego roztworu soli fizjologicznej do rejestracji zewnętrznej (PSS)
    1. Ogrzej roztwory podstawowe do RT rano w dniu nagrania z zaciskiem krosowym.
    2. Odpipetować składniki z każdego bulionu zgodnie z pożądaną objętością końcową, z wyjątkiem CaCl2, np. do przygotowania 500 ml PSS: 140 mM NaCl = 14 ml 5M; 5 mM KCl = 2,5 ml z 1M; 1,2 mM MgCl2 = 6 ml ze 100 mM; 1,2 mM NaH2PO4 = 3 ml z 200 mM.
    3. Dodać wodę podwójnie destylowaną (ddH2O) do końcowej objętości 400 ml i zrównoważyć.
    4. Odważyć 0,9 g glukozy i 1,19 g HEPES i całkowicie rozpuścić w mieszaninie roztworów.
    5. Dodaj bulion CaCl2 (2,5 mM = 12,5 ml ze 100 mM) mieszając.
    6. Dodaj do 99% końcowej objętości.
    7. Dostosuj pH do 7,4 za pomocą NaOH lub HCl.
    8. Sprawdź osmolarność i wyreguluj za pomocą 5 M NaCl lub glukozy, jeśli to konieczne.
    9. Dodać ddH2O do końcowej objętości 500 ml w cylindrze.
  3. Przygotowanie roztworów wewnętrznych mikropipet (roztwory na bazie EGTA K+)
    1. Zważyć lub odpipetować odpowiednią objętość odczynników z każdego preparatu zgodnie z pożądaną objętością końcową i stężeniem, np. do przygotowania 50 ml roztworu wewnątrzkomórkowego na bazie EGTA K+ do objętości ~ 30 ml ddH2O: 100 mM K-glukonianu = 1,17 g; 35 mM KCl = 1,75 ml z 1 M; 2 mM MgCl2 = 1 ml ze 100 mM; 0,1 mM EGTA = 0,05 ml ze 100 mM; 10 mM HEPES = 0,072 g.
    2. Dodać tyle wody na ~ 95% końcowej objętości i pozwolić, aby roztwór zrównoważył się w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że roztwór jest klarowny.
    3. Ciągle mieszając roztwór, dostosuj pH do 7,2 za pomocą KOH.
    4. Zważyć i dodać 0,078 g Mg-ATP do roztworu, aż do całkowitego rozpuszczenia.
    5. Umieść roztwór na lodzie i użyj małej podwielokrotności do pomiaru osmolarności; zazwyczaj roztwór mierzy ~290 mOsmol i nie wymaga regulacji. Jeśli osmolarność różni się znacznie od 280-295 mOsmol, przygotuj nowy roztwór.
    6. Dodaj ddH2O do końcowego woluminu.
    7. Podzielić roztwór na podwielokrotności o pojemności 500 μl, przefiltrować filtrem strzykawkowym 0,2 μm, szczelnie zamknąć i natychmiast przechowywać w temperaturze ≤ -20 °C.
    8. W dniu eksperymentu z patch-clamp rozmrozić jedną porcję roztworu wewnątrzkomórkowego na lodzie i przechowywać w chłodzie podczas eksperymentu patch-clamp, aby zapobiec degradacji.
  4. Wyciągnij pipety z plastrami ze szklanych kapilar (postępując zgodnie z instrukcją obsługi ściągacza do pipet), aby uzyskać rozmiary mikropipet o oporze 5-10 M po napełnieniu roztworem wewnątrzkomórkowym.

4. Konfiguracja eksperymentu z zaciskiem krosowym i ustalanie konfiguracji całej komórki z komórkami

  1. Ustawianie eksperymentu z zaciskiem krosowym
    1. Włącz konfigurację patch-clamp (komputer, wzmacniacz sterowany komputerowo, digitizer itp.)
    2. Otwórz oprogramowanie patch-clamp (np. AXON pCLAMP10 lub HEKA PatchMaster) i skonfiguruj protokoły zapisów elektrofizjologicznych. Ustaw filtr sygnału na dolnoprzepustowy na 1-3 kHz, a digitizer na 10-20 kHz.
    3. Włącz kamerę, mikromanipulator i źródło światła.
    4. Gdy wzmacniacz sterowany komputerowo jest włączony, uziemij ciało eksperymentatora, dotykając rękami zestawu zaciskowego, który został uziemiony, przed dotknięciem sceny głównej, w celu ochrony jej przed porażeniem prądem.
    5. Przenieść komórki nabłonkowe hodowli na szklanym szkiełku nakrywkowym do komory rejestracyjnej wypełnionej ~1 ml standardowego PSS w temperaturze pokojowej. Ostrożnie wymienić kąpiący się PSS co najmniej dwa razy za pomocą pipety przed jakimikolwiek eksperymentami z patch-clamp.
      UWAGA: Opcjonalnie należy napełnić system perfuzyjny standardowym roztworem PSS lub innym roztworem zewnętrznym zgodnie z planowanym eksperymentem. Przed rozpoczęciem eksperymentów z zaciskiem krosowym należy kilkakrotnie sproszkować zamontowaną na mikroskopie komorę rejestracyjną (RC-26G lub RC-26GLP) za pomocą PSS z prędkością ~2 ml / min. Upewnij się, że wzdłuż systemu perfuzyjnego nie ma pęcherzyków powietrza.
    6. Przeglądaj i wybieraj komórki pod mikroskopem odwróconym za pomocą obiektywów 10X i 40X wyposażonych w system optyczny z kontrastem różnicowym. Poszukaj dużych, pojedynczych, odizolowanych komórek do nagrywania. Zidentyfikuj izolowane komórki nabłonka najądrza na podstawie ich kulistego kształtu z szorstkimi mikrokosmkami na jednym końcu błon i spolaryzowanym rozkładem zawartości wewnątrzkomórkowej (Rysunek 1).
    7. Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml (domowej roboty niemetalowej igły do mikrostrzykawki) napełnij mikropipetę roztworem wewnętrznym (roztwór o niskiej zawartości EGTA K+, patrz krok 3.3). Upewnij się, że w mikropipecie nie ma pęcherzyków powietrza, które mogą zwiększyć jej rezystancję. Użyj wystarczającej ilości roztworu, aby roztwór wewnętrzny zanurzył pokrytą chlorkiem srebrną elektrodę drucianą w uchwycie mikropipety.
    8. Zamontuj mikropipetę w uchwycie elektrody i zastosuj niskie nadciśnienie (~0,2 ml objętości strzykawki). Utrzymuj niskie dodatnie ciśnienie w sposób ciągły, aż do dotknięcia błony komórkowej w późniejszych krokach.
  2. Ustalanie konfiguracji całej komórki z komórkami do nagrań
    1. Zanurzyć pipetę w roztworze kąpieli z najwyższą prędkością mikromanipulatora. Znajdź końcówkę pipety na ekranie podłączonym do aparatu cyfrowego; Zmniejsz prędkość mikromanipulatora do trybu średnio-wysokiego.
    2. Szybko sprawdź rezystancję mikropipet (5-10 MΩ) za pomocą polecenia interfejsu akwizycji danych (np. "Test membrany" w systemie AXON), stosując krok napięcia (np. 5 mV przez 100 ms) generowany przez wzmacniacz sterowany komputerowo. Wymień mikropipetę na nową, jeśli rezystancja znacznie wykracza poza ten zakres.
    3. Zacznij przesuwać się w dół obiektywu zamontowanego na mikroskopie; stopniowo prowadź mikropipetę w kierunku wybranej komórki. Zawsze najpierw opuszczaj obiektyw, a następnie opuszczaj mikropipetę do płaszczyzny ostrości, tak aby mikropipeta znalazła się powyżej środkowej powierzchni wybranej komórki.
    4. Anuluj do zera potencjał złącza cieczy między pipetą a roztworem kąpieli za pomocą polecenia "przesunięcie pipety" w interfejsie sterownika oprogramowania.
    5. Ustaw sterowany komputerowo sterownik wzmacniacza na napięcie cęgowe, a test membrany na tryb "Kąpiel".
    6. Dokładne ustawienie ostrości zapewnia wyraźniejszy widok na celę, a następnie stopniowo obniżaj mikropipetę za pomocą mikromanipulatora z niską/średnią prędkością.
    7. Gdy mikropipeta znajdzie się w pobliżu celi (co objawia się zmniejszonym prądem po wyzwoleniu przez polecenie testu membranowego), natychmiast usuń niskie nadciśnienie i zastosuj słabe podciśnienie (objętość strzykawki 0,1 ml), aby utworzyć gigaseal (>1 GΩ).
    8. Monitoruj rezystancję za pomocą testu membranowego. Jeśli rezystancja wynosi >500 MΩ, ale <1 GΩ, zastosuj potencjał ujemny (zwykle jako potencjał trzymania, który jest ustawiony na -60 mV), który może pomóc w utworzeniu gigaseal. Skompensuj przejściowy prąd pojemnościowy mikropipety.
    9. Jeśli uszczelka ma >1 GΩ i jest stabilna (jak pokazano w interfejsie oprogramowania), zastosuj krótkie i mocne ssanie, aby przerwać błonę komórkową. Nie należy stosować kompensacji rezystancji szeregowej i pojemności ogniwa.
    10. Natychmiast po osiągnięciu udanej konfiguracji całego ogniwa należy zastosować krok hiperpolaryzacyjny 10 mV (5 ścieżek z minimalnymi odstępami czasu, czas trwania 20 ms, próbka sygnału przy 20 kHz) z potencjałem utrzymywania -60 mV.
    11. Przełącz tryb napięcia na tryb zeroprądowy i zaznacz odczyty z interfejsu oprogramowania lub wykonaj zapis bez przerw (10-60 s) dla odczytów potencjału błonowego ogniwa.
    12. Szybko przełącz się z powrotem i pozostań w trybie napięciowym oraz zastosuj protokoły napięcia zgodnie z zaplanowanymi eksperymentami i zmierz odpowiedzi prądowe. Odejmowanie nie jest stosowane do wewnętrznego prądu upływowego podczas nagrań.
    13. Monitoruj stabilność odpowiedzi podczas nagrań lub różne parametry komórki. Na przykład użyj interfejsu poleceń "Test membrany", aby sprawdzić rezystancję wejściową (Ri), rezystancję szeregową (Rs) i pojemność błony komórkowej(CM) w teście membranowym w trybie "Komórka" podczas przełączania protokołów.
      UWAGA: Nagłe spadki rezystancji wejściowej zwykle wskazują na luźną plamę, a dramatyczny wzrost rezystancji szeregowej może wskazywać na zatkanie końcówki mikropipety przez organelle wewnątrzkomórkowe lub fragmenty błony. Podczas nagrywania należy regularnie monitorować położenie mikropipety, aby sprawdzić, czy nie występuje dryft, który może prowadzić do utraty plastra. Jeśli dryft stanowi problem, ostrożnie podnieś mikropipetę i komorę łatającą z dna komory rejestracyjnej. Ten krok może czasami prowadzić do utraty plastra, w takim przypadku konieczne jest powtórzenie procedury zaciskania krosówek na całe komórki.

5. Analiza pasywnych właściwości elektrofizjologicznych komórek

  1. Po uzyskaniu danych z eksperymentów z zaciskiem krosowym, otwórz dane bez przerw w oprogramowaniu Clampfit i zmierz średnią wartość spoczynkowego potencjału błonowego dla każdej komórki. Alternatywnie użyj wartości oznaczonej od napięcia prądu zerowego w trybie bieżącym. Skoryguj wartości za pomocą potencjału złącza cieczy (12,4 mV w tym badaniu).
  2. Otwórz dane z kroku hiperpolaryzacji 10 mV (ΔV) uzyskanego z ogniwa, zmierz różnicę prądów przed i w trakcie kroku (krok ΔI) i oblicz rezystancję wejściową (Ri), korzystając z równania jako:
    figure-protocol-1
  3. Obliczyć pojemność ogniwa (CM, w jednostce pF) (użyj tych samych danych prądowych z kroku hiperpolaryzacji 10 mV, całkując całkowitą powierzchnię pod prądem kondensatora membranowego podczas początkowego prądu zaniku przejściowego podniesionego po wyzwalaniu kroku napięcia), aby uzyskać wartość całkowitego skumulowanego ładunku (Q, w jednostce pA•ms) ogniwa. Użyj następującego równania:
    figure-protocol-2
  4. Oblicz wartość rezystancji szeregowej (Rs) dla każdego ogniwa, dopasowując początkowy prąd przejściowy z ujemnego kroku 10 mV za pomocą standardowego algorytmu wykładniczego, aby uzyskać prąd zaniku stałej czasowej (T, w jednostce ms) i użyj następującego równania:
    figure-protocol-3

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisana procedura trawienia enzymatycznego do izolacji komórek nabłonkowych z najądrzy ogona szczura jest zmodyfikowanym protokołem z naszych poprzednich badań9,12. W wyniku tej metody uzyskuje się mieszaninę pojedynczych komórek o ponad 90% żywotności i bez pęcherzy powierzchniowych lub powiększonej objętości komórek. Heterogeniczna mieszanina komórek składa się głównie z komórek głównych, komórek czystych i komórek podstawnych, ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym protokole enzymatyczna dyspersja najądrzy ogona szczura konsekwentnie dawała zdrowe komórki nabłonka. Jakość komórek nabłonka najądrza do eksperymentów z klamrą łatkową zależy od kilku krytycznych kroków w protokole. Na przykład odwirowanie mieszaniny komórek przy niskiej sile odśrodkowej (30 x g) jest ważne dla usunięcia plemników i zawartości światła najądrza; Komórki nabłonka najądrza stają się niezdrowe w obecności plemników w hodowli komórkowej. Ponadto hodowla zdysocjowanej mieszaniny komórek na szalce Petrie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Dr. Christopherowi Antosowi za pomocne komentarze do tekstu. Prace te zostały wsparte funduszami na rozpoczęcie działalności z ShanghaiTech University, które przyznano Winnie Shum oraz z funduszy Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (NNSFC nr 31471370).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Instrument systemu AXON
Wzmacniacz sterowany komputerowoUrządzenia molekularne - AxonMulticlamp 700B Wzmacniacz
Cyfrowy system akwizycjiUrządzenia molekularne - KonwerterDigidata 1550
MikroskopOlympusBX-61WI
MikromanipulatorSutter InstrumentsMPC-325
Komora nagraniowa i grzałkaliniowa Warner InstrumentsTC-324C
Instrument systemu HEKA
Patch Clampamplifier Harvard Bioscience - HEKAEPC-10 USB podwójny
mikroskopOlympusIX73
MikromanipulatorSutter InstrumentsMPC-325
Komora nagraniowa i grzałka liniowaWarner InstrumentsTC-324C
Other Instrument
Micropipette PullerSutter Instrument P-1000
Komora nagraniowaWarner InstrumentsRC-26G lub domowa komora
Borokrzemianowe szkło kapilarne z żarnikiemSutter Instrument / Harvard ApparatusBF150-86-10
Stół do izolacji drgańTMC 63544
Kamera cyfrowaHAMAMASTUORCA-Flash4.0 V2 C11440-22CU
strong>Odczynniki do izolacji
RPMI 1640 mediumGibco22400089
Penicylina/StreptomycynaGibca15140112
IMDMATCC 30-2005 
IMDMGibcoC12440500BT
Kolagenaza ISigmaC0130
Kolagenaza IISigmaC6885
5-&alfa;-dihydrotestosteronMedchemexpressHY-A0120
Płodowa surowica bydlęcaKoziorożecFBS-12A
Roztwory wewnętrzne do mikropipet (roztwór na bazie K+) (pH 7,2, 280-295 mOsm)
KCl, 35mMSigma/różneV900068
MgCl2 i middot; 6H2O, 2mMSigma/różneM2393
EGTA, 0,1mMSigma/różneE4378
HEPES, 10mMSigma/ różneV900477
K-glukonian, 100mMSigma/różneP-1847
Mg-ATP, 3mMSigma/RóżneA9187
Standardowy roztwór soli fizjologicznej z zapisem zewnętrznym (PSS) (pH 7,4, 300-310 mOsm)
NaCl, 140mMSigma/różneV900058
KCl, 4,7mMSigma/różneV900068
CaCl2, 2.5mMSigma/różneV900266
MgCl2 · 6H2O, 1.2mMSigma/różneM2393
NaH2PO4, 1.2mMSigma/różneV900060
HEPES, 10mMSigma/różneV900477
Glukoza, 10mMSigma / różneV900392
< silne > Do regulacji pH< / mocny>
NaOHSigma / różneV900797Czystość > = 97%
KOHSigma / różne60371Czystość >=99,99%
patch-clampAxon <

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shum, W. W. C., Ruan, Y. C., Da Silva, N., Breton, S. Establishment of Cell-Cell Cross Talk in the Epididymis: Control of Luminal Acidification. J Androl. 32 (6), 576-586 (2011).
  2. Robaire, B., Hinton, B. T. Knobil and Neill's Physiology of Reproduction. Plant, T. M., Zeleznik, A. J. , Elsevier. 691-771 (2015).
  3. Da Silva, N., et al. A dense network of dendritic cells populates the murine epididymis. Reproduction. 141 (5), 653-663 (2011).
  4. Kolb, H. A. Special Issue on Ionic Channels II. , Springer. 51-91 (1990).
  5. Clapham, D. E. Calcium Signaling. Cell. 80 (2), 259-268 (1995).
  6. Frizzell, R. A., Hanrahan, J. W. Physiology of Epithelial Chloride and Fluid Secretion. Cold Spr Harb Pers Med. 2 (6), (2012).
  7. Wong, P. Y. D. CFTR gene and male fertility. Mol Hum Reprod. 4 (2), 107-110 (1998).
  8. Shum, W. W. C., et al. Transepithelial Projections from Basal Cells Are Luminal Sensors in Pseudostratified Epithelia. Cell. 135 (6), 1108-1117 (2008).
  9. Gao, D. Y., et al. Coupling of TRPV6 and TMEM16A in epithelial principal cells of the rat epididymis. J Gen Physiol. 148 (2), 161-182 (2016).
  10. Huang, S. J., et al. Electrophysiological Studies of Anion Secretion in Cultured Human Epididymal Cells. J Physiol. 455, 455-469 (1992).
  11. Chan, H. C., Fu, W. O., Chung, Y. W., Chan, P. S. F., Wong, P. Y. D. An Atp-Activated Cation Conductance in Human Epididymal Cells. Biol Repro. 52 (3), 645-652 (1995).
  12. Cheung, K. H., et al. Cell-cell interaction underlies formation of fluid in the male reproductive tract of the rat. J Gen Physiol. 125 (5), 443-454 (2005).
  13. Pastor-Soler, N., Pietrement, C., Breton, S. Role of acid/base transporters in the male reproductive tract and potential consequences of their malfunction. Physiol. 20, 417-428 (2005).
  14. Evans, A. M., Osipenko, O. N., Haworth, S. G., Gurney, A. M. Resting potentials and potassium currents during development of pulmonary artery smooth muscle cells. Ame J Physiol-Heart Circ Physiol. 275 (3), 887-899 (1998).
  15. Golowasch, J., et al. Membrane Capacitance Measurements Revisited: Dependence of Capacitance Value on Measurement Method in Nonisopotential Neurons. J Neurophysiol. 102 (4), 2161-2175 (2009).
  16. Cole, K. S. Membranes, Ions and Impulses. A Chapter of Classical Biophysics. , University of California Press. Berkeley, Calif. (1968).
  17. Lo, C. M., Keese, C. R., Giaever, I. Impedance analysis of MDCK cells measured by electric cell-substrate impedance sensing. Biophys J. 69, 2800-2807 (1995).
  18. Solsona, C., Innocenti, B., Fernandez, J. M. Regulation of exocytotic fusion by cell inflation. Biophys J. 74 (2), 1061-1073 (1998).
  19. Robinson, D. W., Cameron, W. E. Time-dependent changes in input resistance of rat hypoglossal motoneurons associated with whole-cell recording. J Neurophysiol. 83 (5), 3160-3164 (2000).
  20. Sontheimer, H. Neuro Methods: Patch-Clamp Applications and Protocols. Boulton, A. A., Baker, G. B., Walz, W. , Humana Press. New Jersey. (1995).
  21. Cheung, Y. M., Hwang, J. C., Wong, P. Y. Epithelial membrane potentials of the epididymis in rats [proceedings]. J Physiol. 263 (2), 280(1976).
  22. Lybaert, P., et al. KATP channel subunits are expressed in the epididymal epithelium in several mammalian species. Biol Reprod. 79 (2), 253-261 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kom rki nab onka naj drzaizolacja kom rekw a ciwo ci elektrycznenaj drze szczuratrawienie kolagenazrejestracja patch clamppierwotna hodowla kom rkowaspoczynkowy potencja b onowyfunkcja naj drza

Powiązane artykuły