Wykrywanie i wizualizacja kompleksów białkowych indukowanych uszkodzeniem DNA w hodowlach komórek zawiesinowych za pomocą testu ligacji zbliżeniowej

Summary

Tutaj pokazano, jak test ligacji zbliżeniowej in situ (PLA) może być wykorzystany do wykrywania i wizualizacji bezpośrednich interakcji białko-białko między ATM i p53 w hodowlach komórek zawiesinowych narażonych na stres genotoksyczny.

Abstract

Odpowiedź na uszkodzenie DNA koordynuje naprawę uszkodzeń DNA, które pojawiają się spontanicznie, są spowodowane stresem genotoksycznym lub pojawiają się w kontekście zaprogramowanych pęknięć DNA w limfocytach. Kinaza zmutowana ataksja-teleangiektazja (ATM), kinaza związana z ATM i Rad3 (ATR) oraz podjednostka katalityczna kinazy białkowej zależnej od DNA (DNA-PKcs) są jednymi z pierwszych, które są aktywowane po indukcji uszkodzenia DNA i są centralnymi regulatorami sieci kontrolującej naprawę DNA, apoptozę i przeżycie komórki. Jako część szlaku supresyjnego nowotworu, ATM i ATR aktywują p53 poprzez fosforylację, regulując w ten sposób aktywność transkrypcyjną p53. Uszkodzenie DNA powoduje również powstawanie tzw. ognisk wywołanych promieniowaniem jonizującym (IRIF), które reprezentują kompleksy białek czujnika uszkodzenia i naprawy DNA, które gromadzą się w miejscach uszkodzenia DNA, które są wizualizowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Kolokalizacja białek w IRIF nie musi jednak oznaczać bezpośrednich interakcji białko-białko, ponieważ rozdzielczość mikroskopii fluorescencyjnej jest ograniczona.

Test ligacji zbliżeniowej in situ (PLA) to nowatorska technika, która pozwala na bezpośrednią wizualizację interakcji białko-białko w komórkach i tkankach z niespotykaną specyficznością i czułością. Technika ta opiera się na przestrzennej bliskości specyficznych przeciwciał wiążących się z białkami będącymi przedmiotem zainteresowania. Gdy badane białka znajdują się w zakresie ~ 40 nm, reakcja amplifikacji jest wyzwalana przez oligonukleotydy, które są sprzężone z przeciwciałami, a produkt amplifikacji jest wizualizowany przez znakowanie fluorescencyjne, dając sygnał odpowiadający subkomórkowej lokalizacji oddziałujących białek. Na przykładzie ustalonej interakcji funkcjonalnej między ATM a p53 pokazano, w jaki sposób PLA można wykorzystać w hodowlach komórek zawiesinowych do badania bezpośrednich interakcji między białkami, które są integralną częścią odpowiedzi na uszkodzenie DNA.

Introduction

Uszkodzenie DNA uruchamia wysoce regulowaną serię zdarzeń obejmujących interakcje białko-białko i modyfikacje potranslacyjne, które zapewniają efektywną i szybką naprawę DNA, chroniąc w ten sposób integralność genomu¹. Zazwyczaj naprawę DNA bada się w komórkach wystawionych na promieniowanie jonizujące poprzez monitorowanie powstawania tzw. ognisk wywołanych promieniowaniem jonizującym (IRIF) za pomocą (konfokalnej) mikroskopii fluorescencyjnej. Wiele białek naprawczych i wykrywających uszkodzenia DNA tworzy IRIF, które reprezentują kompleksy białkowe, które zarodkują w miejscach chromatyny, powodując uszkodzenie DNA^2,3. Lokalizacja i rozdzielczość IRIF w czasie daje ważny wgląd w czasoprzestrzenną organizację naprawy DNA i może wskazywać na udział różnych szlaków naprawy DNA. Charakter uszkodzenia DNA i etap cyklu komórkowego, w którym dochodzi do uszkodzenia, określają, który szlak naprawy DNA jest aktywowany. Na przykład w komórkach aktywnie zaangażowanych w replikację DNA (faza S) rekombinacja homologiczna (HR) jest dominującym szlakiem naprawy DNA, podczas gdy w komórkach w fazie G1 lub G2/M cyklu komórkowego dominuje niehomologiczny szlak naprawy łączenia końców (NHEJ). Jednym z najwcześniejszych zdarzeń następujących po uszkodzeniu DNA jest aktywacja kinaz wykrywających uszkodzenia DNA: białka z mutacją ataksji teleangiektazji (ATM), które jest głównie aktywne w fazach G1 i G2/M cyklu komórkowego i reguluje NHEJ, oraz ataksji teleangiektazji i białka związanego z Rad3 (ATR), które działa w fazie S poprzez aktywację HR. Zarówno ATM, jak i ATR są bardzo plejotropowymi kinazami, które fosforylują wiele białek, które biorą udział w naprawie DNA, śmierci komórki i przeżyciu⁴. Wykazano, że obie kinazy fosforylują i aktywują białko supresorowe p53 po ekspozycji na stres genotoksyczny, co wskazuje, że kinazy te są mediatorami kluczowej osi sygnalizacji supresyjnej nowotworu^5,6.

Powstawanie i skład IRIF jest zazwyczaj oceniane poprzez określenie kolokalizacji różnych białek za pomocą dwukolorowego barwienia immunofluorescencyjnego i mikroskopii, jednak nie wszystkie białka, które są częścią kompleksów białek naprawczych, tworzą IRIFs, co ogranicza możliwość zastosowania tego podejścia. Co więcej, mikroskopia immunofluorescencyjna (konfokalna) jest ograniczona przez właściwości dyfrakcyjne światła, co skutkuje raczej słabą rozdzielczością przestrzenną około 200-300 nm, przekraczającą rozmiar większości struktur subkomórkowych, co zasadniczo uniemożliwia bezpośrednie badanie interakcji białko-białko na poziomie molekularnym. W związku z tym kolokalizacja wzorców barwienia immunofluorescencyjnego wykrytych przez (konfokalną) mikroskopię fluorescencyjną niekoniecznie wskazuje na bezpośrednie interakcje białko-białko. Ostatnio opracowano nowe technologie superrozdzielczości, takie jak trójwymiarowa mikroskopia oświetlenia strukturalnego (3D-SIM)⁷, która została z powodzeniem wykorzystana do zbadania powstawania IRIF 53BP1 i BRCA1 w nanoskali, ujawniając charakterystykę rozkładu przestrzennego tych białek, której nie można było wykryć za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej⁸.

Do wykrywania interakcji białko-białko in vivo można użyć kilku innych metod, takich jak koimmunoprecypitacja, metody pull-down i metody badań przesiewowych drożdży. Techniki te są jednak dość kłopotliwe, wymagają dużej ilości komórek lub białek lub wiążą się z nadekspresją białek, co wprowadza artefakty eksperymentalne. Niedawno opracowano nowatorską technikę, która umożliwia wizualizację i kwantyfikację interakcji białko-białko in situ (tj. w komórkach i tkankach), która jest określana jako test ligacji zbliżeniowej (PLA)^9,10. Przeciwciała pierwszorzędowe, które rozpoznają dwa interesujące białka, są wykrywane przez przeciwciała drugorzędowe, które są sprzężone z oligonukleotydami (tak zwane sondy PLA). Jeśli dwa różne przeciwciała drugorzędowe są wystarczająco blisko siebie ze względu na interakcje między białkami rozpoznawanymi przez przeciwciała pierwszorzędowe, sprzężone oligonukleotydy hybrydyzują i mogą być ligowane, tworząc zamknięty kolisty substrat DNA. Ten kołowy substrat jest następnie amplifikowany przez amplifikację tocznego koła i wizualizowany za pomocą komplementarnych oligonukleotydów sprzężonych z fluorochromem. Używając PLA, subkomórkowa lokalizacja interakcji białko-białko jest zachowana, ponieważ znakowany fluorescencyjnie produkt amplifikacji toczącego się koła pozostaje podłączony do sond PLA. Rozdzielczość tego testu wynosi <50 nm, w oparciu o ustalenie, że średnica przeciwciała wynosi około 7-10 nm¹¹. Amplifikacja tocznego koła może mieć miejsce tylko w przypadku, gdy dwie pary przeciwciał (pierwszorzędowa + drugorzędowa) fizycznie oddziałują w obrębie obwodu określonego przez ich rozmiar (10 + 10 + 10 + 10 = 40 nm). Etap wzmacniania sygnału zwiększa czułość testu PLA i umożliwia wykrywanie oddziaływań białek o niskiej ekspresji. PLA generuje punktowe, podobne do ognisk wzorce sygnałów, które można określić ilościowo dla każdej komórki, za pomocą których można ocenić wewnątrz- i międzykomórkową zmienność interakcji białko-białko.

Tworzenie i skład kompleksów naprawczych DNA i IRIF-ów jest głównie badany w przylegających liniach komórkowych, takich jak ludzka linia komórek nabłonkowych kostniakomięsaka U2OS, ludzka embrionalna linia komórkowa nerki HEK293 i linia komórek nabłonka barwnikowego siatkówki RPE-1, które są szybko rosnące i łatwe do transfekcji. Hodowle komórek zawiesinowych, takie jak linie komórek limfoidalnych i szpikowych, są stosowane rzadziej, ponieważ są one mniej podatne na transfekcję i na ogół nie przylegają do szkiełek nakrywkowych, co wymaga dodatkowych/alternatywnych etapów obrazowania. Ustąpienie uszkodzeń DNA jest jednak bardzo istotne w kontekście nowotworów złośliwych limfoidalnych i szpikowych, ponieważ na odpowiedź na uszkodzenie DNA często wpływają aberracje genomowe (napędzające) w tych nowotworach, odgrywając kluczową rolę w złośliwej transformacji prawidłowych komórek limfatycznych i szpikowych (progenitorowych)^12,13,14.

Ten protokół opisuje, jak można wykorzystać PLA do oceny i ilościowego określenia interakcji białko-białko po indukcji uszkodzenia DNA w zawiesinowych hodowlach komórkowych. W tym przypadku PLA jest wykonywany w celu określenia i wizualizacji interakcji między ATM i p53 po uszkodzeniu DNA w ludzkich komórkach białaczki B-komórkowej, które są indukowane do zatrzymania cyklu komórkowego w fazie G1. Warto zauważyć, że przedstawiony tutaj protokół nie ogranicza się do badania interakcji ATM i p53 w komórkach białaczki zatrzymanych przez G1, ale może być również wykorzystany do wizualizacji innych interakcji białko-białko w różnych typach komórek i hodowlach komórek zawiesinowych.

Protocol

1. Leczenie komórek i indukcja uszkodzeń DNA

1. Hodowla ludzkich linii komórek limfoblastycznych B-komórkowych BCR-ABL+ BV173 lub SUP-B15 w IMDM uzupełnionych 20% FCS, 50 μM β-merkaptoetanolem, 2 mM L-glutaminą, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO_{2 .} Policz komórki i płytkę w 2 x 10⁶ komórek/ml w płytkach 6-dołkowych, w 5 ml / dołku.
   UWAGA: Opcjonalnie można stosować zawiesinowe linie komórkowe różnego pochodzenia.
2. Aby zatrzymać komórki BCR-ABL+ B-ALL w fazie G1 cyklu komórkowego, dodaj 5 μM metanosulfonianu imatynibu (STI571) i inkubuj przez noc.
   1. Opcjonalnie pomiń ten krok podczas badania interakcji białko-białko w całym cyklu komórkowym lub w typach komórek BCR-ABL-ujemnych.
3. Wywołać uszkodzenie DNA poprzez dodanie 50 ng/ml neokarzynostatyny (NCS) do kultury i inkubować przez 2 godziny.
   1. Alternatywnie, wywołać uszkodzenie DNA poprzez napromieniowanie komórek za pomocą źródła radioaktywnego [¹³⁷Cs] w dawce 0,5 Gy/min, w dawce 5 Gy. Po napromieniowaniu pozostawić ogniwo na regenerację przez 2 godziny w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO_{2 .}
4. Opcjonalnie, aby ocenić udział aktywności kinazy ATM w odpowiedzi na uszkodzenie DNA, dodać 5 μM inhibitora kinazy ATM KU55933 przed dodaniem NCS lub napromienianiem.
5. Przygotować 1x PBS + 10% BSA, nakładając 5 g frakcji V BSA na 50 ml 1x PBS w zlewce lub kolbie Erlenmeyera i pozostawić w temperaturze pokojowej do rozpuszczenia BSA. Nie potrząsaj ani nie mieszaj, ponieważ spowoduje to obfite pienienie. Powoli przefiltruj przez filtr 0,22 μm i trzymaj na lodzie.
6. Zbierz komórki i umyj dwukrotnie lodowatym 1x PBS. Policz komórki i ponownie zawieś w 2 x 10⁶/ml w 1x PBS + 10% BSA. Utrzymuj komórki na lodzie.

2. Cytowirowanie, utrwalanie i przepuszczalność

1. Przygotuj 4% roztwór paraformaldehydu w 1x PBS na świeżo. Dodać 2 g PFA do 50 ml 1x PBS i inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 55 °C, aż roztwór będzie klarowny. Przefiltrować roztwór przez filtr 0,22 μm i przechowywać w temperaturze pokojowej do czasu użycia.
   UWAGA: Opcjonalnie utrwalacz 4% PFA można przechowywać w stanie zamrożonym w temperaturze -20 °C. Po zamrożeniu rozmrozić tylko raz do użycia. W przeciwnym razie 4% roztwór PFA w PBS można zakupić bezpośrednio.
2. Ostrożnie wypoleruj szkiełka mikroskopowe o wymiarach 76 mm x 26 mm niestrzępiącą się chusteczką i odtłuść je, umieszczając w 96% etanolu w słoiku Coplin na 5 minut. Pozostaw szkiełka mikroskopowe do wyschnięcia na powietrzu przez 10 minut.
3. Zamontuj szkiełka mikroskopowe w lejkach cytospinowych/cytologicznych o powierzchni 6 mm. Wstępnie powlekaj szkiełka, pipetując 50 μL 1x PBS + 10% BSA do każdego lejka i wiruj przez 1 minutę przy 500 obr./min.
4. Dodać 100 μl zawiesiny komórek (co odpowiada 0,2 x 10⁶ komórek) do każdego lejka i wirować przez 5 minut przy 500 obr./min. Dla każdej kombinacji przeciwciał wymagane są co najmniej 4 preparaty (eksperyment z dwoma przeciwciałami; dwie kontrole z pojedynczym przeciwciałem; brak kontroli z przeciwciałami).
5. Ostrożnie zdemontuj lejki i upewnij się, że nie dotykasz miejsc. Natychmiast przystąp do utrwalania próbki.
   1. Opcjonalnie pozostaw szkiełka do wyschnięcia na powietrzu przez co najmniej 30 minut. Po wyschnięciu na powietrzu zawiń szkiełka pojedynczo w folię aluminiową i przechowuj w temperaturze -20 °C do czasu użycia. Używając mrożonych preparatów, pamiętaj o rozmrożeniu szkiełek owiniętych w ręcznik papierowy, aby zapobiec jawnej kondensacji na szkiełkach.
6. Narysuj okrąg (przybliżona średnica 15-20 mm) wokół tego miejsca za pomocą długopisu PAP blokującego płyn (końcówka 5 mm).
7. Dodać 50 μl 4% roztworu utrwalającego PFA do każdego miejsca i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
8. Umyj komórki 3 razy przez 5 minut z 1x PBS w słoiku Coplin w temperaturze RT z delikatnym mieszaniem.
9. Osusz szkiełka wokół miejsc niestrzępiącą się chusteczką i usuń jak najwięcej płynu z miejsca za pomocą pipety, nie dotykając miejsca lub przechylając szkiełko. Dodać 50 μL 0,25% Triton-X w 1x PBS do każdego miejsca i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej bez mieszania.
10. Umyj szkiełka 3 razy przez 5 minut w ~50-60 ml 0,05% Tween-20 in TBS (TBS-T) w słoiku Coplin w temperaturze RT z delikatnym mieszaniem. W ten sposób można jednocześnie przetwarzać 10 szkiełek.

3. Blokowanie i inkubacja przeciwciał pierwotnych

1. Sklep TBS-T i osusz szkiełka wokół miejsc niestrzępiącą się chusteczką. Usunąć jak najwięcej płynu z miejsca za pomocą pipety, nie dotykając miejsca lub przechylając szkiełko. Krótko wymieszaj roztwór blokujący i dodaj jedną kroplę (~ 40 μl) do każdego miejsca. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C we wstępnie ogrzanej, wilgotnej komorze.
2. Przygotuj koktajl przeciwciał, mieszając kozio-anty-ATM w stosunku 1:1,000 i króliczo-anty-fosfo-Ser15-p53 w stosunku 1:100 w komercyjnym rozcieńczalniku przeciwciał, rozcieńczalniku przeciwciał wirowych przed użyciem. Do eksperymentów kontrolnych należy przygotować rozcieńczenia przeciwciał zawierające tylko kozio-anty-ATM i tylko królicze przeciwciało anty-fosfo-Ser15-p53 (kontrole z pojedynczym przeciwciałem).
3. Stuknąć roztwór blokujący, ale należy uważać, aby nie dopuścić do wyschnięcia komórek przed dodaniem rozcieńczeń przeciwciał. Dodać 30 μl każdego rozcieńczenia koktajlu przeciwciał i inkubować w wilgotnej komorze przez noc w temperaturze 4 °C.
4. Przygotować na miejscu bufor A do przemywania i bufor do przemywania B, rozpuszczając zawartość jednej saszetki buforu A i buforu B w końcowej objętości 1 000 ml wody każdy.
   1. Alternatywnie należy przygotować bufor A do płukania, rozpuszczając 8,8 g NaCl, 1,2 g Tris-base i 0,5 ml Tween-20 w 800 ml wody. Dostosuj pH do 7,4 za pomocą HCl i dodaj do końcowej objętości 1,000 ml.
   2. Alternatywnie należy przygotować bufor płuczący B, rozpuszczając 5,84 g NaCl, 4,24 Tris-base i 26,0 g Tris-HCl w 500 ml wody. Dostosuj pH do 7,5 za pomocą HCl. Dodaj wodę do końcowej objętości 1,000 ml.
   3. Przefiltruj oba roztwory przez filtr 0,22 μm.
5. Umyj szkiełka 2 razy przez 5 minut z 1x buforem do mycia A in situ w słoiku Coplin w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.

4. Sondy PLA, ligacja i amplifikacja

1. Przygotuj sondy PLA, rozcieńczając anty-kozioł PLUS i anty-królik MINUS w stosunku 1:5 w komercyjnym rozcieńczalniku przeciwciał. Strząśnij 1x bufor A do płukania in situ ze szkiełek i dodaj 30 μl mieszaniny sondy PLA do każdego miejsca. Inkubować przez 1 h w temperaturze 37 °C we wstępnie ogrzanej, wilgotnej komorze.
   UWAGA: Można zastosować dowolną kombinację przeciwciał drugorzędowych sond PLA PLUS i MINUS (anty-myszy, anty-królika, anty-kozy), o ile zastosowane przeciwciała pierwszorzędowe są hodowane u różnych gatunków, a kombinacja sond PLA powinna zawsze zawierać sondę PLUS i sondę MINUS.
2. Myć szkiełka 2 razy przez 5 minut z ~50-60 ml 1x bufor do płukania A in situ w słoiku Coplin w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.
3. Przygotować roztwór ligacji i ligazy na lodzie, dodając 1 μl ligazy do 39 μl roztworu ligacji i dodając 40 μl roztworu ligacji i ligazy do każdego miejsca. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C we wstępnie ogrzanej, wilgotnej komorze.
4. Umyj szkiełka 2 razy przez 5 minut za pomocą ~50-60 ml 1x bufor do płukania A in situ w słoiku Coplin w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.
5. Przygotować mieszaninę amplifikacji i polimerazy na lodzie, rozcieńczając roztwór podstawowy amplifikacji w stosunku 1:5 w wodzie. Następnie dodaj 0,5 μl polimerazy do 39,5 μl 1x roztworu do amplifikacji dla każdego miejsca.
   UWAGA: Odczynniki do amplifikacji są wrażliwe na światło i należy je chronić przed bezpośrednim działaniem światła. Odczynnik wzmacniający występuje w czterech różnych kolorach (CZERWONY: wzbudzenie 594 nm, emisja 624 nm; FarRED: wzbudzenie 644 nm, emisja 669 nm; POMARAŃCZOWY: wzbudzenie 554 nm, emisja 576 nm; ZIELONY: wzbudzenie 501 nm, emisja 523 nm), upewnij się, że dostępny zestaw mikroskopowy ma odpowiednie właściwości wzbudzenia i filtry do obrazowania tych kolorów.
6. Strząśnij 1x bufor do płukania in situ A i dodaj 40 μl mieszaniny amplifikacji i polimerazy na miejsce. Inkubować przez 100 minut w temperaturze 37 °C we wstępnie ogrzanej, wilgotnej komorze.

5. Montaż i obrazowanie

1. Przygotuj 0,01x in situ bufor do płukania B, dodając 1 ml 1x buforu do płukania B do 99 ml wody.
2. Stuknąć z mieszaniny amplifikacji i polimerazy i umyć szkiełka 2 razy przez 10 minut 1x buforem B do płukania in situ w słoiku Coplin w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.
3. Umyj szkiełka 1 minutę w 0,01x buforze do płukania B.
4. Strząśnij nadmiar 0,01x buforu B i osusz szkiełka wokół miejsc niestrzępiącą się chusteczką. Usunąć jak najwięcej płynu z miejsca za pomocą pipety, nie dotykając miejsca lub przechylając szkiełko.
5. Rozcieńczyć pożywkę montażową zawierającą DAPI w stosunku 1:5 w podłożu montażowym bez DAPI, aby uniknąć nadmiernego barwienia jąder.
6. Dodać 25-30 μl podłoża montażowego zawierającego DAPI w proporcji 1:5 do szkiełka nakrywkowego o wymiarach 24 mm x 24 mm i podnieść szkiełko nakrywkowe za pomocą szkiełka, lekko docisnąć, aby upewnić się, że nie ma uwięzionych pęcherzyków powietrza. Uszczelnij szkiełko nakrywkowe lakierem do paznokci i odczekaj co najmniej 15 minut przed obrazowaniem.
7. Przeanalizuj szkiełka za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (konfokalnego).
   1. Policz liczbę punktowych sygnałów PLA na komórkę w co najmniej 4 uzyskanych polach obrazu (obiektyw 20x, zliczając co najmniej 20 komórek na stan lub kombinację przeciwciał, w oparciu o obliczenia mocy przy użyciu przewidywanej średniej 7 ± 5 sygnałów w leczonych komórkach i 2 ± 2 sygnałów w komórkach nieleczonych, z prawdopodobieństwem błędu typu I wynoszącym 0,05, i potęga 80%, jak zgłoszono wcześniej¹⁵).
      UWAGA: Najlepszą rozdzielczość uzyskuje się poprzez akwizycję stosu Z i dekonwolucję za pomocą pakietów oprogramowania (np. ImageJ, Leica Acquisition Suite (LAS)). Sygnały powinny być łatwo dostrzegalne w obrębie obwodu jądrowego, zgodnie z definicją barwienia DAPI.
   2. Nie licz sygnałów, które wyraźnie pojawiają się poza jądrami. Zazwyczaj leczenie NCS lub napromienianie γ powoduje około 5-10 sygnałów phosho-p53/ATM PLA na komórkę. Kontrole z pojedynczym przeciwciałem mogą dawać pewien sygnał tła, ale nie powinien on przekraczać 1-2 sygnałów PLA na 1 na każde 20 komórek.
   3. Do celów publikacji i prezentacji rób zdjęcia za pomocą obiektywu z olejkiem immersyjnym 40X lub 63X. Szkiełka można przechowywać w temperaturze 4 °C i należy je chronić przed działaniem światła.

Results

Wykazano, że fosforylacja p53 na reszcie Ser15 jest zależna od aktywności kinazy ATM¹⁶. Aby zademonstrować i potwierdzić specyficzność techniki PLA na preparatach cytospinowych zawiesinowych kultur komórkowych, wykazano, że indukcja uszkodzenia DNA przez 2-godzinną obróbkę NCS komórek BCR-ABL+ B-ALL zatrzymanych w fazie G1 cyklu komórkowego spowodowała specyficzną interakcję między ATM a fosfo-Ser15-p53, zgodnie z oczekiwaniami. Punktowe sygnały PLA zaobserwowano w...

Discussion

W niniejszym raporcie wykazano, że PLA może być używany do określania i wizualizacji specyficznej interakcji między białkami w zawiesinowych hodowlach komórkowych. Warto zauważyć, że opisany tutaj protokół nie ogranicza się do badania kompleksów naprawczych DNA, ale ma również zastosowanie do wizualizacji i ilościowego określania innych interakcji białko-białko w hodowlach komórek zawiesinowych. Wykazano, że kinaza ATM oddziałuje z fosforylowanym p53 w komórkach B-ALL BCR-ABL+ zatrzymanych przez G1 pod wpływem czynnika i...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Linia komórkowa BV173	DSMZ	AC-20	BCR-ABL+ Linia komórkowa B-ALL
Linia komórkowa SUP-B15 Linia komórkowa	DSMZ	ACC-389	BCR-ABL+ Linia komórkowa B-ALL
Zmodyfikowana przez Iscove'a Pożywka Dulbecco (IMDM)	Gibco (Life Technologies)	21980-032
Surowica cielęca płodu	Sigma Aldrich	F7524	lot #: 064M3396
L-glutamina	Gibco (życie Technologie)	25030-024
penicylina/streptomycyna	Gibco (Life Technologies)	15140-122
metanosulfonian imatynibu	LC Laboratories	I-5508	Rozpuścić w DMSO, przygotować 10 mM roztwór podstawowy
neokarzinostatyna	Sigma Aldrich	N9162	Mutagenne/teratogenne, należy obchodzić się z
KU55933	Selleckchem	S1092	Rozpuścić w DMSO, przygotować 5 mM roztwór podstawowy
Starfrost Preparaty mikroskopowe	Waldemar Knittel	VA11200 003FKB
Długopis PAP bloker płynów	Sigma Aldrich	Z377821-1EA
Lejek cytospinowy	Q Path Labonord SAS	003411324
Duolink In Situ Czerwony zestaw startowy Koza/Królik	Sigma Aldrich	DUO92105	Dostępne dla różnych gatunków/kombinacji, dostępne również w FarRED, Orange i Green
goat-anti-ATM	Bethyl Laboratories	A300-136A	PLA-grade; z powodzeniem użyliśmy lot#A300-136A-1 w naszych badaniach
sygnalizacji komórkowej	anty-fosfo-Ser15-p53	9284	Z powodzeniem wykorzystaliśmy partię #9284-4 w naszych badaniach
Przeciwblaknięcie przeciwblaknięcia medium montażowego Vectashield z DAPI	Vector Labs	H-1200
Vectashield antiblading podłoże montażowe	Vector Labs	H-1000
4% paraformaldehyd w PBS	Santa Cruz Biotechnology	sc-281692	Dostępne również u różnych innych dostawców