Jonoforeza w czasie rzeczywistym z tetrametyloamonem w celu ilościowego określenia frakcji objętościowej i krętości przestrzeni zewnątrzkomórkowej mózgu

Podsumowanie

Ten protokół opisuje jonoforezę w czasie rzeczywistym, metodę, która mierzy parametry fizyczne przestrzeni zewnątrzkomórkowej (ECS) żywych mózgów. Dyfuzja obojętnej cząsteczki uwolnionej do ECS służy do obliczenia ułamka objętościowego ECS i krętości. Idealnie nadaje się do badania ostrych, odwracalnych zmian w ECS mózgu.

Streszczenie

Ta recenzja opisuje podstawowe pojęcia i protokół do wykonywania metody jonoforezy w czasie rzeczywistym (RTI), złotego standardu do badania i ilościowego określania przestrzeni zewnątrzkomórkowej (ECS) żywego mózgu. ECS otacza wszystkie komórki mózgowe i zawiera zarówno płyn śródmiąższowy, jak i macierz zewnątrzkomórkową. Transport wielu substancji niezbędnych do aktywności mózgu, w tym neuroprzekaźników, hormonów i składników odżywczych, odbywa się poprzez dyfuzję przez ECS. Zmiany w objętości i geometrii tej przestrzeni zachodzą podczas normalnych procesów mózgowych, takich jak sen, i stanów patologicznych, takich jak niedokrwienie. Jednak struktura i regulacja ECS w mózgu, szczególnie w stanach chorobowych, pozostaje w dużej mierze niezbadana. Metoda RTI mierzy dwa parametry fizyczne żywego mózgu: ułamek objętościowy i krętość. Ułamek objętościowy to proporcja objętości tkanki zajmowanej przez ECS. Skrętność jest miarą względnej przeszkody, jaką napotyka substancja podczas dyfuzji przez obszar mózgu, w porównaniu z ośrodkiem bez przeszkód. W RTI obojętna cząsteczka jest pulsowana z mikroelektrody źródłowej do ECS mózgu. Ponieważ cząsteczki dyfundują z dala od tego źródła, zmieniające się stężenie jonu jest mierzone w czasie za pomocą jonoselektywnej mikroelektrody umieszczonej w odległości około 100 μm. Na podstawie wynikowej krzywej dyfuzji można obliczyć zarówno ułamek objętościowy, jak i krętość. Technika ta została wykorzystana w wycinkach mózgu wielu gatunków (w tym ludzi) oraz in vivo do badania ostrych i przewlekłych zmian ECS. W przeciwieństwie do innych metod, RTI może być używany do badania zarówno odwracalnych, jak i nieodwracalnych zmian w ECS mózgu w czasie rzeczywistym.

Wprowadzenie

Przestrzeń zewnątrzkomórkowa (ECS) to sieć połączonych ze sobą kanałów znajdujących się na zewnątrz wszystkich komórek mózgu, zawierająca zarówno płyn śródmiąższowy, jak i macierz zewnątrzkomórkową (Rycina 1a oraz Rycina 1b). Dystrybucja wielu substancji niezbędnych do funkcjonowania komórek mózgu, w tym składników odżywczych, hormonów i neurotransmiterów, odbywa się poprzez dyfuzję w obrębie ECS. Zmiany parametrów fizycznych tej przestrzeni, w tym objętości, geometrii i macierzy zewnątrzkomórkowej, mogą drastycznie wpływać na dyfuzję przez ECS oraz lokalne stężenia jonów otaczających komórki mózgu, co ma głęboki wpływ na funkcjonowanie tych komórek^1,2.

Iontoforeza w czasie rzeczywistym (RTI) jest wykorzystywana do określania dwóch charakterystyk strukturalnych regionu mózgu: frakcji objętościowej oraz krętości^3,4,5. Frakcja objętościowa (α) to proporcja objętości tkanki zajmowanej przez ECS (V_ECS) w stosunku do całkowitej objętości tkanki (V_tissue) w reprezentatywnej objętości elementarnej;

Krętość (λ) to względna przeszkoda, jaką napotyka substancja dyfundując przez region mózgu w porównaniu do ośrodka pozbawionego przeszkód;

gdzie D^* (cm² s^-1) to efektywny współczynnik dyfuzji substancji w mózgu, a D (cm²s^-1) to współczynnik dyfuzji swobodnej substancji w medium swobodnym, takim jak rozcieńczony żel agarozowy.

Obecnie najczęściej stosowaną substancją sondą w metodzie RTI jest mały kation tetrametylammonium (TMA). TMA ma masę cząsteczkową 74 g/mol, całkowicie dysocjuje w roztworze i posiada jeden ładunek dodatni. Badania RTI z wykorzystaniem tego jonu wykazały, że α 0.2 oraz λ 1.6^1,2. Oznacza to, że ECS stanowi w przybliżeniu 20% całkowitej objętości mózgu, a dyfuzja małej, obojętnej cząsteczki zachodzi w ECS około 2,5 raza wolniej niż w ośrodku bez przeszkód³. Jednakże zarówno α, jak i λ zmieniają się w zależności od wieku mózgu, regionu i stanu, a także w warunkach patologicznych¹. Zmiany tych parametrów wiązano z rozwojem mózgu, starzeniem się, snem, epilepsją oraz wieloma innymi podstawowymi procesami i chorobami mózgu^1,6. Choć inne techniki pozwalają mierzyć α i λ, RTI umożliwia pomiar obu tych wartości w lokalnych obszarach żywej tkanki w czasie rzeczywistym. Z tego powodu RTI stało się niezastąpionym narzędziem do badania zmian α i λ podczas ostrych i odwracalnych czynników stresowych.

Teoria wspierająca RTI została pierwotnie zwalidowana przez Nicholsona i Phillipsa, a technika ta jest szeroko stosowana od tamtego czasu^4,7. Eksperymenty z wykorzystaniem RTI rozpoczynają się od uwolnienia impulsu TMA z mikroelektrody źródłowej poprzez jontoforezę do rozcieńczonego żelu agarozowego. Po wyrzuceniu jony swobodnie dyfundują z punktowego źródła, wybierając jedną z potencjalnie nieskończonej liczby losowych ścieżek (Rysunek 1d). Zmieniające się stężenie jonów jest mierzone w czasie za pomocą mikroelektrody selektywnej jonowo (ISM) umieszczonej w odległości około 100 µm (Rysunek 1c). Zmiany stężenia TMA są nanoszone na wykres i dopasowywane do krzywej, co pozwala na obliczenie zarówno D, jak i liczby transportowej mikroelektrody jontoforetycznej (parametry omówione w Protokole). Mając te wartości, procedurę powtarza się w interesującym badacza obszarze mózgu w celu uzyskania D^* oraz obliczenia α i λ. Sterowanie mikroelektrodą jontoforetyczną, zbieranie danych, sporządzanie wykresów i dopasowywanie krzywej stężenia TMA oraz obliczanie parametrów eksperymentalnych są zazwyczaj wykonywane przez programy Wanda i Walter, które zostały zaprojektowane specjalnie w tym celu (oprogramowanie i instrukcje są dostępne bezpłatnie od autorów na żądanie).

Sekcja Protokół niniejszego przeglądu opisuje podstawowe procedury niezbędne do zaprojektowania i przeprowadzenia RTI w skrawkach mózgu gryzoni. Technikę tę stosowano również w modelach niegryzoniowych, w tym w skrawkach mózgu ludzkiego oraz w preparatach mózgu in vivo^1,4,6,8,9. Sekcja Wyniki Reprezentatywne prezentuje zarówno wyniki idealne, jak i nieidealne, aby zwrócić uwagę na niuanse w interpretacji danych. Na koniec sekcja Dyskusja krótko omawia techniki rozwiązywania problemów, ograniczenia RTI, alternatywne techniki stosowane do badania ECS oraz przyszłe zastosowania RTI.

Rycina 1: Schematy dyfuzji przez ECS. (a) Schemat ECS: Przedstawia rozmiar i rozmieszczenie ECS w typowym przekroju mózgu. Kolor żółty oznacza ECS pomiędzy szarymi wypustkami komórek mózgu. Objętość ECS stanowi około 20% całkowitej objętości tkanki (t.j. ułamek objętościowy = 0,2) w warunkach fizjologicznych. (b) Powiększony schemat ECS: Wyróżnia parametry fizyczne przyczyniające się do krętości, w tym geometrię komórek mózgu (szare) i macierz zewnątrzkomórkową (przedstawioną jako sieć wielobarwnych glikozaminoglikanów i proteoglikanów). (c) Trójwymiarowy schemat dyfuzji z punktowego źródła: Przedstawia wypadkowy ruch cząsteczek obojętnych ze źródła iontoforetycznego do ISM. Z pominięciem barier dyfuzyjnych i wychwytu komórkowego cząsteczki dyfundują na zewnątrz we wszystkich kierunkach, tworząc sferyczny front stężeń. ISM określa lokalne stężenie cząsteczek obojętnych uwolnionych ze źródła iontoforetycznego. (d) Symulacja komputerowa dyfuzji w ECS mózgu: [Po lewej] Konfiguracja symulacji Monte Carlo; zielone sfery reprezentują wypustki komórek mózgu, a czerwony krzyżyk reprezentuje źródło punktowe. Ta konfiguracja modeluje tkankę mózgową przedstawioną na Rycini 1a. [Środkowe obrazy] 3 i 6 cząsteczek wykonujących ruchy losowe podczas dyfuzji przez przestrzeń zewnątrzkomórkową mózgu, ukazane w 2 wymiarach. [Po prawej] Błądzenia losowe wielu cząsteczek uwolnionych ze źródła punktowego. Wypadkowy ruch wszystkich cząsteczek ze źródła punktowego jest skierowany na zewnątrz, jak przedstawiono na Rycini 1c. Skumulowane błądzenia losowe obrysowują przestrzenie między komórkami (t.j. ECS; dalsze wyjaśnienia w referencji⁵). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem zwierząt, stosowane w celu uzyskania próbek tkanek, zostały zatwierdzone przez komisję etyki ds. zwierząt w SUNY Downstate Medical Center.

1. Przygotowanie roztworów i sprzętu

1. Przygotować 150 mM roztwór NaCl do wypełnienia referencyjnej komory ISM. Przechowywać go w strzykawce 10 mL z podłączonym filtrem 0,22 µm (w celu usunięcia bakterii lub cząstek).
2. Przygotować 150 mM roztwór chlorku TMA (TMA-Cl) do wypełnienia mikroelektrod. Przechowywać go w strzykawce 10 mL z podłączonym filtrem 0,22 µm. Roztwory TMA-Cl (w tym protokole) należy przygotować z 5 M roztworu stokowego producenta, aby zapewnić właściwe stężenie.
3. Chlorować co najmniej cztery druty srebrne do wykonania mikroelektrod poprzez zanurzenie ich w wybielaczu (podchlorynie sodu) na co najmniej 2 h. Usunąć nadmiar wybielacza za pomocą etanolu i pozostawić druty do wyschnięcia.
4. Przygotować w zlewce 50 mL 0,3% agarozy w 150 mM NaCl i 0,5 mM TMA-Cl, a następnie przykryć naczynie. Należy używać agarozy w proszku, możliwie świeżej, aby zapewnić dokładne pomiary dyfuzji.
5. Podgrzać i wymieszać roztwór agarozy za pomocą mieszadła magnetycznego w celu jej rozpuszczenia. Pozostawić roztwór do ostygnięcia do temperatury pokojowej. Przechowywać w 4 °C przez maksymalnie 1 tydzień.
6. Przygotować elektrodę obojętną (masową) wykonaną z 4% agarozy w 1 M KCl (instrukcje w Suplemencie A).
7. Wykonać mały, porowaty kubek, który zmieści się w komorze eksperymentalnej i zapewni ciągłość elektryczną między jego zawartością a otoczeniem (Rysunek 2a). Umieścić metalowy pierścień na dnie kubka, aby zapobiec jego wypływaniu podczas częściowego zanurzenia w wodzie.
8. Wykorzystać rozcieńczenia szeregowe 5 M roztworu stokowego TMA-Cl do przygotowania pięciu 100 mL roztworów TMA-Cl do kalibracji ISM. Roztwory powinny mieć końcowe stężenia 0,5, 1, 2, 4 i 8 mM TMA-Cl, wszystkie w 150 mM NaCl. Przechowywać roztwory kalibracyjne w szczelnym pojemniku, aby zapobiec parowaniu.

2. Konfiguracja elektroniczna

1. Podłączyć komponenty układu eksperymentalnego RTI zgodnie ze schematem blokowym na Rysunku 2b; zestaw powinien obejmować wzmacniacz z dwoma kanałami wejściowymi (jeden z nich musi posiadać bardzo wysoką impedancję dla wycinka elektrody ISM selektywnej wobec jonów), filtr dolnoprzepustowy ustawiony na 10 Hz, rejestrator wykresów, przetwornik A/C + C/A, jednostkę jontoforetyczną (lub wzmacniacz zdolny do generowania impulsów prądu stałego) oraz komputer (PC) z zainstalowanymi programami Wanda i Walter. Sprawdzić układ elektroniczny, aby potwierdzić poprawność wszystkich połączeń.
2. W razie potrzeby osłonić układ eksperymentalny w uziemionej obudowie (np. klatce Faradaya), ponieważ elektrody ISM charakteryzują się wysoką rezystancją i są wrażliwe na artefakty powstające w wyniku ruchu w pobliżu.
3. Utworzyć dedykowaną stację kalibracji ISM składającą się z wzmacniacza z podwójnym wejściem, rejestratora wykresów, odpowiedniego uchwytu do ISM oraz obojętnej elektrody uziemiającej. Jeśli to możliwe, osłonić obudowę. Pominąć ten krok, jeśli elektrody ISM są kalibrowane w układzie eksperymentalnym (krok 3.29).

Rysunek 2: Porowata naczynka eksperymentalna i układ elektroniczny. (a) Porowate naczynko eksperymentalne: Do stworzenia naczynka eksperymentalnego wykorzystano porowatą siatkę, która zapewnia ciągłość elektryczną między agaroza (wewnątrz) a eksperymentalnym płynem kąpielowym (na zewnątrz). Do dna naczynka przymocowano metalowy pierścień, aby zapobiec jego pływaniu w roztworze kąpielowym. (b) Schemat blokowy układu RTI (kroki 2.1 i 2.2): Mikroelektroda jonoselektywna (ISM) jest podłączona do wzmacniacza (amp.). ISM posiada dwie tuby. Jedna z nich zawiera w końcówce ciekły wymiennik jonowy (LIX) i generuje napięcie proporcjonalne do logarytmu stężenia TMA w końcówce wraz z lokalnym napięciem otoczenia; ścieżka sygnału jest zaznaczona czerwoną linią. Druga tuba ISM jest tzw. tubą referencyjną i mierzy napięcie otoczenia w końcówce ISM; jest ona połączona niebieską ścieżką sygnałową. Wzmacniacz posiada dwa tzw. stopnie wejściowe (head stages) łączące się z ISM; jednostki te mają wzmocnienie 1 (x1) i dopasowują wysoką impedancję mikroelektrody do niskiej impedancji reszty obwodu wzmacniacza. Stopień wejściowy połączony z tubą jonoselektywną musi być w stanie dopasować się do rezystancji wejściowej wynoszącej około 1 000 MΩ, podczas gdy rezystancja tuby referencyjnej wynosi zazwyczaj około 10 MΩ. Po opuszczeniu stopnia wejściowego napięcie z tuby referencyjnej jest odwracane i odejmowane od napięcia na tubie jonoselektywnej za pomocą wzmacniacza sumującego (Σ), aby uzyskać czyste napięcie sygnału jonowego. Wyjścia wzmacniacza trafiają do jednostki kondycjonowania sygnału, która zapewnia dodatkowe wzmocnienie i wielobiegunowy filtr dolnoprzepustowy (≤10 Hz; zazwyczaj filtr Bessela), który usuwa szum i zapobiega aliasingowi sygnału w przetworniku analogowo-cyfrowym (A/D). Wyjścia filtra są również wyświetlane na rejestratorze paskowym. Przetwornik A/D cyfryzuje sygnały i przesyła je do komputera osobistego (PC). PC generuje również sygnał cyfrowy, który jest konwertowany przez przetwornik cyfrowo-analogowy (D/A) na analogowy impuls napięcia dostarczany do jednostki jontoforezy, która zamienia napięcie na impuls prądowy o stałej amplitudzie i przesyła go do mikroelektrody jontoforetycznej. Ścieżka sygnału jontoforezy jest zaznaczona zieloną linią. Akwizycja danych i sygnał jontoforezy są kontrolowane przez program Wanda, który generuje plik wyjściowy dla każdego zapisu dyfuzji w formie rejestracji napięcia w funkcji czasu, wraz ze wszystkimi parametrami definiującymi eksperyment. Drugi program, Walter, odczytuje plik wyjściowy i wykorzystuje dane kalibracyjne ISM do konwersji zcyfryzowanych napięć na stężenia. Krzywe stężenia w funkcji czasu są następnie dopasowywane w programie Walter do odpowiedniego rozwiązania równania dyfuzji. Wyznaczane są wartości D oraz n_t, jeśli ośrodkiem jest agaroza, oraz λ i α, jeśli ośrodkiem jest mózg. Sygnały analogowe są liniami ciągłymi; sygnały cyfrowe są liniami przerywanymi. W kąpieli zawierającej skrawek znajduje się również obojętna elektroda uziemiająca (niewidoczna na schemacie). Linie czerwone = sygnał jonowy, Linie niebieskie = sygnał referencyjny, Linie zielone = polecenie jontoforezy, Linie ciągłe = analogowe, Linie przerywane = cyfrowe. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

3. Przygotowanie i kalibracja mikroelektrod jonoselektywnych

1. Przygotować ISMs zgodnie z poniższym protokołem na jeden dzień przed eksperymentem. ISMs należy przygotować w partiach, aby zapewnić dostępność co najmniej dwóch sztuk w dniu eksperymentu.
   UWAGA: Większość ISM jest stabilna przez dzień lub dwa. Wytwarzanie ISM jest wrażliwe na wilgotność i warunki atmosferyczne. Nie każda mikroelektroda zostanie pomyślnie skalibrowana.
2. Za pomocą starej pincety odłupać około 0,5 cm szkła na końcu jednej z kapilar dwukanałowej kapilary borokrzemowej.
3. odłup końcówkę jednej rurki na przeciwległym końcu kapilary (Rycina 3a). Należy upewnić się, że septum nie jest uszkodzone (kluczowe). Uwaga: Należy nosić okulary ochronne, aby zapobiec obrażeniom spowodowanym przez odpryski szkła.
4. Umieść kapilarę w butelce z acetonem na co najmniej 1 h w celu usunięcia zanieczyszczeń.
5. Wyjąć kapilarę z acetonu i przedmuchać ją krótkim impulsem suchego, sprężonego azotu lub powietrza, aby usunąć nadmiar acetonu. Należy usunąć cały aceton z kapilary, ponieważ jego pozostałości mogą zakłócić proces silanizacji (kluczowe).
6. Wytwór końcówkę mikropipety za pomocą wyciągacza pionowego lub poziomego. Dostosuj parametry tak, aby uzyskać pipetę o długim zwężeniu i ostrym czubku, o rozmiarze około 1 µm lub mniejszej średnicy. Na koniec tego etapu z jednej kapilary zostaną wykonane dwie pipety (Rysunek 3a).
7. Przedstaw pojedynczą mikropipetę pod złożonym mikroskopem pionowym z obiektywem 10X. Odciąć końcówkę za pomocą szkiełka przedmiotowego, tak aby końcowa średnica końcówki (tj. obie lufy) wynosi od 2 do 5 µm (Rysunek 3b). Ta pipeta będzie odtąd określana jako ISM.
8. Napełnij uszkodzoną część obudowy ISM roztworem referencyjnym NaCl o stężeniu 150 mM przez otwór po stronie uszkodzenia, używając strzykawki o pojemności 10 ml podłączonej do 0.22 µm filtr oraz igłę 28 G o długości 97 mm (Rycina 3b). Nie należy napełniać strzykawki powyżej trzech czwartych jej wysokości.
9. Napełnij nieociętą kapilarę ISM roztworem wypełniającym TMA-Cl o stężeniu 150 mM. Delikatnie postukaj w ISM, aby usunąć pęcherzyki powietrza z roztworu. Sprawdź obecność pęcherzyków pod mikroskopem używanym do obcinania końcówki.
10. Opal tył ISM palnikiem Bunsena, aby upewnić się, że nie nastąpi przepływ roztworu wypełniającego przez septum znajdujące się z tyłu ISM. Po opaleniu upewnij się, że górna jedna czwarta ISM jest sucha.
11. Wprowadź chlorkowany drut srebrny do roztworu referencyjnego ISM i zgnij odcinek drutu wystający z kapilary, aby oznaczyć go jako człon referencyjny (Rycina 3c). Należy upewnić się, że drut jest zanurzony w roztworze wypełniającym i pozostaje w nim przez cały czas trwania eksperymentu.
12. Nasunąć krótki odcinek rurki z politetrafluoroetylenu (o długości ok. 20 cm) na końcówkę igły strzykawki 25 G. Drugi koniec rurki umieścić w tylnej części obudowy elektrody jonoselektywnej. Należy upewnić się, że rurka znajduje się w obudowie, ale powyżej roztworu wypełniającego (Rysunek 3c).
13. Podgrzej kawałek wosku dentystycznego za pomocą palnika Bunsena i uszczelnij zarówno rurkę, jak i srebrny drut w ich odpowiednich tulejach (Rycina 3c). Należy upewnić się, że wokół plastikowej rurki w tulei selektywnej jonowo utworzono szczelne zamknięcie powietrzne (krytyczne).
14. Przygotować mały, przezroczysty szklany pojemnik (pojemnością 5 ml lub mniej) zawierający 4% chlorotrimetylosilanu w ksylenie. Uwaga: Ksyleny i silany są bardzo niebezpieczne dla zdrowia; obie substancje chemiczne należy obchodzić się wewnątrz dygestorium i utylizować w odpowiedni sposób.
15. Umieść pojemnik przed stereomikroskopem sekcyjnym zamontowanym poziomo w dygestorium. Przymocuj ISM pionowo nad pojemnikiem, używając mikromanipulatora (Rycina 3d).
16. Zanurz końcówkę mikroelektrody w roztworze chlorotrimetylosilanu.
17. Podłącz pustą strzykawkę o pojemności 10 ml do igły o rozmiarze 25G prowadzącej do ISM. Wywieraj dodatnie ciśnienie powietrza za pomocą strzykawki, aż do utworzenia pęcherzyka roztworu TMA-Cl; krok ten należy przeprowadzić pod bezpośrednią kontrolą wizualną przy użyciu mikroskopu.
18. Lekko stuknij uchwyt ISM, aby usunąć pęcherzyk powietrza z końcówki.
19. Naciągnąć roztwór chlorotrimetylosilanu do wysokości około 1,500 µm do końcówki ISM, wykorzystując podciśnienie wytworzone za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml.
20. Całkowicie wypchnąć roztwór chlorotrimetylosilanu z końcówki ISM, aż do momentu utworzenia się pęcherzyka roztworu TMA-Cl na końcówce (Rysunek 3d).
21. Powtórz kroki 3.19 i 3.20 pięciokrotnie. Upewnij się, że za każdym razem do końcówki jest zasysana równomierna, nieprzerwana kolumna cieczy. Jeśli nie można zassać roztworu do końcówki, sprawdź, czy przewód nie jest zablokowany, czy uszczelnienie powietrzne jest kompletne lub czy końcówka ISM nie jest zablokowana.
22. Wypłucz cały roztwór chlorotrimetylosilanu z końcówki, aż do utworzenia pęcherzyka roztworu TMA-Cl.
23. Podtrzymując dodatnie ciśnienie w strzykawce, wyjmij ISM z roztworu ksylenu. Upewnij się, że cały roztwór ksylenu został usunięty z końcówki ISM, ponieważ nadmiar ksylenu zniszczy kolumnę wymiennika utworzoną w kolejnych krokach.
24. Umieść końcówkę ISM w małym, przezroczystym pojemniku (oryginalnym opakowaniu wymiennika lub małej kuwecie) zawierającym ciekły wymiennik jonowy (LIX) dla TMA. Krok ten należy przeprowadzić pod bezpośrednią kontrolą wizualną, korzystając z poziomego układu mikroskopowego.
25. Zastosuj niewielkie podciśnienie, aby zaciągnąć minimalną ilość LIX do końcówki (t. j. natychmiast po zauważeniu wniknięcia LIX do końcówki, należy zaprzestać przykładania podciśnienia).
26. Odłącz strzykawkę o pojemności 10 ml od rurki i pozostaw ISM na 5 min. W tym czasie LIX będzie wnikać do silanizowanej końcówki, aż zostanie osiągnięty stan równowagi.
27. Usuń moduł ISM z urządzenia LIX. Wyciągnij rurkę z tulei wymiennika (usuwając przy tym jak najmniej wosku). Wprowadź chlorowany drut srebrny do niewielkiego otworu powstałego w tylnej części modułu ISM. Uszczelnij drut w materiale wypełniającym tuleję wymiennika za pomocą roztopionego wosku.
28. Pozostawić ISM na co najmniej 30 min. Przymocować gotowe ISM do wewnętrznej krawędzi zlewki, używając dowolnego elastycznego kleju tymczasowego.
29. Zkalibruj sensor ISM, rejestrując napięcie mierzone przez sensor w każdym roztworze kalibracyjnym przygotowanym w kroku 1.8.
    UWAGA: Kalibrację można przeprowadzić w stacji kalibracyjnej (patrz krok 2.3) lub w układzie eksperymentalnym. Procedura ta została opisana w Suplemencie B oraz w pracy Haacka i wsp.¹⁰.
30. Jeśli kalibracja wielu ISM zakończyła się pomyślnie, należy przerwać procedurę w tym miejscu do dnia planowanego użycia. W przeciwnym razie należy wykonać kolejne ISM.
31. W dniu przeprowadzenia eksperymentu ponownie skalibrować mikroelektrodę (patrz krok 3.29).

Rysunek 3: Przygotowanie mikroelektrody jon-selektywnej. (a) ISM po obłupaniu końców kapilary i wyciąganiu (kroki 3.2-3.6): Pojedyncza rurka na obu końcach szklanej kapilary zostaje obłupana. ISM powstaje poprzez wyciąganie jednej dwukanałowej szklanej kapilary w celu utworzenia dwóch mikropipet z cienkimi końcówkami. (b) ISM po wypełnieniu obu kanałów od tyłu (kroki 3.7-3.9): Końcówka pojedynczej ISM jest obłupana do średnicy 2-5 µm. Kanał jon-selektywny jest wypełniany TMA-Cl, a kanał referencyjny wypełniany NaCl. (c) ISM przed powleczeniem chlorotrimetylosilanem (kroki 3.11-3.13): Chlorkowany drut srebrny zostaje wprowadzony do kanału referencyjnego. Przewód z politetrafluoroetylenu (PTFE) zostaje połączony z igłą 25 G i wprowadzony do kanału jon-selektywnego. Szczelne zamknięcie obu kanałów od góry zostaje wykonane przy użyciu wosku dentystycznego. (d) Powlekanie mikropipety chlorotrimetylosilanem (kroki 3.15-3.26): [Małe powiększenie] ISM zawieszona w chlorotrimetylosilanie w linii z poziomo zamontowanym stereomikroskopem. [Duże powiększenie] Widok przez poziomo zamontowany stereomikroskop na końcówkę ISM w roztworze chlorotrimetylosilanu. Po wizualizacji końcówki pod mikroskopem, niewielka ilość roztworu TMA-Cl jest wypychana z kanału jon-selektywnego (wystarczająca do utworzenia małego pęcherzyka roztworu TMA-Cl). Uchwyt ISM jest opukiwany, aby uwolnić pęcherzyk roztworu TMA-Cl, a następnie chlorotrimetylosilan jest wciągany do końcówki. Cykl ten jest powtarzany kilka razy. Po całkowitym usunięciu chlorotrimetylosilanu z ISM, elektroda zostaje umieszczona w ciekłym wymieniaczu jonowym (LIX) dla TMA, a LIX jest wciągany do końcówki kanału jon-selektywnego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

4. Przygotowanie mikroelektrod do jontoforezy

UWAGA: Mikroelektrody do jontoforezy powinny zostać wykonane w dniu przeprowadzenia eksperymentu.

1. Wytnij dwukanałową kapilarę z borokrzemianowego szkła, korzystając z pionowego lub poziomego wyciągacza. Dostosuj parametry tak, aby uzyskać pipetę podobną do mikropipet wykonanych w kroku 3.6 (Rycina 4a).
2. Umieść mikropipetę pod mikroskopem złożonym użytym w kroku 3.7 i odetnij końcówkę za pomocą szklanego okładki mikroskopowej w taki sposób, aby otrzymana średnica wynosiła od 2 do 5 µm (Rycina 4a).
3. Napełnij oba kanały roztworem wypełniającym 150 mM TMA-Cl, używając strzykawki 10 mL z podłączonym filtrem 0.22 µm oraz igłą 28 G o długości 97 mm (Rycina 4a).
4. Delikatnie opukaj mikropipetę, aby upewnić się, że w roztworze w obu kanałach nie pozostały pęcherzyki powietrza.
5. Wprowadź chlorkowane druty srebrne do obu kanałów mikropipety. Upewnij się, że druty są zanurzone w roztworach wypełniających na tyle głęboko, aby pozostawały z nimi w kontakcie przez cały czas trwania eksperymentu.
6. Uszczelnij druty w kanałach za pomocą gorącego wosku dentystycznego. Delikatnie splot druty, skręcając je wokół siebie (gotową mikroelektrodę przedstawiono na Rycini 4b).

Rycina 4: Przygotowanie mikroelektrody do jontoforezy. (a) Mikroelektroda do jontoforezy po wypełnieniu obu kanałów (kroki 4.1-4.3): Mikroelektroda do jontoforezy jest wyciągana z rurki kapilarnej. Koniuszek mikroelektrody jest odłupywany do średnicy 2-5 µm. Oba kanały mikroelektrody do jontoforezy są wypełniane roztworem TMA-Cl. (b) Gotowa mikroelektroda do jontoforezy (kroki 4.5-4.6): Mikroelektroda do jontoforezy z dwoma wprowadzonymi do kanałów srebrnymi drutami chlorkowanymi. Kanały mikroelektrody są uszczelnione woskiem, a srebrne druty są ze sobą skręcone z tyłu mikroelektrody. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

5. Przygotowanie sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego i plastrów tkanki mózgowej gryzoni

1. Przygotuj 1 L sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (ACSF) o składzie odpowiednim dla eksperymentu i dodaj do niego 0,5 mM TMA-Cl.
   UWAGA: TMA-Cl jest niezbędny do ustalenia stężenia tła TMA podczas eksperymentu.
2. Przygotuj skrawki mózgu gryzoni o grubości 400 µm zgodnie ze standardowymi protokołami^11,12. Do preparatyki i utrzymania skrawków mózgu użyj ACSF przygotowanego w kroku 5.1.

6. Iontofereza w czasie rzeczywistym w agarozy

1. Włącz komputer, na którym uruchomione są programy Walter i Wanda.
   UWAGA: Programy te są dostępne bezpłatnie na życzenie. Chociaż oprogramowanie to nie jest niezbędne, w przeciwnym razie konieczne byłoby zaprogramowanie podobnego narzędzia lub przeprowadzenie analizy ręcznie.
2. Przeprowadź ACSF przez komorę zanurzeniową z odpowiednią prędkością (np. 2 ml/min). Ustaw kontroler temperatury na pożądaną wartość i napowietrzaj ACSF mieszaniną 95% O2₂/5% CO₂ (lub inna odpowiednia mieszanina gazowa) przez cały czas trwania eksperymentu.
3. Zamocuj elektrodę obojętną (masę) w odpowiednim uchwycie i zanurz jej końcówkę w płynie ACSF przepływającym przez komorę perfuzyjną. Podłącz przewód do uziemienia zestawu rejestracyjnego.
4. Napełnić porowaty kubek (wykonany w kroku 1.7) wcześniej przygotowaną 0,3% agarozą i umieścić go w komorze imersyjnej. Należy upewnić się, że roztwór nie przelewa się przez górną krawędź kubka.
5. Zamocuj skalibrowany ISM do uchwytu pipety jednego mikromanipulatora, a mikroelektrodę do jontoforezy do drugiego. Ustaw uchwyty pod kątem odpowiednim dla danej konfiguracji (Rycina 5a).
6. Podłącz przewody mikroelektrod ISM i do jontoforezy do odpowiednich przedwzmacniaczy głowicowych wzmacniacza rejestrującego. Alternatywnie można je podłączyć bezpośrednio do wzmacniacza (w zależności od konfiguracji układu).
7. Należy upewnić się, że ciężar lub ułożenie przewodów połączeniowych bądź klipsów nie powoduje przemieszczania się mikroelektrod, ponieważ niewielkie wahania w ich pozycji mogą wpłynąć na wyniki.
8. Włącz zestaw elektroniczny (z kroku 2). Uruchom programy Walter i Wanda w osobnych instancjach.
9. W interfejsie graficznym (GUI) programu Wanda kliknij "Kalibrować" (Rysunek 6a). W polu kalibracji (Rycina 6b), wprowadź wartości napięć zmierzonych podczas kalibracji ISM (krok 3.29) i kliknij "Dopasowanie danych."
   UWAGA: Pozwala to na dopasowanie do następującej postaci równania Nicolsky’ego (alternatywnie równanie można dopasować inną metodą, aby uzyskać M i K):
   
   Tutaj, V zmierzonym napięciem (mV), M jest nachyleniem w równaniu Nicolsky’ego (mV), C jest stężeniem jonu (mM), K jest interferencja (mM), a V₀ jest napięciem przesunięcia (mV)³.
10. Kliknij "Zaakceptuj" w polu Kalibracja, aby automatycznie przenieść nachylenie (M) oraz interferencję (K) wygenerowane w kroku 6.9 do głównego interfejsu graficznego (GUI).
    UWAGA: Tutaj, K reprezentuje interferencję Na, która zazwyczaj jest pomijalna.
11. Po lewej stronie interfejsu graficznego użytkownika (GUI) należy upewnić się, że wszystkie parametry eksperymentalne zostały wprowadzone w odpowiednich polach (Rysunek 6a).
    1. W polu Source Method ustaw źródło na iontophoretic source (domyślne), a następnie "Czas trwania nagrania" Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia. "200 s" (domyślny), the "Rozpocznij puls" Proszę o podanie tekstu źródłowego do tłumaczenia. "10 s" (domyślne), the "Koniec impulsu" Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. "60 s" (domyślny), the "Prąd polaryzacji" do "20 nA" (domyślny), the "Prąd główny" Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. "100 nA" (domyślne) oraz "Współczynnik konwersji" do odpowiedniej wartości.
    2. W polu Elektroda pomiarowa ustaw "Kąpiel C" do stężenia TMA zawartego w roztworze kąpieli (wyrażonego w mM). Ustawić "Całkowite wzmocnienie," "Kanał wyjściowy," "kanał ISM," i "Kanał ref." do odpowiednich wartości dla stosowanego systemu akwizycji danych.
       UWAGA: The "Współczynnik konwersji" należy ustawić na odpowiednią wartość (charakterystyczną dla używanego urządzenia do jontoforezy). Wartość ta określa natężenie prądu przepływającego dla danego napięcia przyłożonego z przetwornika cyfrowo-analogowego (nA/mV).
12. Umieść sondę temperatury w czarence z agarem. Zapisz zmierzoną temperaturę w "Temperatura" wpis w "Elektroda pomiarowa" okno interfejsu graficznego użytkownika (GUI) (Rysunek 6a).
13. Włącz oświetlacz podstolikowy. W razie potrzeby włącz kamerę podłączoną do mikroskopu oraz monitor kamery.
14. Opuścić mikroelektrody co najmniej 1,000 µm głęboko w agarozy i wycentrować je w otworze (Rycina 5b). Wizualizuj je pod mikroskopem, używając obiektywu 10X (obiektywu imersyjnego wodnego z dużą odległością roboczą).
15. Ustaw napięcie offsetu na wzmacniaczu na 0 mV dla obu kanałów (referencyjnego oraz ISM), aby przyjąć napięcie zarejestrowane w agarozie jako napięcie bazowe.
16. W wzmacniaczu dwukanałowym ręcznie przesuń złącze kanału ISM na wyjście odejmowania napięcia, aby ustawić funkcję odejmowania (subtrakcji) na „on” pomiędzy kanałem referencyjnym a kanałem ISM.
    UWAGA: Odjęcie to zapewnia, że zmiany napięcia w kanale ISM odzwierciedlają wyłącznie zmiany stężenia TMA.
17. Przesunąć ISM tak, aby dotykał on końcówki mikroelektrody do jontforezy. Wycentrować końcówki względem siebie we wszystkich trzech osiach kierunkowych.
18. Wyzeruj względne położenia obu mikroelektrod na panelach sterowania mikromanipulatorami. Upewnij się, że mikroelektrody są wyśrodkowane dokładnie i precyzyjnie (krytyczne).
19. Przenieś ISM 120 µm oddalając się od mikroelektrody do jonoforezy w jednej osi (osi lewo-prawo, Rysunek 5b). Wprowadź tę odległość do "Elektroda pomiarowa" okno interfejsu graficznego użytkownika (GUI) (Rycina 6a).
20. Rozpocznij nagrywanie, klikając "Pozyskać" w interfejsie graficznym (GUI) (Rycina 6a); pozwól programowi przeprowadzić pełny zapis.
    UWAGA: Mikrolektroda do jontoforezy otrzymuje stały prąd polaryzacyjny. Po kliknięciu "Pozyskaj," przed przyłożeniem głównego prądu przez ograniczony czas następuje krótka przerwa.
21. Powtórz krok 6.20 jeszcze dwa lub trzy razy. Przed zarejestrowaniem nowych pomiarów poczekaj, aż sygnał TMA powróci do poziomu bazowego; program zapisze każdy pomiar do późniejszej analizy.
22. Sprawdź odstępy między dwiema mikroelektrodami, przesuwając ISM z powrotem do pozycji zerowej określonej przez kontroler. Jeśli mikroelektrody nie są już wycentrowane, wycentruj je ponownie, stosując tę samą strategię co w kroku 6.17. Odnotuj wszelkie zmiany w położeniu elektrod.
    UWAGA: Jeśli odstępy zmienią się o więcej niż około 2%, pomiary uzyskane w kroku 6.19 nie mogą zostać uznane za dokładne i należy przeprowadzić je ponownie.

Rysunek 5: Układ do eksperymentów w agarze. (a) Układ do eksperymentu w rozcieńczonym agarze (kroki 6.1-6.5): Mały porowaty pojemnik wypełniony rozcieńczonym agarem umieszczony w działającej komorze perfuzyjnej. Mikroelektroda do jontoforezy (lewa strona) oraz ISM (prawa strona) są zamocowane w uchwytach mikroelektrod; uchwyty te są osadzone w ramionach robotycznych mikromanipulatorów. Sonda temperatury jest umieszczona w żelu agarowym, a obojętna elektroda uziemiająca znajduje się wewnątrz komory zanurzeniowej. (b) Powiększony widok mikroelektrod w agarze: Mikroelektroda do jontoforezy (lewa strona) i ISM (prawa strona) są wizualizowane w agarze przy użyciu obiektywu imersyjnego 10X (obiektyw zanurzony tutaj w 150 mM NaCl). Mikroelektrody są pozycjonowane za pomocą mikromanipulatorów na głębokość 1 000 µm; odstęp między mikroelektrodami wynosi 120 µm. Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Rysunek 6: Interfejs oprogramowania Wanda Computer. (a) Nawigacja po graficznym interfejsie użytkownika (GUI) programu Wanda: Ekran wyświetlany po uruchomieniu oprogramowania Wanda. W polu (1) wybierane są odpowiednie medium, cząsteczka do jontoforezy oraz technika. (2) Przycisk „Calibrate” służy do otwarcia okna kalibracji programu Wanda. Po skalibrowaniu ISM (patrz Rysunek 6b oraz Suplement B), ISM jest umieszczane w agarze lub mózgu, zgodnie z opisem w krokach 6 i 8 protokołu. W polu (6) wprowadzane są wszystkie odpowiednie wartości dla wykonywanego eksperymentu. (7) Przycisk „Acquire” służy do rozpoczęcia rejestracji; w prawym górnym rogu GUI programu Wanda pojawia się wykres napięcia w funkcji czasu. (b) Kalibracja ISM w programie Wanda: Okno otwierane po kliknięciu przycisku (2) „Calibrate” w GUI programu Wanda. Wartości z kroku 3.29 wprowadza się do pola (3), a następnie wybiera (4) „Fit Data”. Następnie potwierdza się liniowość krzywej kalibracyjnej. Przycisk (5) „Accept” pozwala na powrót do GUI programu Wanda. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

7. Analiza danych z żelu agarozy

1. Uruchom program Walter na komputerze (PC). W "0. Rekordy z:" menu, kliknij w "Wanda/VOLTORO" przycisk do odczytu rekordów wygenerowanych przez system Wanda (Rycina 7a).Zakładając, że wymagane jest wyeksportowanie danych do arkusza kalkulacyjnego, otwórz odpowiednie oprogramowanie. Kliknij "Arkusz 1,3" w "1. Wpisz w programie Excel?" menu (Rycina 7b).
2. W następnym oknie wyskakującym wybrać rekordy do odczytania, a następnie kliknąć "Otwórz" (Rycina 7b); należy pamiętać, że zapisy zostaną automatycznie przedstawione na wykresie. Aby rozpocząć procedurę dopasowania, należy wykonać następujące kroki.
   1. W "2. Opcje" menu, kliknij w "wybierz rec" przycisk. W ramach "Rycina 2" okno wyskakujące, należy użyć myszy, aby przesunąć krzyż upodobnie do pierwszego rekordu do przetworzenia (Rysunek 7c); naciśnij dowolny przycisk myszy, aby wybrać rekord.
   2. Kliknij w "dopasuj krzywą" w menu. Wybierz pożądaną liczbę iteracji dopasowania; aby uzyskać dokładne dopasowanie danych, należy przeprowadzić co najmniej 20 iteracji.
   3. W menu wybierz "Wszystkie" aby dopasować wszystkie punkty danych i wybrać "Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia." Program dopasuje krzywą do wyświetlonych danych. Należy obserwować procedurę dopasowania i porównać zapis eksperymentalny z uzyskaną krzywą o najlepszym dopasowaniu.
3. Wybierz opcję zapisu wyniku w odpowiednim programie arkusza kalkulacyjnego, klikając "Excel" w "7. Wyniki" menu (Rysunek 7d). Należy odnotować (i zapisać) następujące kluczowe dane, które posłużą do określenia funkcjonalności mikroelektrody do jontoforezy:D(E5)', 'Referencja D(E5)', 'r_app, liczba transportowan_t', 'Pozorna liczba n_t'.
   UWAGA: "D(E5)"Zmierzony współczynnik dyfuzji swobodnej x 10⁵ (cm²/s); "Referencja D(E5)"Teoretyczny współczynnik dyfuzji swobodnej x 10⁵ (cm²/s). Wartość ta jest pobierana z bazy danych w programie Walter na podstawie wprowadzonych danych dotyczących jonu, medium i temperatury. "r_app"Pozorny rozstaw mikroelektrod (cm), obliczony na podstawie wartości zmierzonej i referencyjnej D(E5). "n_t"Liczba transportowa (bezwymiarowa). Liczba ta określa frakcję prądu jontoforezy wykorzystywaną do uwalniania TMA⁴. "Pozorna liczba n_t"Pozorna liczba transportu (bezwymiarowa). Jest to liczba transportu obliczona z aplikacja_rWartość ta powinna być zbliżona do zmierzonej n_t.
4. Powtórz kroki 7.1–7.3 dla każdego z zapisów dla wybranej pary mikroelektrod.
5. W celu sprawdzenia, czy mikroelektroda do jontoforezy jest sprawna, należy wykonać następujące czynności.
   1. Porównaj "r_app" z rzeczywistym r (t.j. 120 µm); kryterium to jest spełnione, jeśli średnie wartości ze wszystkich prób różnią się od siebie o nie więcej niż 4%.
   2. Porównaj "D(E5)" z pomocą Referencja D(E5); kryterium to zostaje spełnione, jeśli wartości średnie ze wszystkich prób nie różnią się od siebie o więcej niż 8%.
   3. Porównaj "n_t" między próbami z tym samym mikroelektrodem; kryterium to zostaje spełnione, jeśli wartości średnie ze wszystkich prób mieszczą się w granicach 10% względem siebie.
6. Jeśli jedno z kryteriów z kroku 7.5 nie zostało spełnione, należy rozwiązać problemy z mikroelektrodą do jontoforezy lub rozpocząć testowanie kolejnej elektrody.
7. Jeśli mikroelektroda do jontoforezy zostanie uznana za odpowiednią do eksperymentu, należy zapisać średnią liczbę transportową ze wszystkich prób w "Transport Num N" pole w interfejsie graficznym użytkownika (GUI) programu Wanda (Rysunek 6a).

Rysunek 7: Interfejs oprogramowania komputerowego Walter. (a) Wybór programu do gromadzenia danych w Walter: menu „0. Records From:” otwiera się po uruchomieniu oprogramowania Walter. Opcja ładowania zapisów utworzonych przez Wandę jest wybierana poprzez kliknięcie przycisku „Wanda/Voltoro”. (b) Wybór danych i miejsca wyjściowego analizy danych w Walter: [Lewo] Po otwarciu odpowiedniego programu arkusza kalkulacyjnego wybiera się opcję „Sheets 1,3”, aby wszystkie wyniki analizy danych z programu Walter zostały przekazane do wcześniej otwartego programu arkusza. [Prawo] Po wybraniu miejsca wyjściowego analizy danych otwiera się okno wyskakujące, umożliwiające użytkownikowi wybór pierwszego i ostatniego zapisu, który ma zostać odczytany przez program Walter. (c) Wybór zapisu do analizy w programie Walter: [Prawo] Po wybraniu plików do odczytu otworzy się okno wyskakujące, w którym wszystkie wybrane zapisy zostaną przedstawione w formie wykresu („Rysunek 2”). [Lewo] W menu „2.Options” kliknięto „select rec” i za pomocą myszy przesunięto celownik, aby zidentyfikować pierwszy zapis do analizy; aby wybrać zapis, należy nacisnąć dowolny przycisk myszy. (d) Eksport analizy danych z programu Walter do arkusza kalkulacyjnego: Po dopasowaniu danych pojawia się okno wyskakujące oraz menu „7. Results”. [Lewo] Wykres wybranego zapisu (niebieski) wraz z dopasowaną krzywą dyfuzyjną wygenerowaną przez program Walter (czerwony). [Prawo] Menu „7. Results” umożliwia zapisanie danych z analizy w programie arkusza kalkulacyjnego poprzez kliknięcie przycisku „Excel”. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

8. Iontoforeza w czasie rzeczywistym w skrawkach mózgu

1. Umieść plaster mózgu o grubości 400 µm w komorze rejestracyjnej, upewniając się, że jest on całkowicie zanurzony w przepływającym ACSF. Upozycjonuj plaster za pomocą pędzla akwarelowego i delikatnie zabezpiecz go siatką.
2. Przesuń zarówno mikroelektrodę do jontoforezy, jak i ISM nad obszar zainteresowania na plastrze mózgu. Zanurz obie w przepływającym ACSF, ale powyżej poziomu plastra.
3. Ustaw offset napięcia dla kanału referencyjnego i kanału czujnika jonowego na "0" mV. Odczekaj, aż napięcie w obu kanałach się ustabilizuje. Na rejestratorze zapisz napięcie zmierzone na kanale czujnika jonowego ISM. Wykorzystaj tę wartość do obliczenia parametru bazowego V w programie Wanda.
4. Wprowadź ISM i mikroelektrodę do jontoforezy na głębokość 200 µm w plaster i w odległości 120 µm od siebie. Odczekaj na stabilizację sygnału po wprowadzeniu mikroelektrody do plastra mózgu.
   UWAGA: Prąd polaryzacyjny przyłożony do mikroelektrody do jontoforezy powoduje niewielką akumulację TMA. Częstym błędem jest zbyt wczesne rozpoczęcie rejestracji, co prowadzi do niedoszacowania narastania sygnału.
5. Na rejestratorze zapisz ustabilizowane napięcie zmierzone w plastrze mózgu na kanale czujnika jonowego ISM. Oblicz różnicę napięć między sygnałem TMA zmierzonym w kroku 8.3 a krokiem 8.4 i wprowadź tę wartość do pola "Baseline V (mV)" w sekcji Measuring Electrode w interfejsie programu Wanda (Rycina 6a).
6. Po lewej stronie interfejsu upewnij się, że wszystkie parametry eksperymentalne zostały poprawnie zapisane/wprowadzone. Ustaw parametr "Medium" na "Brain," "Transport number" na średnią wartość obliczoną dla mikroelektrody do jontoforezy w kroku 7.4, a "Temperature" na temperaturę kąpieli zawierającej plaster.
   UWAGA: Wartość V musi być zapisana dla każdego zestawu pomiarów. Bazowe V zostanie przekonwertowane przez program Wanda na parametr bazowy C (mM) (t.j. stężenie TMA w tkance mózgowej).
7. Rozpocznij rejestrację, klikając "Acquire" i poczekaj na zakończenie pełnego zapisu. Odczekaj, aż sygnał TMA powróci do poziomu bazowego przed rozpoczęciem nowej rejestracji.
8. Wykonaj od dwóch do trzech kolejnych rejestracji przed usunięciem mikroelektrod z wybranego miejsca w mózgu. Wprowadź zmierzoną temperaturę do oprogramowania Wanda bezpośrednio przed każdą rejestracją.
9. Przesuń obie mikroelektrody po przekątnej z powrotem do powierzchni plastra. Unieś obie na wysokość co najmniej 50 µm powyżej plastra. Za pomocą rejestratora określ wszelkie zmiany między aktualnie zmierzonym V a pomiarem z kroku 8.3.
10. Wycentruj końcówki ISM i mikroelektrod jontoforetycznych względem siebie w osiach x, y i z. Odczytaj ewentualne zmiany odstępów z wyświetlacza panelu sterowania mikromanipulatora.

9. Analiza danych mózgu

1. Otwórz nowy arkusz kalkulacyjny do zapisania wyników analizy.
2. Powtórz kroki 7.1-7.4 w programie Walter, aby przeanalizować pomiary wykonane w mózgu.
3. Zapisz dane w programie arkusza kalkulacyjnego, klikając „Excel” w menu programu Walter. Odnotuj α, frakcję objętościową ECS mózgu; λ, krętość ECS mózgu oraz k (s^-1), niespecyficzny klirens.

10. Sprawdzanie liczby transportowej i kalibracja ISM

1. Zmierzyć liczbę transportową (n_t) ISM na koniec eksperymentu, stosując poniższy protokół. Alternatywnie można sprawdzić n_t po kluczowych próbach lub gdy pomiary wydają się anomalne. Należy jednak pamiętać, że zbyt częste sprawdzanie n_t może doprowadzić do uszkodzenia skrawka mózgu.
2. Wykonać nowe rejestracje w agarozie. Patrz kroki 6.4, 6.11, 6.12, 6.14, 6.15 oraz 6.17-6.22.
3. Powtórzyć kroki 7.1-7.4 w programie Walter, aby uzyskać n_t z nowych rejestracji w agarozie. Przejrzeć arkusz kalkulacyjny: jeśli n_t zmieniło się o więcej niż 10% w stosunku do n_t uzyskanego przed pomiarami w mózgu, dane uzyskane za pomocą tej mikroelektrody jontoforetycznej są niewiarygodne.
4. Przeprowadzić nową kalibrację (patrz krok 3.29) dla ISM po zebraniu wszystkich danych z mózgu. Nowo uzyskane dane kalibracyjne ISM wprowadzić do okna kalibracji programu Wanda (patrz kroki 6.9 i 6.10) i sprawdzić, czy wartość nachylenia różni się o mniej niż 10% od poprzedniej kalibracji.
   UWAGA: Dane uzyskane za pomocą tego ISM są niewiarygodne, jeśli wartość nachylenia różni się o więcej niż 10% od poprzedniej kalibracji.

Wyniki

Skuteczność techniki RTI została zademonstrowana w eksperymencie zaprojektowanym w celu pomiaru zmian w α i podczas wyzwania hipoozmotycznego (Rycina 8 i Rycina 9). Wcześniejsze badania wykazały, że obniżenie osmolarności ECS poprzez przemywanie hipotonicznym ACSF spowoduje zmniejszenie się α oraz wzrost λ¹³.

W tym eksp...

Dyskusja

Rysunek 10: Nieidealne dane obrazujące typowe problemy techniczne. (a) Schematy typowych problemów technicznych z mikroelektrodami do jontoforezy: Porównanie prawidłowego uwalniania TMA z działającej mikroelektrody jontoforetycznej z trzema źródłami wykazującymi problemy techniczne. [Duże powiększenie, a1] Prąd w idealnym źródle jontoforetycznym jest przenoszony w równym stopniu przez uwalnianie T...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Przetwornik A/D i D/A	National Instruments Corporation	NI USB-6221 DAQ	NI USB-6221 jest nadal sprzedawany przez NI jako urządzenie "Legacy". Zalecają używanie DAQ NI USB-6341 X Series do nowych instalacji, jednak nie testowaliśmy nowszych jednostek. Opisujemy użycie NI USB-6221 z MATLAB i Windows 7 (32-bitowym). Alternatywa: znacznie starszy konwerter A/D PCI-MIO-16E-4 (używany tylko w systemie Windows XP lub starszym systemie operacyjnym) z panelem złączy BNC BNC-2090 i SH68-68-EP. Jak wspomniano w Podręczniku Wanda, dostępny jest eksperymentalny program MATLAB do korzystania z plików binarnych Axon.
agaroza	Lonza	NuSieve GTG Agaroza #50081	do przygotowania rozcieńczonego żelu agarozowego do pomiarów RTI
wzmacniacz do ISM	Dagan	Model IX2-700 Podwójny wewnątrzkomórkowy przedwzmacniacz	jonowy i wzmacniacz napięcia odniesienia z głowicami N=0,1 (dla lufy referencyjnej) i N=0,001 (dla lufy jonowej)
Miscroscope związków biologicznych (z obiektywem 4x i 10x)			do rozdrabniania końcówek mikroelektrod i kontroli mikroelektrod; różni dostawcy, np. Rurki
ze szkła kapilarnego borokrzemianowego Theta	Aparat Harvarda	Warner Instruments model TG200-4; Zamówienie #64-0811	Rurki szklane dwulufowe do mikroelektrod jonoselektywnych i mikroelektrod jonoforetycznych; Średnica zewnętrzna 2,0 mm, średnica wewnętrzna 1,4 mm, przegroda 0,2 mm, długość 10 cm
szczotka	Winsor & Newton	University Series 233, okrągła	szczotka z uchwytem shoft rozmiar 0, dostępna w
Amazon Bunsen Burner	Kamera Fisher
do wizualizacji mikropipet	Olympus	OLY-150	wymaga monitora, filtr podczerwieni na iluminatorze podstopnia jest opcjonalnym
rejestratorem			wykresówdo ciągłego rejestrowania napięć na mikroelektrodzie jonoselektywnej podczas kalibracji w wzorcach tetrametyloamonu oraz podczas eksperymentu RTI; np. Kipp & Zarejestrowano wykres podwójnej kanelu Zonen typu BD112, dostępny odnowiony
chlorotrimetylosilan, puriss., > 99%	Katalog Sigma-Aldrich	# 92360	do silanizacji; UWAGA: łatwopalny, ostra toksyczność (doustna, skórna, wziewna), skóra, uszkodzenie oczu, gwałtownie reaguje z wodą, pełny opis patrz Sigma-Aldrich Safety Information
Oprogramowanie komercyjne	The MathWorks	MATLAB, Zestaw narzędzi do pozyskiwania	i analizy danych za pomocą programów Wanda i Walter. Pamiętaj, że dostępna jest licencja akademicka.
okulary ochronne	Mikroskop złożony Fisher
ze stałym stopniem	Olympus	BX51WI	może używać innych mikroskopów złożonych ze stałymi stopniami
kleszczy	Fine Science Tools	#11251-10	do rozdrabniania kapilary szklanej; Dumond #5, najlepiej używany i już niepotrzebny do precyzyjnej pracy
dygestorium			do silanizacji i napełniania końcówki beczki jonoselektywnej ciekłym wymieniaczem jonowym; różne zasilacze, np. Captair z filtrem asygnalizacyjnym sprzedawany przez Erlab
szklany szkiełko mikroskopowe	Fisher	#12-550A	do rozdrabniania końcówek mikroelektrod
grzałka/mieszadło	Fisher	Corning PC-420D	do przygotowania rozcieńczonego żelu agarozowego i roztworów mieszających
jednostka jonoforetyczna	Dagan	ION-100 i PS-100	ION-100 to jednokanałowa jednostka jonoforezy zgodna z +/- 130 V; PS-100 to zewnętrzny zasilacz; alternatywy: np. Axoprobe-1A wyprodukowany przez Axon Instruments (obecnie Molecular Devices), wycofany z produkcji, sprawdź dostępność odnowionych jednostek (eBay i inne witryny)
ciekły wymieniacz jonowy (LIX) do tetrametyloamonu	potasu World Precision Instruments	IE190	Uwaga: jest to odpowiednik oryginalnego wymiennika potasu Corning 477317 opartego na tetrafenlyboranie - nie mylić z neutralnym nośnikowym wymiennikiem potasu pochodzi z laboartory Dr. Simon, ETH, Zurych, która nie wykrywa tetrametyloamonu i jest sprzedawana przez firmę Fluka. Możesz również samodzielnie wykonać płynny wymieniacz jonowy dla tetrametyloamonu: 3% wagowo tetrakis potasu = boran (p-chlorofenylu) rozpuszczony w 2,3-dimetylonitrobenzenie. Kupuj chemikalia od firmy Fluka (obecnie część Sigma). Patrz Oehme i Simon (1976) Anal. Chim. Dzieje Apostolskie 86,21-25; UWAGA: Właściwości toksykologiczne tego ciekłego wymieniacza jonowego nie zostały w pełni określone. Spożycie lub kontakt z ciałem ludzkim może być szkodliwy. Zachowaj należytą ostrożność! Ciekłe wymieniacze jonowe należy przechowywać w chłodnym miejscu, z dala od bezpośredniego światła słonecznego.
uchwyt mikroelektrody	WPI	M3301EH	do przechowywania jonoselektywnego prefabrykatu mikroelektrody do silanizacji i wypełnienia końcówki jonoselektywnej beczki ciekłym wymieniaczem jonowym; WPI sprzedaje dwie wersje tego uchwytu, bezbarwną M3301EH i czarną M3301EH. Z naszego doświadczenia wynika, że przezroczysty M3301EH wydaje się być mocniejszy niż M3301EH.
mikromanipulator	Narishige	MM-3	do pozycjonowania prefabrykatu mikroelektrod jonoselektywnych podczas silanizacji i napełniania końcówki cylindra jonoselektywnego ciekłym wymieniaczem jonowym; może być zastąpiony dowolnym mikromanipulatorem trójosiowym w dobrym stanie technicznym
ściągacz do mikropipet	Sutter Instruments	Model P-97	do ciągnięcia szklanych rurek dwulufowych; inne ściągacze mogą być używane, o ile mogą pomieścić dwulufowy termometr z mikrosondą z dwulufowymi rurkami
	Physiotemp	Model BAT-12R	cienka sonda tego termometru jest umieszczona w pobliżu
igły do rejestracji		Strzykawki i igły BD # 305122 (rozmiar 25)	do silanizacji; Igły BD PrecisionGlide 25 G x 5/8 cala (0,5 mm x 16 mm)
obiektyw 5X suchy	Olympus	MPlan N
obiektyw 10X zanurzenie w wodzie	Olympus	UMPlan FL N	10X obiektyw do zanurzenia w wodzie, apertura numeryczna 0,3, odległość robocza 3,3 mm
plastikowe pojemniki (z pokrywkami)	Fisher	#14-375-148	do przechowywania roztworów wzorcowych tetrametyloamonu i mikroelektrod
platforma i stolik translacyjny x-y do mikroskopu stałostolikowego	EXFO	Gibraltar Platforma Burleigh	mieści komorę krocząt, mikromanipulatory i akcesoria, stolik translacyjny x-y porusza mikroskopem bez uszczerbku dla stabilności zapisu
porowaty minicup			do pomiarów RTI w rozcieńczonym żelu agarozowym; domowy
klej wielokrotnego użytku	Bostik	Blu-Tack	do mocowania mikroelektrod do naczynia przechowawczego i do innych zastosowań; różni dostawcy, dostępni w Amazon
mikromanipulator robotyczny z precyzyjnym pozycjonowaniem x,y,z	Sutter Instruments	MP-285	dwa mirkomanipulatory są potrzebne do oddzielnego przechowywania mikroelektrody jonoselektywnej i mikroelektrody jonoforetycznej. Możliwe jest również przyklejanie mikropipet w układzie rozstawionym (patrz tekst).
jednostka kondycjonowania sygnału z filtrem dolnoprzepustowym	Axon Instruments	CyberAmp 320 lub 380	nie jest już dostępny u producenta, ale może być dostępny w serwisie E-Bay; alternatywy: np. Filtr/wzmacniacz FLA-01 firmy Cygnus Technology. Jest to instrument jednokanałowy z minimalnym odcięciem przy 10 Hz przy użyciu wielobiegunowego filtra Bessela, ale firma może być skłonna do zmodyfikowania go w celu uzyskania niższej częstotliwości odcięcia (2 Hz), jeśli zajdzie taka potrzeba.
srebrny drut	A-M Systems	#7830	średnica 0,015", goła (bez powłoki)
komora na plastry	Aparat Harvarda	Warner Model RC-27L	to jest komora zanurzeniowa; nie używaj
			do silanizacji i napełniania końcówki jonoselektywnej beczki ciekłym wymieniaczem jonowym; zamontowany poziomo;
strzykawka różnych dostawców, 10 ml		Strzykawki i igły BD #309604	do zasypywania mikroelektrod i do silanizacji; Filtr strzykawkowy BD Luer-Lok z końcówką
0,22 i mikro; m pore	Whatman	#6780-1302	do filtrowania roztworów zasypki; dostępne od igły
strzykawkowej Fisher, rozmiar 28, 97 mm	World Precision Instruments	MicroFil MF28G-5	do zasypywania mikroelektrod
Rurki teflonowe (=PTFE)	Dostawa komponentów	STT-28 Ścianka świetlna rurki PTFE (rozmiar 28)	do silanizacji beczki jonoselektywnej; pasuje do igieł BD PrecisionGlide 25 G x 5/8 cala. Uwaga: Teflon jest niezbędny, rurki PVC stopiłyby się pod wpływem gorącego wosku.
system kontroli temperatury	Harvard Apparatus	Warner Models TC-344B i SH-27A	TC-344B to podwójny automatyczny regulator temperatury, SH-27A to grzałka liniowa; sterownik i grzałka współpracują z komorami warstwowymi Warnera chlorek
tetrametyloamonu (TMA)	Sigma-Aldrich	T-3411	5 M roztwór; UWAGA: ostra toksyczność (doustna, skórna, inhalacyjna), rakotwórczość, niebezpieczna dla środowiska wodnego, pełny opis znajduje się w Sigma-Aldrich Informacja o bezpieczeństwie
mikrotom	Leica	VT1000S	do cięcia plastrów mózgu
ksylenów	Fisher	X5-1	do silanizacji; UWAGA: łatwopalny, ostra toksyczność (doustna, skórna, wziewna), skóra, uszkodzenie oczu, rakotwórczość patrz Fisher Safety Information w celu uzyskania pełnego opisu

AmScope Wymieniacz jonowy szklanymi mikroskopu stereoskopowego z komorą warstwową interfejsu