Artykuł metodologiczny

Izolacja fragmentów mikronaczyniowych pochodzących z mysiej tkanki tłuszczowej jako jednostek unaczynienia dla inżynierii tkankowej

DOI:

10.3791/55721

⸱

30 kwietnia 2017

 ,  ,  ,  , 
1Institute for Clinical and Experimental Surgery, Saarland University, 2Division of Plastic Surgery and Hand Surgery, University Hospital Zurich, University of Zurich

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy protokół izolowania fragmentów mikronaczyniowych pochodzących z tkanki tłuszczowej, które reprezentują obiecujące jednostki unaczynienia. Można je szybko wyizolować, nie wymagają przetwarzania in vitro, a tym samym mogą być stosowane do jednoetapowej prewaskularyzacji w różnych dziedzinach inżynierii tkankowej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Funkcjonalna sieć mikronaczyniowa ma kluczowe znaczenie dla przetrwania i integracji inżynieryjnych konstruktów tkankowych. W tym celu ustalono kilka strategii angiogennych i prewaskularyzacyjnych. Jednak większość podejść opartych na komórkach obejmuje czasochłonne etapy in vitro w celu utworzenia sieci mikronaczyniowej. W związku z tym nie nadają się do śródoperacyjnych zabiegów jednoetapowych. Fragmenty mikrokrążenia pochodzące z tkanki tłuszczowej (ad-MVF) stanowią obiecujące jednostki unaczynienia. Można je łatwo wyizolować z tkanki tłuszczowej i wykazują funkcjonalną morfologię mikronaczyń. Co więcej, po implantacji in vivo szybko łączą się w nowe sieci mikronaczyniowe. Ponadto wykazano, że ad-MVF indukuje limfangiogenezę. Wreszcie, są bogatym źródłem mezenchymalnych komórek macierzystych, co może dodatkowo przyczyniać się do ich wysokiego potencjału unaczynienia. W poprzednich badaniach wykazaliśmy niezwykłą zdolność unaczynienia ad-MVF w zmodyfikowanych substytutach kości i skóry. W niniejszym badaniu przedstawiono znormalizowany protokół enzymatycznej izolacji ad-MVF z mysiej tkanki tłuszczowej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Inżynieria tkankowa skupia się na wytwarzaniu substytutów tkanek i narządów, które utrzymują, przywracają lub rozszerzają funkcję niedziałających odpowiedników in vivo1,2. Los inżynieryjnych konstruktów tkankowych zależy w dużej mierze od odpowiedniego unaczynienia3. Sieci mikronaczyniowe w tych konstrukcjach powinny być hierarchicznie zorganizowane z tętniczkami, naczyniami włosowatymi i żyłkami, aby umożliwić efektywną perfuzję krwi po inokulacji do układu naczyniowego biorcy4. Tworzenie takich sieci jest jednym z kluczowych wyzwań w inżynierii tkankowej. W tym celu w ciągu ostatnich dwóch dekad wprowadzono szerokie spektrum eksperymentalnych strategii unaczynienia5,6.

Podejścia angiogenne stymulują wrastanie mikronaczyń biorczych w zmodyfikowane tkanki za pomocą strukturalnych lub fizykochemicznych modyfikacji rusztowań, takich jak włączenie czynników wzrostu7. Jednak w przypadku unaczynienia dużych trójwymiarowych konstruktów, strategie zależne od angiogenezy są znacznie ograniczone przez powolne tempo wzrostu rozwijających się mikronaczyń8.

Natomiast koncepcja prewaskularyzacji ma na celu wygenerowanie funkcjonalnych sieci mikronaczyniowych w obrębie struktur tkankowych przed ich implantacją9. Konwencjonalna prewaskularyzacja polega na kokulturze komórek tworzących naczynia, takich jak komórki śródbłonka, komórki ścienne lub komórki macierzyste10, w rusztowaniach. Po utworzeniu sieci mikronaczyniowej, prewaskularyzowane konstrukty mogą być następnie wszczepiane do ubytków tkankowych. Warto zauważyć, że to podejście prewaskularyzacyjne jest trudne do zastosowania w warunkach klinicznych, ponieważ opiera się na skomplikowanych i czasochłonnych procedurach in vitro, które są ograniczone przez główne przeszkody regulacyjne9. W związku z tym nadal istnieje potrzeba opracowania nowych strategii prewaskularyzacji, które są bardziej odpowiednie do szerokiego zastosowania klinicznego.

Taką strategią prewaskularyzacji może być zastosowanie fragmentów mikronaczyniowych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ad-MVF). ad-MVF reprezentują silne jednostki unaczynienia, które mogą być zbierane w dużych ilościach z tkanki tłuszczowej szczurów11,12 i myszy13. Składają się z segmentów naczyń tętniczych, naczyń włosowatych i komorowych, które wykazują fizjologiczną morfologię mikronaczyń ze światłem i stabilizującymi komórkami okołonaczyniowymi14,15. Ta unikalna cecha pozwala na natychmiastowe wszczepienie rusztowań wysiewanych ad MVF w ubytki tkanek bez wstępnej uprawy. Tam ad-MVF szybko łączą się w funkcjonalne sieci mikronaczyniowe. Ponadto ad-MVF stanowią bogate źródło mezenchymalnych komórek macierzystych16, co może dodatkowo przyczyniać się do ich uderzającej zdolności regeneracyjnej. W związku z tym ad-MVF są coraz częściej stosowane w różnych dziedzinach inżynierii tkankowej14,15,17,18,19,20,21.

Izolacja ad-MVF została pierwotnie ustanowiona w rats11,12. W niniejszym artykule opisujemy protokół, który pozwala na standaryzowaną izolację mysiego ad-MVF z poduszeczek tłuszczowych najądrza. Może to dostarczyć dalszych informacji na temat mechanizmów molekularnych leżących u podstaw funkcji ad-MVF przy użyciu transgenicznych modeli myszy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Narodowego Instytutu Zdrowia dotyczącymi wykorzystania zwierząt doświadczalnych i były zgodne z wytycznymi instytucjonalnymi (Landesamt für Soziales, Gesundheit und Verbraucherschutz, Abt. Lebensmittel- und Veterinärwesen, Zentralstelle, Saarbrücken, Niemcy).

1. Przygotowanie narzędzi chirurgicznych

  1. Przygotuj nożyczki do preparacji, kleszcze chirurgiczne, małe nożyczki przygotowawcze, cienkie kleszcze i sterylną szalkę Petriego z 15 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle firmy Dulbecco (DMEM; 10% płodowa surowica cielęca (FCS), 100 U/ml penicyliny, 0,1 mg/ml streptomycyny) do zbierania poduszeczek tłuszczowych najądrza.
  2. Wystawić narzędzia chirurgiczne na działanie roztworu dezynfekującego przez 5 minut. Alternatywnie wysterylizować je (sterylizacja parowa; 121 °C, 20 min).

2. Zwierzęta i anestezjologia

  1. Należy starannie wybrać szczep myszy, zgodnie ze wskazaniami dla badania i badanego obiektu.
    UWAGA: W tym badaniu wykorzystaliśmy samce myszy C57BL / 6 typu dzikiego jako dawców do zbierania tłuszczu najądrza. Co ciekawe, ad-MVF może być również izolowany od zwierząt dawców z dodatnim wynikiem transgenicznego białka zielonej fluorescencji (GFP) (C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)1Osb/J)22. Ma to tę główną zaletę, że fragmenty są łatwo wykrywalne przez barwienie immunohistochemiczne GFP po implantacji myszom typu dzikiego GFP-ujemnym14.
  2. Znieczulić zwierzęta za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia ksylazyny (15 mg/kg) i ketaminy (75 mg/kg). Upewnij się, że zwierzęta są głęboko znieczulone, wykonując szczypanie palca u nogi bez reakcji. Płyn do płukania oczu nie jest wskazany, ponieważ zwierzęta dawcy są uśmiercane po zbiorze tłuszczu.
    UWAGA: Upewnij się, że analgezja i sterylność chirurgiczna są zgodne z odpowiednimi wytycznymi kraju i instytucji, w której planowane są eksperymenty.

3. Pobieranie poduszek tłuszczowych najądrza

  1. Przenieś zwierzę na stół operacyjny. Umieść zwierzę w pozycji leżącej pod chirurgicznym mikroskopem stereoskopowym i potwierdź głębokie znieczulenie za pomocą uszczypnięcia palca u nogi.
  2. Unieruchomij łapy, przyklejając je taśmą do serwety chirurgicznej i zdezynfekuj brzuch roztworem dezynfekującym.
  3. Oddziel skórę brzucha od leżącej pod spodem warstwy mięśniowej za pomocą nożyczek preparacyjnych.
  4. Wykonaj laparotomię w linii środkowej za pomocą nożyczek preparacyjnych i rozłóż bocznie płaty ściany brzucha.
  5. Obustronnie zidentyfikuj jądro, najądrze i poduszeczkę tłuszczową najądrza za pomocą cienkich kleszczyków (ryc. 1). Nie uszkadzaj struktur jelitowych, aby zapobiec zanieczyszczeniu poduszek tłuszczowych kałem.
  6. Zbierz poduszeczki tłuszczowe najądrza małymi nożyczkami do przygotowania i cienkimi kleszkami pod mikroskopem stereoskopowym. Zachowaj kilkumilimetrowy margines bezpieczeństwa między najądrzem a tłuszczem, aby zmniejszyć ryzyko przypadkowego pobrania najądrza.
    UWAGA: Tę procedurę można również wykonać bez mikroskopu stereoskopowego. Może to jednak dodatkowo zwiększyć ryzyko przypadkowego uszkodzenia najądrza i powrózka nasiennego.
  7. Przenieść poduszeczki tłuszczowe najądrza na szalkę Petriego zawierającą 15 ml DMEM wstępnie podgrzanego w temperaturze 37 °C w celu transportu do laboratorium komórkowego.
  8. Zwierzę należy złożyć w ofierze przez nacięcie aorty brzusznej lub zwichnięcie szyjki macicy.

4. Izolacja ad-MVF

  1. Przygotować trzy sterylne szalki Petriego z 15 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), sterylnymi probówkami z polipropylenu (PP) o pojemności 14 ml, sterylną kolbą Erlenmeyera o pojemności 50 ml, sterylnymi stożkowymi probówkami do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i wysterylizowanymi drobnymi nożyczkami.
  2. Umyj poduszeczki tłuszczowe trzykrotnie na szalkach Petriego z 15 ml PBS pod okapem z przepływem laminarnym.
  3. Przenieś tłuszcz do probówki PP o pojemności 14 ml. Oznaczyć objętość pobranej tkanki tłuszczowej (w ml) za pomocą skali probówkowej. Tkankę tłuszczową zmielić mechanicznie cienkimi nożyczkami, aż do uzyskania jednorodnej zawiesiny tkankowej.
  4. Przenieść zmieloną tkankę z dwiema objętościami kolagenazy NB4G (0,5 U/ml PBS) do 50-mililitrowej kolby Erlenmeyera za pomocą 10-mililitrowej pipety miarowej. Całkowita objętość staje się trzykrotnie większa od objętości tkanki tłuszczowej zmierzonej w kroku 4.3. Przeprowadzać trawienie tkanek w inkubatorze przez 10 minut przy energicznym mieszaniu za pomocą automatycznego mieszadła (wielkość mieszadła magnetycznego: 25 mm) w temperaturze 37 °C i w wilgotnych warunkach atmosferycznych z 5% CO2 .
  5. Obserwuj niewielką frakcję (10 μl) strawionej tkanki pod mikroskopem, aby ocenić, czy trawienie można zatrzymać. Upewnij się, że poferment zawiera głównie "wolny" ad-MVF obok pojedynczych komórek, wskazując odpowiedni punkt do zatrzymania procesu trawienia enzymatycznego (ryc. 2).
    UWAGA: Ten krok wymaga doświadczenia w procedurze i ma kluczowe znaczenie dla jakości izolowanych reklam MVF. Przedłużone trawienie tłuszczu powoduje powstanie zawiesiny jednokomórkowej bez ad-MVF.
  6. Zneutralizować enzym za pomocą dwóch objętości PBS/20% FCS. Całkowita objętość staje się trzykrotnie większa od objętości zawiesiny naczynia komórkowego w kroku 4.4. Przenieś zawiesinę naczynia komórkowego z powrotem do nowych probówek PP.
  7. Inkubować zawiesinę przez 5 minut w temperaturze 37 °C w celu grawitacyjnego oddzielenia ad-MVF od pozostałego tłuszczu. Następnie ostrożnie usuń główny supernatant tłuszczu za pomocą pipety precyzyjnej o pojemności 1 ml. Powtórz ten cykl kilka razy za pomocą pipety precyzyjnej o pojemności 100 μl, aż zawiesina będzie wydawać się beztłuszczowa.
  8. Umieść filtr 500 μm na stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Przenieść zawiesinę naczynia komórkowego za pomocą pipety miarowej o pojemności 10 ml z probówek PP o pojemności 14 ml na membranę filtracyjną w celu usunięcia pozostałych skrzepów tłuszczu. Przefiltrowaną zawiesinę przenieść do nowych probówek PP o pojemności 14 ml zgodnie z liczbą indywidualnych izolatów ad-MVF dla planowanych eksperymentów.
    UWAGA: W przypadku testów in vitro koncentrujących się na tworzeniu sieci mikronaczyniowej korzystne może być dalsze oczyszczanie zawiesiny naczynia komórkowego w celu poprawy jakości obrazowania podczas analiz mikroskopowych. W tym celu zawiesinę można dodatkowo jednorazowo przefiltrować filtrem 20 μm w celu usunięcia pojedynczych komórek z ad-MVF zebranych na filtrze.
  9. Odwirować zawiesinę naczynia komórkowego (600 x g, 5 min, temperatura pokojowa) w celu uzyskania osadu zawierającego ad-MVF.
  10. Po odwirowaniu usunąć supernatant do momentu, aż pozostanie 1 ml. Ponownie zawiesić osad z ad-MVF w tym 1 ml i przenieść zawiesinę do stożkowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
  11. Odwirować zawiesinę ad-MVF w probówce do mikrowirówki (600 x g, 5 min) w celu uzyskania osadu.
  12. Usunąć supernatant w celu ponownego zawieszenia osadu w wymaganej końcowej objętości PBS / 20% FCS.
    UWAGA: Liczbę ad-MVF na izolat można ocenić za pomocą zliczania mikroskopowego. W tym celu 1/10 końcowej zawiesiny naczynia komórkowego rozcieńcza się w stosunku 1:10 w PBS, a 100 μl tego rozcieńczenia przenosi się do studzienki z 96-dołkową płytką. Cała liczba ad-MVF wykazujących morfologię podobną do naczynia jest następnie liczona i ekstrapolowana na cały izolat. Wymagane stężenie i oczyszczanie ad-MVF można indywidualnie dostosować do danego zastosowania ad MVF in vitro lub in vivo. Może to obejmować osadzanie ad-MVF w żelach kolagenowych w celu analizy in vitro tworzenia sieci mikronaczyniowych lub umieszczanie ad-MVF na rusztowaniach w celu implantacji in vivo do ubytków tkankowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W obecnym badaniu przeprowadziliśmy sześć procedur izolacji ad-MVF z tkanką tłuszczową od 7- do 12-miesięcznych samców myszy C57BL/6 typu dzikiego (średnia masa ciała: 35 ± 1 g). Rysunek 1 ilustruje pobieranie mysich poduszek tłuszczowych najądrza, a następnie mechaniczną i enzymatyczną izolację ad-MVF. Czas potrzebny na zebranie tłuszczu wynosił 30 minut, a na wyizolowanie ad-MVF 120 minut. W sumie zabieg trwał 150 minut.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszym badaniu przedstawiono sprawdzony protokół izolacji ad-MVF. Uzyskanie ad-MVF z mysiej tkanki tłuszczowej jest prostą procedurą składającą się z kilku krytycznych kroków. Myszy wykazują różne podskórne i śródbrzuszne złogi tłuszczu. Jak opisano wcześniej w przypadku szczurów, najbardziej odpowiednim źródłem tłuszczu do izolacji ad-MVF są poduszeczki tłuszczowe najądrzy ze względu na ich wielkość, jednorodną strukturę i minimalne zanieczyszczenie większymi naczyniami krwionośnymi11,12

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jesteśmy wdzięczni za doskonałą pomoc techniczną Janine Becker, Caroline Bickelmann i Ruth Nickels. Badanie zostało sfinansowane z grantu Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG - Niemiecka Fundacja Badawcza) - LA 2682/7-1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Stożkowa probówka do mikrowirówek 1,5 mlVWR, Kelsterbach, Niemcy700-5239
100-µ Pipeta precyzyjna LEppendorf, Hamburg, Niemcy4920000059
Pipeta pomiarowa 10 mlCostar, Corning Inc., Nowy Jork, USA4488
Probówki PP 14 mlGreiner bio-one, Frickenhausen, Niemcy187261
Pipeta precyzyjna 1 mlEppendorf, Hamburg, Niemcy4920000083
500-&mikro; m filtr (pluriStrainer 500 µ m)HISS Diagnostics, Fryburg, Niemcy43-50500-03
50-mL stożkowa probówka wirówkowaGreiner bio-one, Frickenhausen, Niemcy227261
50-mL kolba ErlenmeyeraVWR, Kelsterbach, Niemcy214-0211
96-dołkowa płytkaGreiner bio-one, Frickenhausen, Niemcy65518
roztwór do odrywania komórek (Accutase)eBioscience, San Diego, CA USA00-4555-56
C57BL/6 myszyCharles River, Kolonia, Niemcy027
C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)1Osb/Jmyszy The Jackson Laboratory, Bar Harbor, USA003291
CD117-FITCBD Biosciences, Heidelberg, Niemcy553373
CD31-PEBD Biosciences, Heidelberg, Niemcy553354
Kolagenaza NB4G Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Niemcy17465.02Partia przetestowana przez producenta pod kątem aktywności enzymatycznej
Nożyczki preparacyjneBraun Aesculap AG & CoKG, Melsungen, NiemcyBC 601
Barwnik wiążący DNA (Bisbenzimide H33342)Sigma-Aldrich, Taufkirchen, NiemcyB2261
Zmodyfikowane podłoże Eagle firmy Dulbecco (DMEM) PAN Biotech, Rickenbach, NiemcyP04-03600
Surowica cielęca płodu (FCS)Biochrom GmbH, Berlin, NiemcyS0615
Kleszcze drobnoziarnisteS& T AG, Neuhausen, SzwajcariaFRS-15 RM-8
Drobne nożyczkiWorld Precision Instrumets, Sarasota, FL, USA503261
Substytut skóry (Integra)Integra Life Sciences, Sain Priest, Francja62021
Ketamina Serumwerk Bernburg AG, Bernburg, Niemcy7005294
M-IgG2akAL488   eBioscience, San Diego, CA USA53-4724-80
Octeniderm (roztwór dezynfekujący)Schü lke & Mayer, Norderstedt, Niemcy118211
Penicylina/StreptomycynaBiochrom, Berlin, NiemcyA2213
szalka PetriegoGreiner bio-one, Frickenhausen, Niemcy664160
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Lonza Group, Bazylea, Szwajcaria17-516F
pluriSitko 20-&mikro; m (20 &mikro; m filter)HISS Diagnostics, Fryburg, Niemcy43-50020-03
Rat-IgG2akFITCBD Biosciences, Heidelberg, Niemcy553988
Rat-IgG2akPEBD Biosciences, Heidelberg, Niemcy553930
Małe nożyczki preparacyjneS& T AG, Neuhausen, SzwajcariaSDC-15 R-8S
Kleszcze chirurgiczneBraun Aesculap AG & CoKG, Melsungen, NiemcyTaśma BD510R
(Heftpflaster Seide) 1,25 cmFink & Walter GmbH, Mechweiler, Niemcy1671801
Xylazine Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Niemcy1320422
α-SMA-AL488eBioscience, San Diego, CA USA53-9760-82Znakowanie wewnątrzkomórkowe dodatkowo wymaga Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences, Heidelberg, Niemcy; #554722)

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Langer, R., Vacanti, J. P. Tissue engineering. Science. 260 (5110), 920-926 (1993).
  2. Khademhosseini, A., Langer, R. A decade of progress in tissue engineering. Nat Protoc. 11 (10), 1775-1781 (2016).
  3. Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J. Vascularization is the key challenge in tissue engineering. Adv Drug Deliv Rev. 63 (4-5), 300-311 (2011).
  4. Rouwkema, J., Khademhosseini, A. Vascularization and Angiogenesis in Tissue Engineering: Beyond Creating Static Networks. Trends Biotechnol. 34 (9), 733-745 (2016).
  5. Laschke, M. W., Menger, M. D. Vascularization in tissue engineering: angiogenesis versus inosculation. Eur Surg Res. 48 (2), 85-92 (2012).
  6. Sarker, M., Chen, X. B., Schreyer, D. J. Experimental approaches to vascularisation within tissue engineering constructs. J Biomater Sci Polym Ed. 26 (12), 683-734 (2015).
  7. Frueh, F. S., Menger, M. D., Lindenblatt, N., Giovanoli, P., Laschke, M. W. Current and emerging vascularization strategies in skin tissue engineering. Crit Rev Biotechnol. 20, 1-13 (2016).
  8. Utzinger, U., Baggett, B., Weiss, J. A., Hoying, J. B., Edgar, L. T. Large-scale time series microscopy of neovessel growth during angiogenesis. Angiogenesis. 18 (3), 219-232 (2015).
  9. Laschke, M. W., Menger, M. D. Prevascularization in tissue engineering: Current concepts and future directions. Biotechnol Adv. 34 (2), 112-121 (2016).
  10. Baiguera, S., Ribatti, D. Endothelialization approaches for viable engineered tissues. Angiogenesis. 16 (1), 1-14 (2013).
  11. Wagner, R. C., Kreiner, P., Barrnett, R. J., Bitensky, M. W. Biochemical characterization and cytochemical localization of a catecholamine-sensitive adenylate cyclase in isolated capillary endothelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 69 (11), 3175-3179 (1972).
  12. Wagner, R. C., Matthews, M. A. The isolation and culture of capillary endothelium from epididymal fat. Microvasc Res. 10 (3), 286-297 (1975).
  13. Laschke, M. W., Menger, M. D. Adipose tissue-derived microvascular fragments: natural vascularization units for regenerative medicine. Trends Biotechnol. 33 (8), 442-448 (2015).
  14. Laschke, M. W., et al. Vascularisation of porous scaffolds is improved by incorporation of adipose tissue-derived microvascular fragments. Eur Cell Mater. 24, 266-277 (2012).
  15. Frueh, F. S., et al. Adipose tissue-derived microvascular fragments improve vascularization, lymphangiogenesis and integration of dermal skin substitutes. J Invest Dermatol. 137 (1), 217-227 (2017).
  16. McDaniel, J. S., Pilia, M., Ward, C. L., Pollot, B. E., Rathbone, C. R. Characterization and multilineage potential of cells derived from isolated microvascular fragments. J Surg Res. 192 (1), 214-222 (2014).
  17. Nakano, M., et al. Effect of autotransplantation of microvessel fragments on experimental random-pattern flaps in the rat. Eur Surg Res. 30 (3), 149-160 (1998).
  18. Nakano, M., et al. Successful autotransplantation of microvessel fragments into the rat heart. Eur Surg Res. 31 (3), 240-248 (1999).
  19. Shepherd, B. R., Hoying, J. B., Williams, S. K. Microvascular transplantation after acute myocardial infarction. Tissue Eng. 13 (12), 2871-2879 (2007).
  20. Pilia, M., et al. Transplantation and perfusion of microvascular fragments in a rodent model of volumetric muscle loss injury. Eur Cell Mater. 28, 11-23 (2014).
  21. Laschke, M. W., et al. Adipose tissue-derived microvascular fragments from aged donors exhibit an impaired vascularisation capacity. Eur Cell Mater. 28, 287-298 (2015).
  22. Okabe, M., Ikawa, M., Kominami, K., Nakanishi, T., Nishimune, Y. 'Green mice' as a source of ubiquitous green cells. FEBS Lett. 407 (3), 313-319 (1997).
  23. Honek, J., et al. Modulation of age-related insulin sensitivity by VEGF-dependent vascular plasticity in adipose tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (41), 14906-14911 (2014).
  24. Cho, C. H., et al. Angiogenic role of LYVE-1-positive macrophages in adipose tissue. Circ Res. 100 (4), e47-e57 (2007).
  25. Han, S., Sun, H. M., Hwang, K. C., Kim, S. W. Adipose-Derived Stromal Vascular Fraction Cells: Update on Clinical Utility and Efficacy. Crit Rev Eukaryot Gene Expr. 25 (2), 145-152 (2015).
  26. Chen, Y. J., et al. Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues. J Vis Exp. (109), e53886(2016).
  27. Guillaume-Jugnot, P., et al. Autologous adipose-derived stromal vascular fraction in patients with systemic sclerosis: 12-month follow-up. Rheumatology (Oxford). 55 (2), 301-306 (2016).
  28. Tissiani, L. A., Alonso, N. A Prospective and Controlled Clinical Trial on Stromal Vascular Fraction Enriched Fat Grafts in Secondary Breast Reconstruction. Stem Cells Int. , 2636454(2016).
  29. Calcagni, M., et al. The novel treatment of SVF-enriched fat grafting for painful end-neuromas of superficial radial nerve. Microsurgery. , (2016).
  30. Hoying, J. B., Boswell, C. A., Williams, S. K. Angiogenic potential of microvessel fragments established in three-dimensional collagen gels. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 32 (7), 409-419 (1996).
  31. Kirkpatrick, N. D., Andreou, S., Hoying, J. B., Utzinger, U. Live imaging of collagen remodeling during angiogenesis. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 292 (6), H3198-H3206 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja tkanki t uszczowejizolacja enzymatycznacytometria przep ywowakom rki CD31 dodatniemezenchymalne kom rki macierzystetkanka t uszczowa myszytrawienie kolagenaz

Powiązane artykuły