Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja fragmentów mikronaczyniowych pochodzących z mysiej tkanki tłuszczowej jako jednostek unaczynienia dla inżynierii tkankowej

12.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55721

⸱

30 kwietnia 2017

 ,  ,  ,  , 
1Institute for Clinical and Experimental Surgery, Saarland University, 2Division of Plastic Surgery and Hand Surgery, University Hospital Zurich, University of Zurich

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy protokół izolowania fragmentów mikronaczyniowych pochodzących z tkanki tłuszczowej, które reprezentują obiecujące jednostki unaczynienia. Można je szybko wyizolować, nie wymagają przetwarzania in vitro, a tym samym mogą być stosowane do jednoetapowej prewaskularyzacji w różnych dziedzinach inżynierii tkankowej.

Streszczenie

Funkcjonalna sieć mikronaczyniowa ma kluczowe znaczenie dla przetrwania i integracji inżynieryjnych konstruktów tkankowych. W tym celu ustalono kilka strategii angiogennych i prewaskularyzacyjnych. Jednak większość podejść opartych na komórkach obejmuje czasochłonne etapy in vitro w celu utworzenia sieci mikronaczyniowej. W związku z tym nie nadają się do śródoperacyjnych zabiegów jednoetapowych. Fragmenty mikrokrążenia pochodzące z tkanki tłuszczowej (ad-MVF) stanowią obiecujące jednostki unaczynienia. Można je łatwo wyizolować z tkanki tłuszczowej i wykazują funkcjonalną morfologię mikronaczyń. Co więcej, po implantacji in vivo szybko łączą się w nowe sieci mikronaczyniowe. Ponadto wykazano, że ad-MVF indukuje limfangiogenezę. Wreszcie, są bogatym źródłem mezenchymalnych komórek macierzystych, co może dodatkowo przyczyniać się do ich wysokiego potencjału unaczynienia. W poprzednich badaniach wykazaliśmy niezwykłą zdolność unaczynienia ad-MVF w zmodyfikowanych substytutach kości i skóry. W niniejszym badaniu przedstawiono znormalizowany protokół enzymatycznej izolacji ad-MVF z mysiej tkanki tłuszczowej.

Wprowadzenie

Inżynieria tkankowa skupia się na wytwarzaniu substytutów tkanek i narządów, które utrzymują, przywracają lub rozszerzają funkcję niedziałających odpowiedników in vivo1,2. Los inżynieryjnych konstruktów tkankowych zależy w dużej mierze od odpowiedniego unaczynienia3. Sieci mikronaczyniowe w tych konstrukcjach powinny być hierarchicznie zorganizowane z tętniczkami, naczyniami włosowatymi i żyłkami, aby umożliwić efektywną perfuzję krwi po inokulacji do układu naczyniowego biorcy4. Tworzenie takich sieci jest jednym z kluczowych wyzwań w inżynierii tkankowej. W tym celu w ciągu ostatnich dwóch dekad wprowadzono szerokie spektrum eksperymentalnych strategii unaczynienia5,6.

Podejścia angiogenne stymulują wrastanie mikronaczyń biorczych w zmodyfikowane tkanki za pomocą strukturalnych lub fizykochemicznych modyfikacji rusztowań, takich jak włączenie czynników wzrostu7. Jednak w przypadku unaczynienia dużych trójwymiarowych konstruktów, strategie zależne od angiogenezy są znacznie ograniczone przez powolne tempo wzrostu rozwijających się mikronaczyń8.

Natomiast koncepcja prewaskularyzacji ma na celu wygenerowanie funkcjonalnych sieci mikronaczyniowych w obrębie struktur tkankowych przed ich implantacją9. Konwencjonalna prewaskularyzacja polega na kokulturze komórek tworzących naczynia, takich jak komórki śródbłonka, komórki ścienne lub komórki macierzyste10, w rusztowaniach. Po utworzeniu sieci mikronaczyniowej, prewaskularyzowane konstrukty mogą być następnie wszczepiane do ubytków tkankowych. Warto zauważyć, że to podejście prewaskularyzacyjne jest trudne do zastosowania w warunkach klinicznych, ponieważ opiera się na skomplikowanych i czasochłonnych procedurach in vitro, które są ograniczone przez główne przeszkody regulacyjne9. W związku z tym nadal istnieje potrzeba opracowania nowych strategii prewaskularyzacji, które są bardziej odpowiednie do szerokiego zastosowania klinicznego.

Taką strategią prewaskularyzacji może być zastosowanie fragmentów mikronaczyniowych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ad-MVF). ad-MVF reprezentują silne jednostki unaczynienia, które mogą być zbierane w dużych ilościach z tkanki tłuszczowej szczurów11,12 i myszy13. Składają się z segmentów naczyń tętniczych, naczyń włosowatych i komorowych, które wykazują fizjologiczną morfologię mikronaczyń ze światłem i stabilizującymi komórkami okołonaczyniowymi14,15. Ta unikalna cecha pozwala na natychmiastowe wszczepienie rusztowań wysiewanych ad MVF w ubytki tkanek bez wstępnej uprawy. Tam ad-MVF szybko łączą się w funkcjonalne sieci mikronaczyniowe. Ponadto ad-MVF stanowią bogate źródło mezenchymalnych komórek macierzystych16, co może dodatkowo przyczyniać się do ich uderzającej zdolności regeneracyjnej. W związku z tym ad-MVF są coraz częściej stosowane w różnych dziedzinach inżynierii tkankowej14,15,17,18,19,20,21.

Izolacja ad-MVF została pierwotnie ustanowiona w rats11,12. W niniejszym artykule opisujemy protokół, który pozwala na standaryzowaną izolację mysiego ad-MVF z poduszeczek tłuszczowych najądrza. Może to dostarczyć dalszych informacji na temat mechanizmów molekularnych leżących u podstaw funkcji ad-MVF przy użyciu transgenicznych modeli myszy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Narodowego Instytutu Zdrowia dotyczącymi wykorzystania zwierząt doświadczalnych i były zgodne z wytycznymi instytucjonalnymi (Landesamt für Soziales, Gesundheit und Verbraucherschutz, Abt. Lebensmittel- und Veterinärwesen, Zentralstelle, Saarbrücken, Niemcy).

1. Przygotowanie narzędzi chirurgicznych

  1. Przygotuj nożyczki do preparacji, kleszcze chirurgiczne, małe nożyczki przygotowawcze, cienkie kleszcze i sterylną szalkę Petriego z 15 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle firmy Dulbecco (DMEM; 10% płodowa surowica cielęca (FCS), 100 U/ml penicyliny, 0,1 mg/ml streptomycyny) do zbierania poduszeczek tłuszczowych najądrza.
  2. Wystawić narzędzia chirurgiczne na działanie roztworu dezynfekującego przez 5 minut. Alternatywnie wysterylizować je (sterylizacja parowa; 121 °C, 20 min).

2. Zwierzęta i anestezjologia

  1. Należy starannie wybrać szczep myszy, zgodnie ze wskazaniami dla badania i badanego obiektu.
    UWAGA: W tym badaniu wykorzystaliśmy samce myszy C57BL / 6 typu dzikiego jako dawców do zbierania tłuszczu najądrza. Co ciekawe, ad-MVF może być również izolowany od zwierząt dawców z dodatnim wynikiem transgenicznego białka zielonej fluorescencji (GFP) (C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)1Osb/J)22. Ma to tę główną zaletę, że fragmenty są łatwo wykrywalne przez barwienie immunohistochemiczne GFP po implantacji myszom typu dzikiego GFP-ujemnym14.
  2. Znieczulić zwierzęta za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia ksylazyny (15 mg/kg) i ketaminy (75 mg/kg). Upewnij się, że zwierzęta są głęboko znieczulone, wykonując szczypanie palca u nogi bez reakcji. Płyn do płukania oczu nie jest wskazany, ponieważ zwierzęta dawcy są uśmiercane po zbiorze tłuszczu.
    UWAGA: Upewnij się, że analgezja i sterylność chirurgiczna są zgodne z odpowiednimi wytycznymi kraju i instytucji, w której planowane są eksperymenty.

3. Pobieranie poduszek tłuszczowych najądrza

  1. Przenieś zwierzę na stół operacyjny. Umieść zwierzę w pozycji leżącej pod chirurgicznym mikroskopem stereoskopowym i potwierdź głębokie znieczulenie za pomocą uszczypnięcia palca u nogi.
  2. Unieruchomij łapy, przyklejając je taśmą do serwety chirurgicznej i zdezynfekuj brzuch roztworem dezynfekującym.
  3. Oddziel skórę brzucha od leżącej pod spodem warstwy mięśniowej za pomocą nożyczek preparacyjnych.
  4. Wykonaj laparotomię w linii środkowej za pomocą nożyczek preparacyjnych i rozłóż bocznie płaty ściany brzucha.
  5. Obustronnie zidentyfikuj jądro, najądrze i poduszeczkę tłuszczową najądrza za pomocą cienkich kleszczyków (ryc. 1). Nie uszkadzaj struktur jelitowych, aby zapobiec zanieczyszczeniu poduszek tłuszczowych kałem.
  6. Zbierz poduszeczki tłuszczowe najądrza małymi nożyczkami do przygotowania i cienkimi kleszkami pod mikroskopem stereoskopowym. Zachowaj kilkumilimetrowy margines bezpieczeństwa między najądrzem a tłuszczem, aby zmniejszyć ryzyko przypadkowego pobrania najądrza.
    UWAGA: Tę procedurę można również wykonać bez mikroskopu stereoskopowego. Może to jednak dodatkowo zwiększyć ryzyko przypadkowego uszkodzenia najądrza i powrózka nasiennego.
  7. Przenieść poduszeczki tłuszczowe najądrza na szalkę Petriego zawierającą 15 ml DMEM wstępnie podgrzanego w temperaturze 37 °C w celu transportu do laboratorium komórkowego.
  8. Zwierzę należy złożyć w ofierze przez nacięcie aorty brzusznej lub zwichnięcie szyjki macicy.

4. Izolacja ad-MVF

  1. Przygotować trzy sterylne szalki Petriego z 15 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), sterylnymi probówkami z polipropylenu (PP) o pojemności 14 ml, sterylną kolbą Erlenmeyera o pojemności 50 ml, sterylnymi stożkowymi probówkami do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i wysterylizowanymi drobnymi nożyczkami.
  2. Umyj poduszeczki tłuszczowe trzykrotnie na szalkach Petriego z 15 ml PBS pod okapem z przepływem laminarnym.
  3. Przenieś tłuszcz do probówki PP o pojemności 14 ml. Oznaczyć objętość pobranej tkanki tłuszczowej (w ml) za pomocą skali probówkowej. Tkankę tłuszczową zmielić mechanicznie cienkimi nożyczkami, aż do uzyskania jednorodnej zawiesiny tkankowej.
  4. Przenieść zmieloną tkankę z dwiema objętościami kolagenazy NB4G (0,5 U/ml PBS) do 50-mililitrowej kolby Erlenmeyera za pomocą 10-mililitrowej pipety miarowej. Całkowita objętość staje się trzykrotnie większa od objętości tkanki tłuszczowej zmierzonej w kroku 4.3. Przeprowadzać trawienie tkanek w inkubatorze przez 10 minut przy energicznym mieszaniu za pomocą automatycznego mieszadła (wielkość mieszadła magnetycznego: 25 mm) w temperaturze 37 °C i w wilgotnych warunkach atmosferycznych z 5% CO2 .
  5. Obserwuj niewielką frakcję (10 μl) strawionej tkanki pod mikroskopem, aby ocenić, czy trawienie można zatrzymać. Upewnij się, że poferment zawiera głównie "wolny" ad-MVF obok pojedynczych komórek, wskazując odpowiedni punkt do zatrzymania procesu trawienia enzymatycznego (ryc. 2).
    UWAGA: Ten krok wymaga doświadczenia w procedurze i ma kluczowe znaczenie dla jakości izolowanych reklam MVF. Przedłużone trawienie tłuszczu powoduje powstanie zawiesiny jednokomórkowej bez ad-MVF.
  6. Zneutralizować enzym za pomocą dwóch objętości PBS/20% FCS. Całkowita objętość staje się trzykrotnie większa od objętości zawiesiny naczynia komórkowego w kroku 4.4. Przenieś zawiesinę naczynia komórkowego z powrotem do nowych probówek PP.
  7. Inkubować zawiesinę przez 5 minut w temperaturze 37 °C w celu grawitacyjnego oddzielenia ad-MVF od pozostałego tłuszczu. Następnie ostrożnie usuń główny supernatant tłuszczu za pomocą pipety precyzyjnej o pojemności 1 ml. Powtórz ten cykl kilka razy za pomocą pipety precyzyjnej o pojemności 100 μl, aż zawiesina będzie wydawać się beztłuszczowa.
  8. Umieść filtr 500 μm na stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Przenieść zawiesinę naczynia komórkowego za pomocą pipety miarowej o pojemności 10 ml z probówek PP o pojemności 14 ml na membranę filtracyjną w celu usunięcia pozostałych skrzepów tłuszczu. Przefiltrowaną zawiesinę przenieść do nowych probówek PP o pojemności 14 ml zgodnie z liczbą indywidualnych izolatów ad-MVF dla planowanych eksperymentów.
    UWAGA: W przypadku testów in vitro koncentrujących się na tworzeniu sieci mikronaczyniowej korzystne może być dalsze oczyszczanie zawiesiny naczynia komórkowego w celu poprawy jakości obrazowania podczas analiz mikroskopowych. W tym celu zawiesinę można dodatkowo jednorazowo przefiltrować filtrem 20 μm w celu usunięcia pojedynczych komórek z ad-MVF zebranych na filtrze.
  9. Odwirować zawiesinę naczynia komórkowego (600 x g, 5 min, temperatura pokojowa) w celu uzyskania osadu zawierającego ad-MVF.
  10. Po odwirowaniu usunąć supernatant do momentu, aż pozostanie 1 ml. Ponownie zawiesić osad z ad-MVF w tym 1 ml i przenieść zawiesinę do stożkowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
  11. Odwirować zawiesinę ad-MVF w probówce do mikrowirówki (600 x g, 5 min) w celu uzyskania osadu.
  12. Usunąć supernatant w celu ponownego zawieszenia osadu w wymaganej końcowej objętości PBS / 20% FCS.
    UWAGA: Liczbę ad-MVF na izolat można ocenić za pomocą zliczania mikroskopowego. W tym celu 1/10 końcowej zawiesiny naczynia komórkowego rozcieńcza się w stosunku 1:10 w PBS, a 100 μl tego rozcieńczenia przenosi się do studzienki z 96-dołkową płytką. Cała liczba ad-MVF wykazujących morfologię podobną do naczynia jest następnie liczona i ekstrapolowana na cały izolat. Wymagane stężenie i oczyszczanie ad-MVF można indywidualnie dostosować do danego zastosowania ad MVF in vitro lub in vivo. Może to obejmować osadzanie ad-MVF w żelach kolagenowych w celu analizy in vitro tworzenia sieci mikronaczyniowych lub umieszczanie ad-MVF na rusztowaniach w celu implantacji in vivo do ubytków tkankowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W niniejszym badaniu przeprowadzono sześć procedur izolacji ad-MVF z tkanki tłuszczowej samców myszy szczepu C57BL/6 typu dzikiego w wieku od 7 do 12 miesięcy (średnia masa ciała: 35 ± 1 g). Rysunek 1 przedstawia pobieranie tłuszczowych poduszek nadjajdzielnych myszy z późniejszą mechaniczną i enzymatyczną izolacją ad-MVF. Czas wymagany do pobrania tłuszczu wyniósł 30 min, a izolacja ad-MVF trwała 120 min. Łącznie procedura zajęła 150 min.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W niniejszym badaniu przedstawiono sprawdzony protokół izolacji ad-MVF. Uzyskanie ad-MVF z mysiej tkanki tłuszczowej jest prostą procedurą składającą się z kilku krytycznych kroków. Myszy wykazują różne podskórne i śródbrzuszne złogi tłuszczu. Jak opisano wcześniej w przypadku szczurów, najbardziej odpowiednim źródłem tłuszczu do izolacji ad-MVF są poduszeczki tłuszczowe najądrzy ze względu na ich wielkość, jednorodną strukturę i minimalne zanieczyszczenie większymi naczyniami krwionośnymi11,12

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Jesteśmy wdzięczni za doskonałą pomoc techniczną Janine Becker, Caroline Bickelmann i Ruth Nickels. Badanie zostało sfinansowane z grantu Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG - Niemiecka Fundacja Badawcza) - LA 2682/7-1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Stożkowa probówka do mikrowirówek 1,5 mlVWR, Kelsterbach, Niemcy700-5239
100-µ Pipeta precyzyjna LEppendorf, Hamburg, Niemcy4920000059
Pipeta pomiarowa 10 mlCostar, Corning Inc., Nowy Jork, USA4488
Probówki PP 14 mlGreiner bio-one, Frickenhausen, Niemcy187261
Pipeta precyzyjna 1 mlEppendorf, Hamburg, Niemcy4920000083
500-&mikro; m filtr (pluriStrainer 500 µ m)HISS Diagnostics, Fryburg, Niemcy43-50500-03
50-mL stożkowa probówka wirówkowaGreiner bio-one, Frickenhausen, Niemcy227261
50-mL kolba ErlenmeyeraVWR, Kelsterbach, Niemcy214-0211
96-dołkowa płytkaGreiner bio-one, Frickenhausen, Niemcy65518
roztwór do odrywania komórek (Accutase)eBioscience, San Diego, CA USA00-4555-56
C57BL/6 myszyCharles River, Kolonia, Niemcy027
C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)1Osb/Jmyszy The Jackson Laboratory, Bar Harbor, USA003291
CD117-FITCBD Biosciences, Heidelberg, Niemcy553373
CD31-PEBD Biosciences, Heidelberg, Niemcy553354
Kolagenaza NB4G Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Niemcy17465.02Partia przetestowana przez producenta pod kątem aktywności enzymatycznej
Nożyczki preparacyjneBraun Aesculap AG & CoKG, Melsungen, NiemcyBC 601
Barwnik wiążący DNA (Bisbenzimide H33342)Sigma-Aldrich, Taufkirchen, NiemcyB2261
Zmodyfikowane podłoże Eagle firmy Dulbecco (DMEM) PAN Biotech, Rickenbach, NiemcyP04-03600
Surowica cielęca płodu (FCS)Biochrom GmbH, Berlin, NiemcyS0615
Kleszcze drobnoziarnisteS& T AG, Neuhausen, SzwajcariaFRS-15 RM-8
Drobne nożyczkiWorld Precision Instrumets, Sarasota, FL, USA503261
Substytut skóry (Integra)Integra Life Sciences, Sain Priest, Francja62021
Ketamina Serumwerk Bernburg AG, Bernburg, Niemcy7005294
M-IgG2akAL488   eBioscience, San Diego, CA USA53-4724-80
Octeniderm (roztwór dezynfekujący)Schü lke & Mayer, Norderstedt, Niemcy118211
Penicylina/StreptomycynaBiochrom, Berlin, NiemcyA2213
szalka PetriegoGreiner bio-one, Frickenhausen, Niemcy664160
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Lonza Group, Bazylea, Szwajcaria17-516F
pluriSitko 20-&mikro; m (20 &mikro; m filter)HISS Diagnostics, Fryburg, Niemcy43-50020-03
Rat-IgG2akFITCBD Biosciences, Heidelberg, Niemcy553988
Rat-IgG2akPEBD Biosciences, Heidelberg, Niemcy553930
Małe nożyczki preparacyjneS& T AG, Neuhausen, SzwajcariaSDC-15 R-8S
Kleszcze chirurgiczneBraun Aesculap AG & CoKG, Melsungen, NiemcyTaśma BD510R
(Heftpflaster Seide) 1,25 cmFink & Walter GmbH, Mechweiler, Niemcy1671801
Xylazine Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Niemcy1320422
α-SMA-AL488eBioscience, San Diego, CA USA53-9760-82Znakowanie wewnątrzkomórkowe dodatkowo wymaga Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences, Heidelberg, Niemcy; #554722)

Bibliografia

  1. Langer, R., Vacanti, J. P. Tissue engineering. Science. 260 (5110), 920-926 (1993).
  2. Khademhosseini, A., Langer, R. A decade of progress in tissue engineering. Nat Protoc. 11 (10), 1775-1781 (2016).
  3. Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J. Vascularization is the key challenge in tissue engineering. Adv Drug Deliv Rev. 63 (4-5), 300-311 (2011).
  4. Rouwkema, J., Khademhosseini, A. Vascularization and Angiogenesis in Tissue Engineering: Beyond Creating Static Networks. Trends Biotechnol. 34 (9), 733-745 (2016).
  5. Laschke, M. W., Menger, M. D. Vascularization in tissue engineering: angiogenesis versus inosculation. Eur Surg Res. 48 (2), 85-92 (2012).
  6. Sarker, M., Chen, X. B., Schreyer, D. J. Experimental approaches to vascularisation within tissue engineering constructs. J Biomater Sci Polym Ed. 26 (12), 683-734 (2015).
  7. Frueh, F. S., Menger, M. D., Lindenblatt, N., Giovanoli, P., Laschke, M. W. Current and emerging vascularization strategies in skin tissue engineering. Crit Rev Biotechnol. 20, 1-13 (2016).
  8. Utzinger, U., Baggett, B., Weiss, J. A., Hoying, J. B., Edgar, L. T. Large-scale time series microscopy of neovessel growth during angiogenesis. Angiogenesis. 18 (3), 219-232 (2015).
  9. Laschke, M. W., Menger, M. D. Prevascularization in tissue engineering: Current concepts and future directions. Biotechnol Adv. 34 (2), 112-121 (2016).
  10. Baiguera, S., Ribatti, D. Endothelialization approaches for viable engineered tissues. Angiogenesis. 16 (1), 1-14 (2013).
  11. Wagner, R. C., Kreiner, P., Barrnett, R. J., Bitensky, M. W. Biochemical characterization and cytochemical localization of a catecholamine-sensitive adenylate cyclase in isolated capillary endothelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 69 (11), 3175-3179 (1972).
  12. Wagner, R. C., Matthews, M. A. The isolation and culture of capillary endothelium from epididymal fat. Microvasc Res. 10 (3), 286-297 (1975).
  13. Laschke, M. W., Menger, M. D. Adipose tissue-derived microvascular fragments: natural vascularization units for regenerative medicine. Trends Biotechnol. 33 (8), 442-448 (2015).
  14. Laschke, M. W., et al. Vascularisation of porous scaffolds is improved by incorporation of adipose tissue-derived microvascular fragments. Eur Cell Mater. 24, 266-277 (2012).
  15. Frueh, F. S., et al. Adipose tissue-derived microvascular fragments improve vascularization, lymphangiogenesis and integration of dermal skin substitutes. J Invest Dermatol. 137 (1), 217-227 (2017).
  16. McDaniel, J. S., Pilia, M., Ward, C. L., Pollot, B. E., Rathbone, C. R. Characterization and multilineage potential of cells derived from isolated microvascular fragments. J Surg Res. 192 (1), 214-222 (2014).
  17. Nakano, M., et al. Effect of autotransplantation of microvessel fragments on experimental random-pattern flaps in the rat. Eur Surg Res. 30 (3), 149-160 (1998).
  18. Nakano, M., et al. Successful autotransplantation of microvessel fragments into the rat heart. Eur Surg Res. 31 (3), 240-248 (1999).
  19. Shepherd, B. R., Hoying, J. B., Williams, S. K. Microvascular transplantation after acute myocardial infarction. Tissue Eng. 13 (12), 2871-2879 (2007).
  20. Pilia, M., et al. Transplantation and perfusion of microvascular fragments in a rodent model of volumetric muscle loss injury. Eur Cell Mater. 28, 11-23 (2014).
  21. Laschke, M. W., et al. Adipose tissue-derived microvascular fragments from aged donors exhibit an impaired vascularisation capacity. Eur Cell Mater. 28, 287-298 (2015).
  22. Okabe, M., Ikawa, M., Kominami, K., Nakanishi, T., Nishimune, Y. 'Green mice' as a source of ubiquitous green cells. FEBS Lett. 407 (3), 313-319 (1997).
  23. Honek, J., et al. Modulation of age-related insulin sensitivity by VEGF-dependent vascular plasticity in adipose tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (41), 14906-14911 (2014).
  24. Cho, C. H., et al. Angiogenic role of LYVE-1-positive macrophages in adipose tissue. Circ Res. 100 (4), e47-e57 (2007).
  25. Han, S., Sun, H. M., Hwang, K. C., Kim, S. W. Adipose-Derived Stromal Vascular Fraction Cells: Update on Clinical Utility and Efficacy. Crit Rev Eukaryot Gene Expr. 25 (2), 145-152 (2015).
  26. Chen, Y. J., et al. Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues. J Vis Exp. (109), e53886(2016).
  27. Guillaume-Jugnot, P., et al. Autologous adipose-derived stromal vascular fraction in patients with systemic sclerosis: 12-month follow-up. Rheumatology (Oxford). 55 (2), 301-306 (2016).
  28. Tissiani, L. A., Alonso, N. A Prospective and Controlled Clinical Trial on Stromal Vascular Fraction Enriched Fat Grafts in Secondary Breast Reconstruction. Stem Cells Int. , 2636454(2016).
  29. Calcagni, M., et al. The novel treatment of SVF-enriched fat grafting for painful end-neuromas of superficial radial nerve. Microsurgery. , (2016).
  30. Hoying, J. B., Boswell, C. A., Williams, S. K. Angiogenic potential of microvessel fragments established in three-dimensional collagen gels. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 32 (7), 409-419 (1996).
  31. Kirkpatrick, N. D., Andreou, S., Hoying, J. B., Utzinger, U. Live imaging of collagen remodeling during angiogenesis. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 292 (6), H3198-H3206 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Izolacja tkanki t uszczowejizolacja enzymatycznacytometria przep ywowakom rki CD31 dodatniemezenchymalne kom rki macierzystetkanka t uszczowa myszytrawienie kolagenaz
Izolacja fragmentów mikronaczyniowych pochodzących z mysiej tkanki tłuszczowej jako jednostek unaczynienia dla inżynierii tkankowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.