Artykuł metodologiczny

Glikoinżynieria metaboliczna kwasu sjalowego z wykorzystaniem mannozaminy modyfikowanych N-acylem

DOI:

10.3791/55746

⸱

25 listopada 2017

 , 
1Max von Pettenkofer-Institut & Genzentrum, Virologie, Nationales Referenzzentrum für Retroviren, Medizinische Fakultät, LMU München, 2Institut für Laboratoriumsmedizin, klinische Chemie und Pathobiochemie, Charité - Universitätsmedizin Berlin, 3Institut für Physiologische Chemie, Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kwas sjalowy to typowa jednostka monosacharydowa występująca w glikokoniugatach. Bierze udział w wielu interakcjach molekularnych i komórkowych. W artykule przedstawiono metodę modyfikacji ekspresji kwasu sjalowego na powierzchni komórki za pomocą glikoinżynierii metabolicznej z pochodnymi N-acetylmannosaminy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kwas sjalowy (Sia) jest bardzo ważnym składnikiem glikokoniugatów, takich jak N- i O-glikany czy glikolipidy. Ze względu na swoje położenie na nieredukujących końcach oligo- i polisacharydów, a także swoje unikalne właściwości chemiczne, kwas sjalowy bierze udział w wielu różnych interakcjach receptor-ligand. Modyfikując ekspresję kwasu sjalowego na powierzchni komórki, w konsekwencji wpłynie to na interakcje zależne od kwasu sjalowego. Może to być pomocne w badaniu interakcji zależnych od kwasu sjalowego i może potencjalnie wpływać na niektóre choroby w korzystny sposób. Poprzez glikoinżynierię metaboliczną (MGE) można modulować ekspresję kwasu sjalowego na powierzchni komórki. W tym przypadku komórki, tkanki, a nawet całe zwierzęta są traktowane zmodyfikowanymi C2 pochodnymi N-acetylmannosaminy (ManNAc). Te aminokwasy cukry działają jako cząsteczki prekursorowe kwasu sjalowego i dlatego są metabolizowane do odpowiednich gatunków kwasu sjalowego i wyrażane na glikokoniugatach. Zastosowanie tej metody daje intrygujące efekty w różnych procesach biologicznych. Na przykład może drastycznie zmniejszyć ekspresję kwasu polisjalowego (polySia) w leczonych komórkach neuronalnych, a tym samym wpływać na wzrost i różnicowanie neuronów. Tutaj pokazujemy syntezę chemiczną dwóch najczęstszych pochodnych N-acylomannozaminy modyfikowanej C2, N-propionylomannozaminy (ManNProp) oraz N-butanoylmannosaminy (ManNBut), a ponadto pokazujemy, jak te nienaturalne aminocukry można zastosować w eksperymentach z hodowlą komórkową. Ekspresja zmodyfikowanych gatunków kwasu sjalowego jest oznaczana ilościowo za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) i dalej analizowana za pomocą spektrometrii mas. Wpływ na ekspresję kwasu polisjalowego jest wyjaśniany za pomocą Western blot przy użyciu dostępnego na rynku przeciwciała przeciwko kwasowi polisjalowemu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kwas sjalowy jest monosacharydem, który zazwyczaj można znaleźć na nieredukujących końcach glikokoniugatów, takich jak N- i O-glikany lub glikolipidy. Spośród wszystkich cukrów prostych kwas sjalowy ma pewne unikalne właściwości chemiczne. Ma szkielet 9 atomów C, grupę karboksylową w pozycji C-1, która jest deprotonowana, a tym samym naładowana ujemnie w warunkach fizjologicznych, oraz funkcję aminową w pozycji C-5. Chociaż do tej pory scharakteryzowano ponad 50 naturalnie występujących wariantów kwasu sjalowego1, dominującą formą kwasu sjalowego występującą u ludzi jest kwas N-acetyloneuraminowy (Neu5Ac). Inne ssaki również wyrażają większe ilości kwasu N-glikolylneuraminowego (Neu5Gc)2,3.

Ze względu na swoją eksponowaną pozycję w glikokoniugatach, kwas sjalowy bierze udział w wielu interakcjach receptor-ligand, np. zależne od hemaglutyniny wiązanie wirusa grypy z komórkami gospodarza4. Epitopem kwasu sjalowego pełniącym ważne funkcje biologiczne, zwłaszcza podczas embriogenezy i w układzie nerwowym, jest kwas polisjalowy. Kwas polisjalowy jest polimerem zawierającym do 200 połączonych kwasów sjalowych alfa 2,8. Głównym nośnikiem białkowym kwasu polisjalowego jest cząsteczka adhezyjna komórek nerwowych (NCAM). Ekspresja kwasu polisjalowego moduluje właściwości adhezyjne NCAM, ponieważ ekspresja kwasu polisjalowego zmniejsza adhezję i zwiększa plastyczność układu nerwowego5.

Zmiany w ekspresji kwasu (poli)sjalowego ostatecznie wpłyną na wiele różnych interakcji biologicznych. Można to wykorzystać do badania znanych procesów zależnych od kwasu sjalowego na poziomie molekularnym, do odkrycia nowych interakcji glikokoniugatów lub zbadania możliwych podejść terapeutycznych. Dostępne są różne metody, za pomocą których można modulować ekspresję kwasu sjalowego na powierzchni komórki, na przykład leczenie glikozydazami specyficznymi dla kwasu sjalowego (sialidazy), hamowanie enzymów biorących udział w biosyntezie kwasu sjalowego6,7,8, lub obniżenie lub zmiana ekspresji kluczowego enzymu biosyntezy kwasu sjalowego9.

Inną wszechstronną metodą modulowania ekspresji kwasu sjalowego jest MGE (znana również jako metaboliczna inżynieria oligosacharydowa, MOE). W tym przypadku komórki, tkanki, a nawet zwierzęta są traktowane nienaturalnymi pochodnymi ManNAc, które zawierają modyfikacje C2-amino. Będąc cząsteczkami prekursorowymi kwasu sjalowego, po wychwycie komórkowym, te analogi ManNAc są jednokierunkowo metabolizowane do nienaturalnych kwasów sjalowych i mogą ulegać ekspresji na sjalowych glikokoniugatach. Komórki potraktowane pochodnymi ManNAc przenoszącymi alifatyczne modyfikacje C2, takie jak ManNProp lub ManNBut, zawierają kwas N-propionyloneuraminowy (Neu5Prop) lub kwas N-butanoylneuraminowy (Neu5But) w swoich glikokoniugatach10,11. Wykorzystując grupy funkcyjne wprowadzone do pozycji C2 ManNAc, występujące nienaturalne kwasy sjalowe mogą być sprzężone, np. poprzez ligację Staudingera lub cykloaddycję azydku alkinu, z barwnikami fluorescencyjnymi i w ten sposób uwidocznione na powierzchni komórki12.

Ekspresja tych nienaturalnych kwasów sjalowych ma intrygujący wpływ na wiele procesów biologicznych, w tym infekcje patogenami, adhezję i migrację komórek nowotworowych, ogólną adhezję komórek, a także unaczynienie i różnicowanie (dla przeglądu patrz: Wratil et al.13). Co ciekawe, MGE z mannosaminami modyfikowanymi N-acylem może być również używany do zakłócania ekspresji kwasu polisjalowego. Kwas polisjalowy jest wytwarzany przez dwie różne polisjalotransferazy (ST8SiaII i ST8SiaIV). Wykazano, że polisjalilotransferaza ST8SiaII jest hamowana przez nienaturalne prekursory kwasu sjalowego, takie jak ManNProp lub ManNBut14,15. Ponadto wykazano w ludzkich komórkach nerwiaka zarodkowego, że zastosowanie ManNProp lub ManNBut również zmniejsza sialilację w całości15.

MGE z mannosaminami modyfikowanymi N-acylem to łatwa do zastosowania metoda, która została z powodzeniem zastosowana, nie tylko w hodowlach komórkowych ssaków i bakterii, ale także u całych zwierząt różnych gatunków, takich jak Caenorhabditis elegans16, danio pręgowany17, lub myszy18,19,20,21. Zwłaszcza pochodne ManNAc zawierające modyfikacje alifatyczne, w tym ManNProp i ManNBut, są pomijalnie cytotoksyczne, nawet w stężeniach milimolowych w pożywce do hodowli komórkowych lub osoczu krwi. Ponadto są stosunkowo łatwe do syntezy.

Tutaj podajemy szczegóły dotyczące stosowania MGE z mannosaminami modyfikowanymi N-acetylem. Po pierwsze, wyjaśniono syntezę chemiczną dwóch najczęściej stosowanych pochodnych ManNAc w tej dziedzinie, ManNProp i ManNBut. Następnie pokazujemy, jak MGE można zastosować w eksperymencie in vivo. Jako przykład, linia komórkowa nerwiaka zarodkowego Kelly została wybrana, aby wykazać zmniejszoną ekspresję epitopu polisjalowego przez Western blot po leczeniu pochodnymi ManNAc. Nienaturalne kwasy sjalowe na powierzchni komórki oznaczono ilościowo za pomocą HPLC i poddano dalszej analizie za pomocą spektrometrii mas.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie i odczynników

  1. Przygotowanie 3 mM roztworu mettlenku sodu
    1. Rozpuścić 8,1 mg mettlenku sodu w 50 ml metanolu (3 mM) w szklanej butelce o pojemności 100 ml z mieszadłem. Przechowywać w temperaturze pokojowej (RT) przez kilka tygodni.
  2. Przygotowanie buforu Tris-HCl
    1. Połącz 8,766 g NaCl, 157 mg Tris-HCl i 146 mg EDTA w szklanej butelce o pojemności 100 ml z mieszadłem i rozpuść w 80 ml wody.
    2. Dodać wodorotlenek sodu (1 M, w wodzie) lub HCl (20%, w wodzie) do roztworu mieszającego, obserwując pH za pomocą pH-metru, i dostosować pH do 8,0.
    3. Dodaj objętość wody potrzebną do uzyskania końcowej objętości 100 ml. Przefiltrować roztwór za pomocą sterylnego systemu filtrów 0,22 μm.
      UWAGA: 100 ml buforu Tris-HCl będzie zawierał 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl i 5 mM EDTA (pH 8,0). Roztwór można przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni.
  3. Przygotowanie roztworu aprotyniny
    1. Rozpuść 10 mg aprotyniny w 1 ml wody (1,54 mM). Roztwór aprotyniny rozdzielić na 10 probówek z tworzywa sztucznego o pojemności 1,5 ml (każda po 100 μl). Przechowywać w temperaturze -20 °C przez kilka tygodni.
  4. Przygotowanie roztworu leupeptyny
    1. Rozpuścić 10 mg leupeptyny w 2 ml wody (10 mM). Podać roztwór leupeptyny 10 x 1,5 ml plastikowych probówek. Przechowywać w temperaturze -20 °C przez kilka tygodni.
  5. Przygotowanie roztworu fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF)
    1. Rozpuścić 34,8 mg PMSF w 2 ml etanolu (100 mM). Roztwór PMSF należy rozdzielić do 10 probówek z tworzywa sztucznego o pojemności 1,5 ml. Przechowywać w temperaturze -20 °C przez kilka tygodni.
  6. Przygotowanie roztworu dichlorowodorku 1,2-diamino-4,5-metylodioksybenzolu (DMB)
    1. Połącz 15,62 mg DMB, 352 μl β-merkaptoetonu i 48 μl roztworu wodorosiarczynu sodu (39%) i dodaj 9,6 ml wody (6,9 mM DMB, 500 mM β-merkaptoetanolu i 0,19% wodorosiarczynu sodu). Roztwór DMB należy rozmieścić w 40 probówkach z tworzywa sztucznego o pojemności 1,5 ml (każda po 250 μl). Przechowywać w chronionym przed światłem w temperaturze -20 °C przez kilka tygodni.
  7. Przygotowanie 1 M roztworu kwasu trifluorooctowego (TFA)
    1. Dodaj 770,3 μl 100% TFA do 9,23 ml wody w plastikowej tubie o pojemności 15 ml (1 M). Przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni.
  8. Przygotowanie roztworu TFA o stężeniu 120 mM
    1. Dodaj 92,4 μl TFA (100%) do 9,91 ml wody (120 mM) w plastikowej tubie o pojemności 15 ml. Przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni.
  9. Przygotowanie 400 mM roztworu wodorotlenku sodu (NaOH)
    1. Rozpuścić 160 mg NaOH w 10 ml wody (400 mM) w plastikowej probówce o pojemności 15 ml. Przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni.
  10. Przygotowanie buforu do lizy Western blot
    1. Rozpuścić 5,84 g NaCl, 0,1 g tris(hydroksymetylo)-aminometanu (Tris), 0,1 g CaCl2, 0,95 g MgCl2 i 1 g Triton-X100 w 100 ml wody i dostosować pH do 7,8. Przechowywać w temperaturze 4 °C. Dodać 100 μl każdego inhibitora proteazy (aprotyniny, leupeptyny i PMSF) przed użyciem buforu do lizy.
  11. Przygotowanie buforu do elektroforezy w żelu poliakryloamidowym dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE)
    1. Rozpuść 0,3 g Tris, 1,5 g glicyny i 0,1 g SDS w 100 ml wody i dostosuj pH do 7,3. Sklep w RT.
  12. Przygotowanie buforu Western blot
    1. Rozpuść 0,3 g Tris, 1,1 g glicyny w 90 ml wody i dodaj 10 ml etanolu. Sklep w RT.
  13. Przygotowanie roztworu blokującego
    1. Rozpuść 1 g mleka beztłuszczowego w 25 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Zawsze przygotowuj świeże.

2. Synteza ManNProp i pokrewnych mannozaminy modyfikowanych N-acylem

  1. Rozpuścić 431,2 mg chlorowodorku mannozaminy w 10 ml 3 ml roztworu mettlenku sodu w szklanej butelce o pojemności 50 ml z mieszadłem.
  2. Schłodzić mieszaninę na lodzie do temperatury 0 °C. Do roztworu mieszającego powoli dodawać kroplami 210 μl chlorku propionylu (2,4 mmol) lub 248 μl chlorku butanoylu (2,4 mmol) w celu syntezy odpowiednio ManNProp lub ManNBut. Mieszaninę mieszającą inkubować w temperaturze 0 °C przez 4 godziny.
  3. Przenieść roztwór do plastikowej probówki o pojemności 50 ml. Wbij 4-8 otworów w pokrywkę plastikowej rurki cienką igłą. Szybko zamrozić roztwór za pomocą ciekłego azotu, a następnie liofilizować (liofilizować go) przez 48 godzin lub do całkowitego wyschnięcia.
  4. Zmieszaj 350 g żelu krzemionkowego 60 z 750 ml octanu etylu/metanolu/wody (15:2:1) (jest to zawiesina). Napełnić szklaną kolumnę (o średnicy 35 mm i długości 70 cm) zawiesiną żelu krzemionkowego 60 i przed użyciem umyć przygotowaną kolumnę dodatkowym 100 ml octanu etylu/metanolu/wody (15:2:1).
  5. Rozpuścić wysuszone produkty z etapu 2.3 (5 g suchego produktu) w 10 ml octanu etylu/metanolu/wody (15:2:1) i załadować je pipetą do kolumny z żelem krzemionkowym. Zebrać 4 ml frakcji po 500 ml (dla ManNProp). UWAGA: ManNBut wymywa się z kolumny około po 700 ml.
  6. Uwolnione frakcje przenieść do plastikowych probówek o pojemności 15 ml. Wbij 3-6 otworów w pokrywkę plastikowej rurki cienką igłą. Szybko zamrozić roztwór za pomocą ciekłego azotu, a następnie liofilizować go aż do całkowitego wyschnięcia.
    UWAGA: Produkty liofilizowane mogą być przechowywane przez kilka miesięcy w RT.
  7. Sprawdzić czystość produktów za pomocą spektrometrii mas (patrz sekcja 9).
    UWAGA: Alternatywnie, czystość można również zweryfikować za pomocą 1-godzinnegomagnetycznego rezonansu jądrowego (NMR).

3. Hodowla komórkowa

  1. Hodowla komórek nerwiaka zarodkowego Kelly'ego w pożywce Roswell Park Memorial Institute (RPMI) zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej, 100 U penicyliny, 100 mg streptomycyny, 2 mM L-glutaminy zawierającej 5 mM ManNAc, 5 mM ManNProp lub 5 mM ManNBut, w temperaturze 37 °C i 5% CO2,
    UWAGA: Komórki hodowane w pożywce bez ManNAc lub jego analogów są używane jako kontrola.
  2. Przed zastosowaniem mannozaminy należy odłączyć komórki nerwiaka zarodkowego Kelly'ego, inkubując je przez 10 minut z trypsyną/EDTA (0,25%, 0,02% w PBS) i policzyć za pomocą komory Neubauera lub licznika komórek. Zasiej komórki pod zdefiniowanymi liczbami w oparciu o rozmiar talerza/naczynia.
    1. Aby zmierzyć cukrów prostych kwasu sjalowego, wysiewaj 1 x 105 komórek w pożywce o objętości 500 μl na 48-dołkową płytkę do hodowli tkankowej. Do analizy kwasów polisjalowych wysiewa się 1 x 106 komórek w 3 ml pożywki na szalce do hodowli komórkowej o średnicy 6 cm. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Wymieniaj podłoże co 24 godziny < br /> UWAGA: Efekt MGE nasila się wraz z całkowitym czasem leczenia. Aby uzyskać wysoką wydajność metaboliczną, traktuj komórki przez 5-7 dni.
  3. Po zabiegu zdekantować podłoże. Umyj talerze/naczynia za pomocą PBS. Odłącz komórki, inkubując je przez 10 minut z trypsyną/EDTA (0,25%, 0,02%, w PBS). Zneutralizuj trypsynę, dodając tę samą objętość pożywki do hodowli komórkowych do oderwanych komórek. Przenieś oderwane komórki do plastikowych probówek o pojemności 15 ml. Odwirować próbki przez 3 minuty przy 500 x g i odrzucić supernatant.
    1. Dodać 5 ml PBS i odwirować komórki (patrz krok 3.3). Powtórz procedurę prania jeszcze dwa razy.
      UWAGA: Przemyte osady komórkowe bez supernatantu można przechowywać w temperaturze -20 °C przez kilka dni. Jeśli ekspresja kwasu polisjalowego ma zostać wyjaśniona, przejdź do punktu 10.

4. Liza komórek do analizy HPLC

  1. Przygotowanie buforu do lizy HPLC
    1. Połącz 5 ml buforu Tris-HCl, 5 μl roztworu aprotyniny, 20 μl roztworu leupeptyny i 50 μl roztworu PMSF.
      UWAGA: 5 ml buforu do lizy HPLC będzie zawierało 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 1,54 μM aprotyniny, 40 μM leupeptyny i 1 mM PMSF (pH 8,0). Ten bufor powinien być zawsze przygotowywany świeży przed lizą komórek.
  2. Ponownie zawiesić zebrane granulki komórek (krok 3.3) każdy w 500 μl lodowatego buforu do lizy HPLC i ultra-sonicyzować próbki za pomocą igły procesora ultradźwiękowego trzy razy przez okres 30 s przy średnio-wysokich amplitudach. Próbki należy schłodzić na lodzie przez co najmniej 1 minutę pomiędzy cyklami.

5. Separacja frakcji membranowej

  1. Odwirować próbki zlizowanych komórek przez 2 godziny w temperaturze 20 000 x g i w temperaturze 4 °C. Oddzielić supernatant (około 480 μl), reprezentujący białka cytozolowe, w plastikowych probówkach o pojemności 1,5 ml. Oznaczyć stężenie białka w tych frakcjach, stosując np. test Bradforda lub test kwasu bicinchoninowego (BCA).
    UWAGA: Stężenie białka (około 1 mg/ml) frakcji cytozolowych można później odnieść do zmierzonych ilości szanowanych gatunków kwasu sjalowego. Osad reprezentuje frakcję membrany, która jest używana w kroku 6.1.

6. Hydroliza kwasowa

UWAGA: Oligo- i polisacharydy w błonach komórkowych są hydrolizowane do monosacharydów. Co więcej, możliwe modyfikacje O w cukrów prostych są również hydrolizowane. Jest to konieczne do ilościowej analizy HPLC, ponieważ przytłaczająca większość kwasów sjalowych we frakcjach błonowych jest naturalnie włączona do glikokoniugatów i może zawierać modyfikacje O-acetylu lub O-laktolilu.

  1. Dodać 150 μl 1 M roztworu TFA do oddzielonych frakcji membranowych (osad z sekcji 5). Inkubować próbki przez 4 godziny w temperaturze 80 °C z wytrząsaniem przy 200-600 obr./min.
  2. Odwirowywać próbki przez około 30 minut przy 20 000 x g i temperaturze 21 °C przy użyciu probówek filtracyjnych o pojemności 0,5 ml z membranami wykluczającymi 3 kDa, aż objętość górnej fazy będzie mniejsza niż 20 μl.
    UWAGA: Ten krok jest ważny, aby pozbyć się zanieczyszczeń o wyższej masie cząsteczkowej.
  3. Przenieść dolną fazę zawierającą mniejsze cząsteczki, w tym kwas sjalowy, do plastikowych probówek o pojemności 2 ml. Wbij 2-4 otwory w nasadkach plastikowych rurek cienką igłą. Szybkie zamrożenie próbek za pomocą ciekłego azotu, a następnie liofilizacja przez noc.
    UWAGA: Wysuszone próbki można przechowywać przez kilka dni w temperaturze pokojowej. Wymień nakrętkę bez otworów, aby zapewnić dłuższe przechowywanie.

7. Etykietowanie fluorescencyjne

  1. Ponownie zawiesić wysuszone próbki w 10 μl 120 mM roztworze TFA i dodać 50 μl roztworu DMB. Przenieś próbki do ciemnych probówek o pojemności 1,5 ml, aby chronić je przed światłem ultrafioletowym.
  2. W przypadku wzorców rozpuść 1 μl Neu5Ac (60 ng/ml w wodzie) lub 1 μl Neu5Gc (60 ng/ml w wodzie) w 10 μl 120 mM roztworze TFA w ciemnych probówkach o pojemności 1,5 ml. Dodać 50 μl roztworu DMB.
  3. Próbki błony komórkowej i wzorce należy inkubować przez 1,5 godziny w temperaturze 56 °C, chroniąc przed światłem. Po inkubacji dodać 4 μl 400 mM roztworu NaOH do każdej próbki, aby zatrzymać reakcję znakowania.

8. Analiza HPLC

UWAGA: Znakowane próbki są analizowane w systemie HPLC wyposażonym w kolumnę C18 RP (110 A, wielkość cząstek 3 μm, 4,6 x 150 mm), detektor fluorescencji i kolektor frakcji. Stosowane rozpuszczalniki to metanol, acetonitryl i woda. Upewnij się, że odgazowałeś wszystkie rozpuszczalniki przed pomiarami, jeśli system HPLC nie ma wewnętrznego odgazowywacza.

  1. Ustaw temperaturę kolumny na 40 °C i skonfiguruj detektor fluorescencji odpowiednio na 373 nm dla wzbudzenia i 448 nm dla emisji. Wstrzyknąć próbkę o objętości 10 μl i rozdzielić sondy na 50 minut przy natężeniu przepływu 0,5 ml/min z metanolem/acetonitrylem/wodą (6:8:86) jako eluentem. Do analizy spektrometrii mas zbierz interesujące nas piki.
    UWAGA: Oczekuje się, że Neu5Gc wypłynie po 6-8 minutach, Neu5Ac po 9 - 12 minutach, Neu5Prop po 17 - 23 minutach, a Neu5But po 38 - 44 minutach. Frakcjonowane próbki można przechowywać przez kilka godzin w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem.
  2. Po zmierzeniu każdej próbki przemyć kolumnę przez 7,5 minuty przy natężeniu przepływu 1,0 ml/min (objętość ≈ 1,5 kolumny) metanolem/acetonitrylem/wodą (6:25:69) i ponownie wyrównać układ przez 7,5 minuty przy natężeniu przepływu 1,0 ml/min z metanolem/acetonitrylem/wodą (6:8:86).
  3. Do analizy ilościowej należy obliczyć obszar pod krzywą pików kwasu sjalowego będącego przedmiotem zainteresowania, korzystając z oprogramowania operacyjnego odpowiedniego systemu HPLC22.
    UWAGA: Uzyskane dane można odnieść do wzorca Neu5Ac lub Neu5Gc oraz do zmierzonych stężeń białek we frakcjach cytozolowych (patrz punkt 5.1).

9. Analiza spektrometrii mas cukrów prostych kwasu sjalowego

UWAGA: Interesujące piki retencji HPLC mogą być dalej analizowane za pomocą chromatografii cieczowej (LC) spektrometrii mas z elektrorozpylaniem i jonizacją (ESI-MS), w celu weryfikacji nienaturalnych gatunków kwasu sjalowego.

  1. W celu analizy spektrometrii mas wstrzyknij 20 μl pobranej próbki do systemu LC/selektywnego detektora masy (MSD) z 79,9% metanolem, 20% alkoholem izopropylowym i 0,1% kwasem mrówkowym jako eluentem, natężeniem przepływu 0,5 ml/min, napięciem kapilarnym 4 kV i temperaturą kapilarną 350 °C22,23.
  2. W oprogramowaniu oceniającym odpowiedniego systemu LC/MSD wybrać interesujący nas pik na chromatogramie jonów całkowitych. Umożliwia wyświetlenie widma masowego rozwiązanego piku. Wyświetlanie dodatniego stosunku masy do ładunku w zakresie od 300 do 700,
    UWAGA: Znakowanie DMB kwasów sjalowych prowadzi do wzrostu masy cząsteczkowej o 116,2 g/mol. Formy kwasu sjalowego znakowane DMB mają następujące masy cząsteczkowe: DMB-Neu5Ac = 424,2 g/mol, DMB-Neu5Gc = 441,8 g/mol, DMB-Neu5Prop = 436,2 g/mol, DMB-Neu5But = 453,2 g/mol. Częstymi adduktami są acetonitryl, sód lub alkohol izopropylowy.

10. Analiza Western Blot kwasu polisjalowego w komórkach nerwiaka zarodkowego Kelly'ego

  1. Przygotowanie lizatów komórkowych
    1. Dodaj 1 ml buforu do lizy Western blot do granulek komórek z kroku 3.3 i wiruj. Inkubować przez 30 minut na lodzie. Wir co 5 minut. Odwirowywać próbki przez 1,5 godziny w temperaturze 20 000 x g w temperaturze 4 °C. Zebrać supernatant zawierający białka z komórek poddanych lizie.
    2. Określić stężenie białka we frakcjach białkowych, np. test Bradforda lub test BCA. Rozcieńczyć próbki do stężenia białka 1,5 μg/μl w buforze do lizy.
    3. Przygotuj próbki do SDS-PAGE, dodając 10 μl buforu próbki Laemmli do 90 μl frakcji białkowej (1,5 μg/μL) i gotuj próbkę przez 5 min24.
  2. Immunoblotting (Immunoblotting)
    1. Stosować 8% żele akrylowe SDS z kieszeniami 20 - 30 μl i grubością 0,75 lub 1 mm. Uruchom żel pod ciśnieniem 25 mA przez 2 godziny przy RT.
    2. Ostrożnie zdejmij szklaną osłonę z żelu. Wytnij i wyrzuć górną część żelu zawierającą kieszenie ładunkowe. Żel umieszczamy na membranie nitrocelulozowej (0,2 μm), uprzednio nasączonej buforem Western blot. Przenieść białka do nitrocelulozy zgodnie z zaleceniami systemu (np. 250 mA przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C).
    3. Usunąć membranę nitrocelulozową z systemu bibuły. Zabarwić plamę czerwienią Panceau, aby uwidocznić białka. Przenieść membranę nitrocelulozową do plastikowej komory i dodać 10 ml roztworu blokującego. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.
    4. Zdekantować roztwór blokujący i dodać przeciwciało monoklonalne anty-polySia 735 (1 μg/ml) do PBS. Inkubować błonę przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C. Po inkubacji przemyć membranę co najmniej trzy razy przez 5 minut PBS.
    5. Dodać poliklonalne przeciwciało drugorzędowe anty-mysie IgG (1 μg/ml) sprzężone z peroksydazą chrzanową (HRP) lub znacznikiem fluorescencyjnym w PBS. Inkubować błonę przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Po inkubacji przemyć membranę co najmniej trzy razy przez 5 minut PBS.
    6. Przenieść membranę na płytkę odpowiedniego imagera. Wykryj sygnał zgodnie z instrukcjami producenta.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chromatogramy HPLC fluorescencyjnego znakowanego Neu5Ac i wzorców Neu5Gc są przedstawione w Rysunek 2. Stosując opisaną tu metodę, Neu5Gc znakowany DMB zwykle eluuje między 7 - 9 minutami elucji, a DMB-Neu5Ac między 10 - 12 minutami. Kilka mniejszych pików na chromatogramie pojawia się zwykle między 2 - 6 minutami. Te piki reprezentują nieprzereagowane DMB i półprodukty reakcji25.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jeżeli chemicznie syntetyzowane pochodne ManNAc, ManNProp i ManNBut są analizowane za pomocą spektrometrii mas, należy zidentyfikować tylko prawidłowy pik masy dla obu próbek. W związku z tym można przyjąć, że produkty mają czystość powyżej 99%. Niewielkie ilości Neu5Gc, który normalnie nie występuje w komórkach ludzkich29, są wykrywane we frakcjach błonowych komórek poddanych lizie. Najprawdopodobniej dzieje się to poprzez szlak ratunkowy, który rekrutuje Neu5Gc z płodowych koniugatów sialoglykok...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy L. D. Nguyenowi za korektę manuskryptu i owocne dyskusje. Ponadto dziękujemy J. Dernedde i H. G. Nguyenowi za pomoc w przygotowaniu sesji zdjęciowej. Większość scen filmu została nakręcona w laboratoriach R. Taubera. Dziękujemy również Instytutowi Maxa Plancka za koloidy i interfejsy oraz za umożliwienie nam bezpłatnego dostępu do ich laboratorium spektrometrii mas. RH był wspierany przez DFG (ProMoAge).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
KomórkiSigma-Aldrich92110411
RPMI podłożeSigma-AldrichR8758
75 ml kolby do hodowli tkankowychGreiner690175
48-dołkowe Corning3548
FCSPAAA15-102
Pióro/PaciorkowiecGibco15140-122
TrypsynaGibco15400-054
EDTARothX986.1
TrisServa37190.03
SDSRoth2326.2
Sprzęt SDS-PAGE (zbiorniki, szkło itp., maszynaVWRSDS Gel/Blot
AcrylamideRoth3019.1
Drabinka białkowaFisher Scientific267620
NitrocelulozaGE Healthcare10600002
Pęczek czerwonyRoth5938.2
Mleko w proszkuRothT145.3
ECLMilliporeWBLUF 0500
0,5 ml Filtr odśrodkowy z membraną 3 kDaMerck-MilliporeUFC500324
probówki wirówkowe 15 mlSigma-Aldrich (Corning)CLS430791-500EA
2-merkaptoetanolSigma-AldrichM6250-10ML
2-PropanolSigma-Aldrich34965-1LHPLC gradient klasy
4,5-metylenodioksy-1,2-fenylenodiaminy dichlorowodorekSigma-AldrichD4784-50MG
48 dołk, płaska płytka do hodowli tkankowejSigma-Aldrich (Corning)CLS3548-100EA
50 ml probówki wirówkoweSigma-Aldrich (Corning)CLS430829-500EA
AcetonitrylSigma-Aldrich34967-1LHPLC gradientowa
aprotynina z płuc bydlęcychSigma-AldrichA1153-10MGliofilizowany proszek, 3-8 TIU/mg stały
chlorek butyryluSigma-Aldrich109614-250G
C18 Kolumna RPPhenomenex00F-4435-E0110 Å, 3 &mikro; Wielkość cząstek M, 4,6 x 150 mm
Chlorowodorek D-mannozaminySigma-AldrichM4670-1G
Dulbecco's Buforowany fosforanem roztwór soliPAN BiotechP04-36500
Kwas etylenodiaminotetraoctowySigma-AldrichE9884-100G
Kwas mrówkowySigma-Aldrich56302-50ML-GL
Roztwórkwasu solnegoSigma-AldrichH1758-100ML36,5-38,0%, w wodzie
LeupeptinSigma-AldrichL2884-10MG
MetanolCarl-RothT169.2HPLC klasa gradientu
N-acetylo-D-mannozaminaSigma-AldrichA8176-250MG
Kwas N-acetyloneuraminowySigma-AldrichA0812-25MG
Kwas N-glikolyloneuraminowySigma-AldrichG9793-10MG
Fluorek fenylometanosulfonyluSigma-AldrichP7626-250MG
Chlorek propionyluSigma-AldrichP51559-500G
Probówki Safe-Lock, 1,5 mL, bursztynowe (ochrona przed światłem)Probówki Eppendorf30120191
Safe-Lock, 1,5 mL, bezbarwneEppendorf30120086
Sodium roztwór wodorosiarczynuSigma-Aldrich13438-1L-R-D40%, w wodzie
Chlorek soduSigma-Aldrich746398-500G-D
Wodorotlenek soduSigma-Aldrich795429-500G-D
Wodorotlenek soduroztwór Sigma-Aldrich319511-500ML1,0 M, w wodzie
Mettlenek soduSigma-Aldrich164992-5G
Kwas trifluorooctowySigma-AldrichT6508-100ML-D Chlorowodorek
TrisSigma-AldrichT5941-100G
Trypsyna 0,25 %/EDTA 0,02 % w PBSPAN BiotechP10-019100
WodaCarl-RothT905.1Klasa gradientu HPLC
Żel krzemionkowy 60Carl-Roth9779.1
HPLCAgilent
System ESI-MSDAgilent

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Angata, T., Varki, A. Chemical diversity in the sialic acids and related alpha-keto acids: An evolutionary perspective. Chem Rev. 102, 439-469 (2002).
  2. Schauer, R., Schoop, H. J., Faillard, H. On biosynthesis of glycolyl group of N-glycolylneuraminic acid. oxidation of N-acetyl group to glycolyl group. Hoppe-Seylers Zeitschrift Fur Physiologische Chemie. 349, (1968).
  3. Irie, A., Koyama, S., Kozutsumi, Y., Kawasaki, T., Suzuki, A. The molecular basis for the absence of N-glycolylneuraminic acid in humans. J Biol Chem. 273, 15866-15871 (1998).
  4. Kelm, S., et al. Use of sialic acid analogues to define functional groups involved in binding to the influenza virus hemagglutinin. Eur J Biochem. 205, 147-153 (1992).
  5. Colley, K. J., Kitajima, K., Sato, C. Polysialic acid: Biosynthesis, novel functions and applications. Crit Rev Biochem Mol Biol. 49, 498-532 (2014).
  6. Rillahan, C. D., et al. Global metabolic inhibitors of sialyl- and fucosyltransferases remodel the glycome. Nat Chem Biol. 8, 661-668 (2012).
  7. Wratil, P. R., et al. A Novel Approach to Decrease Sialic Acid Expression in Cells by a C-3-modified N-Acetylmannosamine. J Biol Chem. 289, 32056-32063 (2014).
  8. Nieto-Garcia, O., et al. Inhibition of the key enzyme of sialic acid biosynthesis by C6-Se modified N-acetylmannosamine analogs. Chem Sci. 7, 3928-3933 (2016).
  9. Keppler, O. T., et al. UDP-GlcNAc 2-epimerase: A regulator of cell surface sialylation. Science. 284, 1372-1376 (1999).
  10. Kayser, H., et al. Biosynthesis of a nonphysiological sialic acid in different rat organs, using N-propanoyl-D-hexosamines as precursors. J Biol Chem. 267, 16934-16938 (1992).
  11. Keppler, O. T., et al. Biosynthetic modulation of sialic acid-dependent virus-receptor interactions of two primate polyoma viruses. J Biol Chem. 270, 1308-1314 (1995).
  12. Laughlin, S. T., Bertozzi, C. R. Imaging the glycome. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12-17 (2009).
  13. Wratil, P. R., Horstkorte, R., Reutter, W. Metabolic Glycoengineering with N-Acyl Side Chain Modified Mannosamines. Angewandte Chemie International Edition. 55, 9482-9512 (2016).
  14. Horstkorte, R., et al. Selective inhibition of polysialyltransferase ST8Siall by unnatural sialic acids. Exp Cell Res. 298, 268-274 (2004).
  15. Gnanapragassam, V. S., et al. Sialic Acid Metabolic Engineering: A Potential Strategy for the Neuroblastoma Therapy. PLOS ONE. 9, 10(2014).
  16. Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. A strain-promoted 3+2 azide-alkyne cycloaddition for covalent modification of blomolecules in living systems. J Am Chem Soc. 126, 15046-15047 (2004).
  17. Dehnert, K. W., et al. Imaging the Sialome during Zebrafish Development with Copper-Free Click Chemistry. ChemBioChem. 13, 353-357 (2012).
  18. Prescher, J. A., Dube, D. H., Bertozzi, C. R. Chemical remodelling of cell surfaces in living animals. Nature. 430, 873-877 (2004).
  19. Neves, A. A., et al. Imaging sialylated tumor cell glycans in vivo. Faseb Journal. 25, 2528-2537 (2011).
  20. Vogt, J., et al. Homeostatic regulation of NCAM polysialylation is critical for correct synaptic targeting. Cell Mol Life Sci. 69, 1179-1191 (2012).
  21. Qiu, L., et al. A novel cancer immunotherapy based on the combination of a synthetic carbohydrate-pulsed dendritic cell vaccine and glycoengineered cancer cells. Oncotarget. 6, 5195-5203 (2015).
  22. Erikson, E., et al. Mouse Siglec-1 Mediates trans-Infection of Surface-bound Murine Leukemia Virus in a Sialic Acid N-Acyl Side Chain-dependent Manner. J Biol Chem. 290, 27345-27359 (2015).
  23. Klein, A., Diaz, S., Ferreira, I., Lamblin, G., Roussel, P., Manzi, A. E. New sialic acids from biological sources identified by a comprehensive and sensitive approach: liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry (LC-ESI-MS) of SIA quinoxalinones. Glycobiology. 7, 421-432 (1997).
  24. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during assembly of head of bacteriophage-T4. Nature. 227, (1970).
  25. Orozco-Solano, M. I., Priego-Capote, F., Luque de Castro, M. D. Ultrasound-assisted hydrolysis and chemical derivatization combined to lab-on-valve solid-phase extraction for the determination of sialic acids in human biofluids by µ-liquid chromatography-laser induced fluorescence. Analytica Chimica Acta. 766, 69-76 (2013).
  26. Hara, S., Takemori, Y., Yamaguchi, M., Nakamura, M., Ohkura, Y. Fluorometric high-performance liquid chromatography of N-acetyl- and N-glycolylneuraminic acids and its application to their microdetermination in human and animal sera, glycoproteins, and glycolipids. Anal Biochem. 164, 138-145 (1987).
  27. İzzetoğlu, S., Şahar, U., Şener, E., Deveci, R. Determination of sialic acids in immune system cells (coelomocytes) of sea urchin, Paracentrotus lividus, using capillary LC-ESI-MS/MS. Fish Shellfish Immunol. 36, 181-186 (2014).
  28. Wolf, S., et al. Chemical Synthesis and Enzymatic Testing of CMP-Sialic Acid Derivatives. ChemBioChem. 13, 2605-2615 (2012).
  29. Sonnenburg, J. L., Altheide, T. K., Varki, A. A uniquely human consequence of domain-specific functional adaptation in a sialic acid-binding receptor. Glycobiology. 14, 339-346 (2004).
  30. Oetke, C., et al. Evidence for efficient uptake and incorporation of sialic acid by eukaryotic cells. Eur J Biochem. 268, 4553-4561 (2001).
  31. Buttner, B., et al. Biochemical engineering of cell surface sialic acids stimulates axonal growth. J Neuro. 22, 8869-8875 (2002).
  32. Kontou, M., Weidemann, W., Bork, K., Horstkorte, R. Biological Chemistry. 390, 575(2009).
  33. Tanaka, F., et al. Expression of polysialic acid and STX, a human polysialyltransferase, is correlated with tumor progression in non small cell lung cancer. Cancer Res. 60, 3072-3080 (2000).
  34. Cheng, B., Xie, R., Dong, L., Chen, X. Metabolic Remodeling of Cell-Surface Sialic Acids: Principles, Applications, and Recent Advances. ChemBioChem. 17, 11-27 (2016).
  35. Collins, B. E., Fralich, T. J., Itonori, S., Ichikawa, Y., Schnaar, R. L. Conversion of cellular sialic acid expression from N-acetyl- to N-glycolylneuraminic acid using a synthetic precursor, N-glycolylmannosamine pentaacetate: inhibition of myelin-associated glycoprotein binding to neural cells. Glycobiology. 10, 11-20 (2000).
  36. Schwartz, E. L., Hadfield, A. F., Brown, A. E., Sartorelli, A. C. Modification of sialic acid metabolism of murine erythroleukemia cells by analogs of N-acetylmannosamine. Biochimica Et Biophysica Acta. 762, 489-497 (1983).
  37. Jones, M. B., et al. Characterization of the cellular uptake and metabolic conversion of acetylated N-acetylmannosamine (ManNAc) analogues to sialic acids. Biotechnol Bioeng. 85, 394-405 (2004).
  38. Bayer, N. B., et al. Artificial and Natural Sialic Acid Precursors Influence the Angiogenic Capacity of Human Umbilical Vein Endothelial Cells. Molecules. 18, 2571-2586 (2013).
  39. Schmidt, C., Stehling, P., Schnitzer, J., Reutter, W., Horstkorte, R. Biochemical engineering of neural cell surfaces by the synthetic N-propanoyl-substituted neuraminic acid precursor. J Biol Chem. 273, 19146-19152 (1998).
  40. Laughlin, S. T., Bertozzi, C. R. In Vivo Imaging of Caenorhabditis elegans Glycans. ACS Chem Biol. 4, 1068-1072 (2009).
  41. Laughlin, S. T., Baskin, J. M., Amacher, S. L., Bertozzi, C. R. In vivo imaging of membrane-associated glycans in developing zebrafish. Science. 320, 664-667 (2008).
  42. Chang, P. V., et al. Copper-free click chemistry in living animals. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 1821-1826 (2010).
  43. Gagiannis, D., Gossrau, R., Reutter, W., Zimmermann-Kordmann, M., Horstkorte, R. Engineering the sialic acid in organs of mice using N-propanoylmannosamine. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1770, 297-306 (2007).
  44. Rong, J., et al. Glycan Imaging in Intact Rat Hearts and Glycoproteomic Analysis Reveal the Upregulation of Sialylation during Cardiac Hypertrophy. J Am Chem Soc. 136, 17468-17476 (2014).
  45. Galuska, S. P., et al. Quantification of Nucleotide-Activated Sialic Acids by a Combination of Reduction and Fluorescent Labeling. Anal Chem. 82, 4591-4598 (2010).
  46. Harms, E., Reutter, W. Half-Life Of N-Acetylneuraminic Acid In Plasma-Membranes Of Rat-Liver And Morris Hepatoma 7777. Cancer Res. 34, 3165-3172 (1974).
  47. Kolarich, D., Lepenies, B., Seeberger, P. H. Glycomics, glycoproteomics and the immune system. Curr Opin Chem Biol. 16, 214-220 (2012).
  48. Preidl, J. J., et al. Fluorescent Mimetics of CMP-Neu5Ac Are Highly Potent, Cell-Permeable Polarization Probes of Eukaryotic and Bacterial Sialyltransferases and Inhibit Cellular Sialylation. Angewandte Chemie-International Edition. 53, 5700(2014).
  49. Macauley, M. S., et al. Systemic Blockade of Sialylation in Mice with a Global Inhibitor of Sialyltransferases. J Biol Chem. 289, 35149-35158 (2014).
  50. Jorge, P., Abdul-Wajid, A. Sialyl-Tn-KLH, glycoconjugate analysis and stability by high-pH anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection (HPAEC-PAD). Glycobiology. 5, 759-764 (1995).
  51. Lin, S. L., Inoue, Y., Inoue, S. Evaluation of high-performance anion-exchange chromatography with pulsed electrochemical and fluorometric detection for extensive application to the analysisof homologous series of oligo- and polysialic acids in bioactive molecules. Glycobiology. 9, 807-814 (1999).
  52. Pan, Y. B., Chefalo, P., Nagy, N., Harding, C., Guo, Z. W. Synthesis and immunological properties of N-modified GM3 antigens as therapeutic cancer vaccines. J Med Chem. 48, 875-883 (2005).
  53. Chefalo, P., Pan, Y. B., Nagy, N., Guo, Z. W., Harding, C. V. Efficient metabolic engineering, of GM3 on tumor cells by N-phenylacetyl-D-mannosamine. Biochemistry. 45, 3733-3739 (2006).
  54. Lee, S., et al. Chemical Tumor-Targeting of Nanoparticles Based on Metabolic Glycoengineering and Click Chemistry. ACS Nano. 8, 2048-2063 (2014).
  55. Koulaxouzidis, G., Reutter, W., Hildebrandt, H., Stark, G. B., Witzel, C. In vivo stimulation of early peripheral axon regeneration by N-propionylmannosamine in the presence of polysialyltransferase ST8SIA2. J Neural Transm. , 1-9 (2015).
  56. Gnanapragassam, V. S., et al. Correction: Sialic Acid Metabolic Engineering: A Potential Strategy for the Neuroblastoma Therapy. PLOS ONE. 11, e0154289(2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Modyfikacja kwasu sialowegoN acylo mannozaminaanaliza polikwasu sialowegowysokosprawna chromatografia cieczowaspektrometria masWestern blottraktowanie kultur kom rkowychznakowanie fluorescencyjneanaliza HPLC

Powiązane artykuły