Tutaj prezentujemy metodę stereologiczną, frakcjonator optyczny, używany do ilościowego określenia powstawania nowych neuronów i ich przeżycia w hipokampie szczura po stymulacji elektrowstrząsowej. Przy prawidłowym wdrożeniu, czułość i wydajność metod stereologicznych zapewnia dokładne oszacowania ze stałą i z góry określoną precyzją.
Artykuł metodologiczny
Technika frakcjonowania optycznego do szacowania liczby komórek w szczurzym modelu terapii elektrowstrząsowej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Metody stereologiczne są zaprojektowane do opisywania parametrów ilościowych bez przyjmowania założeń dotyczących rozmiaru, kształtu, orientacji i rozmieszczenia komórek lub struktur. Metody te okazały się rewolucyjne w analizie ilościowej mózgu ssaków, w której objętościowe populacje komórek są zbyt duże, aby można je było liczyć ręcznie, a stereologia jest obecnie techniką z wyboru, gdy trzeba uzyskać oszacowania wielkości trójwymiarowych z pomiarów na przekrojach dwuwymiarowych. Wszystkie metody stereologiczne są w zasadzie bezstronne; Opierają się jednak na odpowiedniej wiedzy na temat interesującej nas budowy i charakterystyki tkanki. Stereologia opiera się na systematycznym jednolicie losowym próbkowaniu (SURS), z dostosowaniem próbkowania do najbardziej efektywnego poziomu pod względem precyzji, dostarczając wiarygodnych, ilościowych informacji o całej strukturze zainteresowania. Tutaj przedstawiamy frakcjonator optyczny w połączeniu z immunohistochemią BrdU w celu oszacowania produkcji i przeżycia nowo powstałych neuronów w warstwie komórek ziarnistych (w tym w strefie podziarnistej) hipokampa szczura po stymulacji elektrowstrząsowej, która jest jednym z najsilniejszych stymulatorów neurogenezy. Technika frakcjonowania optycznego została zaprojektowana w celu oszacowania całkowitej liczby komórek z grubych odcinków pobranych z pełnej struktury. Grube przekroje dają możliwość obserwacji komórek w ich pełnym zakresie 3D, a tym samym pozwalają na łatwą i solidną klasyfikację komórek w oparciu o kryteria morfologiczne. Przy prawidłowym wdrożeniu, czułość i wydajność frakcjonatora optycznego zapewnia dokładne szacunki ze stałą i z góry określoną precyzją.
Wprowadzenie
Kwantyfikacja komórek w trójwymiarowej (3-D) strukturze może wymagać uzyskania szacunków opartych na bezstronnych zasadach. Nawet dzisiaj w badaniach często wykorzystuje się metody dwuwymiarowe (2D) do raportowania danych o strukturach 3D. Metody te nie uwzględniają jednak niejednorodnego charakteru struktury pod względem kształtu i rozmieszczenia komórek, co skutkuje ograniczeniami metodycznymi; przyjmują założenia dotyczące interesującej nas struktury 3D, a wyniki nie odnoszą się do całej struktury. Ograniczenia te zmniejszają czułość i dokładność metod, a także zwiększają ryzyko błędów1.
Stronniczość w liczeniu komórek może być uniknięta dzięki zastosowaniu stereologii opartej na projektowaniu, która ma ogólne znaczenie dla uzyskania ilościowych informacji o liczbie komórek w danej tkance lub strukturze. Podczas gdy dawniej stereologia była bardzo czasochłonną metodą, postęp w procedurach, oprogramowaniu i obrazowaniu sprawił, że stała się ona znacznie bardziej wydajna i ma szersze zastosowanie. Stereologia obejmuje statystyczne zasady próbkowania i stochastyczną teorię geometrii, aby zapewnić wydajne narzędzia do szacowania objętości, powierzchni, długości i liczby obiektów w strukturze 3D poprzez próbkowanie w sekcjach 2-D2. W ten sposób stereologia pozwala na uzyskanie bezstronnych danych ilościowych na temat zmian strukturalnych w skrawkach tkanki, które dają średnie szacunki rzeczywistych liczb, bez wyczerpującej analizy1. Stereologia jest definiowana jako statystyczne wnioskowanie parametrów geometrycznych na podstawie próbkowanych informacji. Można to osiągnąć poprzez bezstronne próbkowanie, to znaczy systematyczne losowe próbkowanie sekcji, a także reguły zliczania, które zapewniają, że wszystkie obiekty mają równe prawdopodobieństwo zliczenia3. Podczas gdy wyniki stereologiczne mogą mieć różny stopień precyzji, na co wskazuje współczynnik błędu (CE), można go dostosować do nieodłącznej wariancji biologicznej (współczynnik wariancji (CV)) poprzez dostosowanie ilości próbkowania zgodnie z wymaganiami4,5. Kilka wcześniejszych badań stereologicznych badało krótkoterminowy wpływ stymulacji elektrowstrząsowej (ECS) na plastyczność hipokampa u gryzoni6,7. Dane z tych badań wskazują na początkowy wzrost całkowitej liczby neuronów, a także podwyższone różnicowanie synaptyczne po powtórzeniu ECS. Jednak badania te nie szacują neurogenezy bezpośrednio, ponieważ nie wykorzystują specyficznych markerów proliferacji komórek.
Tutaj prezentujemy zastosowanie metody stereologicznej, techniki frakcjonowania optycznego8,9, do ilościowego określania całkowitej liczby nowo powstałych neuronów w warstwie komórek ziarnistych hipokampa szczura (GCL), w tym w strefie subziarnistej (SGZ), jak również ich długoterminowego przeżycia10,11. Poddaliśmy szczury klinicznie odpowiedniemu schematowi ECS (trzy razy w tygodniu przez 3 tygodnie), który jest jednym z najsilniejszych stymulatorów neurogenezy12. Zwierzęta kontrolne leczono przy użyciu tej samej procedury, ale bez przepuszczania prądu. W każdym z 21 dni eksperymentów wszystkim szczurom wstrzykiwano dootrzewnowo 5-bromo-2'-deoksyurydynę (BrdU), która włącza się do DNA zamiast tymidyny podczas podziału komórki13. Po eksperymentach szczury utrzymywano przez cztery różne okresy czasu (24 godziny, 3 miesiące, 6 miesięcy i 12 miesięcy). Stosując zasadę frakcjonowania, uzyskaliśmy znaną frakcję hipokampa poprzez jednolite losowe pobieranie próbek skrawków i zastosowaliśmy disektory optyczne (sondy 3D) do pobranych próbek i wybarwionych immunologicznie grubych skrawków tkanki. Zwraca się szczególną uwagę na to, że zamrożone sekcje zwykle zapadają się w osi z podczas przetwarzania i że w tym konkretnym przypadku należy użyć disektorów optycznych opartych na średniej grubości przekroju ważonej liczbą14. Ponieważ płaszczyzna ogniskowa disektorów optycznych została przesunięta o znaną odległość w dół przez przekrój, neurony BrdU-dodatnie zostały policzone, gdy ich cecha zainteresowania została wyraźnie rozpoznana. W dziedzinie stereologii toczy się dyskusja na temat całkowitej liczby cząstek, które powinny być policzone15; Zazwyczaj w interesującej nas strukturze zlicza się 150-200 neuronów, aby uzyskać odpowiednią precyzję, czyli współczynnik 7-8%8. Liczbę neuronów BrdU-dodatnich przeprowadzono przy użyciu oprogramowania stereologicznego z obrazowaniem za pomocą standardowego mikroskopu wyposażonego w kamerę i następujące obiektywy: 2X, 4X i 10X, a także 100-krotny obiektyw zanurzeniowy w oleju (apertura numeryczna = 1,40) i zmotoryzowany stolik. Ruchy w kierunku z mierzono za pomocą cyfrowego mikrokatora. Końcowe powiększenie wynosiło 3000X.
Protokół
Wszystkie procedury z udziałem zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi duńskiej Inspekcji Eksperymentów na Zwierzętach (Danish Animal Experimentation Inspectorate) i zatwierdzone przez lokalny komitet etyczny ds. zwierząt doświadczalnych.
1. Obróbka tkanek
UWAGA: Po perfuzji przezsercowej i utrwalaniu w 4% paraformaldehydzie (PFA) rozcieńczonej w 0,2 M buforze fosforanowym przez noc w temperaturze 4 °C, mózgi przenosi się do 30% sacharozy w buforze fosforanowym (PBS) na trzy dni w temperaturze 4 °C. Następnie mózgi zamraża się na sproszkowanym suchym lodzie i przechowuje w temperaturze -80 °C do czasu wykonania skrawków.
- Oddziel prawą i lewą półkulę wzdłuż linii środkowej mózgu za pomocą skalpela, a następnie w pierwszym mózgu wybierz losowo jedną z półkul; w kolejnych próbkach przełączaj się systematycznie między półkulą prawą a lewą (Rycina 1A). Przymocuj pobraną półkulę do krążka do preparatów za pomocą medium montażowego, tak aby długa oś była prostopadła do powierzchni krążka.
- Umieść ponumerowane wielodobojowe pojemniki do schładzania wstępnego w kriostacie.
- Zamocuj dysk z próbką w kriotomacie i przetnij cały hipokamp (Bregma 1,80 do -7,04)16do 80 µm grube przekroje w płaszczyźnie czołowej (Rysunek 1B).
- Umieść wszystkie pobrane przekroje kolejno w schłodzonych wielokasetkowych pojemnikach, aby zapewnić zachowanie kolejności cięcia przekrojów.
- Całkowicie pokryć sekcje krioprotektantem i utrzymać pojemniki w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia.
2. Immunobarwienie
UWAGA: Aby zachować kontrolę nad poszczególnymi przekrojami podczas procedury barwienia, należy umieścić pobrane przekroje w siatkach do barwienia z 25 dołkami. Należy użyć co 5th przekroju, co daje średnią końcową liczbę 12 (8-16) przekrojów na hipokamp do immunobarwienia i późniejszego liczenia komórek.
- Przed pobraniem podpróbek z każdego nth sekcja z losowym początkiem między sekcją pierwszą a sekcją n (Rycina 1C) przenieść pojemniki z -20 °C do temperatury pokojowej (RT).
- Zastosowanie np. pędzel, aby przenieść skrawki w kolejności numerycznej do 25-dołkowych siatek do barwienia umieszczonych w szalkach Petriego wypełnionych PBS.
UWAGA: Od tego momentu należy pozostawić sekcje w siatkach do barwienia, które umieszczono w dopasowanych naczyniach szklanych na wytrząsarce orbitalnej (sekcje 2.3 do 2.9). - Przenieść siatki do barwienia do odpowiadających im szklanych naczyń i przemyć przekroje dwukrotnie przez 10 min w PBS w temperaturze pokojowej przed inkubacją w 3% nadtlenku wodoru (H2O2) rozcieńczone w wodzie destylowanej (dH2O)2O) przez 20 min.
- Przenieś przekroje do trzech różnych roztworów kwasu solnego (HCl) (1 M w 0 °C przez 10 min, 2 M w temperaturze pokojowej przez 10 min i 2 M w 37 °C (przez 20 min) przed neutralizacją w 0,1 M tetraboranie sodu w temperaturze pokojowej przez 20 min.
- Po trzech 10-minutowych inkubacjach w 1% Triton X-100 rozcieńczonym w PBS (bufor myjący), przenieś skrawki do buforu myjącego zawierającego 10% płodowej surowicy bydlęcej (roztwór blokujący) na 1 h w temperaturze pokojowej.
- Inkubować skrawki przez 48 h w temperaturze 4 °C przeciwciałem mysim anty-BrdU rozcieńczonym 1:100 w roztworze blokującym.
- Przemyć przekroje 3 × 10 min w buforze do płukania, a następnie inkubować przez 48 h w peroksydazie chrzanowej rozcieńczonej 1:10 w buforze do płukania.
- Przenieś przekroje do PBS na 5 × 10 min, a następnie na 7 min do 0,01% diaminobenzydyny (DAB) rozcieńczonej w PBS, przed przeniesieniem ich do analogicznego roztworu DAB zawierającego 0,02% H2O2.2O2 przez 10 min w temperaturze pokojowej.
- Przeprowadzić serię płukań (2 × 10 min w PBS oraz 2 × 10 min w buforze fosforanowym bez dodatku chlorku sodu), a następnie przymocować skrawki w kolejności numerycznej do szkiełek przedmiotowych.
- Osuszyć skrawki przez około 30 min przed barwieniem kontrastowym fioletem krezylu.
- Umieść preparaty na szkiełkach przedmiotowych w statywie do szkiełek.
- Rehydratyzować skrawki przez 10 min w kuwetach do barwienia zawierających dH2O2Następnie przenieść preparaty do 0,02% roztworu fioletu krezylowego w dH2O2przez 15 min.
- Powtórz krok 2.12 przed trzykrotnym odwodnieniem przekrojów w etanolu (96% przez 5 min i 99% przez 2 × 2 min).
- Przenieście skrawki do ksylenu na 2 × 15 min, a następnie nakryjcie preparaty szkiełkami dekrywacyjnymi, używając szybko schnącego medium montażowego.
- Na koniec pozostaw preparaty z nakrywkami na około 24 h przed zastosowaniem ich w mikroskopii.
3. Szacowanie całkowitej liczby neuronów znakowanych BrdU przy użyciu optycznego frakcjonatora
UWAGA: Należy przeprowadzić badanie pilotażowe z udziałem kilku zwierząt w celu ustalenia optymalnych parametrów pobierania próbek, takich jak liczba analizowanych przekrojów oraz liczba dysektorów optycznych w obrębie pobranych próbek. Badanie pilotażowe pozwala również na wyznaczenie wstępnego współczynnika CV (odchylenie standardowe/średnia) oraz daje możliwość dostosowania CE (patrz sekcja 3.9.3) w celu uzyskania satysfakcjonującej precyzji szacunków określonej przez badacza (szczegóły poniżej). Należy również przeprowadzić analizę rozkładu w osi z, aby ocenić następujące kwestie: skurcz tkanki, jakość barwienia w całym przekroju oraz rozkład komórek w osi z14.
- Sprawdź grubość tkanki w przekrojach, aby potwierdzić, że są one odpowiednie do zastosowania optycznego frakcjonatora, np. czy są wystarczająco grube dla wybranej wysokości dysektora, wliczając strefy ochronne (patrz poniżej). UWAGA: Grubość tkanki jest mierzona w kilku miejscach w obrębie obszaru zainteresowania.
- Umieść preparaty na zmotoryzowanym stole mikroskopu i uruchom preferowane oprogramowanie stereologiczne.
- Wyznacz obszar zainteresowania za pomocą obiektywu o małym powiększeniu (2X lub 4X) przed zmianą na obiektyw imersyjny 100X (patrz Rysunek 2A).
- Używając konkretnego punktu ramki liczącej (np. w narożniku lub w jego sąsiedztwie), zlokalizuj górną powierzchnię przekroju, przesuwając się wzdłuż płaszczyzny ogniskowania, aż jakiś element przekroju znajdzie się w ostrości. Zarejestruj tę pozycję z jako 0 (patrz Rysunek 2B).
- Przesuwaj płaszczyznę ogniskowania w dół przez tkankę, aż ten sam konkretny punkt ramki liczącej znajdzie się na ostatnim poziomie z tkanki będącej w ostrości i zaznacz tę pozycję. Lokalna grubość tkanki jest definiowana od 0 do tego punktu końcowego i może być odczytana na osi z. Zarejestruj grubość tkanki (patrz Rysunek 2B).
- Udokumentuj pełną penetrację barwnika oraz rozkład komórek w pełnej grubości przekroju.
UWAGA: Rozkład neuronów znakowanych BrdU służy jako wytyczna do określenia wymaganych stref ochronnych. Chociaż jednolity rozkład komórek jest krytyczny, dopuszczalne jest zaobserwowanie mniejszej liczby komórek blisko górnej i dolnej krawędzi przekroju, co wskazuje na efekt utraty czap (szczegóły patrz Dorph-Petersen et al., 2009).- Przeprowadź próbkowanie neuronów znakowanych BrdU i zarejestruj ich pozycję z wraz z lokalną grubością przekroju zmierzoną w wybranym narożniku każdej ramki liczącej.
- Przedstaw liczbę neuronów BrdU-dodatnich jako funkcję ich pozycji z.
- Ustal wysokość dysektora i stref ochronnych na podstawie średniej grubości przekroju i rozkładu komórek (patrz 3.1 i 3.2).
UWAGA: Wysokość dysektora powinna być mniejsza niż grubość przekroju, aby uniknąć artefaktów blisko powierzchni. Ryzyko to eliminuje się poprzez uwzględnienie stref ochronnych na górnej i dolnej krawędzi przekroju. - Określ długość kroku pomiędzy dysektorami.
- Wyznacz obszar zainteresowania we wszystkich analizowanych przekrojach i zarejestruj ich powierzchnie.
- Zsumuj te powierzchnie, a następnie podziel przez liczbę dysektorów, które mają zostać rozmieszczone w tym obszarze.
UWAGA: W oparciu o wcześniejsze doświadczenia, dobrym punktem wyjścia jest zastosowanie 75 sond. Pozwoli to na przybliżenie powierzchni i odpowiadających jej pozycji próbkowania (Astep) (szczegóły patrz West, 2012). - Oblicz pierwiastek kwadratowy z Astep, co wyznaczy rozmiar kroku x-y.
- Określ rozmiar ramki liczącej.
- Ustaw rozmiar ramki liczącej na jednostkę dowolną i przeprowadź pilotażowe próbkowanie neuronów BrdU-dodatnich, korzystając z parametrów uzyskanych w sekcjach 3.3 i 3.4.
UWAGA: Rozmiar musi zostać określony empirycznie metodą prób i błędów, jednak zaleca się jego dostosowanie tak, aby umożliwić próbkowanie 2-3 komórek na dysektor8.
- Ustaw rozmiar ramki liczącej na jednostkę dowolną i przeprowadź pilotażowe próbkowanie neuronów BrdU-dodatnich, korzystając z parametrów uzyskanych w sekcjach 3.3 i 3.4.
- Po zakończeniu tego końcowego etapu badania pilotażowego rozpocznij próbkowanie komórek.
UWAGA: Uzyskane parametry próbkowania powinny skutkować zliczeniem około 150-200 komórek w każdym zwierzęciu, co jest wystarczające do uzyskania efektywnego projektu stereologicznego8. - Policz neurony BrdU-dodatnie, używając obiektywu imersyjnego 100× i końcowego powiększenia 2000-3000×. W każdym dysektorze optycznym zidentyfikuj wszystkie neurony znakowane BrdU, które są wyraźnie rozpoznawalne na podstawie cechy zainteresowania (w niniejszym badaniu kryterium jest moment, w którym przednia krawędź neuronu znakowanego BrdU po raz pierwszy pojawia się w ostrości), znajdują się wewnątrz ramki liczącej lub dotykają linii inkluzji (Rysunek 2B). Nie licz neuronów BrdU-dodatnich, które, mimo wyraźnego rozpoznania na podstawie cechy zainteresowania w obrębie wysokości dysektora, dotykają linii ekskluzji. Krytycznie ważne jest skrupulatne przestrzeganie tych zasad liczenia przez cały proces kwantyfikacji stereologicznej.
UWAGA: Ponieważ BrdU wbudowuje się we wszystkie dzielące się komórki, morfologia jest wykorzystywana do odróżnienia neuronów od innych typów komórek. Charakterystyką neuronów jest wyraźnie zdefiniowane jądro z neutralną cytoplazmą i ciemnym jąderkiem. Komórki BrdU-dodatnie są rozpoznawane jako nowo powstałe neurony na podstawie ich względnie większego rozmiaru w porównaniu z komórkami glejowymi. Należy wspomnieć, że w badaniach nad proliferacją krótkoterminową (np. < 24 h) warunkiem wstępnym może być podwójne barwienie z użyciem markerów neuronalnych niedojrzałych17. - Oszacuj całkowitą liczbę neuronów BrdU-dodatnich w każdym mózgu, mnożąc całkowitą liczbę policzonych komórek (ΣQ-) przez odwrotne ułamki próbkowania:
dla
gdzie
Q- to średnia grubość przekroju ważona liczbą komórek, h to wysokość dysektora, asf to ułamek próbkowania powierzchni, ssf to ułamek próbkowania przekrojów, a ti to grubość przekroju w itej ramce liczącej z liczbą komórek 
w dysektorze14,18. - Oblicz współczynnik błędu (CE)8, który jest wariancją próbkowania neuronów BrdU-dodatnich w systematycznym jednorodnym próbkowaniu losowym (SURS).
- Najpierw oblicz szum, który jest równy całkowitej liczbie policzonych neuronów BrdU-dodatnich:
- Następnie oblicz wariancję w SURS:
UWAGA: Uznaliśmy, że powierzchnia i liczba komórek w hipokampie zmieniają się płynnie z przekroju na przekrój i w konsekwencji użyliśmy "klasy gładkości" m = 1 (1/240)8,19
gdzie
Pi to liczba punktów policzonych dla obiektu w itym przekroju, a n to liczba przekrojów4,20. - Na koniec oblicz CE oszacowania:
UWAGA: Zasadniczo optymalna precyzja jest zazwyczaj osiągana, gdy wartość CE jest mniejsza niż połowa zaobserwowanego CV, ponieważ OCV2 = ICV2 + CE2, gdzie OCV to zaobserwowane CV, a ICV to wrodzone CV4.
- Najpierw oblicz szum, który jest równy całkowitej liczbie policzonych neuronów BrdU-dodatnich:
Rycina 1: Schematyczne przedstawienie obróbki tkanek zgodnie z zasadami frakcjonatora zastosowanymi w niniejszym badaniu.
Po zakończeniu eksperymentu półkule są rozdzielane, a półkula prawa lub lewa jest wybierana w sposób systematyczny i losowy (A). Cały mózg, obejmujący cały hipokamp, jest cięty na 80-µm-grube przekroje czołowe (B), z których każdy co 5th przekrój zostaje pobrany próbkowo, zaczynając losowo od przekroju 1 do 5, do końcowego barwienia immunocytochemicznego i kwantyfikacji stereologicznej (C). Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.
Rysunek 2: Ilustracja przedstawiająca procedurę pobierania próbek stereologicznych z wykorzystaniem dysektorów optycznych.
(A) Po obróbce histologicznej wyznaczono obszar GCL/SGZ hipokampa i w sposób jednolity oraz losowy zastosowano w tym regionie dysektory optyczne. (B) W dysektorach optycznych (po lewej) neurony BrdU-dodatnie były liczone tylko wtedy, gdy ich istotna cecha była wyraźnie rozpoznawalna w obrębie wysokości dysektora i znajdowała się wewnątrz ramki liczącej lub dotykała linii włączenia (po prawej). Neurony dotykające linii wykluczenia nie były liczone. Paski skali = 10 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Wyniki
Parametry pobierania próbek
Analizując rozkład wzdłuż osi z w badaniu pilotażowym (Rycina 3), stwierdzono jednorodny rozkład neuronów BrdU-dodatnich w obrębie wysokości disektora. Zmierzono stopień skurczenia się skrawków; końcowa średnia grubość wynosiła 26,4 μm (19,0-32,0 μm) w skrawkach pierwotnie ciętych na 80 μm. Na podstawie grubości tkanki i rozkładu neuronów znakowanych BrdU wysokość disektora ustawiono na 10 μm, a strefy ochronne (guard zones) na górze i na dole skrawka ustawiono odpowiednio na 5 μm i 4-17 μm. W zależności od gęstości komórek powierzchnia ramek liczbowych wynosiła 1414 lub 5210 μm2. Długość kroku wynosiła 220 μm w kierunkach x i y, a liczenie komórek przeprowadzono średnio w 12 (zakres 8-16) skrawkach na zwierzę. Te parametry próbkowania pozwoliły na policzenie średnio 133 (zakres 33-372) komórek BrdU-dodatnich w 173 (107-204) disektorach w każdej półkuli mózgu.
Przykładowo, dla szacunków liczby pozytywnych pod kątem BrdU neuronów u szczurów traktowanych ECS otrzymaliśmy następujące wartości CV i CE: 24 godziny: CV = 0.59, CE = 0.11; 3 miesiące: CV = 0.34, CE = 0.12; 6 miesięcy: CV = 0.43, CE = 0.09; 12 miesięcy: CV = 0.22, CE = 0.09.
Ilościowo określono całkowitą liczbę nowo powstałych neuronów oraz ich długoterminowe przetrwanie w hipokampie szczura po zastosowaniu ECS, wykorzystując metodę optycznego frakcjonatora w połączeniu z techniką barwienia BrdU10,11. Wyniki końcowe wykazały podstawową neurogenezę w czterech grupach zwierząt kontrolnych, która nie różniła się istotnie w zależności od czasu przetrwania (Rycina 3). Ponadto ECS wywołało istotny wzrost całkowitej liczby neuronów BrdU-dodatnich w 24 godzinach (259%, p<0.0001), 3 (229%, p<0.001), 6 (152%, p<0.05) i 12 miesiącach (162%, p<0.05) po przeprowadzeniu eksperymentu w porównaniu do zwierząt z grupy kontrolnej.
Rysunek 3: Dane ilościowe całkowitej liczby neuronów BrdU-dodatnich w GCL/SGZ hipokampa szczura10,11.
Poziome słupki reprezentują wartości średnie. Skróty: GCL, warstwa ziarnista; SGZ, strefa podziarnista; h, godziny; m, miesiące. ****p<0.0001, ***p<0.001 oraz *p<0.05 względem grupy kontrolnej (n=11-12 na grupę). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Dyskusja
Stosując ECS jako metodologię indukowania neurogenezy, stwierdzamy natychmiastowy wzrost o 260% w tworzeniu nowych neuronów BrdU-dodatnich w hipokampie. W tej puli ostro generowanych neuronów stwierdziliśmy 40% wyczerpanie od pierwszego dnia do trzech miesięcy, przy czym prawie 50% nowo powstałych neuronów przeżywa co najmniej 12 miesięcy po leczeniu10,11. Liczenie neuronów znakowanych BrdU przebiegało według ścisłego schematu próbkowania, w którym cały hipokamp został pocięty na odcinki o grubości 80 μm, a następnie podpróbkowanie co 5sekcji z losowym rozpoczęciem próbkowania między sekcją pierwszą a piątą. Zakładając, że te sekcje są wybierane w sposób systematyczny, jest to ewidentnie doskonała metoda zmniejszania wariancji wyniku końcowego, bez wyczerpującego liczenia1. Ten schemat próbkowania pozwolił nam policzyć neurony BrdU-dodatnie średnio w 12 (8-16) sekcjach hipokampa w każdym mózgu szczura, z końcową precyzją 9-11%.
W przypadku stosowania metody frakcjonowania niezbędna jest znajomość ułamka wysokości przekroju, w którym odbywa się liczenie, ponieważ podczas obróbki histologicznej często dochodzi do kurczenia się i deformacji tkanek14. Rzeczywiście, w tym badaniu zaobserwowaliśmy znaczny spadek grubości. Ponadto należy zauważyć, że może wystąpić różnicowy skurcz tkanek, jak przedstawiono w Dorph-Petersen i wsp. 2001. Jednak tak długo, jak cała struktura będąca przedmiotem zainteresowania jest dostępna do analizy, ograniczenia te nie skutkują odchyleniem całkowitej liczby cząstek, tj. neuronów BrdU-dodatnich. W badaniach, w których szczególnym problemem jest kurczenie się tkanek, zawsze należy stwierdzić, że wyniki uzyskuje się w zdeformowanej tkance. W tym badaniu policzyliśmy wysokość dwugałęzi wynoszącą 10 μm. Przekroje niniejszego badania miały końcową średnią grubość 26 μm, strefę ochronną 5 μm u góry i 11 μm (średnią) strefę ochronną u dołu sekcji. Parametry te są dopuszczalne, ponieważ strefy ochronne powinny mieć w przybliżeniu średnicę cząstki, z której pobierane są próbki.
Po wyznaczeniu GCL/SGZ, dysektory zostały równomiernie losowo rozmieszczone w obrębie wyznaczonego obszaru. Dysektory powinny być ustawione ze stałą długością kroku, która optymalizuje pobieranie próbek i liczenie, aby skutecznie uzyskać szacunki z precyzją określoną przez badacza. Optymalna precyzja jest zwykle osiągana poprzez zliczenie do 150-200 komórek w każdej interesującej strukturze5. W niniejszym badaniu naliczyliśmy średnio 133 (zakres 33-372) neuronów BrdU-dodatnich w każdym hipokampie szczura. Ze względu na niską liczbę komórek u niektórych zwierząt kontrolnych, nasza liczba neuronów BrdU-dodatnich spadła poniżej ogólnie akceptowalnej liczby komórek wymaganej do uzyskania odpowiedniej precyzji, co skutkowało stosunkowo wysokimi wartościami CE w tych przypadkach. Ponieważ jednak uzyskaliśmy wartości CE mniejsze niż połowa wartości CV (patrz sekcja dotycząca reprezentatywnych wyników), dodatkowe pobieranie próbek i liczenie nie było wymagane. Wysokie wartości CV pokazują, że największy udział w obserwowanej zmienności ma zmienność biologiczna. Rzeczywiście, możemy stwierdzić, że średnia liczba neuronów BrdU-dodatnich zliczonych w niniejszym badaniu była wyższa niż to konieczne. Na przykład w jednej grupie szczurów osiągnęliśmy wartość CE na poziomie 9%, a wartość CV zaobserwowaliśmy na poziomie 43%. W tym konkretnym przypadku mogliśmy dążyć do precyzji na poziomie około 20%. Podsumowując, precyzja całkowitej liczby neuronów BrdU-dodatnich w niniejszym badaniu jest wystarczająca, ponieważ ujmuje rzeczywiste efekty leczenia na rzeczywistą liczbę cząstek. Ze względu na dość dużą zmienność biologiczną w niektórych grupach zwierząt, te same szacunki można było uzyskać z akceptowalną precyzją, pomimo mniejszych nakładów wysiłku. Wysokie różnice biologiczne w obrębie grup mogą być zrekompensowane jedynie poprzez zwiększenie liczby zwierząt.
Można argumentować, że złoty standard uzyskiwania dokładnych numerów komórek pociąga za sobą wyczerpujące liczenie wszystkich obiektów zainteresowania. Jednak w większości badań nad mózgiem nie jest to możliwe ze względu na ogromną liczbę komórek. Chociaż opcjonalny frakcjonator jest znacznie bardziej wydajny niż wyczerpujące zliczanie komórek, jest stosunkowo czasochłonny w porównaniu z prostym badaniem przesiewowym różnic w liczbie komórek, które jest preferowane, jeśli dokładna liczba komórek nie jest niezbędna. Z naszego doświadczenia wynika, że różnice przekraczające 20-30% można wykryć wyłącznie za pomocą procedur przesiewowych.
Przy prawidłowym przeprowadzeniu pobierania próbek przy użyciu stereologii opartej na projekcie zapewnia bezstronne i precyzyjne szacunki w efektywny sposób1. Bezstronna właściwość stereologii tworzy oszacowania, które po powtórzeniu przybliżają rzeczywistą średnią populacji i zwiększają odtwarzalność oszacowania21. Na początku należy uzyskać reprezentatywną próbkę całej struktury będącej przedmiotem zainteresowania (w tym badaniu GCL/SGZ hipokampa), co pozwala na oszacowanie w statystycznie ważnym podzbiorze sekcji4. Aby uzyskać odpowiednią liczbę sekcji i sond zliczających, stosujemy SURS, który zmniejsza wariancję w porównaniu z próbkowaniem losowym8. Co więcej, SURS zapewnia, że cząstki będące przedmiotem zainteresowania w strukturze są próbkowane z takim samym prawdopodobieństwem, niezależnie od ich wielkości, kształtu, orientacji i rozmieszczenia w strukturze. W związku z tym badania geologiczne są wysoce zalecane, gdy uzyskanie precyzyjnych i bezstronnych szacunków jest centralnym aspektem projektu.
Oświadczenia
Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Dziękujemy Susanne Sørensen za umiejętną pomoc techniczną. Prace te zostały wsparte grantami z Fundacji Velux; Fundacja Jascha; Fundacja Aase i Ejnara Danielsensów; Fundacja Braci Hartmann; Dyrektor Jacob Madsen i żona Olga Madsens Foundation; Doktor Sofus Carl Emil Friis i jego żona Doris Friis' Trust; Fundacja z 1870 r.; Fundacja Torbena i Alice Frimodts oraz Fundacja Badań Neurologicznych. Redakcja manuskryptu została wykonana przez Inglewood Biomedical Editing.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Materiały | |||
| 5'-bromo-2'deoksyurydyna - BrdU | Sigma-Aldrich | 19-160 | |
| Cresyl Violet | Sigma-Aldrich | C5042 | Zawiera następujące materiały na 1 L: 0,2 g fioletu krezylowego; 2,0 g octanu sodu, 3 H2O; 3 ml lodowatego kwasu octowego; 1000 ml wody destylowanej |
| Krioprotektant | Region Stołeczny Apteka, DK | 861334 | Zawiera następujące materiały: Sacharoza; poliwinylopirolidon PVP 40; bufor fosforanu sodu (0,2 M); glikol etylenowy; Zdemineralizowana. |
| dH2O | Apteka Regionu Stołecznego, DK | 817205 | |
| Diaminobenzydyna – DAB | Sigma-Aldrich | D5637 | |
| Envision-HRP | DAKO | K4001 | Polimer znakowany peroksydazą sprzężony z kozimi immunoglobulinami przeciw mysim |
| Etanol - 70 % | Plum A/S | 201098 | |
| Etanol - 96 % | Plum A/S | 201104 | |
| Etanol - 99,9 % | Plum A/S | 201111 | |
| Płodowa surowica bydlęca | In vitro | BI-04-003-1A | |
| H2O2 30% | Apteka Regionu Stołecznego, DK | 896456 | |
| HCl | J. T. Baker | 6081 | |
| Podłoże montażowe | Sakura | 4583 | Tissue Tek |
| Mouse-anti-BrdU | Becton-Dickinson | 347580 | |
| PBS Bufor | Region Stołeczny Apteka, DK | 853436 | pH = 7,4 |
| PFA | VWR | 28,794,295 | pH = 7,4 |
| Bufor fosforanowy | Apteka Regionu Stołecznego, DK | 866533 | 0,1 mol/l, pH 7,4 |
| Szybkoschnące podłoże montażowe | Histolab Products AB | 801 | Pertex |
| Tetraboran sodu | Merck A/S | 1 063 080 500 | |
| Sacharoza | Merck A/S | 1 076 515 000 | |
| Triton X-100 | Merck A/S | 1 086 031 000 | |
| Ksylen | VWR | 28 973 363 | |
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
| >Equipment | |||
| Szkiełka nakrywkowe | Menzel-Glä ser | 24x50 mm #0 | |
| Kriostat | Leica | CM1860 | |
| Mikrokator cyfrowy | Heidenhain | VRZ 401 | |
| Naczynia szklane | Brain Resaerch Laboratories | 1256 | |
| Mikroskop | Nikon | Eclipse 80i | |
| Kamera mikroskopowa | Olympus | DP72 | |
| Szkiełka mikroskopowe | VWR | 48311-703 | SuperFrost + |
| stopień zmotoryzowany | Prior | H101A Pojemniki wielotalerzowe | |
| Sigma-Aldrich | D6315-1CS | Oprogramowanie Nuclon 12-wells | |
| New-Cast | Visiopharm | ver. 4.5.6.440 | |
| Obiektyw 2x | Nikon | CFI Plan UW 2X Obiektyw 4x | |
| Nikon | CFI Plan Fluor 4X | ||
| Obiektyw 10x | Nikon | CFI Plan Fluor 10X | |
| Obiektyw 100x zanurzenie w oleju | Nikon | CFI Plan Apo Lambda DM 100X Olej | Przysłona numeryczna 1.40 |
| Wytrząsarka orbitalna | Gemini BV | CM-9 | Sarstedt |
| Stojak na slajdy | Sakura | 4465 | |
| Naczynia do barwienia szkiełek | Sakura | 4457 | Tissue-Tek |
| Dysk na próbki | Leica | 14037008637 | |
| Siatki do barwienia | Laboratoria Badań Mózgu | 2512 | 25-dołkowe |
Bibliografia
- Boyce, R. W., Dorph-Petersen, K. A., Lyck, L., Gundersen, H. J. Design-based stereology: Introduction to basic concepts and practical approaches for estimation of cell number. Toxicol. Pathol. 38 (7), 1011-1025 (2010).
- West, M. J. Introduction to stereology. 2012 (8), Cold Spring Harb. Protoc. 843-851 (2012).
- West, M. J. Stereological methods for estimating the total number of neurons and synapses: issues of precision and bias. Trends Neurosci. 22 (2), 51-61 (1999).
- Gundersen, H. J., Jensen, E. B. The efficiency of systematic sampling in stereology and its prediction. J. Microsc. 147 (Pt 3), 229-263 (1987).
- West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. Anat. Rec. 231 (4), 482-497 (1991).
- Kaae, S. S., Chen, F., Wegener, G., Madsen, T. M., Nyengaard, J. R. Quantitative hippocampal structural changes following electroconvulsive seizure treatment in a rat model of depression. Synapse. 66 (8), 667-676 (2012).
- Chen, F., Madsen, T. M., Wegener, G., Nyengaard, J. R. Repeated electroconvulsive seizures increase the total number of synapses in adult male rat hippocampus. Eur Neuropsychopharmacol. 19 (5), 329-338 (2009).
- Gundersen, H. J., Jensen, E. B. V., Kiëu, K., Nielsen, J. The efficiency of systematic sampling in stereology - reconsidered. J.Microsc. 193 (3), 199-211 (1999).
- West, M. J. Design based stereological methods for estimating the total number of objects in histological material. Folia Morphol.(Warsz). 60 (1), 11-19 (2001).
- Olesen, M. V., Wörtwein, G., Pakkenberg, B. Electroconvulsive stimulation, but not chronic restraint stress, causes structural alterations in adult rat hippocampus - a stereological study. Hippocampus. 25 (1), 72-80 (2015).
- Olesen, M. V., Wortwein, G., Folke, J., Pakkenberg, B. Electroconvulsive stimulation results in long-term survival of newly generated hippocampal neurons in rats. Hippocampus. 27 (1), 52-60 (2017).
- Madsen, T. M., et al. Increased neurogenesis in a model of electroconvulsive therapy. Biol Psychiat. 47 (12), 1043-1049 (2000).
- Cameron, H. A., Mckay, R. D. G. Adult neurogenesis produces a large pool of new granule cells in the dentate gyrus. J.Comp. Neurol. 435 (4), 406-417 (2001).
- Dorph-Petersen, K. A., Nyengaard, J. R., Gundersen, H. J. G. Tissue shrinkage and unbiased stereological estimation of particle number and size. J.Microsc. 204 (3), 232-246 (2001).
- Schmitz, C., Hof, P. R. Recommendations for straightforward and rigorous methods of counting neurons based on a computer simulation approach. J Chem. Neuroanat. 20 (1), 93-114 (2000).
- Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , 2nd edn, Academic Press. Sydney. (1986).
- Kempermann, G., Gast, D., Kronenberg, G., Yamaguchi, M., Gage, F. H. Early determination and long-term persistence of adult-generated new neurons in the hippocampus of mice. Development. 130 (2), 391-399 (2003).
- Fabricius, K., Wortwein, G., Pakkenberg, B. The impact of maternal separation on adult mouse behaviour and on the total neuron number in the mouse hippocampus. Brain Struct. Funct. 212 (5), 403-416 (2008).
- Dorph-Petersen, K. A., et al. Volume and neuron number of the lateral geniculate nucleus in schizophrenia and mood disorders. Acta neuropathologica. 117 (4), 369-384 (2009).
- Eriksen, N., et al. Application of stereological estimates in patients with severe head injuries using CT and MR scanning images. Br. J. Radiol. 83 (988), 307-317 (2010).
- Gundersen, H. J. Stereology: the fast lane between neuroanatomy and brain function--or still only a tightrope? Acta Neurol. Scand. Suppl. 137, 8-13 (1992).
Przedruki i uprawnienia
