Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Technika eksplantatu ślimakowego u noworodków jako narzędzie przesiewowe in vitro w badaniach słuchu

18.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55704

⸱

8 czerwca 2017

 ,  , 
1Eaton Peabody Laboratories, Department of Otolaryngology, Massachusetts Eye and Ear, 2Department of Otolaryngology, Harvard Medical School, 3Department of Otolaryngology, Vienna General Hospital, Medical University of Vienna, 4Harvard Program in Speech and Hearing Bioscience and Technology

W tym artykule

Podsumowanie

Celem tego protokołu jest zademonstrowanie przygotowania, hodowli, leczenia i barwienia immunologicznego eksplantatów ślimakowych u noworodków myszy. Technika ta może być wykorzystana jako narzędzie przesiewowe in vitro w badaniach słuchu.

Streszczenie

Chociaż w ciągu ostatnich kilku dekad nastąpił znaczny postęp w badaniach nad słuchem, nadal nie ma lekarstwa na Odbiorczy Ubytek Słuchu (SNHL), stan, który zazwyczaj wiąże się z uszkodzeniem lub utratą delikatnych struktur mechanosensorycznych ucha wewnętrznego. W ostatnich latach pojawiły się zaawansowane testy in vitro i ex vivo, które umożliwiają badania przesiewowe coraz większej liczby potencjalnie terapeutycznych związków przy jednoczesnej minimalizacji zasobów i przyspieszeniu wysiłków na rzecz opracowania leków na SNHL. Chociaż jednorodne kultury niektórych typów komórek nadal odgrywają ważną rolę w obecnych badaniach, wielu naukowców polega obecnie na bardziej złożonych hodowlach organotypowych mysich uszu wewnętrznych, znanych również jako eksplantaty ślimaka. Zachowanie zorganizowanych struktur komórkowych w uchu wewnętrznym ułatwia ocenę in situ różnych elementów infrastruktury ślimakowej, w tym wewnętrznych i zewnętrznych komórek rzęsatych, neuronów spiralnych, neurytów i komórek podporowych. W tym miejscu przedstawiamy przygotowanie, hodowlę, leczenie i barwienie immunologiczne eksplantatów ślimaka mysiego u noworodków. Staranne przygotowanie tych eksplantatów ułatwia identyfikację mechanizmów, które przyczyniają się do SNHL i stanowi cenne narzędzie dla społeczności badaczy słuchu.

Wprowadzenie

Odbiorczy ubytek słuchu (SNHL) odzwierciedla uszkodzenie ucha wewnętrznego lub wstępującej ścieżki słuchowej. Podczas gdy ubytek słuchu jest najczęstszym deficytem sensorycznym u ludzi1, terapie lecznicze jeszcze nie istnieją2. Chociaż implanty ślimakowe lub słuchowe pnia mózgu mogą przywrócić pewien stopień słuchu pacjentom z ciężkim lub głębokim SNHL, słuch zapewniany przez te urządzenia nadal bardzo różni się od "naturalnego" słyszenia, zwłaszcza podczas prób rozumienia mowy w hałasie lub słuchania muzyki.

Chociaż zwyrodnienie komórek rzęsatych od dawna uważane jest za główną konsekwencję traumatycznych zdarzeń słuchowych (np. narażenie na głośny hałas), istnieje coraz więcej dowodów na to, że synapsy przekazujące informacje z komórek rzęsatych do nerwu słuchowego są co najmniej tak samo podatne na uraz akustyczny3,4,5,6. Ponieważ progi audiometryczne u ludzi, obecny złoty standard oceny funkcji słuchu, nie przewidują specyficznych uszkodzeń komórek w uchu wewnętrznym, potrzebne są bardziej wyrafinowane narzędzia, aby jak najszybciej wykryć zwyrodnienie komórkowe i rozpocząć odpowiednie leczenie7.

Obiecujące metody leczenia ubytku słuchu są często testowane na homogenicznych hodowlach komórkowych in vitro, ale takie systemy nie modelują dokładnie mikrośrodowiska ślimaka. Wiadomo, że komórki ślimakowe wydzielają czynniki troficzne, które wpływają na inne typy komórek w obrębie ślimaka 8,9, kluczowy proces in vivo, który jest tracony, gdy narząd Corti10,11 lub spiralne neurony zwojowe (SGNs)12 są hodowane w izolacji lub podczas analizy markerów molekularnych13. Jednak badania in vivo, które mogą być niezbędne do walidacji danych in vitro w celu opracowania nowych, spersonalizowanych metod leczenia ubytku słuchu w pogoni za "medycyną precyzyjną", wymagają znacznych zasobów i czasu. Jest to szczególnie istotne, gdy weźmie się pod uwagę, ile wysiłku wymaga udoskonalenie i wykonanie iniekcji do ucha środkowego lub błony okiennej z badaniami słuchu i późniejszym rozwarstwieniem całych mocowań ślimaka. Skuteczne badania przesiewowe obiecujących związków w organotypowych kulturach ex vivo, znanych jako eksplantaty ślimakowe, stanowią ekonomiczną i niezawodną alternatywę14,15,16,17.

Ten artykuł szczegółowo opisuje protokół, za pomocą którego można generować, utrzymywać i oceniać eksplantaty ślimakowe leczone. Podkreślono konkretne zastosowania tego modelu, w tym jego zastosowanie w badaniach przesiewowych potencjalnie terapeutycznych związków oraz ocenę porównawczą wektorów wirusowych w terapii genowej. Podejście oparte na eksplantacji ex vivo pozwala naukowcom na wizualizację wpływu danego leczenia na różne populacje komórek in situ, ułatwiając identyfikację mechanizmów specyficznych dla typu komórki i późniejsze udoskonalenie celowanych środków terapeutycznych.

Ogólnie rzecz biorąc, ta technika dostarcza modelu do badania ślimaka ex vivo, zachowując przy tym istotne wzajemne oddziaływanie między bardzo różnymi typami komórek, które współistnieją w ślimaku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Protokół badania został zatwierdzony przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) Massachusetts Eye and Ear. Eksperymenty przeprowadzono zgodnie z Kodeksem Etycznym Światowego Stowarzyszenia Lekarzy.

1. Przygotowanie sekcji

  1. Przygotowanie stołu operacyjnego
    1. Do dezynfekcji stołu operacyjnego użyj 70% etanolu.
    2. Umieść dwie niesterylne podkładki przygotowawcze obok mikroskopu.
    3. Przygotuj tacę na narzędzia, w tym sterylizowane termicznie nożyczki operacyjne, rękojeść skalpela, mikronóż i kleszcze (po dwa z #4 i #55). Umieść tacę na instrumenty i szalkę Petriego o przezroczystych ściankach i szklanym dnie o średnicy 50 mm na jednej niesterylnej podkładce.
    4. Zaopatrz się w sterylne ostrze skalpela #15, zamykaną plastikową torbę lub pojemnik (do pozbycia się tusz zgodnie z wytycznymi instytucji), lód w wiadrze oraz zimny, sterylny Zrównoważony Roztwór Soli Hanka (HBSS). Umieść te przedmioty na drugiej niesterylnej podkładce.
    5. Przenieś HBSS do plastikowej probówki laboratoryjnej o pojemności 50 ml i umieść ją na lodzie.
  2. Przygotowanie kultury
    1. Przygotuj wszystkie materiały w okapie z przepływem laminarnym. Na każde cztery próbki należy umieścić cztery autoklawowane okrągłe szkiełka nakrywkowe o średnicy 10 mm w czterech wkładkach 4-dołkowej płytki Petriego o średnicy 35 mm.
    2. Na każde 4 próbki należy wymieszać w probówce do mikrowirówki całkowitą objętość 300 μl, składającą się z następujących składników: 10 μl kleju tkankowego, 285 μlNaHCO3 i 5 μL NaOH.
    3. Umieścić 45 μl otrzymanego roztworu na każdym szkiełku nakrywkowym i pozostawić go tam na co najmniej 20 minut w temperaturze pokojowej; roztwór ten można pozostawić na szkiełku nakrywkowym na kilka godzin, ale nie można go pozostawić w stanie O/N.
    4. Umieścić jedną lub dwie 35-milimetrowe 4-dołkowe płytki Petriego wewnątrz 10-centymetrowej szalki Petriego w celu stworzenia dwóch barier chroniących przed zanieczyszczeniem.
    5. Przygotować pożywkę hodowlaną zawierającą 98% zmodyfikowanej pożywki Dulbecco Eagle's Medium (DMEM), 1% N-2 i 1% ampicyliny (65 μl na studzienkę w probówce (mikro)wirówkowej). Przed użyciem podgrzać roztwór do temperatury 25 °C.

2. Mysi eksplantat ślimakowy

  1. Dekapitacja nowonarodzonej myszy
    1. Zaopatrz się w plastikową szalkę Petriego o średnicy 60 mm i spryskaj jej pokrywkę 70% etanolem, aby powierzchnia była mokra.
    2. Wlać zimny HBSS z plastikowej probówki laboratoryjnej do dolnej części plastikowej płytki Petriego o średnicy 60 mm i przezroczystych ściankach o średnicy 50 mm ze szklanym dnem. Przechowuj plastikową probówkę laboratoryjną i obie szalki Petriego na lodzie, aby utrzymać tkankę w niskiej temperaturze, gdy nie jest preparowana.
    3. Umieść nowonarodzoną mysz w wieku P3 - P5 na lodzie w odciętym palcu rękawicy lateksowej i poczekaj, aż hipotermia wywoła utratę przytomności (około 1-3 minut).
    4. Szybko odetnij głowę myszy nożyczkami operacyjnymi i wyrzuć ciało do zamykanej plastikowej torby. Umieść odciętą głowę noworodka w 70% etanolu w pokrywie plastikowej szalki Petriego o średnicy 60 mm.
  2. Makroskopowe rozwarstwienie kości skroniowej
    1. Usuń skórę czaszki, wykonując powierzchowne cięcie od przodu do tylnego końca (bezpośrednio na szczycie szwu strzałkowego) za pomocą ostrza skalpela.
    2. Ostrzem skalpela przeciąć oba zewnętrzne kanały słuchowe i zagiąć skórę do przodu, aby odsłonić całą czaszkę.
      UWAGA: Chociaż na tym etapie zwykle nie jest potrzebny mikroskop preparacyjny, można go użyć do lepszej wizualizacji.
    3. Otwórz czaszkę wzdłuż szwu strzałkowego za pomocą ostrza skalpela #15. Upewnij się, że przecinasz czaszkę, delikatnie przesuwając ostrze w górę iw dół od przodu do tyłu, aby uniknąć ucisku ślimaka.
      UWAGA: Czaszka w tym wieku nie powinna być skostniała i powinna łatwo się ciąć.
    4. Usuń i wyrzuć pysk, wykonując pionowe cięcie bezpośrednio za oczodołami za pomocą ostrza skalpela #15.
      UWAGA: Tylna część czaszki powinna nadal zawierać mózg i ślimak.
    5. Pozbądź się przodomózgowia, móżdżku i pnia mózgu poprzez rozwarstwienie za pomocą kleszczy #4.
  3. Ekstrakcja mikroskopowa ślimaka
    1. Dostosuj mikroskop (powiększenie 6,5x) i źródło światła, umieszczając kleszcze pod lunetą i optymalizując oświetlenie i ostrość.
    2. Umieść dwie połówki czaszki na plastikowej szalce Petriego o średnicy 60 mm wypełnionej zimnym HBSS.
    3. Całkowicie odsłoń ślimak/e, który można zidentyfikować jako przylegający do otaczającej tętnicy strzemiączkowej (kręta tętnica w kości skroniowej) i tępo oddziel narząd od kości skroniowej za pomocą kleszczy #4.
    4. Przenieś ślimak na 50-milimetrową, przezroczystą szalkę Petriego ze szklanym dnem i umieść ją pod mikroskopem.
    5. Umieść plastikową szalkę Petriego o średnicy 60 mm z drugą połową czaszki na lodzie.
    6. Usuń ślimak z układu przedsionkowego i ostrożnie wypreparuj torebkę ślimakową (zwykle chrzęstną w tym wieku) za pomocą kleszczy #4. Użyj kleszczyków #55 do wszystkich dalszych kroków.
  4. Końcowe etapy przetwarzania tkanek
    1. Kontynuuj przetwarzanie tkanki ucha wewnętrznego, ostrożnie oddzielając więzadło spiralne przylegające do narządu Cortiego od reszty ślimaka i modiolusa za pomocą mikronoża lub dwóch kleszczy.
      1. Wytnij ciemniejszy, półprzezroczysty obszar w szczelinie między więzadłem spiralnym a obszarem komórek rzęsatych i przystąp do późniejszego usunięcia więzadła spiralnego, chwytając je w najbardziej podstawowym aspekcie i delikatnie rozwijając, poruszając się wierzchołkowo.
    2. Ustaw próbkę tak, aby uzyskać wzdłużny, strzałkowy widok ślimaka i pokrój ślimak na dwie do trzech sekcji za pomocą mikronoża, klasyfikując te sekcje jako zwoje wierzchołkowe, (środkowe) i podstawne. Usuń tkankę górną i dolną w stosunku do rzeczywistej warstwy komórek rzęsatych i neurytów, aby uzyskać fragment eksplantatu ślimaka, który może leżeć poziomo na szalce Petriego.
      UWAGA: Odpowiedni rozmiar zapewniający stabilne przyleganie do naczynia hodowlanego to około połowa jednego obrotu ślimaka.
    3. Usuń błonę tektorialną, bardzo cienką, półprzezroczystą warstwę bezpośrednio znajdującą się nad narządem Cortiego, delikatnie odklejając ją kleszczami.
    4. Usuń membranę Reissnera, bezpośrednio znajdującą się nad SGN, dotykając jej kleszczami z obu stron i odklejając.
      UWAGA: Usuń wszelkie boczne uszkodzone obszary komórek włosa, odcinając je mikronożem.

3. Przenoszenie próbek na płytki hodowlane

  1. Usunąć 45 μl roztworu kleju tkankowego z czterech szkiełek nakrywkowych. Umyć każde szkiełko nakrywkowe 50 μl sterylnegoH2O. Zassać wodę.
  2. Podnieść pipetę o pojemności 1 ml. Zwilż końcówkę pipety około 120 μl DMEM, aby zapobiec przywieraniu próbki do wnętrza końcówki.
  3. Przenoś próbki pojedynczo za pomocą pipety o pojemności 1 ml. Odpipetować maksymalnie 70 μl z wypełnionej HBSS, małej, przezroczystościennej szalki Petriego ze szklanym dnem i umieścić próbkę wraz z płynem na jednej z 4 wkładek (przygotowanych z szkiełkami nakrywkowymi) na 4-dołkowej szalce Petriego.
  4. Sprawdź pod mikroskopem (50-krotne powiększenie), czy próbka jest we właściwej orientacji. Upewnij się, że obszar komórek rzęsatych, z którego usunięto błonę tektorialną, jest skierowany do góry. Upewnij się, że błona podstawna, wraz z przyciętą, podstawową częścią modiolus, jest skierowana w dół i przylega do szkiełka nakrywkowego.
    1. Jeśli próbka jest zwrócona do góry nogami podczas kontroli, umieść HBSS, który pozostał na końcówce pipety, we wkładce i ponownie umieść próbkę, aż zostanie prawidłowo zorientowana.
      UWAGA: Zapobiegnie to unoszeniu się komórek rzęsatych w pożywce hodowlanej bez wsparcia strukturalnego ze strony szkiełka nakrywkowego, co mogłoby prowadzić do zwyrodnienia.
  5. Odessać nadmiar HBSS za pomocą pipety o pojemności 1 ml. Poczekaj 15 sekund.
  6. Odpipetować 60 μl przygotowanej ciepłej pożywki hodowlanej (98% DMEM, 1% N-2 i 1% ampicyliny) bezpośrednio na próbkę. Uważaj, aby nie dotknąć próbki pipetą. Założyć wewnętrzną i zewnętrzną pokrywę szalki Petriego i inkubować O/N w temperaturze 37 °C.
  7. Umieść wszystkie roztwory podstawowe z powrotem na właściwych miejscach, wyrzuć tusze i odpady resztkowe, odkaż stół chirurgiczny zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi (np. przy użyciu etanolu lub podchlorynu), wyczyść i autoklawuj narzędzia, a ostre przedmioty wyrzuć do odpowiedniego pojemnika.

4. Dodawanie końcowych pożywek hodowlanych i substancji będących przedmiotem zainteresowania

UWAGA: Eksplantaty ślimaka będą gotowe do użycia 10-16 godzin później.

  1. Przygotować mieszaninę 97% DMEM, 1% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% N-2 i 1% ampicyliny (65 μl na studzienkę w probówce do mikrowirówki; przed użyciem podgrzać roztwór do 25 °C).
  2. Dodać inne interesujące substancje do roztworów dla odpowiednich grup leczenia. W przypadku dodania substancji fluorescencyjnych (np. wirusów eksprymujących białko zielonej fluorescencji (GFP); w niedawnej publikacji stężenie 1010 GC wirusów związanych z adenowirusami (AAV) stosowano przez 48 godzin w 50 μl)18, chronić przed światłem.
  3. Przenieś z inkubatora płytki Petriego zawierające eksplantaty ślimaka i umieść je pod okapem z przepływem laminarnym.
  4. Odessać starą pożywkę hodowlaną (bez FBS) za pomocą pipety z wkładów.
  5. Dodać 60 μl na studzienkę przygotowanej ciepłej pożywki hodowlanej (zabiegowej) (97% DMEM, 1% FBS, 1% N-2, 1% ampicyliny i substancje będące przedmiotem zainteresowania).
  6. Umieścić szalkę Petriego z powrotem w inkubatorze (37 °C).
  7. Oglądaj regularnie pod mikroskopem, aby zidentyfikować oznaki zanieczyszczenia, migracji komórek lub oderwania eksplantatu ślimaka i wykonaj barwienie po maksymalnie 7 dniach.

5. Immunofluorescencja - Dzień 1

  1. Przygotować roztwór blokujący (94% sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), 5% normalna surowica kozia lub końska (NGS/NHS, w zależności od przeciwciał drugorzędowych) i 1% niejonowy środek powierzchniowo czynny (patrz tabela materiałów)) i podstawowy roztwór przeciwciał (98,6% PBS, 1% NHS i 0,4% niejonowy środek powierzchniowo czynny z odpowiednimi przeciwciałami).
    UWAGA: Przeciwciała obejmują królicze anty-Myo7A w stężeniu 1:400+ (miozyna 7A, dla wewnętrznych i zewnętrznych komórek rzęsatych) i mysie anty-TuJ1 1:200+ (β-tubulina, dla SGN) LUB mysie (IgG1) anty-CtBP2 1:200+ (białko wiążące c-terminal, dla presynapsy), mysz (IgG2a) anty-PSD95 1:50+ (gęstość postsynaptyczna, dla postsynapsy) i anty-NF-H kurczaka 1:1000+ (neurofilament, dla SGN i włókien nerwowych). "+" oznacza "lub wyżej".
  2. Odessać pożywkę hodowlaną za pomocą pipety. Uważaj, aby nie dotknąć próbki.
  3. Pod okapem z przepływem laminarnym przepłucz eksplantaty ślimaka dwukrotnie sterylnym PBS, umieszczając próbki na wytrząsarce na 5 minut po każdym myciu.
  4. Utrwal tkankę w 4% paraformaldehydzie (PFA - UWAGA) na 20 minut na wytrząsarce (pod maską). Zassać PFA.
  5. Nanieść 60 μl PBS na eksplantaty ślimaka i umieścić szalkę Petriego na wytrząsarce na 5 minut. Odessać PBS. Powtórz 3 razy.
  6. Umieść eksplantaty ślimaka w przygotowanym roztworze blokującym (94% PBS, 5% NHS i 1% niejonowy środek powierzchniowo czynny) na 30 minut na shakerze.
  7. Umieść eksplantaty ślimaka w przygotowanym roztworze przeciwciał podstawowych (98,6% PBS, 1% NHS i 0,4% niejonowy środek powierzchniowo czynny) z odpowiednimi przeciwciałami pierwszorzędowymi (wir przed użyciem) O/N na liczniku w RT.
    UWAGA: Owiń szalki Petriego wilgotnymi ręcznikami papierowymi zamkniętymi w folii (lub folii aluminiowej, jeśli dodany roztwór zawiera materiały fluorescencyjne, takie jak wirusy wykazujące ekspresję GFP), aby utrzymać wilgotność naczyń i zapobiec parowaniu roztworu przeciwciała O/N.

6. Immunofluorescencja - Dzień 2

  1. Przygotować barwienie 4',6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI) (300 nM) i użyć roztworu przeciwciała podstawowego w celu uzyskania właściwych mieszanin przeciwciał drugorzędowych, komplementarnych do przeciwciał pierwszorzędowych w kroku 5.1. (np. koza anty-królik 488 1:200+ i koza anty-mysz 568 1:200+ LUB koza anty-mysz (IgG1) 568 1:1000+, koza anty-mysia (IgG2a) 488 1:500+ i kozia anty-kurczak 647 1:200+ LUB falloidyna 568 1:200+ (dla wewnętrznych i zewnętrznych komórek rzęsatych)).
  2. Odessać roztwór przeciwciała pierwotnego.
  3. Nanieść 60 μl PBS na eksplantaty ślimaka i umieścić szalkę Petriego na wytrząsarce na 5 minut. Odessać PBS. Powtórz 3 razy.
  4. Umieść eksplantaty ślimaka w przygotowanym roztworze przeciwciał podstawowych (98,6% PBS, 1% NHS i 0,4% niejonowego środka powierzchniowo czynnego) z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi (wir przed użyciem) na 1,5 godziny na ladzie i chronić przed światłem.
  5. Odessać roztwór przeciwciała wtórnego i przepłukać eksplantaty ślimaka barwnikiem DAPI (umieszczając na wytrząsarce na 1 minutę, a następnie aspirować).
  6. Nanieść 60 μl PBS na eksplantaty ślimaka i umieścić szalkę Petriego na wytrząsarce na 5 minut. Odessać PBS. Powtórz 3 razy.
  7. Za pomocą kleszczy usuń szkiełka nakrywkowe z próbkami z płytki 4-dołkowej, zanurz je w pojemniku wypełnionym destylowanymH2Oi wysusz szkiełka nakrywkowe, doprowadzając je pionowo do kontaktu z ręcznikami papierowymi.
  8. Umieść kroplę pożywki zapobiegającej blaknięciu na szkiełku mikroskopowym i odwróć szkiełka nakrywkowe, aby zanurzyć w pożywce tkankę skierowaną w dół.
  9. Uszczelnij szkiełko nakrywkowe za pomocą przezroczystego lakieru do paznokci, pokrywając obwodowo krawędź (bez zgniatania próbki pod szkłem). Pozostaw szkiełka leżące płasko w zadaszonym miejscu, z dala od światła, na 15 - 20 minut, aż wyschną, a następnie umieść je w pudełku lub zbadaj pod mikroskopem konfokalnym.
    UWAGA: Barwienie fluorescencyjne najlepiej zachować, przechowując szkiełka w temperaturze 4 lub -20 °C.

7. Obrazowanie konfokalne

  1. Uzyskaj przegląd i powiększone zdjęcia narządu regionu Cortiego, w tym neurytów i SGNs.
    UWAGA: Standardowe ustawienia procesu obrazowania: Format 1 024 x 1 024 pikseli, prędkość 400 Hz, średnia klatek 3, 20% ogólna intensywność lasera i zwykle obiektyw 20X i 63X z zanurzeniem w oleju (potencjalnie w połączeniu z 2-krotnym zoomem cyfrowym). Ustawienia kanałów dla protokołu barwienia DAPI, Myo7A i TuJ1 są opisane powyżej: 405 5% DAPI, "Smart Gain" 766,8 V, "Smart Offset" 0,0% - 488 15% izotiocyjanian fluoresceiny (FITC), "Smart Gain" 622,2 V, "Smart Offset" 0,0% - 561 13% izotiocyjanian tetrametyloromatyny (TRITC), "Smart Gain" 562,4 V, "Smart Offset" 0,0%.
  2. Scal obrazy w stos z za pomocą oprogramowania, aby uzyskać projekcję osi z.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Podczas gdy wiele protokołów koncentruje się na eksplantach narządu Cortiego, technika ta ma na celu zachowanie anatomii całego zwoju ślimaka, w tym SGNs. Daje to badaczom możliwość analizy wpływu danego leczenia na neuryty i somata SGNs, oprócz samego narządu Cortiego. Wykonanie sekcji zachowującej część modiolusa, zgodnie z opisem w niniejszym materiale, jest trudniejsze technicznie niż sam eksplant narządu Cortiego. Jednak obszar neurytów i SGN jest istotny, ponieważ w dwóch ostatnich ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Naukowcy muszą udoskonalić technikę sekcji przed przeprowadzeniem eksperymentów z udziałem eksplantatów ślimaka. Komórki rzęsate są często uszkadzane podczas sekcji wykonywanych na wczesnym etapie krzywej uczenia się, a szczególnie problematycznym momentem dla ich integralności jest usunięcie błony tektorialnej, co wymaga pewnych rąk, odpowiednich narzędzi i doświadczenia. Aby zaoszczędzić czas i zasoby, należy przeprowadzić kontrolę wzrokową pod mikroskopem preparacyjnym i zwrócić uwagę na potencjalnie uszkodzone obszar...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty Narodowego Instytutu Głuchoty i Innych Zaburzeń Komunikacyjnych R01DC015824 (K.M.S.) i T32DC00038 (wspierające S.D.), grant Departamentu Obrony W81XWH-15-1-0472 (K.M.S.), Fundację Bertarelli (K.M.S.), Fundację Nancy Sayles Day (K.M.S.) oraz Centrum Badań nad Szumami Usznymi Lauer (K.M.S.). Dziękujemy Jessice E. Sagers, B.A. za wnikliwe komentarze na temat manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Ampicylina, sól sodowaInvitrogen11593-027
przeciwciało anty-CtBP2, mysie (IgG1)Laboratoria Transdukcji BD612044
przeciwciało anty-Myo7A, królikProteus Biosciences25-6790
przeciwciało anty-NF-H, kurczakEMD MilliporeAB5539
przeciwciało anty-PSD95, przeciwciała myszy (IgG2a) Inc.75-028
Przeciwciało anty-TuJ1, mysieBioLegend801202
Cell-Tak Klej do komórek i tkanek, 5 mgCorning354241
Probówki wirówkowe CELLSTAR 15 mL, stożkowe dno, podziałka, sterylneGreiner Bio-One188161
Naczynie do hodowli komórkowych CELLSTAR, 100 x 20 mmGreiner Bio-One664160
Naczynie do hodowli komórkowych CELLSTAR, 35 x 10 mm, 4 pierścienie wewnętrzneGreiner Bio-One627170
Naczynie do hodowli komórkowych CELLSTAR, 60 x 15 mmGreiner Bio-One628160
Probówki wirówkowe CELLSTAR 50 mL, stożkowe dno, podziałka, sterylnyGreiner Bio-One227261
Przezroczysty lakier do paznokciMikroskopia elektronowa Sciences72180
Naczynia z przezroczystym dnem (szkło 40 mm), PELCO®, tuleja/20, 50 x 7 mmTed Pella Inc.14027-20
Szkiełka nakrywkowe, okrągłe, szkło, średnica 10 mm, grubość #1, 0.13 - 0.16mmTed Pella Inc.
DAPI (4',6-diamidyn-2-fenyloindol, dichlorowodorek)Thermo Fisher ScientificD1306
Woda destylowana, 500 mlThermo Fisher Scientific15230-162 
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), wysoka glukoza, pirogronian, bez glutaminy, 500 mlThermo Fisher Scientific10313-039
Dumont #4 KleszczeFine Science Tools11241-30
Dumont #55 Kleszcze (Dumostar)Fine Science Tools11295-51
Alkohol etylowy (EtOH), czysty, 200 proof, bezwodny, ≥ 99.5%Sigma-Aldrich459836-1L
Płodowa surowica bydlęca (FBS), kwalifikowana, regiony zatwierdzone przez USDA, 500 mlThermo Fisher Scientific10437-028 Podwielokrotność porcji w probówkach o pojemności 50 ml i przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza; C zamrażarka
koza przeciwciało drugorzędowe anty-kurczak-647Thermo Fisher ScientificA-21469
kozie przeciwciało anty-mysie (IgG)-568Thermo Fisher ScientificA-11004
kozie przeciwciało anty-mysie (IgG1)-568Thermo Fisher ScientificA-21124
kozie przeciwciało anty-mysie (IgG2a)-488 przeciwciało drugorzędoweThermo Fisher ScientificA-21131
kozie przeciwciało drugorzędowe anty-królicze-488Thermo Fisher ScientificR37116
H2O, sterylne, EmbryoMax Ultra Pure Water, 500 mlEMD MilliporeTMS-006-B
Zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS), wapń, magnez, bez czerwieni fenolowej, 500 mlThermo Fisher Scientific14025-092
Taca na instrumenty z pokrywką NóżdoMountainside Medical TechMed4255
– kątowy 30°Fine Science Tools10056-12
Szkiełka mikroskopowe, VistaVision, oznaczone kolorami, 75 x 25 mm (3 x 1"), grubość 1 mm, białe, opakowanie 72 sztVWR16004-382
Suplement N-2 (100X), 5 mlThermo Fisher Scientific17502-048
NaHCO3, roztwór wodorowęglanu sodu 7,5%, 100 mlThermo Fisher Scientific25080-094
NaOH, roztwór wodorotlenku sodu, 1 lThermo Fisher ScientificSS266-1
Normalna surowica końska (NHS)Invitrogen16050130
Nożyczki operacyjneRoboz Surgical Instruments Co.RS-6806
Paraformaldehyd (PFA), klasa odczynnika, krystalicznaSigma-AldrichP6148Przed użyciem: Ustal standardowe procedury operacyjne w oparciu o protokoły dostępne online
PBS, pH 7,4, 500 mlThermo Fisher Scientific10010-023 Autoklaw przed użyciem
Falloidyna, Alexa Fluor 568 Podkładka przygotowawcza Thermo Fisher ScientificA12380
, niesterylna Medline05136CS
Probówki do mikrowirówek Safe-Lock, polipropylen, 0.5 mlAutoklawEppendorf022363719
Probówki do mikrowirówek Safe-Lock, polipropylen, 1,5 mlAutoklawEppendorf022363204
Ostrza skalpela - #15Fine Science Tools10015-00
Rękojeść skalpela - #4Narzędzia do nauki10004-13
Mikroskop stereoskopowy Stemi 2000-CZeiss 000000-1106-133
Mikroskop konfokalny TCS SP5LeicaN/A
Triton-X (niejonowy środek powierzchniowo czynny)IntegraT756.30.30
Antyblakowy środek montażowy VectaShield do fluorescencjiVector Laboratories, Inc.H-1000
, zamykana, 4 x 6'' - grubość 2 mmZipline0609132541599
260368 mikro (preparowania) ze stali nierdzewnej . przed użyciem przed użyciemTorba na zamek błyskawiczny

Bibliografia

  1. Mathers, C., Smith, A., Concha, M. Global burden of hearing loss in the year. World Health Organization (WHO). , Available from: http://www.who.int/healthinfo/statistics/bod_hearingloss.pdf (2000).
  2. Geleoc, G. S., Holt, J. R. Sound strategies for hearing restoration). Science. 344 (6184), 1241062(2014).
  3. Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Acceleration of age-related hearing loss by early noise exposure: evidence of a misspent youth. J Neurosci. 26 (7), 2115-2123 (2006).
  4. Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss. J Neurosci. 29 (45), 14077-14085 (2009).
  5. Makary, C. A., Shin, J., Kujawa, S. G., Liberman, M. C., Merchant, S. N. Age-related primary cochlear neuronal degeneration in human temporal bones. J Assoc Res Otolaryngol. 12 (6), 711-717 (2011).
  6. Jensen, J. B., Lysaght, A. C., Liberman, M. C., Qvortrup, K., Stankovic, K. M. Immediate and delayed cochlear neuropathy after noise exposure in pubescent mice. PLoS One. 10 (5), (2015).
  7. Landegger, L. D., Psaltis, D., Stankovic, K. M. Human audiometric thresholds do not predict specific cellular damage in the inner ear. Hear Res. , 83-93 (2016).
  8. Wang, H. C., et al. Spontaneous Activity of Cochlear Hair Cells Triggered by Fluid Secretion Mechanism in Adjacent Support Cells. Cell. 163 (6), 1348-1359 (2015).
  9. Barclay, M., Ryan, A. F., Housley, G. D. Type I vs type II spiral ganglion neurons exhibit differential survival and neuritogenesis during cochlear development. Neural Dev. 6, (2011).
  10. Dinh, C., et al. Short interfering RNA against Bax attenuates TNFalpha-induced ototoxicity in rat organ of Corti explants. Otolaryngol Head Neck Surg. 148 (5), 834-840 (2013).
  11. Mazurek, B., Yu, Y., Haupt, H., Szczepek, A. J., Olze, H. Salicylate modulates Hsp70 expression in the explanted organ of Corti. Neurosci Lett. 501 (2), 67-71 (2011).
  12. Kao, S. Y., et al. Loss of osteoprotegerin expression in the inner ear causes degeneration of the cochlear nerve and sensorineural hearing loss. Neurobiol Dis. 56, 25-33 (2013).
  13. Jan, T. A., Chai, R., Sayyid, Z. N., Cheng, A. G. Isolating LacZ-expressing cells from mouse inner ear tissues using flow cytometry. J Vis Exp. (58), e3432(2011).
  14. Haque, K. D., Pandey, A. K., Kelley, M. W., Puligilla, C. Culture of embryonic mouse cochlear explants and gene transfer by electroporation. J Vis Exp. (95), e52260(2015).
  15. Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti. J Vis Exp. (36), (2010).
  16. Mulvaney, J. F., Dabdoub, A. Long-term time lapse imaging of mouse cochlear explants. J Vis Exp. (93), e52101(2014).
  17. Wang, Q., Green, S. H. Functional role of neurotrophin-3 in synapse regeneration by spiral ganglion neurons on inner hair cells after excitotoxic trauma in vitro. J Neurosci. 31 (21), 7938-7949 (2011).
  18. Landegger, L. D., et al. A synthetic AAV vector enables safe and efficient gene transfer to the mammalian inner ear. Nat Biotechnol. 35 (3), 280-284 (2017).
  19. Dilwali, S., Landegger, L. D., Soares, V. Y., Deschler, D. G., Stankovic, K. M. Secreted Factors from Human Vestibular Schwannomas Can Cause Cochlear Damage. Sci Rep. 5, 18599(2015).
  20. Soares, V. Y., et al. Extracellular vesicles derived from human vestibular schwannomas associated with poor hearing damage cochlear cells. Neuro Oncol. , (2016).
  21. Tong, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Regenerated synapses between postnatal hair cells and auditory neurons. J Assoc Res Otolaryngol. 14 (3), 321-329 (2013).
  22. Yuan, Y., et al. Ouabain-induced cochlear nerve degeneration: synaptic loss and plasticity in a mouse model of auditory neuropathy. J Assoc Res Otolaryngol. 15 (1), 31-43 (2014).
  23. Fernandez, K. A., Jeffers, P. W., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Aging after noise exposure: acceleration of cochlear synaptopathy in "recovered" ears. J Neurosci. 35 (19), 7509-7520 (2015).
  24. Barclay, M., Constable, R., James, N. R., Thorne, P. R., Montgomery, J. M. Reduced sensory stimulation alters the molecular make-up of glutamatergic hair cell synapses in the developing cochlea. Neuroscience. , 50-62 (2016).
  25. Zinn, E., et al. In Silico Reconstruction of the Viral Evolutionary Lineage Yields a Potent Gene Therapy Vector. Cell Rep. 12 (6), 1056-1068 (2015).
  26. Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. Effect of genome size on AAV vector packaging. Mol Ther. 18 (1), 80-86 (2010).
  27. Shu, Y., et al. Identification of Adeno-Associated Viral Vectors That Target Neonatal and Adult Mammalian Inner Ear Cell Subtypes. Hum Gene Ther. , (2016).
  28. Kao, S. Y., Soares, V. Y., Kristiansen, A. G., Stankovic, K. M. Activation of TRAIL-DR5 pathway promotes sensorineural degeneration in the inner ear. Aging Cell. 15 (2), 301-308 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

limak mysi noworodkowyanaliza kom rek rz satychneurony zwoju spiralnegohodowla organotypowaprocedura immunostaininguusuwanie b ony tektorialnejprzekroje zwoj w limakaanaliza obrazowania konfokalnego
Technika eksplantatu ślimakowego u noworodków jako narzędzie przesiewowe in vitro w badaniach słuchu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.