Montaż i śledzenie rozwoju społeczności mikrobiologicznej w ramach platformy Microwell Array

Summary

Rozwój społeczności mikroorganizmów zależy od kombinacji czynników, w tym architektury środowiska, liczebności członków, cech i interakcji. Protokół ten opisuje syntetyczne, mikrofabrykowane środowisko do jednoczesnego śledzenia tysięcy społeczności zawartych w studniach femtolitrowych, w którym można przybliżyć kluczowe czynniki, takie jak wielkość niszy i zamknięcie.

Abstract

Rozwój społeczności mikrobiologicznych zależy od kombinacji złożonych czynników deterministycznych i stochastycznych, które mogą radykalnie zmienić rozkład przestrzenny i działania członków społeczności. Opracowaliśmy platformę macierzy mikrostudzienek, która może być używana do szybkiego łączenia i śledzenia tysięcy społeczności bakteryjnych równolegle. Protokół ten podkreśla użyteczność platformy i opisuje jej zastosowanie do optycznego monitorowania rozwoju prostych, dwuosobowych społeczności w zespole tablic w ramach platformy. W tej demonstracji wykorzystano dwa mutanty Pseudomonas aeruginosa, będące częścią serii mutantów opracowanych w celu badania patogenności wydzielania typu VI. Wstawione chromosomy genów mCherry lub GFP ułatwiają konstytutywną ekspresję białek fluorescencyjnych o różnych długościach fal emisyjnych, które można wykorzystać do monitorowania liczebności i lokalizacji członków społeczności w każdej mikrostudzince. Protokół ten opisuje szczegółową metodę łączenia mieszanin bakterii w studzienkach macierzy oraz wykorzystania obrazowania fluorescencyjnego w czasie i ilościowej analizy obrazu do pomiaru względnego wzrostu populacji każdego członka w czasie. Omówiono zasiewanie i montaż platformy mikrostudzienki, procedury obrazowania niezbędne do analizy ilościowej społeczności drobnoustrojów w obrębie sieci oraz metody, które można wykorzystać do ujawnienia interakcji między obszarem gatunków drobnoustrojów.

Introduction

Społeczności mikrobiologiczne są kształtowane zarówno przez czynniki deterministyczne, takie jak struktura środowiska, jak i procesy stochastyczne, które są związane ze śmiercią komórki, podziałem, koncentracją białek, liczbą organelli i mutacją¹. W środowisku naturalnym analiza indywidualnego wpływu tych wpływów na skład i aktywność społeczności może być prawie niemożliwa. Zasłonięte przez naturalne struktury i zakopane w środowisku chemicznym i biologicznym, identyfikacja członków społeczności i dalsze określenie ich czasoprzestrzennego rozmieszczenia w środowisku naturalnym jest niezwykle trudne. Niemniej jednak ostatnie wysiłki podkreśliły ....

Protocol

1. Wytwarzanie matryc mikrostudzienkowych krzemu

1. Powłoka parylenowa
   1. Osadzać od 1 do 1,5 μm parylenu N na płytkach krzemowych za pomocą dostępnego na rynku systemu powlekania parylenu zgodnie ze specyfikacją i instrukcjami producenta (ustawienia: nastawa parownika = 160 °C; nastawa pieca = 650 °C).
      UWAGA: Około 6 g parylenu N załadowanego do komory daje powłoki o grubości 1-1,5 μm.
2. Fotolitografia
   1. Powlekanie wafli pokrytych parylenem N promotorem adhezji, 20% heksametylodilazanem (HMDS) i 80% octanem eteru monometylowego glikolu propylenowego (PGMEA) (patrz tabela....

Results

Prezentowana tutaj platforma eksperymentalna jest przeznaczona do wysokoprzepustowych i bogatych badań społeczności bakteryjnych. Projekt umożliwia jednoczesną analizę tysięcy społeczności, rosnących w studniach o różnej wielkości. Dzięki tej konstrukcji układu mikrostudzienek można określić zależność końcowego składu zbiorowiska od początkowej gęstości wysiewu, wielkości studni i środowiska chemicznego. Praca ta pokazuje wzrost dwuosobowej społeczności w układzie mikrostudni i przedstawi.......

Discussion

W artykule tym przedstawiono urządzenie do tworzenia matryc mikrodołkowych oraz protokoły eksperymentalne zaprojektowane w celu umożliwienia wysokoprzepustowej i opartej na obrazowaniu żywych komórek analizy rozwoju społeczności bakteryjnej opartej na obrazowaniu żywych komórek. Podczas gdy celem demonstracji było zbadanie wpływu kontaktowego wydzielania typu VI na rozwój społeczności, matryce zostały zaprojektowane tak, aby były elastyczne i umożliwiały badanie szerokiego zakresu społeczności drobnoustrojów i interakcji.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Specjalistyczne systemy powłokowe	Parylene N	CAS: 1633-22-3
Powlekarka Parylene	Specjalistyczne systemy powlekania	Labcoter 2 Jednostka osadzania parylenu PDS2010
Wafel krzemowy	WRS Materiały	średnicy 100 mm, 500-550 i mu; m grubość, Prime, 10-20 rezystywność, N/Phos< 100>,
promotor adhezji	Shin-Etsu Microsci	MicroPrime P20 promotor
postive tone photoresist	Rohm and Haas Electronics Materials LLC (własność Dow)	Microposit S1818 Positive Photoresist (kod 10018357)
Quintel Contact Aligner	Neutronix Quintel Corp	NXQ 7500 Mask Aligner
Reaktywne narzędzie do trawienia jonowego	Oxford Instrumenty	Plasmalab System 100 Reaktywny wytrawiacz
R2A Rosół	TEKnova	R0005
Surowica bydlęca Albumina	Sigma	A9647
Wielomodowy czytnik płytek	Perkin Elmer	Enspire, 2300-0000
Mikroskop fluorescencyjny	Nikon	Eclipse Ti-U
Automated Stage	Prior	ProScan III
Kamera CCD	Nikon	DS-QiMc
Stage-top komora kontroli środowiska	In Vivo Scientific	STEV ECU-HOC
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem	ThermoFisher Scientific	14190144
UltraPure Agaroza	ThermoFisher Scientific	16500500
25 x 75 mm No. 1.5 szkiełko nakrywkowe	Nexterion	Wysoka wydajność #1.5H Szkiełka
Fluorescencyjne preparaty referencyjne	Ted Pella	2273
Fizyczny rysik Profilometr	KLA Chusteczki laboratoryjne Tencor	P-6
	Kimberly Clark	Kimipe KIMTECH SCIENCE Marka, 34155
oprogramowanie komercyjne	Nikon	NIS Elements
Mikroskop konfokalny Zeiss 710	Zeiss
kostki filtracyjne	Nikon	Nikon FITC (96311), Nikon Texas Czerwony(96313)