Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Montaż i śledzenie rozwoju społeczności mikrobiologicznej w ramach platformy Microwell Array

8.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55701

⸱

6 czerwca 2017

 ,  ,  , 
1Biosciences Division, Oak Ridge National Laboratory, 2Bredesen Center for Interdisciplinary Research and Graduate Education, University of Tennessee, 3Center for Nanophase Materials Sciences, Oak Ridge National Laboratory

W tym artykule

Podsumowanie

Rozwój społeczności mikroorganizmów zależy od kombinacji czynników, w tym architektury środowiska, liczebności członków, cech i interakcji. Protokół ten opisuje syntetyczne, mikrofabrykowane środowisko do jednoczesnego śledzenia tysięcy społeczności zawartych w studniach femtolitrowych, w którym można przybliżyć kluczowe czynniki, takie jak wielkość niszy i zamknięcie.

Streszczenie

Rozwój społeczności mikrobiologicznych zależy od kombinacji złożonych czynników deterministycznych i stochastycznych, które mogą radykalnie zmienić rozkład przestrzenny i działania członków społeczności. Opracowaliśmy platformę macierzy mikrostudzienek, która może być używana do szybkiego łączenia i śledzenia tysięcy społeczności bakteryjnych równolegle. Protokół ten podkreśla użyteczność platformy i opisuje jej zastosowanie do optycznego monitorowania rozwoju prostych, dwuosobowych społeczności w zespole tablic w ramach platformy. W tej demonstracji wykorzystano dwa mutanty Pseudomonas aeruginosa, będące częścią serii mutantów opracowanych w celu badania patogenności wydzielania typu VI. Wstawione chromosomy genów mCherry lub GFP ułatwiają konstytutywną ekspresję białek fluorescencyjnych o różnych długościach fal emisyjnych, które można wykorzystać do monitorowania liczebności i lokalizacji członków społeczności w każdej mikrostudzince. Protokół ten opisuje szczegółową metodę łączenia mieszanin bakterii w studzienkach macierzy oraz wykorzystania obrazowania fluorescencyjnego w czasie i ilościowej analizy obrazu do pomiaru względnego wzrostu populacji każdego członka w czasie. Omówiono zasiewanie i montaż platformy mikrostudzienki, procedury obrazowania niezbędne do analizy ilościowej społeczności drobnoustrojów w obrębie sieci oraz metody, które można wykorzystać do ujawnienia interakcji między obszarem gatunków drobnoustrojów.

Wprowadzenie

Społeczności mikrobiologiczne są kształtowane zarówno przez czynniki deterministyczne, takie jak struktura środowiska, jak i procesy stochastyczne, które są związane ze śmiercią komórki, podziałem, koncentracją białek, liczbą organelli i mutacją1. W środowisku naturalnym analiza indywidualnego wpływu tych wpływów na skład i aktywność społeczności może być prawie niemożliwa. Zasłonięte przez naturalne struktury i zakopane w środowisku chemicznym i biologicznym, identyfikacja członków społeczności i dalsze określenie ich czasoprzestrzennego rozmieszczenia w środowisku naturalnym jest niezwykle trudne. Niemniej jednak ostatnie wysiłki podkreśliły znaczenie organizacji przestrzennej dla funkcjonowania społeczności i wskazują na potrzebę uwzględnienia zarówno liczebności, jak i organizacji członków w trwających badaniach2,3,4.

Jest jasne, że lokalne środowisko chemiczne (tj. dostępność składników odżywczych i metabolitów wtórnych), struktura fizyczna (np. architektura gleby, korzenie roślin, cząsteczki oceanu lub mikrokosmki jelitowe), obecność lub brak tlenu oraz wprowadzenie gatunków chorobotwórczych wpływają na skład, architekturę i funkcję społeczności mikroorganizmów5,6,7,8,9,10,11. Niemniej jednak tradycyjne techniki stosowane w kulturach, które zaniedbują uchwycenie tych czynników, nadal przeważają. Skład społeczności (np. obecność współzależnych gatunków), fizyczne przywiązanie, stężenie cząsteczki sygnałowej i bezpośredni kontakt komórka-komórka są ważnymi czynnikami kształtowania społeczności drobnoustrojów i mogą zostać utracone w konwencjonalnych warunkach hodowli. Właściwości te są trudne do odtworzenia w masowej kulturze płynnej lub na płytce agarowej. Dostępność technik mikroprzepływowych, mikrowzorcowych i nanowytwarzania, które pozwalają na odtworzenie kluczowych cech fizycznych i chemicznych środowiska naturalnego, umożliwiła jednak wielu badaczom zbudowanie społeczności bakteryjnych w celu zbadania ich interakcji12,13,14 oraz opracowanie syntetycznych środowisk naśladujących warunki naturalne4,15,16,17,18,19,20.

Ten protokół opisuje metodę wytwarzania urządzenia do mikrodołków i dostarcza szczegółowych procedur eksperymentalnych, które mogą być wykorzystane do funkcjonalizacji studzienek w tablicy i do hodowli bakterii, zarówno jako kolonie jednogatunkowe, jak i w społecznościach wieloosobowych. Praca ta pokazuje również, w jaki sposób bakterie zmodyfikowane do produkcji fluorescencyjnych białek reporterowych mogą być wykorzystywane do monitorowania wzrostu bakterii w studzienkach w czasie. Podobna matryca została zaprezentowana wcześniej i wykazała, że możliwe jest śledzenie wzrostu jednogatunkowych kolonii Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) w mikrostudzienkach. Modulując wielkość studni i gęstość wysiewu, warunki początkowe tysięcy eksperymentów wzrostu mogą być zmieniane równolegle, aby określić, jak początkowe warunki inokulacji wpływają na zdolność bakterii do wzrostu21. W obecnych pracach wykorzystano nieco zmodyfikowaną wersję macierzy mikrostudzienek, która opiera się na poprzedniej pracy, umożliwiając jednoczesne porównywanie wielu macierzy i stosując bardziej niezawodny protokół eksperymentalny. Tablica użyta w tej pracy zawiera wiele podtablic lub zespołów tablicowych, zawierających studnie o różnych rozmiarach, w zakresie średnic od 15 do 100 μm, które są rozmieszczone w trzech różnych odstępach (tj. 2x, 3x i 4x średnica studni). Matryce są wytrawiane w krzemie, a wzrost bakterii zasianych w matrycach krzemowych jest możliwy dzięki uszczelnieniu matryc szkiełkiem nakrywkowym, które zostało pokryte średnio nasyconym żelem agarozowym. W tej demonstracji wykorzystano mutanty P. aeruginosa przeznaczone do badania systemu wydzielania typu VI.

Przedstawione tutaj wyniki przybliżają do ostatecznego celu, jakim jest analiza wieloczłonowych społeczności w mikroukładach studzienek, umożliwiając badaczom monitorowanie obfitości i organizacji bakterii in situ, jednocześnie kontrolując i badając środowisko chemiczne. Powinno to ostatecznie dostarczyć informacji na temat "zasad", które rządzą rozwojem i dziedziczeniem społeczności.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Wytwarzanie krzemowej matrycy mikrodofłków

  1. Powlekanie parylenem
    1. Nanieść od 1-1.5 µm parylenu N na waflach krzemowych z wykorzystaniem komercyjnie dostępnego systemu do powlekania parylenem zgodnie ze specyfikacją i instrukcjami producenta (ustawienia: wartość zadana parownika = 160 °C; wartość zadana pieca = 650 °C).
      UWAGA: Załadowanie do komory około 6 g parylenu N pozwala na uzyskanie powłok o grubości 1-1.5 µm gruby
  2. Fotolitografia
    1. Nanieś metodą spin-coatingu na wafle pokryte parylenem N promotor adhezji, składający się z 20% heksametylodizylazanu (HMDS) i 80% monometylopropylenoglikolu octanu (PGMEA) (patrz na Tabela materiałów) przy 3000 obr./min przez 45 s. Napełnić pipetę transferową o pojemności 2 ml promotorem przylegania i rozpylić go na całej powierzchni wafla. Pozostawić wafle na około 10 s, a następnie osuszyć w wirówce.
    2. Napełnić pipetę transferową o pojemności 2 ml fotorezystem pozytywowym (patrz w Tabela materiałów) i nanieś fotorezyst w centrum wafla. Wiruj z prędkością 3000 obr./min przez 45 s, aby uzyskać powłokę rezystu o grubości około 1.5 µm gruby
    3. Wstępnie wypiecz próbki na płycie grzejnej w temperaturze 115 °C przez 1 min.
    4. Użyj stykowego naświetlacza oraz fotomaski z pożądanym wzorem otworów, aby naświetlić próbkę światłem ultrafioletowym. Naświetl płytkę z naniesioną warstwą spin-coatingową przez wzorowaną fotomaskę przez 6 s, co zapewni przybliżoną dawkę 60-80 mJ/cm².2 pomiar przeprowadzono przy 365 nm.
    5. Wywołaj wzór poprzez zanurzenie próbki w wywoływaczu (< 3% wodorotlenek tetrametylammonium w wodzie; patrz na Tabela materiałów) przez 2 min. Płukać wodą DI i osuszyć czystym, suchym azotem.
      UWAGA: Obszary fotorezystu naświetlone promieniami UV powinny zostać usunięte podczas wywoływania.
  3. Reaktywne trawienie jonowe
    1. Zastosuj trawienie plazmą tlenową, aby usunąć odsłonięty parylen aż do podłoża krzemowego.
      UWAGA: Recepturę można modyfikować w celu zmiany szybkości trawienia parylenu. Dla grubości parylenu od 1 do 5 µmużyć receptury z ciśnieniem 60 mTorr, 20 °C, 100 sccm O22, 10 W RF oraz 2000 W ICP w urządzeniu do reaktywnego trawienia jonowego (RIE). Po trawieniu i usunięciu odsłoniętej warstwy parylenu, obszar wzorowany (t. j.odsłonięty krzem) powinien wyglądać na błyszczący i srebrzysty.
    2. Użyj głębokiego trawienia reaktywnego jonowo (DRIE; np. proces trawienia Bosch DRIE) w celu wytrawienia w krzemie.
      UWAGA: Szybkość i czas trawienia określą głębokość otworu. Jeden pełny cykl procesu Boscha (3-sekundowy etap osadzania: 20 mTorr, 15 °C, 140 sccm C4 F8, 10 W RF i 1750 W ICP, a następnie 10-sekundowy proces trawienia: 20 mTorr, 15 °C, 120 sccm SF66, 8 W RF oraz 1 750 W ICP), odpowiada w przybliżeniu 1 µm głębokości trawienia. Studnie wykorzystane w tej demonstracji mają zakres od 3 - 3.5 µm głęboki
    3. Zweryfikuj głębokość trawienia za pomocą profilometrii fizycznej.
      1. Wprowadź próbkę do profilometru fizycznego (patrz w Tabela materiałów).
      2. Włącz próżnię próbkową i naciśnij przycisk ręcznego ładowania.
      3. Ustaw ostrość układu na próbce, naciskając przycisk „Focus”. Na ekranie podglądu ustaw odpowiednią strukturę do pomiaru.
      4. Zeskanuj próbkę. Wyrównaj profil i zmierz głębokość cechy.
      5. Należy odnotować szybkość trawienia i odpowiednio dostosować kolejne czasy trawienia, aby uzyskać pożądaną głębokość.
        UWAGA: Pomiary będą obejmować głębokość studni krzemowej, grubość osadzonego parylenu oraz grubość fotorezystu. W celu uzyskania dokładnej głębokości studni niezbędna jest weryfikacja grubości każdej warstwy na każdym etapie procedury.

2. Hodowla i wysiew bakterii (Rycina 1a)

  1. Wyhodować kolonie na płytkach z agarem Luria Broth (LB) z zapasów w glicerolu i wykorzystać je w ciągu dwóch tygodni. Wybrać kolonie pożądanych szczepów z płytek LB i przygotować nocne kultury P. aeruginosa. Inkubować nocne kultury przez około 18 h w temperaturze 37 °C przy wytrząsaniu z prędkością 220 rpm w pożywce R2A.
    UWAGA: Kolonie należy wybrać w ciągu dwóch tygodni od wysiania, aby zapewnić utrzymanie mutacji i fluorescencyjnych genów reporterowych. Wszystkie prace z P. aeruginosa powinny być prowadzone w warunkach BSL-2.
  2. Za pomocą diamentowego rysika podzielić wafel krzemowy na pojedyncze chipy zawierające zestawy o różnych rozmiarach i macierze dołków o różnym rozstawie. Upewnić się, że każdy chip zawiera pełny zestaw rozmiarów i rozstawów dołków wymaganych do badania.

Schemat wytwarzania urządzenia mikroprzepływowego; obejmuje montaż warstw i wykres analizy rozkładu porów.
Rysunek 1: Procedura wytwarzania i wysiewania komórek. (a) Matryce mikrootworów są trawione w wafle krzemowe pokryte cienką warstwą parylenu (i). Aby zwilżyć otwory i/lub funkcjonalizować powierzchnię, na wierzch matryc nanosi się kroplę roztworu białek (ii). Roztwór białek jest usuwany, wafle są suszone, a następnie dodaje się nowy roztwór zawierający pożądane bakterie (iii). Roztwór bakteryjny jest usuwany po czasie inkubacji, a wafle pozostawia się do wyschnięcia, co skutkuje obecnością bakterii w otworach i na powierzchni (iv). Bakterie związane z powierzchnią są usuwane poprzez proces lift-off parylenu, dzięki czemu bakterie zostają precyzyjnie wysiane w mikrootworach i pozostają żywotne dzięki pożywce z 2% glicerolem, która pomaga utrzymać nawilżenie otworów (v). Następnie chipy krzemowe są kładzione stroną matrycy do dołu na szkiełku podstawowym pokrytym żelem agarozowym, który wspomaga wzrost bakterii w mikrootworach (vi). (b) Układ podmatryc na pojedynczym urządzeniu krzemowym. Każda podmatryca zawiera zestaw identycznych otworów. Średnice mikrootworów we wszystkich podmatrycach wynoszą od 5-100 µm i są zorganizowane z rozstawem (pitch) wynoszącym 2x, 3x lub 4x średnicę otworu, co zaznaczono kolorami od białego do ciemnoszarego na schemacie w dolnym panelu. Gdy głębokość otworów jest mała (<10 µm), otwory o średnicach 5 i 10 µm są rzadko użyteczne, zazwyczaj z powodu braku kolonizacji tych bardzo małych otworów przez komórki. W niniejszej pracy analizowano wyłącznie dane z otworów o średnicach 15-100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

UWAGA: Jak pokazano na Ryc. 1b, kompletny chip zawiera podmacierze studzienek o średnicach od 5 do 100 µm, z trzema różnymi rozstawami (t.j. 2x, 3x i 4x średnicy), powtarzającymi się 4 razy.

  1. Na powierzchnię matrycy nanieś kropelkę 150 µL roztworu albuminy surowicy bydlęcej (BSA) o stężeniu 500 µg/mL w PBS, aby zwilżyć mikrootwory. Inkubuj roztwór BSA na chipie przez 1 h w temperaturze pokojowej (RT) w komorze wilgotnej.
    1. Przygotuj komorę, wypełniając dno pustego pudełka na końcówki do pipet solą fizjologiczną buforowaną fosforanowo (PBS).
      UWAGA: W celu funkcjonalizacji powierzchni mikrootworów zamiast BSA można zastosować inne substancje, takie jak specyficzne lektyny.
  2. Podczas inkubacji chipów krzemowych z roztworem BSA odwiruj kultury z prędkością 2 500 rpm (co odpowiada średnio 950 x g) przez 5 min, a następnie resuspenduj je w 500 µL świeżej pożywki R2A z 2% glicerolem.
    1. Wyznacz gęstość optyczną (OD) kultury za pomocą spektrometru UV-vis przy 600 nm. Dostosuj ją do wartości OD 0,02, używając pożywki R2A z 2% glicerolem.
      UWAGA: Glicerol pomaga zapobiec wysychaniu otworów podczas usuwania warstwy parylenu (lift-off).
  3. Po inkubacji usuń roztwór BSA i wypłucz 3x za pomocą PBS, usuwając i zastępując kropelkę cieczy pokrywającą krzemową matrycę mikrootworów. Osusz strumieniem azotu.
  4. Do każdej z suchych matryc umieszczonych w komorze wilgotnej dodaj 150 µL kultur o OD 0,02. Inkubuj przez 1 h w temperaturze 4 °C, aby umożliwić przywieranie bakterii do ścianek otworów.
    UWAGA: Chłodzenie nie jest wymagane do samej inkubacji. Inkubacja w 4 °C może służyć do zapobiegania wzrostowi bakterii przed rozpoczęciem obrazowania, co pozwala na wizualizację organizacji przestrzennej społeczności przed wzrostem. Można również zastosować inkubację w temperaturze pokojowej. Oba protokoły dają podobne krzywe wzrostu.

3. Konfiguracja mikroskopu

  1. Przed rozpoczęciem inkubacji bakterii na płytkach krzemowych włącz komorę kontroli środowiskowej na stoliku (patrz tabela materiałów) i dostosuj ustawienia w jednostce sterującej, aby wilgotność (~100%) i temperatura (30-32 °C, patrz krok 3.2) mogły się ustabilizować przed dodaniem próbek.
  2. Wypoziomuj uchwyt na próbki i wyłóż wnętrze wokół próbki chusteczkami laboratoryjnymi nasączonymi PBS (patrz Tabela materiałów), aby zwiększyć wilgotność w komorze do punktu rosy. Ustaw temperaturę komory na 30 °C, a temperaturę pokrywy komory na 32 °C, aby zredukować kondensację w płaszczyźnie obrazowania.
    UWAGA: Uchwyt na preparaty pasuje do komory dla żywych komórek z uszczelką o grubości około 1 cm. Poziomowanie uchwytu na próbki odbywa się przy pomocy poziomicy bąbelkowej umieszczonej na górze uchwytu. Uchwyt na próbki można lekko przechylić, zachowując szczelność uszczelki, w celu wypoziomowania.
  3. Podczas inkubacji kultur na płytkach krzemowych, ręcznie włącz przełącznik zasilania lampy rtęciowej co najmniej 30 min przed obrazowaniem. Ręcznie włącz kamerę i zautomatyzowany stolik mikroskopu. Uruchom oprogramowanie służące do sterowania mikroskopem i urządzeniami peryferyjnymi i upewnij się, że sprzęt został rozpoznany przez oprogramowanie.
    UWAGA: Powiększenie wynosi 10X z NA = 0.3.

4. Przygotowanie szkiełek podstawowych pokrytych agarozą

  1. Podgrzewaj w kuchence mikrofalowej wcześniej przygotowane roztwory agarozy (np. 2% agarozy w pożywce R2A) aż do osiągnięcia stanu ciekłego, przez około 60 s.
  2. Zwilż tył szklanego szkiełka nakrywkowego o wymiarach 75 mm x 22 mm, nr 1,5 etanolem i połóż je wzdłuż, na środku szklanego preparatu o wymiarach 2 x 3" (50 x 75 mm). Umieść dwa ograniczniki z PDMS (grubość ~1 mm) wzdłuż długich krawędzi szkiełka nakrywkowego i przesuń je tak, aby około 1 mm szkiełka wystawało poza krawędź preparatu.
  3. Wlej 5 mL ciekłego roztworu agarozy na szklane szkiełko nakrywkowe, w ilości wystarczającej do jego całkowitego pokrycia, a następnie połóż drugie szklane szkło przedmiotowe o wymiarach 2 x 3" na wierzchu konstrukcji, aby „zamknąć” ciekły agar pomiędzy szkiełkiem nakrywkowym a preparatem.
    UWAGA: Pozwala to kontrolować głębokość agarozy, dzięki czemu całkowita grubość szkiełka nakrywkowego i stwardniałej agarozy będzie równa grubości ograniczników z PDMS.
  4. Pozostaw tak przygotowaną „kanapkę” ze szkła przedmiotowego, szkiełka nakrywkowego i żelu agarowego do czasu, aż roztwór agarozy zacznie twardnieć; następnie przenieś ją do lodówki. Po 15 min usuń nadmiar stałej agarozy i wytnij obszar wokół szklanego szkiełka nakrywkowego. Przenieś całość do czystego naczynia i przechowuj w lodówce do momentu użycia.

5. Uszczelnianie studni przy użyciu szkiełka nakrywkowego pokrytego agarozą i obrazowanie

  1. Po zakończeniu okresu inkubacji bakterii wyjmij pokrywkę szkiełkowa pokrytą agarozą z lodówki i przygotuj chipy krzemowe w następujący sposób.
    1. Zanurzaj chipy krzemowe w wodzie ultrapurej, pojedynczo, przez 10 s każdy. Ustaw je krawędziami na chusteczce laboratoryjnej lub ręczniku papierowym, aż większość nadmiaru cieczy spłynie z krawędzi chipów.
    2. Odetnij kawałek taśmy o długości odpowiadającej krawędzi każdego chipu krzemowego. Przyklej taśmę do parylenu pokrywającego krzem, a następnie użyj jej do szybkiego oddarcia powłoki parylenowej.
    3. Należy niezwłocznie odwrócić każdy obrany chip i umieścić go w taki sposób, aby strona z matrycą mikrowydzieleń była skierowana ku pokrywce szkiełkowej pokrytej agarozą (i stykała się z nią). Należy uważać, aby nie przesuwać ani nie przemieszczać chipa po zetknięciu z agarozą, aby zapobiec wzrostowi bakterii poza obrębem wydzieleń.
  2. Umieść zmontowaną matrycę mikrowycieków z lamellką agarozową w uchwycie na preparaty komory kontroli środowiskowej zamontowanej na stole mikroskopu.
    1. Użyj światła otoczenia lub światła skierowanego (np. (np. latarka), aby zlokalizować interesujące układy. Należy użyć komercyjnego oprogramowania sterującego zautomatyzowanym stolikiem, aby zapisać te pozycje (patrz tabela materiałów). Po zapisaniu pozycji należy wyłączyć światło otoczenia lub światło kierunkowe.
    2. W komercyjnym oprogramowaniu otwórz panel „ND Acquisition”.
      UWAGA: Panel ten zawiera menu do automatycznego zapisywania danych w określonym katalogu, a także funkcję programowalnego pozyskiwania obrazów. W przedstawionych eksperymentach wykorzystano menu „Time”, „XY” oraz „λ”.
    3. Aby zapisać lokalizacje w oprogramowaniu, kliknij „XY menu”, a następnie zaznacz puste pole po lewej stronie dla każdej pozycji, którą należy zapisać. Kliknij również przycisk „Include Z”.
  3. Należy pozyskać obrazy w czasie, przy wybranych długościach fal i 10-krotnym powiększeniu, wykorzystując odpowiednie kostki filtrów fluorescencyjnych (patrz Tabela materiałów).
    1. Używając oprogramowania sterującego oraz zapisanych pozycji tablicy, przejdź do każdego zapisanego miejsca i ustaw ostrość na dołkach. Kliknij każdą pozycję XY na zapisanej liście i dostosuj ostrość za pomocą filtra dla zielonego białka fluorescencyjnego (GFP). Zapisz nową pozycję z, klikając strzałkę wskazującą lokalizację z.
      UWAGA: Proces ten może być czasochłonny. W celu zapobiegania fotobleakingowi zaleca się zwiększenie wzmocnienia oraz zastosowanie filtra neutralnego w celu zmniejszenia natężenia światła.
    2. Wyznacz odległość wzdłuż osi z między płaszczyznami ogniskowymi dla każdej długości fali, odnotowując różnicę w pozycji osi z podczas ustawiania ostrości na powierzchni matrycy. Wybierz 2–3 miejsca z matrycy z mieszaną populacją bakterii czerwonych i zielonych, a następnie ustaw ostrość za pomocą filtra białka fluorescencyjnego czerwonego (RFP).
      1. Odejmij od siebie odległość między płaszczyznami ogniskowania przy użyciu filtrów fluorescencyjnych GFP i RFP, a następnie wprowadź tę korektę płaszczyzny ogniskowania w menu „λ”.
        UWAGA: Na przykład, jeśli matryca wydaje się być w ostrości w kanale GFP w położeniu z wynoszącym 50 µm, a ta sama macierz widoczna jest w kanale RFP przy 55 µmdodaj +5 obok konfiguracji optycznej RFP w menu „λ”.
    3. Rozpocznij akwizycję obrazów w trybie time-lapse.
      UWAGA: W przypadku przedstawionych tutaj eksperymentów obrazy RFP i GFP były pozyskiwane dla każdej pozycji macierzy w odstępach 30 minut, wykorzystując wielowymiarową akwizycję obrazu za pomocą komercyjnego oprogramowania sterującego kamerą, migawką, kołem filtrowym oraz zmotoryzowanym stołem.
      1. W menu „Time” ustaw wartość „interval” na 30 min oraz „duration of the experiment” na 24 h. Kliknij „Run Now”.
        UWAGA: Przy zaznaczonych polach „Time”, „XY” i „λ”, uruchomienie programu spowoduje przemieszczenie stolika w celu wykonania obrazowania każdego miejsca (t.j. (zapisane lokalizacje XYZ), wykonaj obrazowanie w jednej długości fali, a następnie zmień pozycję w osi z, aby uwzględnić różnice w płaszczyźnie ogniskowej (t. j. (sterowanie długością fali $\lambda$), wykonaj drugie zdjęcie, przejdź do kolejnej lokalizacji w macierzy (obrazowanie wielopunktowe) i powtarzaj tę pętlę w odstępach 30 minut (time-lapse).
  4. Należy pozyskać obrazy kontrolne oświetlenia.
    UWAGA: Należy użyć menu „ND Acquisition”, „Time” oraz „XY”, aby wykonać zdjęcia 4 lokalizacji, po 25 obrazów dla każdej z nich.
    1. Wykonaj serię 100 obrazów w „ciemnym polu”, wyłączając wszystkie źródła światła i wykonując „obraz” standardnego preparatu. Obrazy te posłużą do zarejestrowania szumu kamery. Użyj najdłuższego czasu ekspozycji zastosowanego podczas filmowania poklatkowego (krok 5.3.3).
    2. Wykonaj serię 100 obrazów „pola oświetlenia”, obrazując standardny preparat (t. j. jednostajną intensywność RFP lub GFP) w kilku różnych miejscach, aby uchwycić nierównomierne oświetlenie przy zadanych warunkach eksperymentalnych. Należy dobrać czas ekspozycji tak, aby zmaksymalizować sygnał, nie dopuszczając do nasycenia.

6. Analiza

  1. Przetwarzanie stosów obrazów przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu (np. ImageJ).
    1. Konwertuj nabyte obrazy do formatu plików tiff za pomocą oprogramowania komercyjnego. Wgraj obrazy do oprogramowania do analizy obrazu, klikając „File” > „Import” > „Image Sequence”.
    2. Utwórz „Obraz Korekcyjny” (Correction Image) poprzez uśrednienie wszystkich obrazów „ciemnego pola” (darkfield) i „pola oświetlenia” (illumination field). Odejmij średni obraz „ciemnego pola” od średniego obrazu „pola oświetlenia”, wybierając „Process” > „Image Calculator”. Wybierz dwa obrazy, „Image1” i „Image2”, a następnie opcję „Subtract” w polu „Operation”. Kliknij „OK”.
      1. Aby uśrednić obrazy, wczytaj obrazy korekcyjne (lub ciemnego pola), kliknij „Image” > „Stacks” > „Z Project” > „Average Projection”.
    3. W razie potrzeby wykonaj rejestrację obrazów. Następnie wykonaj odejmowanie tła, klikając „Process” > „Subtract Background”. Wpisz promień (np. 125) w polu „radius” i wybierz „sliding paraboloid”.
    4. Wykonaj korekcję oświetlenia za pomocą „Process” > „Calculator Plus”. Wybierz następujące parametry: operation, divide; i1, well image; i2, correction image; k1, correction image mean; oraz k2, 0. Kliknij „Create New Window”.
      UWAGA: Ten zestaw danych nie wymagał rejestracji, ale w innych pracach używano wtyczki ImageJ StackReg z transformacją „Translation”. Do odejmowania tła używaj tego samego promienia paraboloidy przesuwnej dla każdego zestawu obrazów. Na przykład, jeśli największe obrazowane studzienki mają promień pikselowy 100, użyj promienia większego niż 100 (np. 125) dla każdego zestawu obrazów.
  2. Wyznaczanie wzrostu każdego szczepu w mikrostudzienkach.
    1. Wybierz obszary zainteresowania (ROI) wokół każdej mikrostudzienki w wybranych macierzach, korzystając z wtyczki ImageJ „MicroArray”.
      1. W menu „MAP” kliknij „Reset Grid”. Określ liczbę wierszy, kolumn oraz średnicę (na podstawie rozmiaru i liczby studzienek w macierzy; patrz Rysunek 1b). Wybierz opcję „circle” z menu „ROI shape”.
      2. Przytrzymaj klawisz „Alt”, wybierając myszą ROI w lewym górnym rogu, aby przesunąć macierz ROI. Przytrzymaj klawisz „shift”, wybierając ROI w lewym dolnym rogu, aby zmienić rozmiar macierzy. Przytrzymaj klawisz „shift”, wybierając ROI z prawej strony macierzy (ale nie w narożnikach), aby zmienić odstępy między ROI.
      3. Użyj powyższych poleceń, aby dopasować macierz ROI do studzienek na obrazie. Kliknij „Measure RT”.
        UWAGA: Wtyczka wyeksportuje żądane pomiary z każdego ROI. Użyj trzech rozmiarów ROI, tworząc koncentryczne pierścienie wokół studzienek, aby zebrać lokalny sygnał tła (tzn. sygnał z pierścienia środkowego odjęty od pierścienia zewnętrznego) oraz pomiary fluorescencji (tzn. sygnał z pierścienia wewnętrznego).
    2. Zbierz dane w arkuszu kalkulacyjnym i oblicz sygnał tła. Zaimportuj je do specjalistycznego oprogramowania skryptowego do dalszej analizy.
  3. Organizacja i analiza danych
    1. Zaimportuj dane i zorganizuj dane zebrane w ImageJ w macierzy w następującej kolejności dla wszystkich punktów czasowych: kolumna 1, numer podmacierzy; kolumna 2, wiersz studzienki; kolumna 3, kolumna studzienki; kolumna 4, średnia intensywność; kolumna 5, intensywność tła; oraz kolumna 6, średnia intensywność minus intensywność tła.
      1. Rozdziel wyniki akwizycji mCherry i GFP do różnych macierzy. Przechowuj wyniki z każdej podmacierzy i dla każdego koloru w oddzielnej komórce tablicy komórek.
        UWAGA: Taka organizacja ułatwia przełączanie się między danymi obrazowymi a wynikami pomiarów, oczyszczanie danych i zapewnienie, że pomiary dokładnie reprezentują dane.
    2. Skoryguj wyniki o autofluorescencję P. aeruginosa.
      UWAGA: W eksperymentach obejmujących kokulturę szczepów GFP i mCherry należy przeanalizować chip zawierający wyłącznie mCherry, aby ustalić zależność między mCherry a zieloną autofluorescencją.
      1. Wykreśl sygnał mCherry względem GFP dla wszystkich studzienek mCherry ΔretSΔtse/i1-6 we wszystkich punktach czasowych, aby określić zależność między sygnałem mCherry a autofluorescencją w kanale GFP. Odejmij sygnał autofluorescencji od kokultur.
    3. Wykreśl trajektorie i dopasuj zmodyfikowane równanie logistyczne do każdej trajektorii, aby wyodrębnić parametry, stosując metodę najmniejszych kwadratów w arkuszu kalkulacyjnym lub specjalistycznym oprogramowaniu skryptowym.
    4. Szukaj korelacji pomiędzy parametrami trajektorii GFP i mCherry.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przedstawiona tutaj platforma eksperymentalna została zaprojektowana do wysokoprzepustowych i wysokotreściowych badań społeczności bakteryjnych. Taka konstrukcja umożliwia jednoczesną analizę tysięcy społeczności hodowanych w studzienkach o różnych rozmiarach. Dzięki zastosowaniu tej macierzy mikrostudzienek można określić zależność końcowego składu społeczności od początkowej gęstości szczepienia, wielkości studzienki oraz środowiska chemicznego. Niniejsza praca demonstruje wzrost dwuczł...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W artykule tym przedstawiono urządzenie do tworzenia matryc mikrodołkowych oraz protokoły eksperymentalne zaprojektowane w celu umożliwienia wysokoprzepustowej i opartej na obrazowaniu żywych komórek analizy rozwoju społeczności bakteryjnej opartej na obrazowaniu żywych komórek. Podczas gdy celem demonstracji było zbadanie wpływu kontaktowego wydzielania typu VI na rozwój społeczności, matryce zostały zaprojektowane tak, aby były elastyczne i umożliwiały badanie szerokiego zakresu społeczności drobnoustrojów i interakcji...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Matryce Microwell zostały wyprodukowane i scharakteryzowane w Center for Nanophase Materials Sciences User Facilities Division, Office of Basic Energy Sciences, U.S. Department of Energy. Wsparcie finansowe dla tych prac zostało zapewnione za pośrednictwem Funduszu Badawczo-Rozwojowego Dyrektora Narodowego Laboratorium Oak Ridge. Autorzy pragną również podziękować J. Mougous Laboratory (University of Washington, Seattle, WA) za dostarczenie szczepów P. aeruginosa wykorzystanych w tych badaniach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Specjalistyczne systemy powłokoweParylene NCAS: 1633-22-3
Powlekarka ParyleneSpecjalistyczne systemy powlekaniaLabcoter 2 Jednostka osadzania parylenu PDS2010
Wafel krzemowyWRS Materiałyśrednicy 100 mm, 500-550 i mu; m grubość, Prime, 10-20 rezystywność, N/Phos< 100>,
promotor adhezjiShin-Etsu MicrosciMicroPrime P20 promotor
postive tone photoresistRohm and Haas Electronics Materials LLC (własność Dow)Microposit S1818 Positive Photoresist (kod 10018357)
Quintel Contact AlignerNeutronix Quintel CorpNXQ 7500 Mask Aligner
Reaktywne narzędzie do trawienia jonowegoOxford InstrumentyPlasmalab System 100 Reaktywny wytrawiacz
R2A RosółTEKnovaR0005
Surowica bydlęca AlbuminaSigmaA9647
Wielomodowy czytnik płytekPerkin ElmerEnspire, 2300-0000
Mikroskop fluorescencyjnyNikonEclipse Ti-U
Automated StagePriorProScan III
Kamera CCDNikonDS-QiMc
Stage-top komora kontroli środowiskaIn Vivo ScientificSTEV ECU-HOC
Sól fizjologiczna buforowana fosforanemThermoFisher Scientific14190144
UltraPure AgarozaThermoFisher Scientific16500500
25 x 75 mm No. 1.5 szkiełko nakrywkoweNexterionWysoka wydajność #1.5H Szkiełka
Fluorescencyjne preparaty referencyjneTed Pella2273
Fizyczny rysik ProfilometrKLA Chusteczki laboratoryjne TencorP-6
Kimberly ClarkKimipe KIMTECH SCIENCE Marka, 34155
oprogramowanie komercyjneNikonNIS Elements
Mikroskop konfokalny Zeiss 710Zeiss
kostki filtracyjneNikonNikon FITC (96311), Nikon Texas Czerwony(96313)
Nr o przyczepnościjonowynakrywkowe

Bibliografia

  1. Zhou, J., Deng, Y., et al. Stochasticity, succession, and environmental perturbations in a fluidic ecosystem. Proc Natl Acad Sci. 111, E836-E845 (2014).
  2. Valm, A. M., Welch, J. L. M., et al. Systems-level analysis of microbial community organization through combinatorial labeling and spectral imaging. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (10), 4152-4157 (2011).
  3. Satoh, H., Miura, Y., Tsushima, I., Okabe, S. Layered structure of bacterial and archaeal communities and their in situ activities in anaerobic granules. Appl Environ Microbiol. 73 (22), 7300-7307 (2007).
  4. Kim, H. J., Boedicker, J. Q., Choi, J. W., Ismagilov, R. F. Defined spatial structure stabilizes a synthetic multispecies bacterial community. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (47), 18188-18193 (2008).
  5. Nunan, N., Wu, K., Young, I. M., Crawford, J. W., Ritz, K. Spatial distribution of bacterial communities and their relationships with the micro-architecture of soil. FEMS Microbiol Ecol. 44, 203-215 (2003).
  6. Grundmann, G. L. Spatial scales of soil bacterial diversity - The size of a clone. FEMS Microbiol Ecol. 48, 119-127 (2004).
  7. Langenheder, S., Lindstrom, E. S., Tranvik, L. J. Structure and Function of Bacterial Communities Emerging from Different Sources under Identical Conditions. Appl Environ Microbiol. 72 (1), 212-220 (2006).
  8. Camp, J. G., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. Patterns and Scales in Gastrointestinal Microbial Ecology. Gastroenterology. 136 (6), 1989-2002 (2009).
  9. Renner, L. D., Weibel, D. B. Physicochemical regulation of biofilm formation. MRS Bull. 36 (5), 347-355 (2011).
  10. Wessel, A. K., Hmelo, L., Parsek, M. R., Whiteley, M. Going local: technologies for exploring bacterial microenvironments. Nat Rev Microbiol. 11 (5), 337-348 (2013).
  11. Stacy, A., McNally, L., Darch, S. E., Brown, S. P., Whiteley, M. The biogeography of polymicrobial infection. Nat Rev Microbiol. 14 (2), 93-105 (2015).
  12. Hansen, R. R., Shubert, K. R., Morrell-Falvey, J. L., Lokitz, B. S., Doktycz, M. J., Retterer, S. T. Microstructured block copolymer surfaces for control of microbe adhesion and aggregation. Biosensors. 4 (1), 63-75 (2014).
  13. Hansen, R. R., Hinestrosa, J. P., et al. Lectin-functionalized poly(glycidyl methacrylate)- block -poly(vinyldimethyl azlactone) surface scaffolds for high avidity microbial capture. Biomacromolecules. 14 (10), 3742-3748 (2013).
  14. Timm, C. M., Hansen, R. R., Doktycz, M. J., Retterer, S. T., Pelletier, D. A. Microstencils to generate defined, multi-species patterns of bacteria. Biomicrofluidics. 9 (6), (2015).
  15. Keymer, J. E., Galajda, P., Muldoon, C., Park, S., Austin, R. H. Bacterial metapopulations in nanofabricated landscapes. Proc Natl Acad Sci USA. 103 (46), 17290-17295 (2006).
  16. Zhang, Q., Lambert, G., et al. Acceleration of Emergence of Bacterial Antibiotic Resistance in Connected Microenvironments. Science. 333 (6050), 1764-1767 (2011).
  17. Friedlander, R. S., Vlamakis, H., Kim, P., Khan, M., Kolter, R., Aizenberg, J. Bacterial flagella explore microscale hummocks and hollows to increase adhesion. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (14), 5624-5629 (2013).
  18. Zhou, J., Liu, W., et al. Stochastic Assembly Leads to Alternative Communities with Distinct Functions in a Bioreactor Microbial Community. MBio. 4 (2), 1-8 (2013).
  19. van Vliet, S., Hol, F. J., Weenink, T., Galajda, P., Keymer, J. E. The effects of chemical interactions and culture history on the colonization of structured habitats by competing bacterial populations. BMC Microbiol. 14 (1), 116(2014).
  20. Niepa, T. H. R., Hou, L., et al. Microbial Nanoculture as an Artificial Microniche. Sci Rep. 6, 30578(2016).
  21. Hansen, R. H., Timm, A. C., et al. Stochastic Assembly of Bacteria in Microwell Arrays Reveals the Importance of Confinement in Community Development. PLoS ONE. 11 (5), e0155080(2016).
  22. Hood, R. D., Singh, P., et al. A Type VI Secretion System of Pseudomonas aeruginosa Targets a Toxin to Bacteria. Cell Host Microbe. 7 (1), 25-37 (2010).
  23. LeRoux, M., Ja De Leon,, et al. Quantitative single-cell characterization of bacterial interactions reveals type VI secretion is a double-edged sword. Proc Natl Acad Sci. 109 (48), 19804-19809 (2012).
  24. Whitney, J. C., Beck, C. M., et al. Genetically distinct pathways guide effector export through the type VI secretion system. Mol Microbiol. 92 (3), 529-542 (2014).
  25. Warrick, J. W., Timm, A., Swick, A., Yin, J. Tools for Single-Cell Kinetic Analysis of Virus-Host Interactions. PLoS ONE. 11 (1), e0145081(2016).
  26. Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., Van't Riet, K. Modeling of the Bacterial Growth Curve. Appl Environ Microbiol. 56 (6), 1875-1881 (1990).
  27. Halsted, M., Wilmoth, J. L., et al. Development of transparent microwell arrays for optical monitoring and dissection of microbial communities. J Vac Sci Technol B Nanotechnol Microelectron. 34 (6), 06KI03(2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Obrazowanie fluorescencyjne time-lapseilościowa analiza obrazuPseudomonas aeruginosaekspresja białek fluorescencyjnychformowanie się społeczności bakteryjnychprzesiew wysokoprzepustowykrzemowe mikrowelkikomora kontroli środowiskowej
Montaż i śledzenie rozwoju społeczności mikrobiologicznej w ramach platformy Microwell Array
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.