Artykuł metodologiczny

Izolacja populacji bocznej w ostrej białaczce limfoblastycznej indukowanej przez limfokomórki T indukowanej przez Myc u danio pręgowanego

6.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55711

⸱

4 maja 2017

 ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Section of Hematology-Oncology, The University of Chicago, 2Department of Biology and Biotechnology, Worcester Polytechnic Institute

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy technikę izolowania komórek populacji bocznej z modelu danio pręgowanego z indukowaną przez myc ostrej białaczki limfoblastycznej limfoblastycznej (T-ALL). Ten boczny test populacyjny jest bardzo czuły i jest opisany dla T-ALL danio pręgowanego, ale może mieć zastosowanie do innych złośliwych i niezłośliwych typów komórek danio pręgowanego.

Streszczenie

Heterogeniczne populacje komórek, zarówno ze zdrowych, jak i złośliwych tkanek, mogą zawierać populację komórek charakteryzującą się różnicową zdolnością do wydzielania barwnika wiążącego DNA Hoechst 33342. Tę "boczną populację" komórek można zidentyfikować za pomocą metod cytometrii przepływowej po wzbudzeniu barwnika Hoechst 33342 przez laser ultrafioletowy (UV). Populacja boczna wielu typów komórek zawiera komórki macierzyste lub progenitorowe. Jednak nie wszystkie typy komórek mają możliwą do zidentyfikowania populację poboczną. Danio rerio, danio pręgowany, mają solidny model in vivo ostrej białaczki limfoblastycznej z komórek T (T-ALL), ale nie wiadomo, czy te T-ALL danio pręgowanego mają populację poboczną. Opisana tutaj metoda opisuje, w jaki sposób wyizolować boczne komórki populacyjne w danio pręgowanym T-ALL. Zacznijmy od tego, że T-ALL u danio pręgowanego jest generowany poprzez mikrowstrzyknięcie plazmidów tol2 do zarodków w stadium jednokomórkowym. Gdy guzy osiągną etap, w którym rozszerzają się na więcej niż połowę ciała zwierzęcia, można pobrać komórki T-ALL. Komórki są następnie barwione za pomocą Hoechst 33342 i badane za pomocą cytometrii przepływowej pod kątem komórek populacji bocznej. Metoda ta ma szerokie zastosowanie w badaniach nad T-ALL danio pręgowanego. Chociaż nie ma znanych markerów powierzchni komórek u danio pręgowanego, które potwierdzałyby, czy te komórki populacji bocznej są podobne do rakowych komórek macierzystych, możliwe są testy przeszczepu funkcjonalnego in vivo. Co więcej, transkryptomika pojedynczych komórek może być zastosowana do identyfikacji cech genetycznych tych komórek populacji bocznej.

Wprowadzenie

Test populacji pobocznej wykorzystuje zwiększoną zdolność niektórych komórek w tkance do wypływu barwnika wiążącego DNA Hoechst 33342 z powodu wysokiego poziomu białek transportujących kasetę wiążącą ATP (ABC) na błonie komórkowej. Komórki, które wydzielają barwnik Hoechst 33342, można zidentyfikować za pomocą analizy cytometrycznej przepływu o podwójnej długości fali po wzbudzeniu barwnika przez laser UV. Test ten został po raz pierwszy użyty do identyfikacji mysich hematopoetycznych komórek macierzystych (HSC)1, ale od tego czasu został użyty do identyfikacji populacji komórek macierzystych/progenitorowych w wielu tkankach i nowotworach (przegląd w odnośniku 2). Jednak nie wszystkie populacje komórek mają populację poboczną i nie wszystkie populacje boczne są wzbogacone o komórki macierzyste/progenitorowe.

Danio pręgowany to potężny system modeli genetycznych kręgowców do badania ludzkiego raka3,4, z wieloma zaletami w porównaniu z tradycyjnymi mysimi modelami raka. Zarodki danio pręgowanego są zapłodnione zewnętrznie i są optycznie czyste, co ułatwia transgenezę i obserwację in vivo procesów patologicznych, w tym inicjacji i progresji nowotworu. Do tej pory test populacji bocznej w celu wykrycia potencjalnych komórek macierzystych lub progenitorowych był stosowany tylko do szpiku nerkowego danio pręgowanego w celu identyfikacji HSC, a nie do jakichkolwiek modeli raka danio pręgowanego5,6.

Model ostrej białaczki limfoblastycznej (T-ALL) z komórek T jest morfologicznie i genetycznie podobny do ludzkiego T-ALL7,8,11. T-ALL jest agresywnym nowotworem złośliwym, który u ludzi stanowi 10-15% przypadków u dzieci i 25% u dorosłych9. Chociaż leczenie T-ALL uległo poprawie, nawrót choroby jest nadal powszechny i wiąże się ze złym rokowaniem. Guzy T-ALL są niejednorodne i zawierają wiele różnych subpopulacji komórek nowotworowych, w tym komórki inicjujące białaczkę (LIC). LIC są definiowane przez ich zdolność do odrastania całego guza z pojedynczej komórki, a częstość LIC w populacji komórek nowotworowych można obliczyć, przeszczepiając różne dawki komórek biorcom za pomocą testu transplantacji z ograniczeniem rozcieńczenia (LDA). Chociaż eksperymenty LDA zostały przeprowadzone na danio pręgowanym w celu obliczenia częstości występowania LICs8,10,11, to określenie jest dokonywane z perspektywy czasu i nie pozwala na prospektywną izolację LICs. W związku z tym brakuje metody prospektywnego izolowania populacji wzbogaconej o aktywność nowotworowych komórek macierzystych. Identyfikacja i wyizolowanie komórek populacji bocznej z T-ALL danio pręgowanego jest pierwszym krokiem w kierunku rozwiązania tego problemu.

Protokół przedstawiony tutaj opisuje, jak efektywnie generować guzy T-ALL u danio pręgowanego za pomocą transgenezy za pośrednictwem tol2, zbierać komórki nowotworowe T-ALL i barwić je za pomocą Hoechst 33342 w celu identyfikacji bocznej populacji komórek. Przyszłe eksperymenty in vivo z T-ALL danio pręgowanego mogą dotyczyć tego, czy komórki populacji bocznej są wzbogacone o LIC, czy też mają inne właściwości podobne do macierzystych lub progenitorowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury z danio pręgowanym zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie w Chicago. University of Chicago jest akredytowany przez Stowarzyszenie Oceny i Akredytacji Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi (AAALAC).

1. Generowanie i izolowanie fluorescencyjnie znakowanych komórek T-ALL u danio pręgowanego

  1. Mikroiniekcja do syngenicznych zarodków danio pręgowanego
    1. Korzystając z dostępnych na rynku zestawów, wyizoluj koliste DNA plazmidu rag2:c-myc i rag2:zielone białko fluorescencyjne (rag2:GFP) zawierające odwrócone powtórzenia końcowe rozpoznawane przez transpozazę tol2 (patrz Tabela materiałów dla źródła plazmidowego DNA)12 i eluuj DNA w sterylnej wodzie.
      UWAGA: GFP jest używany w tym badaniu, ale każde białko fluorescencyjne będzie działać.
    2. Przygotuj RNA transpozazy pCS2 (tol2)
      1. Wyizoluj DNA plazmidu tol2 za pomocą dostępnych na rynku zestawów (patrz Tabela materiałów dla źródła plazmidowego DNA)12 i wymyj DNA w sterylnej wodzie.
      2. Inkubować 1 μg DNA tol2 w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę z 5 jednostkami enzymu restrykcyjnego NotI w odpowiednim buforze w celu linearyzacji plazmidu. Dezaktywować termicznie NotI w temperaturze 65 °C przez 20 minut.
      3. Transkrybuj tol2 RNA polimerazą SP6 RNA ze zlinearyzowanego DNA za pomocą dostępnego na rynku zestawu do transkrypcji RNA13. Przechowywać RNA w jednorazowych podwielokrotnościach w temperaturze -80 °C.
    3. Przygotować mieszankę do wstrzykiwań na lodzie, dodając 250 ng plazmidowego DNA rag2:c-myc, 250 ng plazmidowego DNA rag2:GFP, 150 ng tol2 RNA i 0,5 μl czerwieni fenolowej. Dostosuj objętość do 10 μl wodą bez nukleaz.
    4. Wstrzyknij ~1 nL mieszanki iniekcyjnej do komórki jednokomórkowego syngenicznego zarodka danio pręgowanego za pomocą mikroiniektora i igły wyciągniętej ze szklanej rurki kapilarnej, zgodnie z wcześniej ustalonymi metodami8,14.
      UWAGA: Syngeniczne danio pręgowane wygenerowane przez partenogenezę15 są tutaj używane w celu wyeliminowania genetycznej heterogeniczności i odrzucenia immunologicznego po przeszczepie. Można jednak również użyć danio pręgowanego typu dzikiego lub dowolnej pożądanej odmiany.
    5. Usuń martwe, słabo rozwinięte lub zniekształcone zarodki po 24 i 48 godzinach od wstrzyknięcia16.
    6. Umieść wstrzyknięte ryby w systemie dla ryb po 6 dniach od wstrzyknięcia i hoduj je zgodnie ze standardowym protokołem6.
  2. Badania przesiewowe danio pręgowanego i monitorowanie wzrostu guza
    1. Po 21 dniach od wstrzyknięcia umieścić pojedynczą wstrzykniętą larwę w kropli pożywki zarodkowej na szalce Petriego i przeprowadzić badanie przesiewowe pod kątem fluorescencji GFP za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego (pasmo wzbudzenia: 470/40, pasmo przepustowe emisji: 525/50)8.
      UWAGA: Larwy danio pręgowanego, które mają zintegrowane zarówno rag2:c-myc, jak i rag2:GFP, będą miały zieloną fluorescencyjną grasicę (ryba dodatnia) i mogą już wykazywać ekspansję złośliwych zielonych komórek fluorescencyjnych poza grasicę. Wszystkie ryby z grasicą GFP+ rozwiną T-ALL GFP+. Larwy, które nie wykazują integracji plazmidów, nie będą miały żadnych zielonych komórek fluorescencyjnych (ryby ujemne).
    2. Oddzielić ujemne ryby (na podstawie braku fluorescencji) do innego zbiornika i ponownie monitorować ryby po 28 i 35 dniach od wstrzyknięcia. Po 28 i 35 dniach od wstrzyknięcia należy znieczulić ryby 0,02% buforowaną trikainą (MS-222) w wodzie systemu rybnego przed badaniem przesiewowym.
    3. Umieść każdą larwę danio pręgowanego, która jest dodatnia dla grasicy znakowanej fluorescencyjnie lub guza znakowanego fluorescencyjnie, w indywidualnym zbiorniku w celu monitorowania wzrostu guza trzy razy w tygodniu.
  3. Zbiór znakowanych fluorescencyjnie komórek T-ALL od pierwotnej ryby nowotworowej
    1. Przygotuj co najmniej 20 ml 10% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej w 0,9x buforowanej fosforanem soli fizjologicznej (FBS/PBS).
    2. Dodać 1 ml FBS/PBS do jednej fiolki soli sodowej heparyny (300 jednostek).
    3. Wybierz ryby z guzami w ponad 50% ciała lub te ryby, które mają trudności z jedzeniem lub pływaniem. Poświęć rybę, przedawkowując ją tricainą lub zanurzając w lodowatej wodzie. Śmierć należy potwierdzić brakiem ruchu skrzeli i bicia serca.
    4. Użyj żyletki, aby usunąć głowę ryby.
    5. Przemyć jamę ryby roztworem heparyny w celu usunięcia nadmiaru czerwonych krwinek.
      1. Za pomocą pipety wstrzyknąć 100 μl roztworu heparyny (przygotowanego w kroku 1.3.2) do jamy ciała ryby. Usuń cały płyn, który się wyleje (będzie zawierał krwinki) i odpipetuj go do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
      2. Użyj świeżej końcówki pipety, aby ponownie umyć ciało. Wykonaj co najmniej trzy prania lub do momentu, gdy wylewający się płyn będzie wyglądał na wolny od krwi.
      3. Usunąć cały płyn z płukania w krokach 1.3.5.1 i 1.3.5.2, ponieważ nie będzie on używany w dalszych analizach.
    6. Zbierz komórki białaczkowe.
      1. Wstrzyknąć 100 μl FBS/PBS do jamy ciała ryby.
      2. Delikatnie uciskaj zewnętrzną część ciała ryby końcówką pipety, aby wycisnąć/wypchnąć komórki nowotworowe.
        UWAGA: Jeśli ten krok zostanie wykonany przy użyciu mikroskopu preparacyjnego, komórki nowotworowe wylewające się z jamy ciała będą widoczne.
      3. Zbierz płyn i komórki z każdego płukania do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
      4. Powtarzaj kroki 1.3.6.1-1.3.6.3, aż większość komórek nowotworowych zostanie zebrana (zwykle 5-10 razy). Zbierz wszystkie komórki nowotworowe do tej samej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Utrzymuj komórki w temperaturze pokojowej.
    7. Wymieszaj zebrane komórki nowotworowe z kroku 1.3.6, delikatnie pipetując je, aby rozdzielić grudki komórek. Przefiltruj zawiesinę komórek przez filtr siatkowy o wielkości 40 μm. Umyj filtr 1-2 razy 100 μl FBS/PBS. Utrzymuj komórki w temperaturze pokojowej.
    8. Wymieszaj 2 μl zawiesiny komórek z 18 μl błękitu trypanowego (0,4%, rozcieńczonego w stosunku 1:10 i przefiltrowanego) w nowej probówce. Załaduj 10 μl na hemocytometr i policz liczbę żywych (nieniebieskich) komórek fluorescencyjnych, aby obliczyć liczbę izolowanych komórek nowotworowych.
      UWAGA: Nieniebieskie komórki GFP-ujemne są prawdopodobnie normalnymi, niezłośliwymi limfocytami T i nie powinny być liczone. Do barwienia komórek za pomocą Hoechst 33342 wymagane są co najmniej 2 x 106 komórek.

2. Barwienie fluorescencyjnie znakowanych komórek T-ALL za pomocą Hoechst 33342 w celu identyfikacji populacji bocznej

  1. Rozcieńczyć Hoechst 33342 1:10 wolnym od nukleazH2O, aby uzyskać stężenie robocze 1 mg/ml. Barwnik należy przechowywać w temperaturze 4 °C i w ciemności.
  2. Przygotować 100 mM roztwór werapamilu, rozpuszczając 49,1 mg w 1 ml dimetylosulfotlenku (DMSO).
    UWAGA: Werapamil jest inhibitorem transporterów ABC i jest ważną kontrolą w eksperymentach populacyjnych ubocznych. Dodanie werapamilu do próbek zahamuje zdolność transporterów ABC do wypływu barwnika Hoechst 33342. W związku z tym prawdziwa populacja poboczna zniknie po dodaniu werapamilu do próbki.
  3. Ustawić łaźnię wodną na 28 °C.
  4. Przygotuj próbki i kontrole w ciemności, dodając komórki i roztwory do probówek do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS).
    1. Przygotuj próbki, dodając 106 komórek, 15 μl 1 mg/ml Hoechst 33342 i 2,5 μl DMSO do probówki FACS. Dostosuj objętość do 1 ml za pomocą FBS/PBS.
    2. Przygotować kontrole, dodając 106 komórek, 15 μl 1 mg/ml Hoechst 33342 i 2,5 μl 100 mM werapamilu do probówki FACS. Dostosuj objętość do 1 ml za pomocą FBS/PBS.
      UWAGA: Zalecane jest minimum 106 komórek/próbkę, ale preferowane jest barwienie większej liczby komórek, zwłaszcza jeśli komórki populacji bocznej zostaną posortowane do dalszej analizy. Nie przekraczać 106 komórek/ml i utrzymywać stężenie Hoechst 33342 na poziomie 15 μg/ml. Jeśli 10 x 106 komórek jest wybarwionych, całkowita objętość reakcji wynosi 10 ml.
  5. Inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 28 °C w ciemności przez 120 min.
  6. Po inkubacji umieść komórki natychmiast na lodzie i trzymaj je w ciemności.
  7. Granulować komórki w temperaturze 4 °C przez 6 minut przy 300 x g. Usunąć supernatant. Umyć 1 ml FBS/PBS.
  8. Granulować komórki w temperaturze 4 °C przez 6 minut przy 300 x g. Usunąć supernatant. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml FBS/PBS.
  9. Przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu sortowania komórek.
  10. 15 minut przed sortowaniem komórek dodać 2 μl jodku propidyny (PI) (1 mg/ml) do każdego 1 ml FBS/PBS (końcowe stężenie: 2 μg/ml). Dobrze wymieszaj.

3. Użyj FACS, aby znaleźć populację boczną w fluorescencyjnie znakowanej populacji komórek T-ALL

  1. Analizuj barwione zawiesiny komórek T-ALL danio pręgowanego na sortowniku komórek wyposażonym w laser UV do wzbudzania barwnikiem Hoechst 33342 i laser 488 nm do wzbudzania PI i wykrywania komórek T-ALL GFP+.
  2. Określ bramkę dla żywych komórek T-ALL GFP+.
    1. Użyj obszaru rozpraszania do przodu (FSC) i bocznego rozpraszania (SSC), aby usunąć gruz.
      UWAGA: FSC służy do rozróżniania wielkości komórki, a SSC służy do rozróżniania ziarnistości komórki.
    2. Użyj szerokości FSC i SSC, aby rozróżnić dublety.
      UWAGA: Detektory cytometru przepływowego identyfikują trzy elementy: powierzchnię, wysokość i szerokość. Obszar jest zwykle używany do pomiaru fluorescencji komórki. Szerokość mierzy czas lotu i jest dwa razy szersza, jeśli dwie komórki są zbite razem.
    3. W przypadku żywych komórek nowotworowych narysuj bramkę wokół komórek dodatnich dla GFP i ujemnych dla PI za pomocą odpowiednich detektorów (np. FITC dla GFP i PerCP Cy5-5 dla PI).
  3. W bramce komórki pod napięciem zmierz fluorescencję Hoechst 33342 przez filtry pasmowoprzepustowe Hoechst Blue i Hoechst Red (odpowiednio 450/50 i 670/30).
    UWAGA: Populacja boczna, jeśli jest obecna, będzie widoczna po jej ustawieniu. Co ważne, populacja boczna musi zniknąć w kontroli werapamilu, aby można ją było uznać za prawdziwą populację poboczną.
  4. W przypadku sortowania komórek populacji bocznej do dalszych eksperymentów należy użyć dużej końcówki dyszy (100 μm) i zebrać komórki do probówki FACS zawierającej 3 ml 100% FBS. Użyj większej końcówki dyszy (100 μm) zamiast mniejszej końcówki (70 μm), aby poprawić żywotność komórek po sortowaniu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby efektywnie generować fluorescencyjne guzy T-ALL indukowane myc u rybek zebrafish, koliste konstrukty DNA flankowane miejscami dla transpozazy tol2 można wstrzykiwać wspólnie z RNA tol2. Poprzednie badania nad wstrzykiwaniem liniowego DNA do embrionów rybek zebrafish wykazały 5% wskaźnik transgenezy8. Przy zastosowaniu protokołu obejmującego transgenezę opartą na tol2 można zaobserwować wskaźniki transgenezy w zakresie od 10-44% (Tabela 1).

...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Test populacji pobocznej jest bardzo czuły; W związku z tym niewielkie zmiany w protokole mogą powodować trudności w wykrywaniu komórek populacji bocznej. Po pierwsze, temperatura na etapie barwienia jest specyficzna dla każdego układu zwierzęcego/komórkowego. W przypadku systemów ssaków test populacji bocznej jest zwykle wykonywany w temperaturze 37 °C2. Gdy komórki T-ALL danio pręgowanego inkubowano w temperaturze 37 °C, wiele komórek obumarło, co sprawiło, że temperatura inkubacji była niedopus...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez University of Chicago Women's Board, Wendy Will Case Fund oraz University of Chicago Comprehensive Cancer Center Support Grant (P30 CA014599). Chcielibyśmy podziękować Flow Cytometry Core na Uniwersytecie w Chicago za pomoc w przygotowaniu tego eksperymentu, a także innym członkom laboratorium de Jong, w szczególności Leslie Pedraza i Seanowi McConnellowi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Syngeniczny danio pręgowany (CG2)Patrz Mizgireuv et al., 2006
rag2:plazmidLangenau Laboratory
rag2:Plazmid GFP skonstruowany w de Jong Labrag2 promotorze z Langenau Laboratory
plazmidChien Laboratorium
NotI-enzym restrykcyjny HFNew England Bio-Labs Inc.Jednostki R3189S500 w rozmiarach 25 i mikro; L
mMessage Machine SP6 Zestaw do transkrypcjiAmbionThermo Fisher Scientific - AM134025 reakcji
QIAGEN Plasmid Midi KitQiagen, Inc.12643
Mikroskop SteREO Discovery V8Mikroskopia Carl Zeiss495015-0008-000
Mikrowtryskiwacz cyfrowyTritech ResearchMINJ-D
Mosiężny uchwyt igły z prostym ramieniemTritech ResearchMINJ-4
Podstawa magnetyczna i podstawaTritech ResearchMINJ-HBMB
MikromanipulatorNarishige Międzynarodowekapilary szklane MN153
Sutter Instrument Co.B100-50-10 10cm bez filamentu
Ściągacz do mikropipet Flaming/BrownSutter Instrument Co.P-97
do mikroładowarekEppendorf North America Inc.
Roztwór czerwieni fenolowejSigma Life ScienceP0290Stężenie 0,5% 100 ml
Plastikowe pipety transferoweFisherbrand137119Dz podziałką 7,5 ml bańka
Metanosulfonian trikainy (MS-222)Western Chemical, Inc.Fisher Scientific - NC0342409100 g
Płodowa surowica bydlęca (FBS)HyClone Laboratories, Inc.Fisher Scientific - SH3007103500 ml
soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS)Gibco firmy Life Technologies1001-023pH 7,4 (1x) - 500 mL
Sól sodowa heparynySigma-Aldrich210615 - 300 fiolek jednostkowych
40 i mikro; m filtr siatkowyFalcon Corning Marka352340Opakowanie 50
sztuk Trypan niebieskiSigma Life ScienceT815420 ml - roztwór (0,4%)
Hoechst 33342Life TechnologiesH357010 ml
VerapamilSigma Life ScienceV46291 g
dimetylosulfotlenku (DMSO)Sigma Life ScienceD8418100 mL
Propidium IodideLife TechnologiesP356610 mL
FACSAria Fusion sorter komórekBD Biosciences
BD FACSDiva 8.0.1BD Biosciences
FlowJo v10.2FlowJo, LLC
c-myc transpozazy pCS2-transpozazy Końcówki do pipet 930001007

Bibliografia

  1. Goodell, M., Brose, K., Paradis, G., Conner, A., Mulligan, R. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J. Exp. Med. 183, 1797-1806 (1996).
  2. Golebiewska, A., Brons, N. H. C., Bjerkvig, R., Niclou, S. Critical appraisal of the side population assay in stem cell and cancer stem cell research. Cell Stem Cell. 8, 136-147 (2011).
  3. Dooley, K., Zon, L. I. Zebrafish: a model system for the study of human disease. Curr Opin Genet Dev. 10 (3), 252-256 (2000).
  4. White, R., Rose, K., Zon, L. Zebrafish cancer: the state of the art and the path forward. Nat Rev Cancer. 13 (9), 624-636 (2013).
  5. Kobayashi, I., et al. Characterization and localization of side population (SP) cells in zebrafish kidney hematopoietic tissue. Blood. 111 (3), 1131-1137 (2008).
  6. Tsinkalovsky, O., Vik-Mo, A. O., Ferreira, S., Laerum, O. D., Fjose, A. Zebrafish kidney marrow contains ABCG2-dependent side population cells exhibiting hematopoietic stem cell properties. Differentiation. 75 (3), 175-183 (2007).
  7. Langenau, D. M., et al. Myc-induced T cell leukemia in transgenic zebrafish. Science. 299, 887-890 (2003).
  8. Blackburn, J. S., Liu, S., Langenau, D. M. Quantifying the frequency of tumor-propagating cells using limiting dilution cell transplantation in syngeneic zebrafish. J Vis Exp. , e2790(2011).
  9. Martelli, A. M., et al. Targeting signaling pathways in T-cell acute lymphoblastic leukemia initiating cells. Adv Biol Regul. 56, 6-21 (2014).
  10. Smith, A. C. H., et al. High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 115 (16), 3296-3303 (2010).
  11. Blackburn, J. S., et al. Clonal evolution enhances leukemia-propagating cell frequency in T cell acute lymphoblastic leukemia through Akt/mTORC1 pathway activation. Cancer Cell. 25, 366-378 (2014).
  12. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Plasmid Purification. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2016).
  13. Kawakami, K. Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates. Genome Biol. 8, (2007).
  14. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
  15. Mizgireuv, I. V., Revskoy, S. Y. Transplantable tumor lines generated in clonal zebrafish. Cancer Research. 66 (6), 3120-3125 (2006).
  16. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish. , University of Oregan Press. (1993).
  17. Hirschmann-Jax, C., et al. A distinct "side population" of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells. Proc Natl Acad Sci. USA. 101 (39), 14228-14233 (2004).
  18. Komuro, H., et al. Identification of side population cells (stem-like cell population) in pediatric solid tumor cell lines. J Pediatr Surg. 42 (12), 2040-2045 (2007).
  19. Moshaver, B., et al. Identification of a small subpopulation of candidate leukemia-initiating cells in the side population of patients with acute myeloid leukemia. Stem Cells. 26 (12), 3059-3067 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Cytometria przep ywowaHoechst 33342T ALL u rybek danio ostrop etwychkom rki macierzyste nowotworuizolacja kom rekfluorescencyjne sortowanie kom rek FACSinhibicja werapamilemjodek propidynybia aczka limfoblastyczna T

Powiązane artykuły