Method Article

Montaż i śledzenie rozwoju społeczności mikrobiologicznej w ramach platformy Microwell Array

DOI:

10.3791/55701

⸱

June 6th, 2017

 ,  ,  , 
1Biosciences Division, Oak Ridge National Laboratory, 2Bredesen Center for Interdisciplinary Research and Graduate Education, University of Tennessee, 3Center for Nanophase Materials Sciences, Oak Ridge National Laboratory

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozwój społeczności mikroorganizmów zależy od kombinacji czynników, w tym architektury środowiska, liczebności członków, cech i interakcji. Protokół ten opisuje syntetyczne, mikrofabrykowane środowisko do jednoczesnego śledzenia tysięcy społeczności zawartych w studniach femtolitrowych, w którym można przybliżyć kluczowe czynniki, takie jak wielkość niszy i zamknięcie.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozwój społeczności mikrobiologicznych zależy od kombinacji złożonych czynników deterministycznych i stochastycznych, które mogą radykalnie zmienić rozkład przestrzenny i działania członków społeczności. Opracowaliśmy platformę macierzy mikrostudzienek, która może być używana do szybkiego łączenia i śledzenia tysięcy społeczności bakteryjnych równolegle. Protokół ten podkreśla użyteczność platformy i opisuje jej zastosowanie do optycznego monitorowania rozwoju prostych, dwuosobowych społeczności w zespole tablic w ramach platformy. W tej demonstracji wykorzystano dwa mutanty Pseudomonas aeruginosa, będące częścią serii mutantów opracowanych w celu badania patogenności wydzielania typu VI. Wstawione chromosomy genów mCherry lub GFP ułatwiają konstytutywną ekspresję białek fluorescencyjnych o różnych długościach fal emisyjnych, które można wykorzystać do monitorowania liczebności i lokalizacji członków społeczności w każdej mikrostudzince. Protokół ten opisuje szczegółową metodę łączenia mieszanin bakterii w studzienkach macierzy oraz wykorzystania obrazowania fluorescencyjnego w czasie i ilościowej analizy obrazu do pomiaru względnego wzrostu populacji każdego członka w czasie. Omówiono zasiewanie i montaż platformy mikrostudzienki, procedury obrazowania niezbędne do analizy ilościowej społeczności drobnoustrojów w obrębie sieci oraz metody, które można wykorzystać do ujawnienia interakcji między obszarem gatunków drobnoustrojów.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Społeczności mikrobiologiczne są kształtowane zarówno przez czynniki deterministyczne, takie jak struktura środowiska, jak i procesy stochastyczne, które są związane ze śmiercią komórki, podziałem, koncentracją białek, liczbą organelli i mutacją1. W środowisku naturalnym analiza indywidualnego wpływu tych wpływów na skład i aktywność społeczności może być prawie niemożliwa. Zasłonięte przez naturalne struktury i zakopane w środowisku chemicznym i biologicznym, identyfikacja członków społeczności i dalsze określenie ich czasoprzestrzennego rozmieszczenia w środowisku naturalnym jest niezwykle trudne. Niemniej jednak ostatnie wysiłki podkreśliły znaczenie organizacji przestrzennej dla funkcjonowania społeczności i wskazują na potrzebę uwzględnienia zarówno liczebności, jak i organizacji członków w trwających badaniach2,3,4.

Jest jasne, że lokalne środowisko chemiczne (tj. dostępność składników odżywczych i metabolitów wtórnych), struktura fizyczna (np. architektura gleby, korzenie roślin, cząsteczki oceanu lub mikrokosmki jelitowe), obecność lub brak tlenu oraz wprowadzenie gatunków chorobotwórczych wpływają na skład, architekturę i funkcję społeczności mikroorganizmów5,6,7,8,9,10,11. Niemniej jednak tradycyjne techniki stosowane w kulturach, które zaniedbują uchwycenie tych czynników, nadal przeważają. Skład społeczności (np. obecność współzależnych gatunków), fizyczne przywiązanie, stężenie cząsteczki sygnałowej i bezpośredni kontakt komórka-komórka są ważnymi czynnikami kształtowania społeczności drobnoustrojów i mogą zostać utracone w konwencjonalnych warunkach hodowli. Właściwości te są trudne do odtworzenia w masowej kulturze płynnej lub na płytce agarowej. Dostępność technik mikroprzepływowych, mikrowzorcowych i nanowytwarzania, które pozwalają na odtworzenie kluczowych cech fizycznych i chemicznych środowiska naturalnego, umożliwiła jednak wielu badaczom zbudowanie społeczności bakteryjnych w celu zbadania ich interakcji12,13,14 oraz opracowanie syntetycznych środowisk naśladujących warunki naturalne4,15,16,17,18,19,20.

Ten protokół opisuje metodę wytwarzania urządzenia do mikrodołków i dostarcza szczegółowych procedur eksperymentalnych, które mogą być wykorzystane do funkcjonalizacji studzienek w tablicy i do hodowli bakterii, zarówno jako kolonie jednogatunkowe, jak i w społecznościach wieloosobowych. Praca ta pokazuje również, w jaki sposób bakterie zmodyfikowane do produkcji fluorescencyjnych białek reporterowych mogą być wykorzystywane do monitorowania wzrostu bakterii w studzienkach w czasie. Podobna matryca została zaprezentowana wcześniej i wykazała, że możliwe jest śledzenie wzrostu jednogatunkowych kolonii Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) w mikrostudzienkach. Modulując wielkość studni i gęstość wysiewu, warunki początkowe tysięcy eksperymentów wzrostu mogą być zmieniane równolegle, aby określić, jak początkowe warunki inokulacji wpływają na zdolność bakterii do wzrostu21. W obecnych pracach wykorzystano nieco zmodyfikowaną wersję macierzy mikrostudzienek, która opiera się na poprzedniej pracy, umożliwiając jednoczesne porównywanie wielu macierzy i stosując bardziej niezawodny protokół eksperymentalny. Tablica użyta w tej pracy zawiera wiele podtablic lub zespołów tablicowych, zawierających studnie o różnych rozmiarach, w zakresie średnic od 15 do 100 μm, które są rozmieszczone w trzech różnych odstępach (tj. 2x, 3x i 4x średnica studni). Matryce są wytrawiane w krzemie, a wzrost bakterii zasianych w matrycach krzemowych jest możliwy dzięki uszczelnieniu matryc szkiełkiem nakrywkowym, które zostało pokryte średnio nasyconym żelem agarozowym. W tej demonstracji wykorzystano mutanty P. aeruginosa przeznaczone do badania systemu wydzielania typu VI.

Przedstawione tutaj wyniki przybliżają do ostatecznego celu, jakim jest analiza wieloczłonowych społeczności w mikroukładach studzienek, umożliwiając badaczom monitorowanie obfitości i organizacji bakterii in situ, jednocześnie kontrolując i badając środowisko chemiczne. Powinno to ostatecznie dostarczyć informacji na temat "zasad", które rządzą rozwojem i dziedziczeniem społeczności.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Wytwarzanie matryc mikrostudzienkowych krzemu

  1. Powłoka parylenowa
    1. Osadzać od 1 do 1,5 μm parylenu N na płytkach krzemowych za pomocą dostępnego na rynku systemu powlekania parylenu zgodnie ze specyfikacją i instrukcjami producenta (ustawienia: nastawa parownika = 160 °C; nastawa pieca = 650 °C).
      UWAGA: Około 6 g parylenu N załadowanego do komory daje powłoki o grubości 1-1,5 μm.
  2. Fotolitografia
    1. Powlekanie wafli pokrytych parylenem N promotorem adhezji, 20% heksametylodilazanem (HMDS) i 80% octanem eteru monometylowego glikolu propylenowego (PGMEA) (patrz tabela materiałów) przy 3,000 obr./min przez 45 s. Napełnij pipetę transferową o pojemności 2 ml promotorem przyczepności i rozsyp nią całą płytkę. Pozostaw wafel na około 10 sekund przed odwirowaniem go do wyschnięcia.
    2. Napełnij pipetę transferową o pojemności 2 ml fotorezystem o dodatnim tonie (patrz Tabela materiałów) i dozuj fotorezystor na środku płytki. Wiruj z prędkością 3 000 obr./min przez 45 s, aby uzyskać powłokę rezystancyjną o grubości około 1,5 μm.
    3. Próbki należy wypraskiwać na miękko na płycie grzejnej w temperaturze 115 °C przez 1 minutę.
    4. Użyj nakładki kontaktowej i fotomaski z pożądanym wzorem dołka, aby wystawić próbkę na działanie światła ultrafioletowego. Naświetlić powlekaną wirowo płytkę przez wzorzystą fotomaskę przez 6 s, podając przybliżoną dawkę 60-80 mJ/cm2 mierzoną przy 365 nm.
    5. Opracować wzór, zanurzając próbkę w wywoływaczu (< 3% wodorotlenku tetrametyloamoniowym w wodzie; patrz tabela materiałów) na 2 minuty. Spłukać wodą demineralizowaną i osuszyć czystym, suchym azotem.
      UWAGA: Obszary fotorezystu wystawione na działanie promieniowania UV należy oczyścić podczas wywoływania.
  3. Reaktywne trawienie jonowe
    1. Użyj wytrawiania plazmą tlenową, aby usunąć odsłonięty parylen aż do podłoża krzemowego.
      UWAGA: Recepturę można modulować, aby zmienić szybkość wytrawiania parylenu. W przypadku grubości parylenu od 1 do 5 μm należy użyć receptury z 60 mTorr, 20 °C, 100 sccm O2, 10 W RF i 2,000 W ICP na narzędziu do reaktywnego trawienia jonowego (RIE). Po wytrawieniu i usunięciu odsłoniętej warstwy parylenu, wzorzysty obszar (czyli odsłonięty silikon) powinien wyglądać na błyszczący i srebrny.
    2. Użyj głębokiego RIE (DRIE; Na przykład, Bosch DRIE) proces wytrawiania w krzemie.
      UWAGA: Szybkość i czas trwania wytrawiania określą głębokość odwiertu. Jeden pełny cykl procesu Bosch (3-sekundowy etap osadzania: 20 mTorr, 15 °C, 140 sccm C4 F8, 10 W RF i 1 750 W ICP, a następnie 10-sekundowy proces wytrawiania: 20 mTorr, 15 °C, 120 sccm SF6, 8 W RF i 1 750 W ICP) odpowiada około 1 μm głębokości wytrawiania. Studnie użyte w tej demonstracji mają głębokość od 3 do 3,5 μm.
    3. Sprawdź głębokość wytrawiania za pomocą profilometrii fizycznej.
      1. Załadować próbkę do profilometru fizycznego (patrz tabela materiałów).
      2. Włącz próżnię próbki i naciśnij przycisk ręcznego ładowania.
      3. Ustaw ostrość systemu na próbce, naciskając przycisk "Focus". Ustaw odpowiednią cechę do pomiaru na ekranie widoku.
      4. Zeskanuj próbkę. Wypoziomuj profil i zmierz głębokość elementu.
      5. Rejestruj szybkość wytrawiania i moduluj kolejne czasy wytrawiania, aby osiągnąć żądaną głębokość.
        UWAGA: Pomiary będą obejmować głębokość studzienki krzemowej, grubość osadzonego parylenu oraz grubość fotorezystu. Weryfikacja grubości każdej warstwy podczas całej procedury jest konieczna, aby uzyskać dokładną głębokość studni.

2. Hodowla i wysiew bakterii (Rysunek 1a)

  1. Rozpocznij tworzenie kolonii na płytkach agarowych Luria Broth (LB) z wywaru glicerolu i zużyj w ciągu dwóch tygodni. Zbierz kolonie pożądanych szczepów z płytek agarowych LB i rozpocznij nocne hodowle P. aeruginosa. Inkubować nocne kultury przez około 18 godzin w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 220 obr./min w pożywce R2A.
    UWAGA: Kolonie należy zebrać w ciągu dwóch tygodni od posiewu, aby zapewnić zachowanie mutacji i fluorescencyjnych genów reporterowych. Wszystkie prace związane z P. aeruginosa powinny być wykonywane w warunkach BSL-2.
  2. Użyj rysika diamentowego, aby pokroić płytkę krzemową na pojedyncze chipy zawierające zespoły o różnych rozmiarach i układach studni. Upewnij się, że każdy chip zawiera pełny zestaw rozmiarów i podziałek studzienek do badania.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Procedura wytwarzania i wysiewu komórek. (a) Matryce mikrostudzienki są wytrawiane w płytkach krzemowych pokrytych cienką warstwą parylenu (i). Aby zwilżyć studzienki i/lub funkcjonalizować powierzchnię, dodaje się roztwór białka w kropli na wierzchu tablic (ii). Roztwór białkowy jest usuwany, wafle są suszone i dodawany jest nowy roztwór zawierający pożądane bakterie (iii). Roztwór bakteryjny usuwa się po okresie inkubacji, a płytki pozostawia się do wyschnięcia, pozostawiając bakterie w studzienkach i na powierzchni (iv). Bakterie związane z powierzchnią są usuwane za pomocą liftingu parylenu, pozostawiając bakterie czysto wysiane w mikrostudzienkach i nadal żywotne dzięki 2% pożywce glicerynowej (v), która pomaga utrzymać nawodnienie studzienek (v). Chipy krzemowe są następnie umieszczane stroną do dołu na szkiełku nakrywkowym pokrytym żelem agarozowym, które odżywia rozwój bakterii w mikrostudzienkach (vi). (b) Układ podtablic na pojedynczym urządzeniu krzemowym. Każda tablica podrzędna zawiera zestaw identycznych studni. Średnica mikrostudzienek we wszystkich podmatrycach waha się od 5 do 100 μm i jest zorganizowana na 2x, 3x lub 4x średnicę studni, która jest oznaczona kolorami od białego do ciemnoszarego na schemacie dolnego panelu. Gdy głębokość studni jest niewielka (<10 μm), średnice studni 5 i 10 μm rzadko są użyteczne, głównie z powodu braku komórek kolonizujących te bardzo małe studnie. W niniejszej pracy przeanalizowano jedynie dane ze studni o średnicach 15-100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

UWAGA: Jak pokazano na Rysunek 1b, kompletny chip zawiera podtablice studni o średnicach od 5 do 100 μm, z trzema różnymi podziałkami (tj. 2x, 3x i 4x średnica) powtarzającymi się 4 razy.

  1. Umieścić 150 μl kropli 500 μg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w roztworze PBS na wierzchu matrycy, aby zwilżyć mikrostudzienki. Inkubować roztwór BSA przez 1 godzinę na chipie w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze.
    1. Stwórz komorę, wypełniając dno pustego pudełka z końcówkami do pipet solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
      UWAGA: Inne substancje, takie jak określone lektyny, mogą być stosowane zamiast BSA do funkcjonalizacji powierzchni mikrostudzienek.
  2. Podczas inkubacji chipów krzemowych z roztworem BSA, odwirować kultury z prędkością 2 500 obr./min (co odpowiada średnio 950 x g) przez 5 minut, a następnie ponownie zawiesić je w 500 μl świeżej pożywki R2A z 2% glicerolem.
    1. Oznaczyć OD kultury za pomocą spektrometru UV-vis przy długości fali 600 nm. Dostosuj go do OD 0,02 za pomocą 2% glicerolu R2A medium.
      UWAGA: Glicerol pomaga zapobiegać wysychaniu studzienek podczas startu parylenu.
  3. Po inkubacji usunąć roztwór BSA i przepłukać 3x PBS, usuwając i zastępując kroplę cieczy pokrywającą matrycę mikrostudzienki krzemowej. Suszyć pod azotem.
  4. Dodać 150 μl kultur o średnicy 0,02 OD do każdej z suchych matryc umieszczonych w wilgotnej komorze. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C, aby bakterie mogły przylgnąć do ścianek studzienki.
    UWAGA: Chłodzenie nie jest wymagane do inkubacji. Czas inkubacji wynoszący 4 °C można wykorzystać do zapobiegania rozwojowi bakterii przed rozpoczęciem obrazowania, dzięki czemu można zobrazować organizację przestrzenną społeczności przed wzrostem. Można również zastosować inkubację w temperaturze pokojowej. Oba protokoły skutkują podobnymi krzywymi wzrostu.

3. Ustawienie mikroskopu

  1. Przed rozpoczęciem inkubacji bakterii na chipach krzemowych włącz komorę kontroli środowiska stage-top (patrz tabela materiałów) i dostosuj ustawienia w skrzynce sterowniczej tak, aby wilgotność (~100%) i temperatura (30-32 °C, patrz krok 3.2) mogły się zrównoważyć przed dodaniem próbek.
  2. Wypoziomuj uchwyt próbki i wyłóż wnętrze wokół próbki chusteczkami laboratoryjnymi nasączonymi PBS (patrz Tabela materiałów), aby zwiększyć wilgotność w komorze do punktu rosy. Ustaw temperaturę komory na 30 °C, a pokrywy komory na 32 °C, aby zmniejszyć kondensację pary wodnej na płaszczyźnie obrazowania.
    UWAGA: Uchwyt suwaka pasuje do komory żywej komórki z uszczelką o grubości około 1 cm. Uchwyt na próbkę jest poziomowany za pomocą poziomicy, która jest umieszczona na górze uchwytu próbki. Uchwyt próbki można lekko przechylić i pozostać uszczelniony w uszczelce do poziomu.
  3. Podczas inkubacji kultur na chipach krzemowych należy ręcznie włączyć wyłącznik zasilania lampy rtęciowej co najmniej 30 minut przed obrazowaniem. Ręcznie włącz kamerę i zautomatyzowany stolik mikroskopu. Otwórz oprogramowanie używane do sterowania mikroskopem i urządzeniami peryferyjnymi i upewnij się, że sprzęt jest rozpoznawany przez oprogramowanie.
    UWAGA: Powiększenie wynosi 10X przy NA = 0,3.

4. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych pokrytych agarozą

  1. Uprzednio przygotowane roztwory agarozy (tj. 2% agarozy w pożywce R2A) podgrzać w mikrofalówce aż do osiągnięcia stanu ciekłego, około 60 s.
  2. Zwilż tylną część szkiełka nakrywkowego o wymiarach 75 mm x 22 mm, #1.5 etanolem i umieść go wzdłuż, wyśrodkowanie, na szkiełku podstawowym o wymiarach 2 x 3" (50 x 75 mm). Umieścić dwie przekładki PDMS (grubość ~1 mm) wzdłuż dłuższych krawędzi szkiełka nakrywkowego i przesunąć szkiełko nakrywkowe tak, aby około 1 mm szkiełka nakrywkowego wystawało poza krawędź szkiełka.
  3. Wlej 5 ml płynnego roztworu agarozy na szklane szkiełko nakrywkowe, tylko tyle, aby całkowicie je przykryć, i umieść drugie szkiełko 2 x 3" na wierzchu zespołu, aby "umieścić" płynny agar między szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkiem.
    UWAGA: Kontroluje to głębokość agarozy, dzięki czemu całkowita grubość szkiełka nakrywkowego i utwardzonej agarozy jest równa grubości przekładek PDMS.
  4. Pozostawić kanapkę szkiełko-szkiełko nakrywkowe-żel agarozowo-szkiełkowy do zastygnięcia, aż roztwór agarozy zacznie krzepnąć; następnie przenieś go do lodówki. Po 15 minutach usuń nadmiar stałej agarozy i przetnij wokół szklanego szkiełka nakrywkowego. Przenieś to do czystego naczynia i wstaw do lodówki do czasu użycia.

5. Uszczelnianie studzienek za pomocą szkiełka nakrywkowego pokrytego agarozą i obrazowanie

  1. Po zakończeniu okresu inkubacji bakterii wyjmij z lodówki szkiełko nakrywkowe pokryte agarozą i przygotuj wióry silikonowe w następujący sposób.
    1. Zanurz wióry krzemowe w ultraczystej wodzie, pojedynczo, na 10 sekund każdy. Ustaw je na krawędziach na chusteczce laboratoryjnej lub chusteczce, aż większość nadmiaru płynu spłynie z krawędzi chipsów.
    2. Wytnij kawałek taśmy, aby dopasować długość krawędzi każdego chipa krzemowego. Przyłóż taśmę do parylenu, który pokrywa silikon i użyj jej do szybkiego odklejenia powłoki parylenu.
    3. Natychmiast odwróć każdy obrany wiór i umieść każdy wiór w taki sposób, aby bok układu mikrostudzienki był skierowany w stronę (i stykał się z) pokrytą agarozą stroną szkiełka nakrywkowego pokrytego agarozą. Uważaj, aby nie przesuwać ani nie przesuwać chipa po dotknięciu agarozy, aby zapobiec rozwojowi bakterii poza studzienkami.
  2. Umieść zmontowaną matrycę mikrostudzienek/szkiełko nakrywkowe z agarozy w uchwycie szkiełek w górnej części komory kontroli środowiska na miscroskopie.
    1. Użyj światła otoczenia lub światła skierowanego (np. latarki), aby zlokalizować interesujące tablice. Użyj komercyjnego oprogramowania sterującego zautomatyzowanym etapem, aby zapisać te pozycje (patrz tabela materiałów). Wyłącz światło otoczenia lub światło kierunkowe po zapisaniu pozycji.
    2. W oprogramowaniu komercyjnym otwórz panel "ND Acquisition".
      UWAGA: Ten panel zawiera menu do automatycznego zapisywania w określonym katalogu, a także programowalnej akwizycji obrazu. W tych eksperymentach używane są menu "Czas", "XY" i "λ".
    3. Aby zapisać lokalizacje w oprogramowaniu, kliknij "menu XY", a następnie zaznacz puste pole po lewej stronie dla każdej pozycji, którą należy zapisać. Kliknij także przycisk "Dołącz Z".
  3. Uzyskuj obrazy w czasie na żądanych długościach fal i powiększeniu 10 za pomocą odpowiednich kostek filtra fluorescencyjnego (patrz tabela materiałów).
    1. Użyj oprogramowania sterującego i zapisanych pozycji tablicy, aby przejść do każdej zapisanej lokalizacji i skupić się na studniach. Kliknij każdą lokalizację XY na zapisanej liście i dostosuj ostrość za pomocą filtra Green Flourescence Protein (GFP). Zapisz nową pozycję z, klikając strzałkę wskazującą lokalizację z.
      UWAGA: Ten proces może być czasochłonny. Rozważ podjęcie środków ostrożności polegających na zwiększeniu wzmocnienia i użyciu filtra o neutralnej gęstości w celu zmniejszenia natężenia światła, aby zapobiec fotowybielaniu.
    2. Określ odległość osi z między płaszczyznami ogniskowej dla każdej długości fali, zwracając uwagę na różnicę w położeniu osi z po ustawieniu ostrości na powierzchni matrycy. Wybierz 2-3 lokalizacje z tablicy z mieszaną populacją czerwono-zielonych bakterii i skoncentruj się za pomocą filtra czerwonego białka fluorescencji (RFP).
      1. Odejmij odległość między płaszczyznami ogniskowej za pomocą filtrów fluorescencyjnych GFP i RFP i dodaj tę regulację płaszczyzny ogniskowej w menu "λ".
        UWAGA: Na przykład, jeśli matryca wydaje się być zogniskowana w kanale GFP w lokalizacji z 50 μm, a ta sama matryca wydaje się skupiona w kanale RFP na 55 μm, dodaj +5 obok konfiguracji optycznej RFP w menu "λ".
    3. Rozpocznij akwizycję obrazu poklatkowego.
      UWAGA: W przypadku pokazanych tutaj eksperymentów obrazy RFP i GFP zostały uzyskane dla każdej pozycji matrycy w odstępach 30-minutowych przy użyciu wielowymiarowej akwizycji obrazu za pomocą komercyjnego oprogramowania, które steruje kamerą, migawką, kołem filtrów i zmotoryzowanym stolikiem.
      1. Ustaw "interwał" na 30 minut, a "czas trwania eksperymentu" na 24 godziny w menu "Czas". Kliknij "Uruchom teraz"."
        UWAGA: Po zaznaczeniu pól "Czas", "XY" i "λ" uruchomienie programu przesunie stolik, aby zobrazować każdą lokalizację (tj. zapisane lokalizacje XYZ), wykonać zdjęcie na jednej długości fali, przesunąć pozycję z, aby uwzględnić różnice w płaszczyźnie ogniskowej (tj. lambda lub kontrola długości fali), wykonać drugi obraz, Przejdź do następnej lokalizacji tablicy (wielopunktowej) i zapętlaj ją w odstępach 30-minutowych (poklatkowe).
  4. Pozyskiwanie obrazów sterujących oświetleniem.
    UWAGA: Użyj menu "Akwizycja ND", "Czas" i "XY", aby zrobić zdjęcia 4 lokalizacji, z których każda jest 25-krotna.
    1. Wykonaj serię 100 zdjęć "ciemnego pola", wyłączając wszystkie źródła światła i robiąc "zdjęcie" standardowego slajdu. Te obrazy uchwycą szum aparatu. Użyj najdłuższego czasu naświetlania używanego podczas filmu poklatkowego (krok 5.3.3).
    2. Wykonaj serię 100 obrazów "pola oświetlenia", obrazując standardowy slajd (tj. jednolitą intensywność RFP lub GFP) w kilku różnych miejscach, aby uchwycić nierównomierne oświetlenie w danych warunkach eksperymentalnych. Wybierz czas ekspozycji, który maksymalizuje sygnał bez osiągania nasycenia.

6. Analiza

  1. Przetwarzaj stosy obrazów za pomocą oprogramowania do analizy obrazów (np. ImageJ).
    1. Konwertuj uzyskane obrazy do formatu pliku tiff za pomocą komercyjnego oprogramowania. Prześlij obrazy do oprogramowania do analizy obrazów, klikając "Plik"> "Importuj"> "Sekwencja obrazów".
    2. Utwórz "Obraz korekcyjny", uśredniając wszystkie obrazy "ciemnego pola" i "pola oświetlenia". Odejmij średni obraz "ciemnego pola" od średniego obrazu "pola oświetlenia", wybierając "Proces" > "Kalkulator obrazu". Wybierz dwa obrazy, "Image1" i "Image2", a następnie "Odejmij" w polu "Operation". Kliknij "OK".
      1. Aby uśrednić, załaduj obrazy korekcyjne (lub ciemne pole), kliknij "Obraz" > "Stosy" > "Projekt Z" > "Projekcja średnia".
    3. W razie potrzeby przeprowadź rejestrację obrazu. Następnie wykonaj odejmowanie tła, klikając "Proces" > "Odejmij tło". Wprowadź promień (np. 125) w polu "promień" i wybierz "paraboloida ślizgowa".
    4. Wykonaj korekcję oświetlenia za pomocą "Proces" > "Kalkulator Plus". Wybierz następujące parametry: operacja, dzielenie; i1, obraz dobrze; i2, obraz korekcyjny; k1, średnia obrazu korekcyjnego; i k2, 0. Kliknij "Utwórz nowe okno"
      UWAGA: Ten zestaw danych nie wymagał rejestracji, ale w innych pracach użyto wtyczki ImageJ StackReg z transformacją "Translation". Do odejmowania tła należy użyć tego samego promienia paraboloidy ślizgowej dla każdego zestawu obrazów. Na przykład, jeśli największe obrazowane dołki mają promień piksela 100, użyj promienia większego niż 100 (>np. 125) dla każdego zestawu obrazów.
  2. Określ wzrost każdego szczepu w mikrostudzienkach.
    1. Wybierz obszary zainteresowania (ROI) wokół każdej mikrostudzienki w żądanych układach za pomocą wtyczki ImageJ "MicroArray".
      1. W menu "MAPA" kliknij "Resetuj siatkę". Określ wiersze, kolumny i średnicę (na podstawie rozmiaru i liczby studni na tablicy; zobacz Rysunek 1b). Wybierz "okrąg" z menu "Kształt ROI".
      2. Przytrzymaj "Alt" podczas wybierania lewego górnego rogu myszy za pomocą myszy, aby przesunąć tablicę ROI. Przytrzymaj "shift" podczas wybierania ROI w lewym dolnym rogu, aby zmienić rozmiar tablicy. Przytrzymaj "shift" podczas wybierania ROI z prawej strony tablicy, ale nie w rogach, aby zmienić odstępy między ROI.
      3. Użyj powyższych poleceń, aby dopasować tablicę ROI do studzienek na obrazie. Kliknij "Zmierz RT."
        UWAGA: Wtyczka wyeksportuje żądane pomiary z każdego ROI. Użyj trzech rozmiarów ROI, tworząc koncentryczne pierścienie wokół studzienek, aby zebrać lokalnie sygnał tła (tj. sygnał ze środkowego pierścienia odjęty od pierścienia zewnętrznego) i pomiary fluorescencji (tj. sygnał z pierścienia wewnętrznego).
    2. Zbierz dane w arkuszu kalkulacyjnym i oblicz sygnał tła. Zaimportuj go do niestandardowego oprogramowania skryptowego w celu dalszej analizy.
  3. Organizacja i analiza danych
    1. Zaimportuj dane i uporządkuj dane zebrane w ImageJ w macierzy w następującej kolejności dla wszystkich czasów: kolumna 1, numer podtablicy; kolumna 2, wiersz dołka; kolumna 3, kolumna studzienki; kolumna 4, średnia intensywność; kolumna 5, intensywność tła; i kolumna 6, średnia intensywność - intensywność tła.
      1. Rozdziel wyniki akwizycji mCherry i GFP na różne macierze. Przechowuj wyniki z każdej podtablicy i każdego koloru w innej komórce w tablicy komórek.
        UWAGA: Ta organizacja ułatwia przechodzenie między danymi obrazu a wynikami pomiarów, czyszcząc dane i upewniając się, że pomiary dokładnie odzwierciedlają dane.
    2. Dostosuj do autofluorescencji P. aeruginosa.
      UWAGA: W eksperymentach obejmujących jednoczesną hodowlę szczepów GFP i mCherry, chip zawierający tylko mCherry powinien być analizowany w celu ustalenia związku między mCherry a zieloną autofluorescencją.
      1. Wykreślić sygnał mCherry-vsus-GFP ze wszystkich studzienek mCherry ΔretSΔtse/i1-6 we wszystkich punktach czasowych, aby określić związek między sygnałem mCherry a autofluorescencją w kanale GFP. Odejmij sygnał autofluorescencji od kokultur.
    3. Wykreśl trajektorie i dopasuj zmodyfikowane równanie logistyczne do każdej trajektorii, aby wyodrębnić parametry przy użyciu metody najmniejszych kwadratów pasujących do oprogramowania do obsługi arkuszy kalkulacyjnych lub niestandardowych skryptów.
    4. Poszukaj korelacji między parametrami trajektorii GFP i mCherry.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentowana tutaj platforma eksperymentalna jest przeznaczona do wysokoprzepustowych i bogatych badań społeczności bakteryjnych. Projekt umożliwia jednoczesną analizę tysięcy społeczności, rosnących w studniach o różnej wielkości. Dzięki tej konstrukcji układu mikrostudzienek można określić zależność końcowego składu zbiorowiska od początkowej gęstości wysiewu, wielkości studni i środowiska chemicznego. Praca ta pokazuje wzrost dwuosobowej społeczności w układzie mikrostudni i przedstawi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W artykule tym przedstawiono urządzenie do tworzenia matryc mikrodołkowych oraz protokoły eksperymentalne zaprojektowane w celu umożliwienia wysokoprzepustowej i opartej na obrazowaniu żywych komórek analizy rozwoju społeczności bakteryjnej opartej na obrazowaniu żywych komórek. Podczas gdy celem demonstracji było zbadanie wpływu kontaktowego wydzielania typu VI na rozwój społeczności, matryce zostały zaprojektowane tak, aby były elastyczne i umożliwiały badanie szerokiego zakresu społeczności drobnoustrojów i interakcji...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Matryce Microwell zostały wyprodukowane i scharakteryzowane w Center for Nanophase Materials Sciences User Facilities Division, Office of Basic Energy Sciences, U.S. Department of Energy. Wsparcie finansowe dla tych prac zostało zapewnione za pośrednictwem Funduszu Badawczo-Rozwojowego Dyrektora Narodowego Laboratorium Oak Ridge. Autorzy pragną również podziękować J. Mougous Laboratory (University of Washington, Seattle, WA) za dostarczenie szczepów P. aeruginosa wykorzystanych w tych badaniach.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Specjalistyczne systemy powłokoweParylene NCAS: 1633-22-3
Powlekarka ParyleneSpecjalistyczne systemy powlekaniaLabcoter 2 Jednostka osadzania parylenu PDS2010
Wafel krzemowyWRS Materiałyśrednicy 100 mm, 500-550 i mu; m grubość, Prime, 10-20 rezystywność, N/Phos< 100>,
promotor adhezjiShin-Etsu MicrosciMicroPrime P20 promotor
postive tone photoresistRohm and Haas Electronics Materials LLC (własność Dow)Microposit S1818 Positive Photoresist (kod 10018357)
Quintel Contact AlignerNeutronix Quintel CorpNXQ 7500 Mask Aligner
Reaktywne narzędzie do trawienia jonowegoOxford InstrumentyPlasmalab System 100 Reaktywny wytrawiacz
R2A RosółTEKnovaR0005
Surowica bydlęca AlbuminaSigmaA9647
Wielomodowy czytnik płytekPerkin ElmerEnspire, 2300-0000
Mikroskop fluorescencyjnyNikonEclipse Ti-U
Automated StagePriorProScan III
Kamera CCDNikonDS-QiMc
Stage-top komora kontroli środowiskaIn Vivo ScientificSTEV ECU-HOC
Sól fizjologiczna buforowana fosforanemThermoFisher Scientific14190144
UltraPure AgarozaThermoFisher Scientific16500500
25 x 75 mm No. 1.5 szkiełko nakrywkoweNexterionWysoka wydajność #1.5H Szkiełka
Fluorescencyjne preparaty referencyjneTed Pella2273
Fizyczny rysik ProfilometrKLA Chusteczki laboratoryjne TencorP-6
Kimberly ClarkKimipe KIMTECH SCIENCE Marka, 34155
oprogramowanie komercyjneNikonNIS Elements
Mikroskop konfokalny Zeiss 710Zeiss
kostki filtracyjneNikonNikon FITC (96311), Nikon Texas Czerwony(96313)
Nr o przyczepnościjonowynakrywkowe

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhou, J., Deng, Y., et al. Stochasticity, succession, and environmental perturbations in a fluidic ecosystem. Proc Natl Acad Sci. 111, E836-E845 (2014).
  2. Valm, A. M., Welch, J. L. M., et al. Systems-level analysis of microbial community organization through combinatorial labeling and spectral imaging. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (10), 4152-4157 (2011).
  3. Satoh, H., Miura, Y., Tsushima, I., Okabe, S. Layered structure of bacterial and archaeal communities and their in situ activities in anaerobic granules. Appl Environ Microbiol. 73 (22), 7300-7307 (2007).
  4. Kim, H. J., Boedicker, J. Q., Choi, J. W., Ismagilov, R. F. Defined spatial structure stabilizes a synthetic multispecies bacterial community. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (47), 18188-18193 (2008).
  5. Nunan, N., Wu, K., Young, I. M., Crawford, J. W., Ritz, K. Spatial distribution of bacterial communities and their relationships with the micro-architecture of soil. FEMS Microbiol Ecol. 44, 203-215 (2003).
  6. Grundmann, G. L. Spatial scales of soil bacterial diversity - The size of a clone. FEMS Microbiol Ecol. 48, 119-127 (2004).
  7. Langenheder, S., Lindstrom, E. S., Tranvik, L. J. Structure and Function of Bacterial Communities Emerging from Different Sources under Identical Conditions. Appl Environ Microbiol. 72 (1), 212-220 (2006).
  8. Camp, J. G., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. Patterns and Scales in Gastrointestinal Microbial Ecology. Gastroenterology. 136 (6), 1989-2002 (2009).
  9. Renner, L. D., Weibel, D. B. Physicochemical regulation of biofilm formation. MRS Bull. 36 (5), 347-355 (2011).
  10. Wessel, A. K., Hmelo, L., Parsek, M. R., Whiteley, M. Going local: technologies for exploring bacterial microenvironments. Nat Rev Microbiol. 11 (5), 337-348 (2013).
  11. Stacy, A., McNally, L., Darch, S. E., Brown, S. P., Whiteley, M. The biogeography of polymicrobial infection. Nat Rev Microbiol. 14 (2), 93-105 (2015).
  12. Hansen, R. R., Shubert, K. R., Morrell-Falvey, J. L., Lokitz, B. S., Doktycz, M. J., Retterer, S. T. Microstructured block copolymer surfaces for control of microbe adhesion and aggregation. Biosensors. 4 (1), 63-75 (2014).
  13. Hansen, R. R., Hinestrosa, J. P., et al. Lectin-functionalized poly(glycidyl methacrylate)- block -poly(vinyldimethyl azlactone) surface scaffolds for high avidity microbial capture. Biomacromolecules. 14 (10), 3742-3748 (2013).
  14. Timm, C. M., Hansen, R. R., Doktycz, M. J., Retterer, S. T., Pelletier, D. A. Microstencils to generate defined, multi-species patterns of bacteria. Biomicrofluidics. 9 (6), (2015).
  15. Keymer, J. E., Galajda, P., Muldoon, C., Park, S., Austin, R. H. Bacterial metapopulations in nanofabricated landscapes. Proc Natl Acad Sci USA. 103 (46), 17290-17295 (2006).
  16. Zhang, Q., Lambert, G., et al. Acceleration of Emergence of Bacterial Antibiotic Resistance in Connected Microenvironments. Science. 333 (6050), 1764-1767 (2011).
  17. Friedlander, R. S., Vlamakis, H., Kim, P., Khan, M., Kolter, R., Aizenberg, J. Bacterial flagella explore microscale hummocks and hollows to increase adhesion. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (14), 5624-5629 (2013).
  18. Zhou, J., Liu, W., et al. Stochastic Assembly Leads to Alternative Communities with Distinct Functions in a Bioreactor Microbial Community. MBio. 4 (2), 1-8 (2013).
  19. van Vliet, S., Hol, F. J., Weenink, T., Galajda, P., Keymer, J. E. The effects of chemical interactions and culture history on the colonization of structured habitats by competing bacterial populations. BMC Microbiol. 14 (1), 116(2014).
  20. Niepa, T. H. R., Hou, L., et al. Microbial Nanoculture as an Artificial Microniche. Sci Rep. 6, 30578(2016).
  21. Hansen, R. H., Timm, A. C., et al. Stochastic Assembly of Bacteria in Microwell Arrays Reveals the Importance of Confinement in Community Development. PLoS ONE. 11 (5), e0155080(2016).
  22. Hood, R. D., Singh, P., et al. A Type VI Secretion System of Pseudomonas aeruginosa Targets a Toxin to Bacteria. Cell Host Microbe. 7 (1), 25-37 (2010).
  23. LeRoux, M., Ja De Leon,, et al. Quantitative single-cell characterization of bacterial interactions reveals type VI secretion is a double-edged sword. Proc Natl Acad Sci. 109 (48), 19804-19809 (2012).
  24. Whitney, J. C., Beck, C. M., et al. Genetically distinct pathways guide effector export through the type VI secretion system. Mol Microbiol. 92 (3), 529-542 (2014).
  25. Warrick, J. W., Timm, A., Swick, A., Yin, J. Tools for Single-Cell Kinetic Analysis of Virus-Host Interactions. PLoS ONE. 11 (1), e0145081(2016).
  26. Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., Van't Riet, K. Modeling of the Bacterial Growth Curve. Appl Environ Microbiol. 56 (6), 1875-1881 (1990).
  27. Halsted, M., Wilmoth, J. L., et al. Development of transparent microwell arrays for optical monitoring and dissection of microbial communities. J Vac Sci Technol B Nanotechnol Microelectron. 34 (6), 06KI03(2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microbial Community DevelopmentMicrowell Array PlatformTime lapse Fluorescence ImagingQuantitative Image AnalysisPseudomonas aeruginosaFluorescent Protein ExpressionBacterial Community AssemblyHigh throughput ScreeningSilicon Micro WellsEnvironmental Control Chamber

Related Articles