Method Article

Nagrania całokomórkowe patch-clamp izolowanych pierwotnych komórek nabłonka z najądrza

DOI:

10.3791/55700

⸱

August 3rd, 2017

 ,  ,  ,  , 
1School of Life Science and Technology, ShanghaiTech University, 2Institute of Biochemistry and Cell Biology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, 3University of Chinese Academy of Sciences, 4Shanghai Institute for Advanced Immunochemical Studies, ShanghaiTech University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy protokół, który łączy izolację komórek i zapis z użyciem całego patch-clampu komórkowego w celu zmierzenia właściwości elektrycznych pierwotnych zdysocjowanych komórek nabłonkowych z najądrzy ogona szczura. Protokół ten pozwala na badanie właściwości funkcjonalnych pierwotnych komórek nabłonka najądrza w celu dalszego wyjaśnienia fizjologicznej roli najądrza.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Najądrza jest organem niezbędnym do dojrzewania plemników i zdrowia reprodukcyjnego. Nabłonek najądrza składa się ze misternie połączonych typów komórek, które różnią się nie tylko cechami molekularnymi i morfologicznymi, ale także właściwościami fizjologicznymi. Różnice te odzwierciedlają ich różnorodne funkcje, które razem tworzą niezbędne mikrośrodowisko dla rozwoju plemników po jądrze w świetle najądrza. Zrozumienie właściwości biofizycznych komórek nabłonka najądrza ma kluczowe znaczenie dla ujawnienia ich funkcji w plemnikach i zdrowiu reprodukcyjnym, zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i patofizjologicznych. Chociaż ich właściwości funkcjonalne nie zostały jeszcze w pełni wyjaśnione, komórki nabłonka najądrza można badać za pomocą techniki patch-clamp, narzędzia do pomiaru zdarzeń komórkowych i właściwości błony pojedynczych komórek. W tym miejscu opisujemy metody izolacji komórek i zapisu krosówek całokomórkowych w celu zmierzenia właściwości elektrycznych pierwotnych zdysocjowanych komórek nabłonkowych z najądrzy ogona szczura.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Najądrze w męskim układzie rozrodczym to organ pokryty warstwą mozaikowych komórek nabłonkowych. Podobnie jak w innych tkankach nabłonkowych, różne typy komórek nabłonka najądrza, w tym komórki główne, komórki przezroczyste, komórki podstawne oraz komórki układu immunologicznego i limfatycznego, działają w sposób skoordynowany, aby funkcjonować jako bariera na pierwszej linii kanalika oraz jako komórki podporowe dla dojrzewania i fizjologii plemników1,2,3. W związku z tym te komórki nabłonkowe odgrywają istotną rolę w zdrowiu reprodukcyjnym.

Komórk....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach są przeprowadzane zgodnie z wytycznymi Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Technicznego w Szanghaju, które spełniają lokalne i międzynarodowe wymagania.

1. Zwierzęta doświadczalne

  1. Użyj dorosłych samców szczurów Sprague-Dawley (~300-450 g) w wieku 8-12 tygodni. W tym wieku u szczurów plemniki dotarły do najądrzy ogona.

2. Izolacja komórek nabłonkowych z najądrzy ogona szczura

UWAGA: Następujące kroki są wykonywane w warunkach nieaseptycznych, chyba że zaznaczono inaczej.

  1. Przygotowanie narzęd....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisana procedura trawienia enzymatycznego do izolacji komórek nabłonkowych z najądrzy ogona szczura jest zmodyfikowanym protokołem z naszych poprzednich badań9,12. W wyniku tej metody uzyskuje się mieszaninę pojedynczych komórek o ponad 90% żywotności i bez pęcherzy powierzchniowych lub powiększonej objętości komórek. Heterogeniczna mieszanina komórek składa się głównie z komórek głównych, komórek czystych i komórek podstawnych, .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym protokole enzymatyczna dyspersja najądrzy ogona szczura konsekwentnie dawała zdrowe komórki nabłonka. Jakość komórek nabłonka najądrza do eksperymentów z klamrą łatkową zależy od kilku krytycznych kroków w protokole. Na przykład odwirowanie mieszaniny komórek przy niskiej sile odśrodkowej (30 x g) jest ważne dla usunięcia plemników i zawartości światła najądrza; Komórki nabłonka najądrza stają się niezdrowe w obecności plemników w hodowli komórkowej. Ponadto hodowla zdysocjowanej mieszaniny komórek na szalce Petrie.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Dr. Christopherowi Antosowi za pomocne komentarze do tekstu. Prace te zostały wsparte funduszami na rozpoczęcie działalności z ShanghaiTech University, które przyznano Winnie Shum oraz z funduszy Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (NNSFC nr 31471370).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Instrument systemu AXON
Wzmacniacz sterowany komputerowoUrządzenia molekularne - AxonMulticlamp 700B Wzmacniacz
Cyfrowy system akwizycjiUrządzenia molekularne - KonwerterDigidata 1550
MikroskopOlympusBX-61WI
MikromanipulatorSutter InstrumentsMPC-325
Komora nagraniowa i grzałkaliniowa Warner InstrumentsTC-324C
Instrument systemu HEKA
Patch Clampamplifier Harvard Bioscience - HEKAEPC-10 USB podwójny
mikroskopOlympusIX73
MikromanipulatorSutter InstrumentsMPC-325
Komora nagraniowa i grzałka liniowaWarner InstrumentsTC-324C
Other Instrument
Micropipette PullerSutter Instrument P-1000
Komora nagraniowaWarner InstrumentsRC-26G lub domowa komora
Borokrzemianowe szkło kapilarne z żarnikiemSutter Instrument / Harvard ApparatusBF150-86-10
Stół do izolacji drgańTMC 63544
Kamera cyfrowaHAMAMASTUORCA-Flash4.0 V2 C11440-22CU
strong>Odczynniki do izolacji
RPMI 1640 mediumGibco22400089
Penicylina/StreptomycynaGibca15140112
IMDMATCC 30-2005 
IMDMGibcoC12440500BT
Kolagenaza ISigmaC0130
Kolagenaza IISigmaC6885
5-&alfa;-dihydrotestosteronMedchemexpressHY-A0120
Płodowa surowica bydlęcaKoziorożecFBS-12A
Roztwory wewnętrzne do mikropipet (roztwór na bazie K+) (pH 7,2, 280-295 mOsm)
KCl, 35mMSigma/różneV900068
MgCl2 i middot; 6H2O, 2mMSigma/różneM2393
EGTA, 0,1mMSigma/różneE4378
HEPES, 10mMSigma/ różneV900477
K-glukonian, 100mMSigma/różneP-1847
Mg-ATP, 3mMSigma/RóżneA9187
Standardowy roztwór soli fizjologicznej z zapisem zewnętrznym (PSS) (pH 7,4, 300-310 mOsm)
NaCl, 140mMSigma/różneV900058
KCl, 4,7mMSigma/różneV900068
CaCl2, 2.5mMSigma/różneV900266
MgCl2 · 6H2O, 1.2mMSigma/różneM2393
NaH2PO4, 1.2mMSigma/różneV900060
HEPES, 10mMSigma/różneV900477
Glukoza, 10mMSigma / różneV900392
< silne > Do regulacji pH< / mocny>
NaOHSigma / różneV900797Czystość > = 97%
KOHSigma / różne60371Czystość >=99,99%
patch-clampAxon <

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shum, W. W. C., Ruan, Y. C., Da Silva, N., Breton, S. Establishment of Cell-Cell Cross Talk in the Epididymis: Control of Luminal Acidification. J Androl. 32 (6), 576-586 (2011).
  2. Robaire, B., Hinton, B. T. Knobil and Neill's Physiology of Reproduction. Plant, T. M., Zeleznik, A. J.....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Whole cell Patch clampEpididymal Epithelial CellsCell IsolationElectrical PropertiesRat EpididymisCollagenase DigestionPatch clamp RecordingPrimary Cell CultureResting Membrane PotentialEpididymis Function

Related Articles