Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Nadmierna akumulacja żółci wywołana ileektomią w jelicie myszy

9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55728

⸱

21 sierpnia 2017

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Case Cardiovascular Research Institute, Case Western Reserve University, 2Harrington Heart and Vascular Institute, University Hospitals Cleveland Medical Center, 3Institute for Transformative Molecular Medicine, Case Western Reserve University School of Medicine, University Hospitals Cleveland Medical Center

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Zależne od jelita cienkiego wchłanianie zwrotne kwasów żółciowych i hamowanie syntezy kwasów żółciowych w wątrobie jest ważne dla homeostazy i zdrowia całego organizmu. W tym badaniu opisujemy mysi model resekcji jelita krętego w celu oceny złego wchłaniania żółci wywołanego przez ileektomię, nadmiernej akumulacji i toksyczności w jelicie myszy.

Streszczenie

Resekcja jelit jest powszechnym podejściem terapeutycznym w chorobach ludzkich, takich jak otyłość, nieswoiste zapalenie jelit, choroba Leśniowskiego-Crohna i rak jelita grubego, które często powodują poważne działania niepożądane podobne do zespołu krótkiego jelita, w tym biegunkę kwasów żółciowych, odwodnienie, zaburzenia elektrolitowe i złe wchłanianie składników odżywczych. Tutaj wprowadzamy mysi model resekcji jelita krętego, zwany ileektomią, w celu oceny komunikacji tkankowej i utrzymania homeostazy układowej. Po resekcji jelita krętego krążąca krew jest trwale pozbawiona specyficznego dla jelita krętego hormonu endokrynnego czynnika wzrostu fibroblastów 15 (FGF15), który uwalnia jego endokrynne hamowanie syntezy kwasów żółciowych w wątrobie. W połączeniu ze zwiększoną produkcją i zniesionym wchłanianiem zwrotnym kwasów żółciowych po usunięciu jelita krętego, myszy, które przeszły operację, cierpią z powodu nadmiernej akumulacji soli żółciowych w jelicie i związanej z tym biegunki, zachorowalności i śmiertelności. Nowatorskie zastosowanie modelu chirurgicznego wprowadzone w tym badaniu może dostarczyć mechanistycznego i funkcjonalnego wglądu w kontrolę jelita krętego nad ogólnoustrojową regulacją metaboliczną w fizjologii i chorobie.

Wprowadzenie

W nowoczesnych badaniach biomedycznych, genetycznie modyfikowane modele zwierzęce są szeroko wykorzystywane do zbierania informacji o chorobach ludzkich. W szczególności specyficzne dla tkanek lub komórek funkcje przyrostu i utraty genów wykorzystano do badania regulacji molekularnej, a także indukowanych skutków biologicznych. Pomimo postępów w manipulowaniu genami docelowymi in vivo, istnieją pewne ograniczenia. Po pierwsze, wiele delecji specyficznych dla komórek lub tkanek będzie miało wpływ na wiele narządów. Na przykład delecja genu nabłonka wyeliminuje ekspresję w nabłonku wielu tkanek. Co więcej, nawet jeśli delecja jest ograniczona do określonej tkanki, kontrola przestrzenna jest rzadko możliwa. Na przykład w tkance takiej jak jelito odrębne segmenty pełnią bardzo specyficzne funkcje, którymi nie można precyzyjnie manipulować in vivo. W takich sytuacjach resekcja tkanek zawierających gen jest uważana za bardziej efektywne podejście badawcze w celu określenia mechanistycznego i funkcjonalnego znaczenia komunikacji tkankowej.

Ileektomia jest najczęściej stosowana u pacjentów z chorobą Leśniowskiego-Crohna i chorobami zapalnymi obejmującymi dystalną część jelita krętego 1,2,3. Jelito kręte zazwyczaj wytwarza kilka hormonów magazynujących energię, takich jak czynnik wzrostu fibroblastów 15/19 (FGF15/19), peptyd YY (PYY) i peptyd glukagonopodobny 1/2 (GLP1/2); Hormony te odgrywają ważną rolę miejscową i hormonalną w wielu funkcjach biologicznych4,5,6. Wśród tych hormonów FGF15 został zidentyfikowany jako silny endokrynologiczny inhibitor syntezy kwasów żółciowych w wątrobie. Po ponownym wchłonięciu do enterocytów jelita krętego, kwasy żółciowe aktywują receptor jądrowy receptora farnezoidu X (FXR) w celu stymulacji ekspresji Fgf15, co z kolei prowadzi do zahamowania syntezy kwasów żółciowych w wątrobie 7. W niedawnym badaniu wprowadziliśmy mysi model ileektomii w celu zbadania osi sygnalizacyjnej czynnika podobnego do jelita krętego 15 (KLF15)-Fgf15, która reguluje okołodobową produkcję kwasów żółciowych w wątrobie 8. Co najważniejsze, wprowadziliśmy do biologii kwasów żółciowych nową rodzinę, czynniki podobne do kruppela, w szczególności KLF15. Na podstawie badań funkcjonalnych, w tym operacji ileektomii, ustaliliśmy, że KLF15 zwiększa syntezę kwasów żółciowych poprzez pośredni mechanizm niewątrobowy. Wreszcie, jelito kręte KLF15 jest również identyfikowane jako pierwszy endogenny ujemny regulator Fgf15.

Segmenty jelitowe schodzące z obszarów proksymalnych do dystalnych są odpowiedzialne za wchłanianie różnych składników odżywczych. Jelito kręte jest głównym segmentem odpowiedzialnym za wchłanianie kwasów żółciowych i witaminy B12 (VB12) 9. We wcześniejszym badaniu wykorzystano mysi model resekcji proksymalnego jelita w celu zbadania zespołu krótkiego jelita; Zaproponowano różne długości resekcji, diety i rodzaje szwów, aby utrzymać optymalny wskaźnik przeżycia po operacji 10. Co więcej, nowszy przegląd wskazuje, że resekcja jelita krętego zwykle powoduje cięższą chorobę niż inne resekcje odcinka przewodu pokarmowego (GI) ze względu na zmniejszoną zdolność adaptacyjną pozostałego odcinka przewodu 11. Temat ten cieszy się dużym zainteresowaniem grup badawczych zajmujących się badaniami podstawowymi i klinicznymi, natomiast wiedza na temat powrotu do zdrowia i skutecznych metod terapeutycznych jest nadal ograniczona.

Biegunka z kwasem żółciowym wynika z braku równowagi w homeostazie kwasów żółciowych w krążeniu jelitowo-wątrobowym 12,13. Może to być konsekwencja resekcji jelita krętego, choroby przewodu pokarmowego lub wynik złego wchłaniania idiopatycznych kwasów żółciowych. U ponad 80% pacjentów stwierdzono biegunkę po poddaniu się resekcji jelita krętego 14. Ileektomia może stać się ważnym modelem chirurgicznym w badaniu biegunki z kwasami żółciowymi. W tym badaniu seria resekcji jelita krętego zapewnia gradientową ocenę niedoboru FGF15, a także złego wchłaniania soli żółciowych w jelitach, nadmiernej akumulacji i uszkodzeń toksycznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Protokół dla zwierząt został sprawdzony i zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Case Western Reserve University School of Medicine i został przeprowadzony zgodnie z Przewodnikiem National Institutes of Health (NIH) dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych (8th Edition, 2011). Myszy zostały poddane eutanazji metodami zgodnymi z wytycznymi Amerykańskiego Towarzystwa Lekarzy Weterynaryjnych (AVMA) dotyczącymi eutanazji zwierząt (wydanie z 2013 r.). W tym protokole wykorzystano C57BL/6J, samce, myszy w wieku 8 - 16 tygodni. Myszy trzymano w 12-godzinnym środowisku cyklu ciemności/światła.

1. Przygotowanie przedoperacyjne

  1. Przenieś myszy do czystej klatki na 24 godziny przed zabiegiem. Zapewnij zwierzętom swobodny dostęp do wody. Zastąp karmę karmą miękką (suplement diety w żelu) na 4 - 6 godzin przed zabiegiem, aby zmniejszyć zawartość jelita cienkiego do zabiegu.
  2. Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne i przygotuj sterylne materiały chirurgiczne jednorazowego użytku. Oczyść obszar operacji i znieczulający stożek nosowy 70% etanolem.
  3. Ustaw mikroskop preparacyjny, parownik znieczulający izofluranem, instrumenty i stół chirurgiczny dla małych zwierząt z kontrolowaną temperaturą do utrzymywania temperatury ciała. Uporządkuj instrumenty, szwy i strzykawki w miejscu, aby mieć do nich swobodny dostęp podczas operacji.
  4. Ustaw źródło światła, aby zapewnić wystarczającą ilość światła w obszarze operacyjnym.
  5. Przygotuj sterylną sól fizjologiczną 0,9% w strzykawce o pojemności 5 ml do oczyszczania jelit i jamy brzusznej.

2. Ileektomia i zespolenie

  1. Znieczulenie myszy izofluranem (2 - 3%) w komorze inkubacyjnej dla małych zwierząt. Określ odpowiednie znieczulenie za pomocą techniki szczypania palców u stóp, gdy zwierzę jest na izofluranie.
  2. Usuń owłosienie z brzucha, nakładając produkt do depilacji i zetrzyj włosy za pomocą gąbek chirurgicznych, zachowując znieczulenie. Umieść mysz na stole chirurgicznym dla małych zwierząt o kontrolowanej temperaturze (Rysunek 1A), aby utrzymać temperaturę ciała na poziomie 37 °C. Utrzymuj znieczulenie izofluranem (1 - 2%) przez maskę na twarz. Potraktuj oczy myszy maścią do oczu.
  3. Oczyść skórę za pomocą jodu powidonu i 70% alkoholu i przykryj operowaną powierzchnię brzucha sterylną gazą chirurgiczną (Rysunek 1B).
  4. Wykonaj nacięcie brzucha w linii środkowej za pomocą skalpela chirurgicznego, gdy znieczulenie jest już aktywne. Użyj aplikatora z bawełnianą końcówką, aby chronić jelito i pociągnij mięsień brzucha myszy za pomocą retraktorów, aby całkowicie otworzyć i odsłonić jamę brzuszną (Rysunek 1C).
  5. Zlokalizuj jelito ślepe. Zaczynając od jelita ślepego, ostrożnie przesuń połączone jelito kręte i część jelita czczego z jamy brzusznej (Rysunek 1D).
    UWAGA: Jelito ślepe można łatwo zidentyfikować ze względu na jego duży rozmiar nawet po poszczeniu.
  6. Podwiązać górną gałąź tętnicy krezkowej górnej za pomocą jedwabnego szwu 7-0, aby zatkać krew zaopatrującą odcinek jelita krętego, który ma zostać wycięty. Kolor jelita krętego zmienia się z różowego na ciemnofioletowy po podwiązaniu. (Rysunek 1E - F).
  7. W zależności od celu eksperymentu, za pomocą nożyczek należy wyciąć i usunąć 50% lub 90% jelita krętego.
    UWAGA: W przypadku operacji pozorowanej nie należy wykonywać podwiązania tętnicy krezkowej górnej i nie usuwać jelita krętego.
  8. Przepłukać światło obu końców jelita krętego 0,9% solą fizjologiczną.
    UWAGA: Ponieważ pozostałe nienaruszone jelito kręte nadal otrzymuje normalny dopływ krwi z tętnicy krezkowej górnej, niewielka ilość krwi zostanie wypłukana podczas procesu. Wskazuje to również, że dopływ krwi do końców jelita krętego jest prawidłowy i zapewnia brak niedokrwienia podczas procedury zespolenia (Rysunek 1G).
  9. Zlokalizuj krezki po stronie obu końców jelita krętego. Wyrównaj krezki i zszyj końce jelita krętego razem za pomocą 8-0 szew (Rysunek 1G - H).
  10. Zszyj przeciwległą stronę jelita krętego, aby utrzymać jelito kręte w zespoleniu w naturalny sposób (Rysunek 1I).
  11. Zszyj górną i dolną stronę między dwoma oryginalnymi szwami, aby dokładnie połączyć ze sobą dwa końce jelita krętego (Rysunek 1J).
  12. Upewnij się, że nie ma wycieku z miejsca zespolenia po zakończeniu trzyetapowej procedury szycia (Rysunek 1G-I). Zwróć jelito ślepe i jelito cienkie do jamy brzusznej do pierwotnego położenia anatomicznego. Umyj obszar operacji ciepłą solą fizjologiczną o sile fizjologicznej 0,9% za pomocą igły. (Rysunek 1K).
  13. Zamknij nacięcie warstwy mięśni brzucha szwem 6-0. Wyrównaj nacięcie skóry brzucha za pomocą kleszczy i zszyj skórę brzucha, aby ułatwić optymalne gojenie się ran (Rysunek 1L).

3. Opieka pooperacyjna

  1. Przenieś myszy pooperacyjne na oddział intensywnej terapii w celu rekonwalescencji. Umieść je w klatce z papierowej pościeli na poduszce grzewczej o kontrolowanej temperaturze, aby kontynuować rekonwalescencję po operacji przez noc. Podawaj myszom miękki pokarm oprócz zwykłego jedzenia i wody.
  2. Podawać buprenorfinę (0,05 - 0,1 mg/kg) we wstrzyknięciu podskórnym co 8-12 godzin w celu znieczulenia.
    UWAGA: Poddaj myszy eutanazji za pomocą CO2 w przypadku poważnego zachorowania.
  3. W punkcie końcowym należy złożyć ofiary myszy za pomocą przedawkowanego izofluranu i w razie potrzeby pobrać próbki (sekcja 4).

4. Ocena nadmiernej akumulacji żółci wywołanej ileektomią

  1. Zważ i wypreparuj myszy jeden dzień po resekcji 0% (pozorowane), 50% lub 90% jelita krętego.
  2. Wyjmij przewód pokarmowy i zważ go. Oblicz stosunek masy przewodu pokarmowego do masy ciała, aby ocenić nasilenie złego wchłaniania i nadmiernej akumulacji soli żółciowych.
  3. Przenieś odcinki przewodu pokarmowego do stożkowych probówek o pojemności 15 ml i pokrój je na krótkie segmenty za pomocą nożyczek. Po pokrojeniu odwirować przy 3 000 x g przez 10 min. Przenieść supernatant (płyn żołądkowo-jelitowy zawierający sole żółciowe) do czystej probówki.
  4. Zmierz całkowitą objętość i masę płynu żołądkowo-jelitowego i oblicz stosunek masy płynu do masy przewodu pokarmowego, aby dokładniej ocenić nadmierną akumulację żółci w przewodzie pokarmowym.
  5. Oznaczyć całkowitą ilość żółci w supernatancie za pomocą testu kwasów żółciowych zgodnie z opisem w odniesieniu 8.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Procedury ileektomii przedstawiono na Rysunku 1. Pierwszy krok obejmuje przygotowanie skóry brzucha myszy, wykonanie nacięcia brzusznego i użycie rozwieraczy w celu pełnego odsłonięcia jelit (Rysunek 1A-C). Następnie zlokalizowano kątnicę myszy (Rysunek 1D); ze względu na jej rozmiar i kształt jest ona łatwo identyfikowalnym punktem orientacyjnym. Kątnica, jelito cie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Aby przeprowadzić udaną ileektomię, tętnica krezkowa górna musi zostać wcześniej podwiązana, aby zablokować dopływ krwi do segmentu reekcyjnego. Niedokrwienny odcinek jelita krętego zmieni kolor na ciemnofioletowy po podwiązaniu. Odcinek jelita krętego musi zostać następnie całkowicie wycięty. Należy zapewnić normalne ukrwienie zatrzymanych końcówek. Jest to niezbędne, aby uniknąć krwawienia i niewłaściwego usunięcia, które może łatwo spowodować niepowodzenie chirurgiczne z powodu martwicy niedokrwiennej po zszyciu. Podc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Te badania są wspierane przez Fundację Toma Petersona i grant NIH R01-HL119780 (Jain, MK).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mikroskop preparacyjnyOlympusSZ61Do zabiegów chirurgicznych 
Regulator temperatury zwierzątPhysitemp Instruments, Inc.TCAT-2LVDo kontroli temperatury ciała
Waporyzator anestezjologiczny IsofluranVetEquip  911104Do znieczulenia Kleszcze
preparacyjne  Narzędzia Fine Science Tools, Inc.11274-20Do zabiegów chirurgicznych 
Nożyczki  Narzędzia Fine Science Tools, Inc.14084-08Do zabiegów chirurgicznych 
Uchwyt igły  Narzędzie chirurgiczne Roboz Co.RS-7882Do chirurgii 
Mikro noże - ostrze igłyFisher Scientific10318-14Do operacji 
6-0 szew monofilamentowyEthicon1698GDo zamykania skóry brzucha
7-0 szew jedwabnyEthicon766GDo podwiązania
8-0 szew monofilamentowyEthicon1714GDo zespolenia
Gąbki chirurgiczneDynarex Corp.3333Do zabiegów chirurgicznych 
Małe aplikatory z bawełnianą końcówką Fisher Scientific23-400-118Do zabiegów chirurgicznych 
IsofluranePiramal Healthcare Limited66794-013-25Do znieczulenia
Chlorowodorek buprenorfinyReckitt-Benckiser Pharmaceuticals12496-0757-1Do znieczulenia
0,9% chlorek sodu do wstrzykiwańB. Braun Medical Inc.0264-7800-10Do mycia/wstrzykiwania
roztworu do przygotowania jodu powidonuDynarex Corp.1413Do przygotowania skóry
Maść weterynaryjna PuralubeDechra Veterinary Products17033-211-38Do pielęgnacji oczu
Płyn do depilacjiChurch & Dwight Co., Inc.Do przygotowania skóry
Oddział intensywnej terapiiThermoCareFW-1Do rekonwalescencji pooperacyjnej
DietGel recoveryClearH2O72-06-5022Do rekonwalescencji pooperacyjnej
Aurum total RNA zestaw tkanki tłuszczowej i włóknistejBio-Rad7326830Do izolacji RNA
iScript odwrotna transkrypcja supermix do RT-qPCRBio-Rad1708841Dla test odwrotnej transkrypcji
TaqMan szybka zaawansowana mieszanka głównaApplied Biosystems/Life Technologies4444965Do analizy QPCR
Zestaw do oznaczania całkowitych kwasów żółciowychGenzymeDiagnostic DZ042A-K01Do oznaczania kwasów żółciowych
C57BL/6J Laboratorium
Jacksona

Bibliografia

  1. McLeod, R. S. Surgery for inflammatory bowel diseases. Dig Dis. 21, 168-179 (2003).
  2. Hancock, L., Windsor, A. C., Mortensen, N. J. Inflammatory bowel disease: the view of the surgeon. Colorectal Dis. 8, 10-14 (2006).
  3. Polle, S. W., Bemelman, W. A. Surgery insight: minimally invasive surgery for IBD. Nat Clin Pract Gastroenterol Hepatol. 4, 324-335 (2007).
  4. Fon Tacer, K., et al. Research resource: Comprehensive expression atlas of the fibroblast growth factor system in adult mouse. Mol Endocrinol. 24, 2050-2064 (2010).
  5. Pournaras, D. J., et al. The role of bile after Roux-en-Y gastric bypass in promoting weight loss and improving glycaemic control. Endocrinology. 153, 3613-3619 (2012).
  6. Spreckley, E., Murphy, K. G. The L-Cell in Nutritional Sensing and the Regulation of Appetite. Front Nutr. 2, 23(2015).
  7. Inagaki, T., et al. Fibroblast growth factor 15 functions as an enterohepatic signal to regulate bile acid homeostasis. Cell Metab. 2, 217-225 (2005).
  8. Han, S., et al. Circadian control of bile acid synthesis by a KLF15-Fgf15 axis. Nat Commun. 6, 7231(2015).
  9. Christl, S. U., Scheppach, W. Metabolic consequences of total colectomy. Scand J Gastroenterol Suppl. 222, 20-24 (1997).
  10. Helmrath, M. A., VanderKolk, W. E., Can, G., Erwin, C. R., Warner, B. W. Intestinal adaptation following massive small bowel resection in the mouse. J Am Coll Surg. 183, 441-449 (1996).
  11. Tappenden, K. A. Pathophysiology of short bowel syndrome: considerations of resected and residual anatomy. J Parenter Enteral Nutr. 38, 14-22 (2014).
  12. Camilleri, M. Bile Acid diarrhea: prevalence, pathogenesis, and therapy. Gut Liver. 9, 332-339 (2015).
  13. Camilleri, M. Advances in understanding of bile acid diarrhea. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 8, 49-61 (2014).
  14. Mottacki, N., Simren, M., Bajor, A. Review article: bile acid diarrhoea - pathogenesis, diagnosis and management. Aliment Pharmacol Ther. 43, 884-898 (2016).
  15. Rao, A., et al. The organic solute transporter alpha-beta, Ostalpha-Ostbeta, is essential for intestinal bile acid transport and homeostasis. Proc Natl Acad Sci. 105, 3891-3896 (2008).
  16. Hofmann, A. F., Poley, J. R. Cholestyramine treatment of diarrhea associated with ileal resection. N Engl J Med. 281, 397-402 (1969).
  17. Kir, S., et al. FGF19 as a postprandial, insulin-independent activator of hepatic protein and glycogen synthesis. Science. 331, 1621-1624 (2011).
  18. Kuipers, F., Bloks, V. W., Groen, A. K. Beyond intestinal soap--bile acids in metabolic control. Nat Rev Endocrinol. 10, 488-498 (2014).
  19. Buchman, A. L., Scolapio, J., Fryer, J. AGA technical review on short bowel syndrome and intestinal transplantation. Gastroenterology. 124, 1111-1134 (2003).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Nadmierna akumulacja kwas w ciowychresekcja jelitamodel mysihormon FGF15analiza kwas w ciowychanastomoza jelitowaanaliza przewodu pokarmowegoilo ciowy PCRtoksyczno soli ciowych
Nadmierna akumulacja żółci wywołana ileektomią w jelicie myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.