Artykuł metodologiczny

Spersonalizowane igły do mikroiniekcji w mózg gryzoni

DOI:

10.3791/55751

⸱

24 stycznia 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Sciences, Section of Pharmacology, and National Institute of Neurosciences, University of Ferrara, 2Laboratory for the Technologies for Advanced Therapies (LTTA), University of Ferrara

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy tutaj protokół mikroiniekcji do mózgu gryzonia, który wykorzystuje igły kwarcowe. Igły te nie powodują wykrywalnych uszkodzeń tkanek i zapewniają niezawodne dostarczanie nawet w głębokich obszarach. Co więcej, mogą być dostosowywane do potrzeb badawczych poprzez spersonalizowane projekty i mogą być ponownie wykorzystywane.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrozastrzyki były używane od dawna do dostarczania leków lub toksyn do określonych obszarów mózgu, a ostatnio były używane do dostarczania produktów terapii genowej lub komórkowej. Niestety, obecne techniki mikroiniekcji wykorzystują stalowe lub szklane igły, które są nieoptymalne z wielu powodów: w szczególności stalowe igły mogą powodować uszkodzenie tkanek, a szklane igły mogą się wyginać, gdy są opuszczane głęboko w mózg, omijając obszar docelowy. W tym artykule opisujemy protokół przygotowania i używania igieł kwarcowych, które łączą w sobie szereg przydatnych funkcji. Igły te nie powodują wykrywalnych uszkodzeń tkanek i, będąc bardzo sztywne, zapewniają niezawodne dostarczanie w pożądanym obszarze mózgu, nawet przy użyciu głębokich współrzędnych. Ponadto istnieje możliwość personalizacji projektu igły poprzez wykonanie wielu otworów o pożądanej średnicy. Wiele otworów ułatwia wstrzykiwanie dużych ilości roztworu na większą powierzchnię, podczas gdy duże otwory ułatwiają wstrzykiwanie komórek. Ponadto te igły kwarcowe można czyścić i ponownie używać, dzięki czemu procedura staje się opłacalna.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrozastrzyki są używane od dawna do dostarczania farmakologicznie aktywnych związków do modulowania aktywności neuronalnej w określonych obszarach mózgu. Ponadto były one używane do wstrzykiwania toksyn w pobliżu określonych populacji neuronów, do naśladowania zdarzeń neurodegeneracyjnych charakterystycznych dla niektórych chorób, na przykład 6-hydroksy-dopaminy w układzie dopaminy nigrostriatal w celu naśladowania choroby Parkinsona1,2 lub immunotoksyny 192 IgG saporyny w celu uszkodzenia układu cholinergicznego3. Ostatnio procedury mikroiniekcji są stosowane do dostarczania wektorów wirusowych lub przeszczepów komórek do terapii genowej lub komórkowej eksperymentalnych zaburzeń mózgu4,5.

Klasyczny rodzaj igieł używanych w tych badaniach jest wykonany ze stali nierdzewnej. Chociaż są łatwe i praktyczne w użyciu, stalowe igły mają wiele problemów6: są stosunkowo duże i mogą powodować uszkodzenie tkanek, z wyciekiem bariery krew-mózg i aktywacją astrocytów; Co więcej, mogą wytwarzać rdzenie tkanki mózgowej, która dostaje się do igły, tworząc przeszkodę lub nawet całkowicie uniemożliwiając przepływ pożądanego roztworu. Ostatnio wprowadzono do użytku igły szklane przygotowywane ad hoc z naczyń włosowatych7,8. Nie powodują one znacznych uszkodzeń tkanek ani aktywacji astrocytów, ale są stosunkowo elastyczne i mogą się wyginać po wprowadzeniu do głębokich struktur, zmniejszając dokładność lokalizacji (obserwacje osobiste).

Istnieje zatem potrzeba jak największego zmniejszenia uszkodzeń (zwłaszcza podczas przeprowadzania eksperymentów w celu leczenia uszkodzeń) przy jednoczesnym zwiększeniu dokładności i powtarzalności (tj. upewnienia się, że wszystkie rozwiązania zostały dostarczone i zapewnienia poprawnej lokalizacji). Ponadto pożądane byłoby stosowanie różnych konstrukcji igieł w celu zapewnienia optymalnego rozprowadzenia wstrzykiwanego roztworu w obszarach mózgu o różnej geometrii. W tym artykule opisujemy protokół przygotowania i użycia igieł kwarcowych do mikroiniekcji w mózg gryzonia. Ze względu na wysoką temperaturę topnienia kapilar kwarcowych nie można naciągnąć na konwencjonalny ściągacz i dlatego nie były używane w przeszłości do generowania igieł. Kwarc ma jednak kilka ważnych zalet w porównaniu ze szkłem, w szczególności wysoką sztywność i odporność na pękanie9. Ze względu na swoją sztywność igły kwarcowe idealnie nadają się do wstrzykiwań w brzuszne obszary mózgu. Ze względu na ich wysoką odporność na pękanie, mogą być modelowane tak, aby zawierały wiele otworów, uzyskując projekty, które mogą okazać się najbardziej skuteczne nawet w przypadku celowania w obszary mózgu o złożonej geometrii10.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie protokoły eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komitet Etyczny Uniwersytetu w Ferrarze ds. Eksperymentów na Zwierzętach oraz przez włoskie Ministerstwo Zdrowia. Wytyczne ARRIVE (Animal Research: Reporting In Vivo Experiments11) są przestrzegane.

1. Przygotowanie igieł kwarcowych

  1. Oczyść i wysterylizuj kapilary kwarcowe (patrz Tabela materiałów), umieszczając je na 5 minut w wodzie destylowanej, 5 minut w etanolu 99% i 5 minut w eterze dietylowym.
  2. Pozostaw naczynka pod maską na co najmniej 1 godzinę, aby całkowicie wyschły.
  3. Igły należy przygotować za pomocą ściągacza laserowego zgodnie z parametrami pozwalającymi na wyprodukowanie odpowiednio długiej, odpowiednio cienkiej igły, w zależności od indywidualnych potrzeb.
    UWAGA: Używamy ściągacza laserowego (patrz Tabela materiałów). Użyj programu z dwiema liniami do ciągnięcia. Pierwsza linia wykorzystuje dużą moc, największą długość skanowania (odpowiadającą WARTOŚCI FILAMENTÓW) i brak siły ciągnącej. Ta kombinacja parametrów prowadzi do stopienia największej części kapilary przy najmniejszej prędkości rozciągania, co pozwala na ukształtowanie długiej igły o dużym rozmiarze wewnętrznym/zewnętrznym i zmniejszonym trzpieniu. W ten sposób igła zachowuje wysoką odporność mechaniczną i szeroką średnicę wewnętrzną, która umożliwia przejście komórek macierzystych lub cząstek wirusa bez zapychania. Prędkość i opóźnienie tej linii programu powinny zatrzymać wydłużenie kapilary, zanim końcówka stanie się zbyt mała i długa, tracąc wymagane właściwości mechaniczne i kształtowe. Druga linia programu ciągnącego jest wykonywana automatycznie, gdy kwarc ostygnie (5 s). Parametry mocy, filamentu i siły ciągnącej są funkcjonalne, aby przeciąć końcówkę o jak najkrótszej długości końcówki i stromym trzpieniu, unikając rozdzielenia dwóch igieł przy zerwaniu końcówki. Rutynowo z naszym sprzętem używamy: (a) Linia 1 = moc 990, żarnik 5, prędkość 130, opóźnienie 110, ciągnięcie 0; (b) Linia 2 = moc 970, żarnik 3, prędkość 0, opóźnienie 70, pociągnięcie 0.
  4. Umieść igły na szalce Petriego uprzednio oczyszczonej etanolem 70%.
    1. Przykryj naczynie plastikową folią parafinową.
  5. Przeciąć naczynia włosowate w mikrodyssektorium.
    1. Podczas rozruchu pozwól laserowi uruchomić proces autokalibracji w celu sprawdzenia mocy i dostarczonej energii. Następnie ustaw parametry cięcia.
      UWAGA: Stosujemy mikrodyssektor (patrz Tabela Materiałów) i następujące parametry: moc lasera energia impulsu (63 μJ), średnica wiązki laserowej 20% maksymalnej apertury (maksymalna apertura: 1,0 μm), oraz prędkość cięcia 10% maksymalnej prędkości (maksymalna prędkość: 30 μm/s).
    2. Mocno przymocuj igłę do stołu mikroskopu i umieść jej końcówkę na środku ekranu komputera.
    3. Na pasku menu kliknij ikonę ołówka i użyj jej, aby narysować znak do laserowego cięcia igły.
      UWAGA: Cięcie powinno odbywać się pod kątem około 45° w stosunku do powierzchni igły.
    4. Na pasku bocznym należy wybrać flagę zawierającą przycisk "START CUT", aby umożliwić laserowi przecięcie wcześniej zaznaczonego miejsca.
    5. W razie potrzeby wytnij boczny otwór(y), powtarzając procedury opisane w 1.5.2-3; nie ma potrzeby zmiany położenia igły (Rysunek 1).
  6. Czyszczenie po cięciu.
    1. Podłącz igłę do pompy próżniowej przez plastikową rurkę.
    2. Włącz pompę i ręcznie ustaw natężenie przepływu do przodu na umiarkowaną prędkość (3 μl/min).
    3. Najpierw odessaj 99% etanol, a następnie wodę destylowaną, aby usunąć zanieczyszczenia spowodowane cięciem.
    4. Ponownie odessać 99% etanolu, aby ułatwić suszenie.
      UWAGA: Każdy krok powinien trwać co najmniej 3 minuty.
  7. Igły należy przechowywać na odpowiednio przykrytej szalce Petriego do dnia zabiegu.
  8. Igły mogą być ponownie użyte; na koniec eksperymentu oczyścić je wybielaczem i etanolem, aby usunąć roztwór i ewentualne pozostałości tkanek. Aby uzyskać pełniejsze czyszczenie, umieść igły w słoiku do przechowywania mikropipet końcówką skierowaną w dół, napełnij słoik wodą destylowaną, aż końcówki zostaną przykryte, gotuj przez 1,5 minuty, aby usunąć resztki tkanki, a następnie umyj etanolem.

2. Procedura

  1. Postępując zgodnie z instrukcjami zawartymi w instrukcji obsługi pompy, wybierz menu ustawień, aby skalibrować pompę zgodnie ze średnicą/objętością strzykawki do mikroiniekcji i ustaw natężenie przepływu na 0,3 μl/min.
  2. Napełnij strzykawkę o pojemności 10 ml (wyposażoną w igłę (np. igłę Hamiltona, 30 G) i krótką probówkę z politetrafluoroetylenu) sterylną wodą i użyj jej do napełnienia strzykawki do mikroiniekcji (po bardzo ostrożnym wyjęciu tłoka) oraz zestawu części zespołu wtryskowego do ręcznej pompy do mikroiniekcji (MMP).
    UWAGA: Zestaw MMP służy do bezpiecznego zamocowania igły w ramie stereotaktycznej (Rysunek 2). W skład zestawu wchodzą: rurka z politetrafluoroetylenu, mufa typu luer-to-tubing, uchwyt na pipety oraz uszczelki do pipet o różnych średnicach zewnętrznych.
  3. Podłączyć igłę do zestawu MMP.
    1. Przepłukać więcej wody przez strzykawkę o pojemności 10 ml i sprawdzić, czy woda wypływa z igły.
      UWAGA: Upewnij się, że usunąłeś wszelkie pęcherzyki powietrza z wnętrza systemu, powtarzając kroki napełniania.
  4. Odłączyć strzykawkę o pojemności 10 ml od strzykawki do mikroiniekcji, powoli popychając tłok, aby pozostawić kroplę wody w górnej części strzykawki do mikroiniekcji. Włożyć tłok do strzykawki do mikroiniekcji.
  5. Podłączyć strzykawkę do mikroiniekcji do pompy i ustawić natężenie przepływu na 0,3 μl/min.
    UWAGA: Poczekaj, aż kropla zacznie wyciekać z końcówki igły, a następnie pozwól jej odejść na kolejne 3 minuty.
  6. Ustaw przepływ na 0,1 μl/min i rozpocznij zabieg chirurgiczny. Pompa powinna pracować podczas wykonywania zabiegu.
    UWAGA: Do eksperymentów opisanych w tym artykule używamy samców szczurów Sprague Dawley o wadze 300 g (w wieku 3 miesięcy). Procedura ta ma jednak zastosowanie do innych gatunków, w szczególności myszy.
  7. Wywołać znieczulenie ogólne metodą zatwierdzoną przez lokalne przepisy.
    UWAGA: Używamy mieszanki iniekcji dootrzewnowej (i.p.) 85 mg/kg ketaminy i 8 mg/kg ksylazyny przez 20-50 minut znieczulenia. Ważne jest, aby użyć szczypania ogona i/lub palców u nóg, aby upewnić się, że zwierzę jest w pełni uspokojone. Poziom znieczulenia i podstawowe parametry życiowe są oceniane przed rozpoczęciem operacji i monitorowane co 10 minut podczas wykonywania operacji. Temperatura ciała zwierzęcia jest utrzymywana na stałym poziomie przed, w trakcie i po zabiegach chirurgicznych za pomocą poduszki grzewczej z recyrkulacją wody. Zwierzęta są monitorowane do czasu całkowitego wyzdrowienia (np. są wyprostowane i poruszają się). Ponadto zwierzęta otrzymują leki przeciwbólowe (tramadol, 5–7 mg/kg i.p.) po operacji co 24 godziny przez trzy dni.
    1. Ogolić głowę zwierzęcia i odpowiednio przygotować miejsce operowane do operacji aseptycznej. Wykonaj dwuetapowy peeling roztworem na bazie jodu (Betadine), a następnie 70% etanolem. Ponadto, aby utrzymać aseptykę, owiń miejsce operacji serwetą chirurgiczną (w filmie zostało pominięte w celach demonstracyjnych).
  8. Umieść szczura w ramce stereotaktycznej nad kocem grzewczym z recyrkulacją wody. Aby zapewnić dodatkową ulgę w bólu, w miejscu zabiegu należy zastosować 0,5% roztwór lidokainy (nie przekraczać 7 mg/kg). Wstępnie wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne za pomocą sterylizatora perełkowego lub płynnej dezynfekcji na zimno, zanurzając sprzęt w 2% aldehydzie glutarowym i 7,05% fenolu (sporodycynie lub Cidex), a następnie spłucz sterylną wodą lub solą fizjologiczną. Dezynfekcja musi być wykonywana nawet między zabiegami. Wykonaj podłużne nacięcie nad czaszką za pomocą wysterylizowanego skalpela. Bądź delikatny, aby uniknąć nadmiernego krwawienia. Otwórz skórę głowy za pomocą płaskiej szpatułki i przyłóż klipsy chirurgiczne do płatów skóry, aby pozostała otwarta. Bardzo delikatnie odłącz okostną, aby odsłonić bregmę i obszar czaszki, przez który zostanie wprowadzona igła.
  9. Zamontuj ramię na ramie stereotaktycznej (podczas gdy przepływ jest w toku) i przesuń końcówkę igły dokładnie na wierzch bregmy, zwracając uwagę, aby nie złamać jej końcówki. Opisz współrzędne przednio-tylne i środkowo-boczne bregmy i przetłumacz na żądane współrzędne. Prowadzony przez stereomikroskop opuść igłę, aż jej końcówka prawie dotknie czaszki, zaznacz miejsce wiercenia po lekkim podniesieniu ramienia stereotaktycznego.
  10. Wywiercić (końcówka wiertła Ø: 0,8 mm; prędkość wiercenia: 1 000 obr./min) czaszkę w zaznaczonym miejscu. Należy zachować ostrożność, aby nie przebić opony twardej podczas wiercenia. Podczas wiercenia należy wlać sterylną sól fizjologiczną, aby uniknąć uszkodzenia kości i martwicy.
  11. Wytnij mały kawałek plastikowej folii parafinowej i umieść go na czaszce. Za pomocą pipety o pojemności 10 μl przygotować kroplę roztworu do wstrzyknięcia na plastikową folię parafinową. Zatrzymać pompę, lekko odsunąć popychacz pompy i wytworzyć mały pęcherzyk powietrza w kapilarze, delikatnie pociągając za tłok strzykawki do mikroiniekcji.
  12. Opuść ramię stereotaktyczne, aż końcówka igły dotrze do kropli. Pobrać próbkę, pociągając (bardzo powoli) za tłok strzykawki do mikroiniekcji, unikając tworzenia się pęcherzyków. Wymienić popychacz pompy w kontakcie z tłokiem i włączyć pompę przy natężeniu przepływu 0,3 μl/min. Poczekaj, aż utworzy się kropla (kilka minut), zanim przejdziesz do następnego kroku.
    UWAGA: W niniejszym przykładowym eksperymencie sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (aCSF) został wlany do prążkowia (AP: +1,5, ML: ±2,7; DV: -5,0) i w grzbietowym hipokampie (AP: -3,5, ML: ±2,1; DV: -3,5; w mm od opony twardej), 2 μl/miejsce. Aby ułatwić porównanie między dwiema metodami wstrzykiwania, każdy obszar mózgu podawano za pomocą igły kwarcowej w jednej półkuli i końcówki 26 G lub igły ze stali nierdzewnej ze skośną końcówką 30 G w drugiej.
  13. Zmniejsz przepływ do 0,1 μl/min, nacinaj oponę twardą igłą ze skośną końcówką ze stali nierdzewnej i powoli opuść ramię stereotaktyczne na osi grzbietowo-brzusznej, wchodząc do tkanki mózgowej. Po osiągnięciu żądanej pozycji należy zejść o dodatkowe 0,1 mm, zatrzymać pompę, podnieść ramię stereotaktyczne o 0,1 mm i ponownie uruchomić pompę przy przepływie do 0,3 μL/min.
    UWAGA: Powodem utrzymywania powolnego przepływu podczas opuszczania igły jest zapewnienie nadciśnienia, które pozwala uniknąć penetracji małych fragmentów tkanki w samej igle. Takie zdarzenie zablokowałoby końcówkę, pogarszając dostarczanie roztworu. Ponieważ natężenie przepływu jest bardzo małe podczas opuszczania igły, a prędkość obniżania wynosi około 10 s/mm, oznacza to, że ilości roztworu, które pozostają wzdłuż ścieżki igły, są znikome w porównaniu z tymi, które są wstrzykiwane w miejscu docelowym. Tego środka ostrożności można uniknąć w przypadku używania igieł z bocznymi otworami.
  14. Uruchom timer i odczekaj wymagany czas w zależności od żądanej objętości do wstrzyknięcia (na przykład 6 min 40 s w przypadku wstrzykiwania 2 μl). Należy monitorować ruch pęcherzyków podczas wstrzykiwania. Na koniec zatrzymaj pompę i odczekaj 5 minut przed powolnym wyjęciem igły. Gdy igła kwarcowa zostanie całkowicie usunięta, ponownie uruchom pompę i sprawdź, czy na końcu igły nie tworzy się kropla.
  15. Uszczelnij otwór w powierzchni czaszki woskiem kostnym, usuń klipsy hemostatyczne i zszyj skórę głowy, pokryj obszar wokół rany kremem z antybiotykiem (np. neosporin) i umieść zwierzę z powrotem w klatce domowej.
    UWAGA: Zgodnie z protokołem eutanazji zatwierdzonym przez instytucjonalną komisję etyczną, w eksperymentach opisanych w tym artykule, zwierzęta zostały głęboko znieczulone zastrzykiem dożylnym 43 mg/kg ketaminy i 7 mg/kg ksylazyny, a następnie pozbawiono im głowy. Mózgi usunięto, zamocowano w formalinie na 48 godzin i zatopiono w parafinie. Wycinki koronalne (8 μm) mózgu przecięto za pomocą mikrotomu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Porównaliśmy uszkodzenia wywołane bezpośrednim mikrowstrzyknięciem w grzbietowy hipokamp i prążkowie szczura za pomocą igły kwarcowej (końcówka o średnicy zewnętrznej 60 μM; jeden otwór boczny o średnicy 20 μM; typ C, Rysunek 1) w porównaniu z dwiema klasycznymi igłami ze stali nierdzewnej o końcu 26 G i krawędzi skośnej 30 G. W tym celu wstrzyknęliśmy 2 μl aCSF w prawy i lewy grzbietowy hipokamp i prążkowie za pomocą odpowiednio kwarcu i stalowej igły, a po 48 godzina...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Technika opisana w tym artykule spełnia nakreślone we Wstępie potrzeby optymalizacji mikroiniekcji wykonywanych w różnych celach12. Opisane tutaj igły redukują uszkodzenia do minimalnego, zasadniczo niewykrywalnego poziomu; W przeciwieństwie do igieł szklanych (które mają skłonność do zginania), igły kwarcowe są sztywne i zapewniają niezawodne uderzenie w pożądany obszar mózgu nawet w głębokich współrzędnych. Co więcej, boczny otwór zapewnia dostarczanie roztworu nawet wtedy, gdy ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została wsparta grantem ze Wspólnoty Europejskiej [FP7-PEOPLE-2011-IAPP project 285827 (EPIXCHANGE)].

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kapilary kwarcoweSutter Instruments, Novato, CAUSA Q100-50-10Bez ściągacza filamentu
SutterP2000
World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USAE210
Mikrodysektor laserowyLeica Microsystems, Wetzlar, NiemcyLMD6500
Strzykawka HamiltonHamilton ILS Innovative Labor Systeme GmbH, StŸ tzerbach, Niemcy19138-U
Pompa do mikroinfuzjiUniventor, Zejtun, MaltaModel 864
Ręczny zestaw pompy do mikroiniekcjiWPIPozycja#: MMP-KITZestaw umożliwiający bezpieczne zamontowanie mikropipet do ramy stereotaktycznej
Wiertarka precyzyjnaProxxon28510 MicroMot 50/EWał napędowy z łożyskiem kulkowym o zmiennej prędkości
Sztuczny mózgowy Igły do płynu mózgowo-rdzeniowegoTocris3525
26 g i 30 g skośneHamilton26 g: 19138-U
30 g skos: 20757
MicrotomeLeica, NiemcyLEICA RM212RT
Słoik do przechowywania mikropipet

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kirik, D., Rosenblad, C., Björklund, A. Characterization of behavioral and neurodegenerative changes following partial lesions of the nigrostriatal dopamine system induced by intrastriatal 6-hydroxydopamine in the rat. Exp Neurol. 152 (2), 259-277 (1998).
  2. Paolone, G., Brugnoli, A., Arcuri, A., Mercatelli, D., Morari, M. Eltoprazine prevents levodopa-induced dyskinesias by reducing striatal glutamate and direct pathway activity. Mov Disord. 30 (13), 1728-1738 (2015).
  3. Paolone, G., Lee, T. M., Sarter, M. Time to pay attention: attentional performance time-stamped prefrontal cholinergic activation, diurnality, and performance. J Neurosci. 32 (35), 12115-12128 (2012).
  4. Shoichet, M. S., Winn, S. R. Cell delivery to the central nervous system. Adv Drug Deliv Rev. 42, 81-102 (2000).
  5. Simonato, M., et al. Progress in gene therapy for neurological disorders. Nature RevNeurol. 9, 277-291 (2013).
  6. Björklund, H., Olson, L., Hahl, D., Schwarcz, R. Short-and Long-Term Consequences of Intracranial Injections of the Excitotoxin, Quinolinic Acid, as Evidenced by GFA Immunohistochemistry of Astrocytes. Brain Res. 317, 267-277 (1986).
  7. Paradiso, B., et al. Localized delivery of fibroblast growth factor-2 and brain-derived neurotrophic factor reduces spontaneous seizures in an epilepsy model. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (17), 7191-7196 (2009).
  8. Falcicchia, C., et al. Silencing Status Epilepticus-Induced BDNF Expression with Herpes Simplex Virus Type-1 Based Amplicon Vectors. PLoS One. 11 (3), 1-17 (2016).
  9. Munoz, J. L., Coles, J. A. Quartz micropipettes for intracellular voltage microelectrodes and ion-selective microelectrodes. J Neurosci Meth. 22 (1), 57-64 (1987).
  10. Sutter Instruments. P-2000: Laser-Based Micropipette Puller. , Available from: http://www.sutter.com/MICROPIPETTE/p-2000.html (2017).
  11. Kilkenny, C., Browne, W., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Animal research: reporting in vivo experiments: the ARRIVE guidelines. J Cereb Blood Flow Metab. 31, 991-993 (2011).
  12. Torres, E. M., Trigano, M., Dunnett, S. B. Translation of cell therapies to the clinic: characteristics of cell suspensions in large-diameter injection cannulae. Cell Transplant. 24, 737-749 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

ig y kwarcowemikrowstrzykni cia do m zgulaserowy wyci gacz kapilarzestaw stereotaksycznypompa do mikrowstrzykiwaniazapobieganie uszkodzeniom tkanekig y wielorazoweg bokie obszary m zgudostosowywanie igie

Powiązane artykuły