Mysie plastry serca o krótkiej osi do badań elektrofizjologicznych

Podsumowanie

Tutaj opisujemy przygotowanie żywotnych wycinków komorowych od dorosłych myszy i ich wykorzystanie do rejestracji potencjału czynnościowego elektrod ostrych. Te wielokomórkowe preparaty zapewniają zachowaną in vivo strukturę tkankową, co czyni je cennym modelem do badań elektrofizjologicznych i farmakologicznych in vitro.

Streszczenie

Mysie kardiomiocyty były szeroko wykorzystywane do badań in vitro fizjologii serca i nowych strategii terapeutycznych. Jednak wielokomórkowe preparaty zdysocjowanych kardiomiocytów nie są reprezentatywne dla złożonej struktury in vivo kardiomiocytów, niemiocytów i macierzy zewnątrzkomórkowej, która wpływa zarówno na właściwości mechaniczne, jak i elektrofizjologiczne serca. W tym miejscu opisujemy technikę przygotowania żywotnych wycinków komorowych serc dorosłych myszy o zachowanej strukturze tkankowej podobnej do in vivo i wykazujemy ich przydatność do zapisów elektrofizjologicznych. Po wycięciu serca komory są oddzielane od przedsionków, perfundowane roztworem wolnym od Ca²⁺ zawierającym monoksym 2,3-butanodionu i zatopione w 4% niskotopliwym bloku agarozowym. Blok umieszcza się na mikrotomie z wibrującym ostrzem, a plastry tkanki o grubości 150-400 μm przygotowuje się, utrzymując częstotliwość drgań ostrza na poziomie 60-70 Hz i przesuwając ostrze do przodu tak wolno, jak to możliwe. Grubość plastrów zależy od dalszej aplikacji. Plastry są przechowywane w lodowatym roztworze Tyrode'a z 0,9 mM Ca²⁺ i monoksymem 2,3-butanodionu (BDM) przez 30 minut. Następnie plastry przenosi się do DMEM o temperaturze 37 °C na 30 minut w celu wypłukania BDM. Plastry mogą być używane do badań elektrofizjologicznych z ostrymi elektrodami lub układami mikroelektrod, do pomiarów siły w celu analizy funkcji skurczu lub do zbadania interakcji przeszczepionych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych a tkanką gospodarza. W celu uzyskania ostrych zapisów elektrodowych plaster umieszcza się w 3-centymetrowym naczyniu do hodowli komórkowej na płycie grzewczej odwróconego mikroskopu. Wycinek jest stymulowany elektrodą jednobiegunową, a wewnątrzkomórkowe potencjały czynnościowe kardiomiocytów w obrębie wycinka są rejestrowane za pomocą ostrej elektrody szklanej.

Wprowadzenie

Cienkie plasterki tkanki były często używane w naukach podstawowych, odkąd Yamamot i Mcllwain wykazali w 1966 roku, że aktywność elektryczna wycinków mózgu jest utrzymywana in vitro¹. Od tego czasu przeprowadzono badania elektrofizjologiczne i farmakologiczne na wycinkach mózgu ², wątroby ³, płuc ⁴ i tkanki mięśnia sercowego ^5,6,7. Pierwsze nagrania patch-clamp w warstwach komorowych z noworodków szczurzych serc zostały opisane w 1990 roku ⁸, ale technika ta na jakiś czas popadła w zapomnienie. Ponad dekadę później nasza grupa opracowała nową metodę przygotowania mysich embrionów ⁹, noworodków ¹⁰ i dorosłych ¹¹ plastrów serca. Te żywotne wycinki tkanek mogą być wykorzystywane do ostrych eksperymentów (dorosłe plastry można hodować przez kilka godzin) lub krótkoterminowych eksperymentów hodowlanych (plastry embrionalne i noworodkowe można hodować przez kilka dni). Warstwy wykazują in vivo cechy elektrofizjologiczne podobne do cech i jednorodny rozrzut wzbudzenia, oceniany za pomocą potencjału czynnościowego elektrody ostrej i zapisów matrycy mikroelektrod ¹¹. Ze względu na swoją "dwuwymiarową" morfologię umożliwiają bezpośredni dostęp elektrod rejestrujących do wszystkich obszarów komory, co czyni je interesującym narzędziem do badań elektrofizjologicznych i stwarza nowe możliwości eksperymentalne w porównaniu z całym sercem perfundowanym metodą Langendorffa. Odpowiedź lekowa wycinków na blokery kanałów jonowych, takie jak werapamil (bloker kanału Ca²⁺ typu L), lidokaina (bloker kanału Na⁺), 4-aminopirydyna (nieselektywny bloker kanału K ⁺ zależny od napięcia) i linopirydyna (bloker kanału K ⁺ KCNQ) ^9,11 odpowiadały znanemu wpływowi na zdysocjowane kardiomiocyty. Pomiary siły izometrycznej wykazały dodatnią zależność częstotliwości siły i silnie sugerowały nienaruszoną funkcję kurczliwości ¹⁰. Wyniki te wykazały, że mysie plastry komorowe nadają się jako model tkankowy in vitro do badań fizjologicznych i farmakologicznych. Co więcej, komorowe wycinki serc biorców w połączeniu z ostrymi zapisami elektrod okazały się bardzo pomocnym narzędziem do scharakteryzowania integracji elektrycznej i mechanicznej, a także dojrzewania przeszczepionego płodu ^{xref"12,13,14} i kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych ¹⁵.

Podsumowując, wycinki komorowe są cennym i dobrze ugruntowanym modelem tkanki wielokomórkowej i powinny być uważane za komplementarne do zdysocjowanych kardiomiocytów i serc perfundowanych Langendorffem w badaniach sercowo-naczyniowych, z główną zaletą dostarczania struktury tkankowej podobnej do in vivo (w przeciwieństwie do komórek zdysocjowanych), jak również bezpośredniego dostępu do technologii pomiarowych, takich jak zapisy z ostrymi elektrodami, do wszystkich obszarów serca (w przeciwieństwie do całego serca przygotowania).

Protokół

Obchodzenie się ze zwierzętami musi być zgodne z wytycznymi lokalnego komitetu ds. dobrostanu zwierząt oraz z Dyrektywą Parlamentu Europejskiego 2010/63/UE.

1. Przygotuj rozwiązania

1. Przygotować roztwór Tyrode'a bez Ca²⁺ (skład w mM): NaCl 136, KCl 5,4, NaH₂PO₄ 0,33, MgCl₂ 1, glukoza 10, HEPES 5, monoksymus 2,3-butanodionu (BDM) 30. Doprowadzić pH do 7,4 za pomocą NaOH w temperaturze 4 °C.
2. Przygotować roztwór Tyrode'a z Ca²⁺ (skład w mM): NaCl 136, KCl 5,4, NaH₂PO₄ 0,33, MgCl₂ 1, glukoza 10, HEPES 5, BDM 30, CaCl₂ 0,9. Doprowadzić pH do 7,4 za pomocą NaOH w temperaturze 4 °C.
3. Przygotuj 4% niskotopliwej agarozy: Umieść 0,6 g niskotopliwej agarozy w 15 ml roztworu Tyrode'a bez Ca²⁺. Podgrzej mieszaninę w kuchence mikrofalowej dwa razy z mocą 750 W przez 10-15 s, aż agaroza się rozpuści. Utrzymywać roztwór w stałej temperaturze 37 °C i ciągle mieszać.
4. Przechowywać Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) bez surowicy w temperaturze 37 °C bąbelkowanej karbogenem (5% CO₂, 95% O₂ ).

2. Przygotuj mikrotom

1. Włączyć mikrotom.
2. Napełnij zewnętrzną komorę mikrotomu lodem.
3. Napełnij wewnętrzną komorę mikrotomu lodowatym roztworem Tyrode bez Ca²⁺ i stale natleniaj roztwór 100%_O2.
4. Umieść stalowe ostrze w uchwycie ostrza mikrotomu.

3. Izolacja serca myszy

1. Wstrzyknąć podskórnie 2 500 j. heparyny. Odczekaj 15 min.
2. Złóż zwierzę w ofierze przez zwichnięcie szyjki macicy.
3. Otwórz klatkę piersiową przez sternotomię.
4. Ostrożnie wypreparuj osierdzie za pomocą małych nożyczek i kleszczy #5.
5. Wprowadź kaniulę do aorty wstępującej i perfuzjuj tętnice wieńcowe in situ lodowatym roztworem Tyrode'a bez Ca²⁺, aż pozostała krew zostanie usunięta.
6. Delikatnie wyciąć serce kleszczami i nożyczkami i przenieść serce w lodowatym roztworze Tyrode'a bez Ca²⁺.
7. Oddziel przedsionki od komór skalpelem lub nożyczkami.

4. Osadzanie komór w 4% niskotopliwej agarozie

1. Umieść komory z wierzchołkiem skierowanym do góry w formie agarozowej (Rysunek 1). Umieść szpilkę na środku formy w lewej komorze komory.
2. Napełnij formę 4% niskotopliwą agarozą w temperaturze 37 °C, aż serce zostanie całkowicie pokryte.
3. Umieść foremkę na lodzie, aby szybciej stwardnieć agarozy, zapobiegając unoszeniu się tkanki.
4. Usuń blok agarozy zawierający komory z formy za pomocą skalpela.
5. Odwróć blok do góry nogami i wypełnij komory komorowe oraz szczelinę z tyłu bloku agarozy, która jest pozostawiona przez szpilkę linienia, 4% niskotopliwej agarozy za pomocą strzykawki z igłą 20 G.
6. Przytnij blok agarozy skalpelem, aby uzyskać płaskie dno bloku i pionową pozycję wierzchołka serca.

5. Cięcie tkanki komorowej

1. Przymocuj blok do uchwytu próbki mikrotomu za pomocą kropli kleju cyjanoakrylowego. Skieruj wierzchołek serca do góry.
2. Umieść uchwyt na próbkę w wewnętrznej komorze na próbki mikrotomu, która jest wypełniona lodowatym tylodym bez Ca²⁺. Całkowicie przykryj blok agarozy roztworem Tyrode.
3. Przygotuj plastry o krótkiej osi o grubości 150-400 μm, w zależności od dalszego zastosowania (dla nagrań ostrych elektrod 150-200 μm), utrzymuj częstotliwość drgań ostrza na poziomie 60-70 Hz i przesuwaj ostrze do przodu tak wolno, jak to możliwe.
4. Za pomocą cienkiego pędzla ostrożnie usuń pozostałą agarozę z plastrów.
5. Delikatnie przenieś plastry pipetą Pasteura do roztworu Tyrode'a z 0,9 mM Ca²⁺ napowietrzonego 100%_O2 i przechowuj je przez co najmniej 30 minut na lodzie, aby odzyskać siły po procedurze krojenia.
6. Następnie trzymaj plastry przez 30 minut w DMEM w temperaturze 37 °C, napowietrzone karbogenem, aby wypłukać BDM przed dalszym użyciem.

6. Przygotowanie zestawu elektrod Sharp

1. W celu podgrzania włącz wszystkie urządzenia elektryczne na 30 minut przed rozpoczęciem nagrywania.
2. Umieść 3 cm naczynie do hodowli komórkowych na płycie grzewczej umieszczonej na odwróconym mikroskopie.
3. Umieść wykonaną na zamówienie elektrodę pierścieniową ( Rysunek 2) w naczyniu i podłącz przewody uziemiające przedwzmacniacza i elektrody stymulującej.
4. Podłącz elastyczne rurki systemu perfuzyjnego do naczynia.
5. Napełnij zbiornik systemu perfuzyjnego DMEM, napowietrzonym karbogenem.
6. Włącz pompę perfuzyjną i ustaw szybkość perfuzji na 2-3 ml/min.
7. Dostosuj temperaturę DMEM w naczyniu do 37 °C, regulując grzałkę przepływową i płytę grzewczą.

7. Nagrania potencjału działania

1. Umieść plasterek komorowy w naczyniu wypełnionym DMEM.
2. Sprawdź integralność strukturalną i żywotność (w oparciu o funkcję skurczową) tkanki za pomocą odwróconego mikroskopu.
3. Napełnij szklaną elektrodę nagrywającą 3 M KCL.
4. Napełnij elektrodę stymulacyjną DMEM.
5. Umieść elektrodę rejestrującą i elektrodę stymulacyjną na uchwytach elektrod.
6. Ostrożnie umieść elektrodę stymulającą na plastrze i włącz stymulator elektryczny. Zacznij od częstotliwości stymulacji 1-2 Hz.
7. Przesunąć elektrodę rejestrującą z mikromanipulatorem nad zamierzoną pozycję nagrywania.
8. Powoli opuść elektrodę rejestrującą, aż końcówka dotknie tkanki.
9. Zastosuj krótki prostokątny impuls elektryczny przez elektrodę rejestrującą, aby przeniknąć przez błonę komórkową.
10. Ostrożnie zmień położenie elektrody rejestrującej, aż zapewniony zostanie stabilny sygnał.
11. Rozpocznij rejestrację potencjałów czynnościowych.

Wyniki

Zawał mięśnia sercowego prowadzi do niemal nieodwracalnej utraty kardiomiocytów. Terapia zastępcza komórek z wykorzystaniem kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych w celu egzogennej regeneracji serca jest obiecującym podejściem terapeutycznym. Integracja elektryczna i dojrzewanie przeszczepionych komórek są kluczowe dla bezpieczeństwa i skuteczności terapii zastępczej komórek.

Aby ocenić integrację i dojrzewanie, prz...

Dyskusja

Wycinki komorowe umożliwiają badania elektrofizjologiczne, farmakologiczne i mechaniczne z zachowaną strukturą tkanek podobną do in vivo i bezpośrednim dostępem technologii pomiarowej do wszystkich obszarów serca. Właściwości fizjologicznego potencjału czynnościowego wykazano w wycinkach embrionalnych, noworodkowych i dorosłych ^9,10,11. Żywotność plastrów, z wyjątkiem warstw powierzchniowych bezpośrednio uszkodzonych w ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Leica VT 1000s	Leica Microsystems, Wetzlar, Niemcy		Mikrotom z wibrującym ostrzem.
Ostrza ze stali nierdzewnej	Campden Instruments, Loughborough, Anglia	7550-1-SS
Pipety Pasteura	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	Z627992
Drobna szczotka, np. rozmiar 6 (4/32")	VWR, International, Radnor, USA	149-2125
Stół przygotowawczy			własnej produkcji
Wylinka do osadzania komór w agaroza			własnej roboty
1 ml strzykawka	Becton, Dickinson; Franklin Lakes, Stany Zjednoczone	300013
Igły 27 G x 3/4''	Braun, Melsungen, Niemcy	4657705
Igły 20 G 11/2''	4657519
Małe nożyczki	WPI, Sarasota, USA	Pęseta 501263
#5, końcówka 0,1 x 0,06 mm	WPI, Sarasota, USA	500342
Tlen gazowy (klasa medyczna O2)	Linde, Monachium, Niemcy
Gaz karbogeniczny (95 % O2, 5 % CO2)	Linde, Monachium, Niemcy
NaCl	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	7647-14-5
KCl	Sigma-Aldrich, St. Louise, Stany	Zjednoczone 746436
CaCl2	Sigma-Aldrich, St. Louise, Stany	Zjednoczone 746495
KH2PO4	Sigma-Aldrich, St. Louise, Stany Zjednoczone	NIST200B
HEPES	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	51558
NaHCO3	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	S5761
D(+)-Glukoza	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	G8270
MgSO4	Sigma-Aldrich, St. Louise, Stany Zjednoczone	M7506
NaOH	Sigma-Aldrich, St. Louise, Stany Zjednoczone	S8045
Klej cyjanoakrylowy	Henkel, Dü sseldorf, Niemcy
Niskotopliwa agaroza	Roth, Karlsruhe, Niemcy	6351.2
Heparyno-sod-25000 I.E./5 ml	Ratiopharm, Ulm, Niemcy
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), o wysokiej zawartości glukozy, GlutaMAX	ThermoScientific, Waltham, USA	10566016
SEC-10LX Wzmacniacz	npi electronic GmbH, Tamm, Niemcy	SEC-10LX
EPC 9	HEKA Elektronik GmbH, Lambrecht, Niemcy
Zeiss Axiovert 200	Zeiss, Oberkochen, Niemcy
Mikromanipulator o małym powiększeniu	Narashige, Tokio, Japonia	Nm-3
Trójosiowy mikromanipulator o dużym powiększeniu	Narashige, Tokio, Japonia	MHW-3
Pompa	perfuzyjna perystaltycznaMulti Channel Systems, Reutlingen, Niemcy	PPS2
2-kanałowy regulator temperatury	Multi Channel Systems, Reutlingen, Niemcy	TCO02
Kwadratowy stymulator impulsów	Natus Europe GmbH, Planegg, Niemcy	Trawa SD9
Kapilary szklane	WPI, Sarasota, USA	1B150F-1