Artykuł metodologiczny

Wpływ allogenicznego osocza bogatopłytkowego (PRP) na proces gojenia przeciętych ścięgien Achillesa szczurów: opis metodologiczny

8.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55759

⸱

19 marca 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Experimental Surgery, GIGA-R & Credec, University of Liège, 2Laboratory of Connective Tissues Biology, GIGA-R, University of Liège, 3Department Argenco, University of Liège, 4Department of Clinical Biology, University Hospital of Liège, University of Liège, 5Physical Medicine and Sport Traumatology Department, FIFA Medical Center of Excellence, University Hospital of Liège, University of Liège

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje proces oceny gojenia ścięgien u szczurów, którym wstrzyknięto allogeniczne osocze bogatopłytkowe (PRP) lub roztwór soli fizjologicznej po usunięciu części ścięgna Achillesa. Postęp gojenia ścięgien jest oceniany w kilku punktach czasowych za pomocą różnych rodzajów analiz.

Streszczenie

Ten artykuł opisuje procedury eksperymentalne używane do obserwacji, czy PRP może pozytywnie wpływać na gojenie ścięgien. Istnieją 4 główne kroki, które należy wykonać: wywołanie zmiany w ścięgnie Achillesa; przygotować PRP i wstrzyknąć go (lub roztwór soli fizjologicznej); usunąć ścięgno; i przeprowadzaj oceny biomechaniczne, molekularne i histologiczne. Na każdym etapie wszystkie procedury i metody są szczegółowo opisane, dzięki czemu można je łatwo odtworzyć.

Ścięgna Achillesa zostały chirurgicznie przecięte (usunięcie odcinka o długości 5 mm). Następnie wstrzyknięto PRP lub roztwór soli fizjologicznej, aby zbadać, czy PRP ma pozytywny wpływ na gojenie się ścięgna. Trzy grupy po 40 zwierząt (w sumie w tym badaniu wykorzystano 120 szczurów) podzielono na 2 podgrupy: grupę iniekcji PRP i grupę kontrolną wstrzykiwania soli fizjologicznej. Szczury uśmiercano w coraz większych punktach czasowych (Grupa A: 5 dni; Grupa B: 15 dni; Grupa C: 30 dni) i usunięto ścięgna. 90 ścięgien poddano testom biomechanicznym przed wykonaniem analizy transkryptomicznej, a 30 pozostałych ścięgien poddano analizie histologicznej.

Wprowadzenie

Koagulacja, procesy zapalne i rola płytek krwi w modulacji odporności są dobrze znane1. Niedawno wykazano, że mają one również właściwości regenerujące2,3. Rzeczywiście, różne cytokiny i czynniki wzrostu (VEGF, PDGF, TGF-B, IGF-I i HGF) są uwalniane przez płytki krwi podczas degranulacji. Te czynniki wzrostu sprzyjają angiogenezie, przebudowie tkanek i gojeniu się ran (kości, skóry, mięśni, ścięgien)2. Wirowanie krwi autologicznej wytwarza osocze bogatopłytkowe (PRP), które zawiera wysokie stężenia płytek krwi w zależności od metody izolacji (od 3 do 10 razy większe niż stężenie wyjściowe we krwi). Rzeczywiście, różne techniki przygotowania PRP nie są w stanie zapewnić identycznego produktu końcowego. Do tej pory nie osiągnięto w tej sprawie ogólnego porozumienia międzynarodowego. Ogólnie rzecz biorąc, PRP może być atrakcyjną opcją terapeutyczną w leczeniu przewlekłych schorzeń układu mięśniowo-szkieletowego, takich jak tendinopatia, zapalenie rozcięgna podeszwowego, choroba zwyrodnieniowa stawów i brak zrostu4. Po raz pierwszy zastosowano go w chirurgii jamy ustnej i implantologii4 w celu poprawy i przyspieszenia gojenia kości po wszczepieniu implantu dentystycznego. W tym badaniu opisujemy powtarzalną metodę, która pozwala na pozyskanie PRP do eksperymentów na zwierzętach4.

Ponieważ uszkodzenia ścięgien są często obserwowane u sportowców i osób pracujących fizycznie, bardzo interesujące jest usprawnienie procesu gojenia, a tym samym skrócenie czasu rekonwalescencji5. Nowe metody leczenia, które się rozwijają, często obejmują stosowanie czynników wzrostu, a podawanie PRP jest prostym i minimalnie inwazyjnym sposobem dostarczania mieszanki endogennych czynników wzrostu4.

Kilka badań in vitro lub na zwierzętach wykazało, że podawanie osocza zawierającego wysoki poziom płytek krwi, poprzez uwalnianie biologicznych mediatorów, może stymulować naprawę ścięgien i więzadeł poprzez uwalnianie biologicznych mediatorów6,7,8,9. Ponadto inne badania wykazały, że PRP może stymulować syntezę kolagenu typu I i III w komórkach ścięgien9,10,11. Zasugerowano również, że PRP może zmniejszać aktywację metaloproteinaz macierzy (MMP), a tym samym zmniejszać degradację macierzy. Komórki biorące udział w procesie zapalnym mogą wytwarzać MMP-9, który odgrywa rolę w przebudowie tkanek (fizjologicznej i patologicznej) wywołanej stanem zapalnym12.

Na podstawie tych informacji, postawiliśmy hipotezę, że pojedyncze wstrzyknięcie PRP w przecięte ścięgna Achillesa szczurów może poprawić proces regeneracji i wytrzymałość mechaniczną naprawianej tkanki. Jest to testowane poprzez pomiar właściwości biomechanicznych gojących się ścięgien podczas procesu rekonwalescencji oraz poprzez przeprowadzanie analiz histologicznych i molekularnych w celu oceny przebudowy kolagenu w nowo powstałej tkance. Celem pracy było sprawdzenie, czy jednorazowe wstrzyknięcie allogenicznego PRP może wpływać na gojenie się przeciętych ścięgien Achillesa.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Opieka nad zwierzętami i obchodzenie się z nimi były wykonywane zgodnie z Przewodnikiem Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych przygotowanym przez Narodową Akademię Nauk i opublikowanym przez National Institutes of Health (USA). Prawodawstwo europejskie i krajowe było ściśle przestrzegane.

1. Przygotowanie zwierząt

  1. Użyj 132 2-miesięcznych samców szczurów Sprague-Dawley o wadze 320-450 g (120 szczurów do eksperymentów i 12 szczurów do pobierania krwi, Ryc. 1). Na podstawie Dell13, 15 szczurów dla każdej grupy wystarczyło do uzyskania potęgi 0,8 (80% szansy na znalezienie istotności statystycznej, jeśli określony efekt istnieje).
  2. Trzymaj wszystkie szczury w klasycznych klatkach w warunkach izolacji w konwencjonalnym obiekcie wyposażonym w przebieralnię. Zainicjuj hodowlę w stojaku IVC (indywidualnie wentylowana klatka), przy czym szczury z filtrem SPF (wolne od specyficznych patogenów) są specjalnie kupowane.
  3. Stosować w następujących warunkach mieszkaniowych: zakres temperatur od 19-24 °C; wilgotność względna: 40-60%; wentylacja: częstotliwość wymiany powietrza: 10-15 na godzinę; cykl jasny/ciemny: 12 h-12 h.
  4. Wysterylizuj wszystkie urządzenia do trzymania w klatkach i użyj napromieniowanej ściółki. Systematycznie wdrażaj wzbogacanie klatek, umieszczając w nich sterylne tacki kartonowe i ręczniki.
  5. Zezwól na wejście do strefy w ograniczonych warunkach: nowy fartuch laboratoryjny, maska, rękawice, obuwie i czepek do włosów przy wejściu.
  6. Przeprowadzaj coroczny monitoring stanu zdrowia kolonii zwierząt wskaźnikowych trzymanych na brudnej ściółce, zgodnie z zaleceniami Felasa14 dla konwencjonalnych obiektów. Trzymać od czterech do pięciu zwierząt w klatce, stosując odpowiednią napromieniowaną dietę i dostarczając zakwaszoną wodę ad libitum. Monitoruj codziennie.
  7. Szczury transferowe wybrane do interwencji chirurgicznej w filtrowaniu górnych klatek do sal operacyjnych na 2 godziny przed zabiegiem.

2. Zabieg chirurgiczny

  1. Przygotuj narzędzia chirurgiczne: cienkie nożyczki, zacisk, dwa zaciski hemostatyczne i uchwyt na igłę. Podczas wszystkich zabiegów należy nosić rękawiczki, maskę, kaptur i fartuch laboratoryjny.
  2. Losowo podziel szczury na dwie grupy (PRP i roztwór soli fizjologicznej).
  3. Wyjmij szczura z klatki i zważ go. Użyj ponumerowanych kolczyków, aby zidentyfikować szczury. Aby uniknąć wysuszenia oczu, umieść krople wody na rogówce.
  4. Znieczulić szczura dootrzewnowo ksylazyną (10 mg/kg masy ciała) i ketaminą (80 mg/kg masy ciała). Aby potwierdzić znieczulenie, umieść zwierzęta pod monitorowaniem krążeniowo-oddechowym i sprawdź, czy nie ma odruchów wzrokowych.
  5. Wstrzyknąć 50 μl buprenorfiny podskórnie (0,01-0,05 mg/kg co 8-12 h) w okolicę szyi jako środek przeciwbólowy.
  6. Ogolić lewą tylną kończynę golarką elektryczną, zdezynfekować ją 3 naprzemiennymi peelingami roztworu izobetadyny/alkoholu (rozcieńczonego w stosunku 1:10) i umieścić szczura na ciepłej podkładce (20 °C) pod mikroskopem preparacyjnym. Umieść szczura na bocznym odleżynie z nogą, która ma być operowana, w pozycji nadrzędnej. Przytrzymaj łapę kleszczami chirurgicznymi.
  7. Za pomocą nożyczek wykonaj małe boczne nacięcie (20-25 mm) w skórze otaczającej lewe ścięgno Achillesa i wypreparuj powięź za pomocą cienkich nożyczek, aby odsłonić kompleks ścięgna Achillesa (Rysunek 2a).
  8. Usuń ścięgno podeszwowe nożyczkami (Rysunek 2b).
  9. Przetnij ścięgno Achillesa poprzecznie 5 mm proksymalnie do przyczepu piętowego i usuń część o długości 5 mm za pomocą nożyczek. Nie zszywaj ścięgna (Rysunek 2c, 2d).
  10. Zszyj powięź, a następnie skórę przędzą wchłanialną, wykonując szew overjet (szew ciągły). Można również stosować szwy monofilamentowe, aby zapobiec przedostawaniu się wilgoci ze skóry do nacięcia chirurgicznego.
  11. Umieść szczura pod lampą grzewczą do momentu przebudzenia, a następnie umieść go z powrotem w klatce (58 x 38 cm) (Nota bene: nie nakłada się unieruchomienia).

3. PRP Preparation15

  1. Znieczulić szczury dawcy ksylazyną (10 mg/kg masy ciała) i ketaminą (80 mg/kg masy ciała) we wstrzyknięciu dootrzewnowym. Iniekcja PRP przeprowadza się 2 godziny po operacji bez konieczności znieczulenia.
  2. Wstrzyknąć podskórnie 50 μl buprenorfiny jako środek przeciwbólowy.
  3. Zebrać krew pełną (20 ml na szczura, końcowe krwawienie) przez nakłucie serca do sterylnych probówek zawierających 3,2% buforowany cytrynian sodu (0,109 M, antykoagulant). Następnie poddaj szczura eutanazji przez wstrzyknięcie dosercowe.
  4. Aby uzyskać PRP, należy odwirować krew przez 10 minut w temperaturze 150 x g i temperaturze pokojowej. Ten początkowy etap wirowania z niską prędkością daje dwie odrębne fazy: dolną fazę składającą się z czerwonych krwinek (RBC), która stanowi około 80-90% całkowitej objętości, oraz górną fazę składającą się z osocza bogatopłytkowego (PRP) (zwykle 10-20% próbki krwi).
  5. Delikatnie zbierz PRP (górna faza) do wtórnej plastikowej rurki za pomocą plastikowej pipety transferowej. Ponieważ interfejs między PRP a czerwonymi krwinkami jest bardzo luźny, nie należy pipetować zbyt blisko interfejsu. Przy prawidłowym obchodzeniu się z zanieczyszczonymi erytrocytami w PRP powinno być poniżej 0,05 x 103 komórek/μL. Wyrzuć pozostałą dolną fazę i pierwotną probówkę do pobierania krwi.
  6. Określ objętość pobranego PRP i zmierz liczbę płytek krwi na analizatorze hematologicznym. Wartości te są wymagane do obliczeń w celu dostosowania stężenia płytek krwi w następnym kroku. Liczba krwinek jest również przydatna do oceny potencjalnego zanieczyszczenia krwinkami czerwonymi i białymi krwinkami. Stężenie płytek krwi w PRP na tym etapie wynosi zwykle 1 – 1,5 x106/μL.
  7. Przeprowadzić drugie odwirowanie PRP przez 10 minut w temperaturze 1 000 x g i temperaturze pokojowej. Ten etap wirowania z dużą prędkością daje luźny osad płytek krwi i supernatant składający się z autologicznego osocza ubogiego w płytki krwi (PPP). Korzystając z wartości określonych w kroku 3.6, obliczyć objętość supernatantu, którą należy odrzucić w celu zagęszczenia PRP i osiągnięcia końcowego stężenia 2,5 x106/μL.
  8. Delikatnie zebrać supernatant (PPP) do wtórnej plastikowej probówki za pomocą plastikowej pipety transferowej, pozostawiając około dwóch trzecich końcowej objętości obliczonej w kroku 3.7. Ponieważ osad jest luźny, znaczna ilość płytek krwi jest tracona w wyniku wyrzucenia PPP, co potencjalnie zmniejsza końcowe pożądane stężenie.
  9. Ostrożnie zawiesić osad płytek krwi z pozostałym supernatantem, delikatnie powtarzając pipetowanie. Zmierz liczbę płytek krwi na tym skoncentrowanym PRP. W razie potrzeby dodać odpowiednią objętość autologicznego PPP, aby osiągnąć końcowe stężenie docelowe.
    UWAGA: Osocze bogatopłytkowe należy zużyć w ciągu 3 godzin od przygotowania.
  10. Dodać 50 μl CaCl2 (11 mEq 10 ml) na ml PRP, aby aktywować płytki krwi
    11. .
  11. Wstrzyknąć 50 μl świeżego roztworu PRP lub soli fizjologicznej za pomocą igły 21G bezpośrednio w zszyte miejsce operacji po około 1 godzinie od przygotowania. W tym czasie PRP należy przechowywać w temperaturze pokojowej.
  12. Uważnie monitoruj powrót do sprawności szczurów w ciągu kilku dni po operacji i przed usunięciem ścięgna Achillesa.

4. Usunięcie ścięgna Achillesa i testy biomechaniczne16

  1. 5, 15 lub 30 dni później5, zważ szczura. Następnie znieczulić ksylazyną (10 mg/kg masy ciała) i ketaminą (80 mg/kg masy ciała) we wstrzyknięciu dootrzewnowym.
  2. Wstrzyknąć podskórnie 50 μl buprenorfiny jako środek przeciwbólowy. Usuń ścięgno przed poświęceniem zwierzęcia, aby utrzymać warunki fizjologiczne tak długo, jak to możliwe.
  3. Ogol lewą tylną kończynę i umieść szczura pod mikroskopem preparacyjnym. Umieść szczura na bocznym odleżynie z nogą, która ma być operowana, w pozycji nadrzędnej. Przytrzymaj łapę palcami.
  4. Wykonaj małe nacięcie (10 mm) w poprzednim miejscu operacji i rozciągaj do momentu odsłonięcia triceps suralis.
  5. Aby usunąć gojące się ścięgno Achillesa, przetnij kość piętową poprzecznie 5-10 mm dystalnie do przyczepu ścięgna Achillesa. Następnie wypreparuj część tricepsa suralis, który jest przyczepiony do ścięgna Achillesa (Ryc. 3b). Część mięśniowa musi być wystarczająco duża, aby zmieścić się w kriożuchwie (Rysunek 3c-d). Umieść próbkę natychmiast w kriożuchwie za pomocą kleszczy (Rysunek 3e).
  6. Po usunięciu kompleksu mięśnia-ścięgna-kości, należy poddać szczura eutanazji przez dosercowe wstrzyknięcie Nembutalu (200 mg/kg). Potwierdź zgon, oceniając brak rytmu serca i oddychania przez 15 minut.
  7. Umieść jednostkę mięśniową w górnej szczęce (Rysunek 3e), zamknij ją i umieść pionowo w uniwersalnej maszynie wytrzymałościowej (106,2 kN, Rysunek 3a). Następnie zamocuj kość między dolnymi zaciskami maszyny (Rysunek 3f).
  8. Dodaj ciekły azot do obu basenów górnej szczęki, aby zamrozić mięsień, tak aby był o rząd wielkości sztywniejszy niż ścięgno i nie odkształcał się podczas próby rozciągania.
  9. Gdy strefa zamarzania dotrze do metalowej granicy zacisku, rozpocznij próbę rozciągania, aby ścięgno zachowało swoją strukturę. Ustaw szybkość przemieszczenia maszyny na stałą prędkość 1 mm/s aż do pęknięcia. Zapisz na komputerze ostateczną wytrzymałość na rozciąganie (UTS) podaną w niutonach (N).
  10. Aby obliczyć pole przekroju poprzecznego, umieść dwie kamery prostopadle do siebie, tworząc eliptyczny kształt, i zrób zdjęcia.
  11. Aby uwzględnić różnicę w polu przekroju poprzecznego gojących się ścięgien, znormalizuj UTS do jednostki powierzchni (N na milimetr kwadratowy), która reprezentuje naprężenia mechaniczne doświadczane przez tkankę.

5. Analiza histologiczna

UWAGA: 15 ścięgien z każdej grupy zostało poddanych analizie histologicznej.

  1. Po jego usunięciu należy natychmiast zanurzyć ścięgno Achillesa w 4% paraformaldehydzie, aby zachować jego strukturę (utrwala się 1 mm tkanki na godzinę, więc czas utrwalenia różni się w zależności od wielkości ścięgna).
  2. Zastąp paraformaldehyd 70% etanolem i pozostaw próbkę na co najmniej jedną noc w tym roztworze.
  3. Umieść ścięgno w małym plastikowym pojemniku z otworami i umieść ten pojemnik w świeżym roztworze 70% etanolu na 1 godzinę.
  4. Umieść pojemnik w 95% etanolu na 1 godzinę. Powtórz.
  5. Umieść pojemnik w 100% etanolu na 1 godzinę. Powtórz.
  6. Umieść pojemnik w 100% ksylenie na 1 godzinę. Powtórz.
  7. Teraz umieść plastikowy pojemnik, w którym znajduje się ścięgno, w płynnej parafinie (56 °C) i pozostaw na noc.
  8. Korzystając ze stacji zatapiania (wyposażonej w stopiony wosk, gorącą płytę i zimną płytę), wybierz metalową formę, która najlepiej pasuje do próbki tkanki i napełnij ją niewielką ilością płynnej parafiny, aby podstawa była pokryta.
    UWAGA: Ustawić próbkę tak, aby uzyskać pionowe sekcje na mikrotomie.
  9. Po prawidłowym umieszczeniu próbki napełnij formę ciekłą parafiną i umieść ją na maszynie chłodniczej. Pozostaw do ostygnięcia przez co najmniej 15 minut.
  10. Wyjmij z bloku parafiny i umieść go na lodzie na co najmniej 30 minut.
  11. Przygotuj kilka czystych szkiełek i umieść na nich kropelki wody dejonizowanej.
  12. W mikrotomie pokrój bloki na odcinki po 5 μm (używaj tylko odcinków ze środkowej części ścięgna) i umieść odcinek na szkiełku.
  13. Umieść szkiełka w piecu grzewczym w temperaturze 65 °C na kilka minut, tak aby parafina zaczęła się topić, aby związać tkankę ze szkłem.
  14. Umieść szkiełka zawierające skrawki parafiny w uchwycie na plastry.
  15. Teraz należy odparafinować i ponownie nawodnić tkankę, umieszczając ją w następujących następujących kolejnych kąpielach:
    8 min w ksylenie (kąpiel 1)
    4 min w ksylenie (kąpiel 2)
    2 min w 100% etanolu
    2 min w 95% etanolu
    2 min w 70% etanolu
    2 min w wodzie dejonizowanej
  16. W celu barwienia Hematoksyliny-Eozyny należy umieścić tkankę w następujących roztworach.
    1. Zanurzyć tkankę na 8 minut w roztworze hematoksyliny (1 g monohydratu hematoksyliny, 0,2 g KIO3, 50 g AIK (SO4)2,12H2O; 200 ml gliceryny; dodać do 1 l wodą destylowaną).
    2. Zanurz chusteczkę na 8 minut pod bieżącą wodą z kranu.
    3. Zanurz tkankę na 30 s w roztworze eozyny (0,25% eozyny w 100 ml wody destylowanej zawierającej 200 μl nierozcieńczonego kwasu octowego).
    4. Zanurz chusteczkę na 2 minuty pod bieżącą wodą z kranu.
  17. W przypadku barwienia trichromowego Massona wykonaj następujące kroki.
    1. Po ponownym uwodnieniu umieścić sekcje w pojemniku z ałunem żelaza (0,5 g (NH4)Fe(SO4)2,12H2O w 10 ml H2O) i zamknąć pojemnik. Podgrzej przez 3 minuty z mocą 280 W w kuchence mikrofalowej.
    2. Pozwól mu ostygnąć przez minutę, a następnie spłucz wodą dejonizowaną.
    3. Umieścić skrawki w zamkniętym pojemniku z roztworem hematoksyliny Regauda (0,5 g hematoksyliny rozpuszczonej w 50 mlH2Ow temperaturze 50 °C, następnie dodać 5 ml 95% etanolu i 5 ml gliceryny), podgrzewać przez 90 s w temperaturze 280 W.
    4. Opłucz go wodą dejonizowaną.
    5. Umieść skrawki w roztworze kwasu pikrynowego (po nasyceniu metanolem) na 3 minuty, płucz przez 5 minut pod bieżącą wodą z kranu, a następnie umieść je w wodzie dejonizowanej na kilka sekund.
    6. Teraz umieść skrawki w kwaśnej fuksyny (0,5 g w 50 ml H2O zawierającej 0,25 ml nierozcieńczonego kwasu octowego) na 5 s i spłucz pod bieżącą wodą z kranu, aż barwnik zniknie.
    7. Inkubować skrawki w roztworze kwasu fosfomolibdenowego (0,5 g w 50 mlH2O) przez 5 minut, umieścić na kilka sekund w wodzie dejonizowanej.
    8. Umieść skrawki w jasnozielonym (0,5 g w 50 ml H2O zawierającym 0,25 ml nierozcieńczonego kwasu octowego) roztworze na kolejne 5 minut i umieść pod bieżącą wodą z kranu, aż barwnik zniknie.
  18. Teraz ponownie odwodnić tkankę.
    1. Zanurz sekcję na 1 minutę w 70% etanolu.
    2. Zanurz sekcję na 1 minutę w 95% etanolu.
    3. Zanurz sekcję na 1 minutę w 100% etanolu.
    4. Zanurz sekcję na 1 minutę w ksylenie (kąpiel 1).
    5. Zanurz sekcję na 1 minutę w ksylenie (kąpiel 2).
    6. Usuń sekcje bez usuwania zbyt dużej ilości ksylenu i nałóż kroplę podłoża montażowego na próbkę.
    7. Połóż szkiełko nakrywkowe na wierzchu (nie prowokując żadnych pęcherzyków) i pozwól mu stwardnieć przez co najmniej 2 godziny.
    8. Hydrolizować 5 odcinków histologicznych (każdy z innego ścięgna) każdej grupy w 6 N HCl przez 3 godziny i oznaczyć stężenie kolagenu, mierząc hydroksyprolinę jako wskaźnik w 5 μm niebarwionych skrawkach.
  19. Znormalizuj wyniki według obszaru przekroju za pomocą oprogramowania producenta.
  20. Zabarwić niektóre sekcje jasnozielonym barwnikiem, aby uwidocznić i określić ilościowo kolagen fibrylarny za pomocą analizy wspomaganej komputerowo.
  21. Zeskanuj sekcje i przekonwertuj zdjęcia w odcieniach szarości za pomocą oprogramowania IrfanView. Użyj oprogramowania do półkwantyfikacji (np. Ilość pierwsza).

6. Ocena molekularna

  1. Po zerwaniu ścięgna, do którego dochodzi podczas prób mechanicznych, należy pobrać próbki, zamrozić je w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C (PRP i roztwór soli fizjologicznej)17.
  2. Użyj komercyjnego zestawu Total RNA, aby wyizolować total RNA17.
  3. Zmierz ekspresję kolagenu (Col I i Col III), metaloproteinaz macierzy (MMP-2, MMP-3 i MMP-9) oraz tenomoduliny (TNMD) za pomocą RT-PCR17,18.
  4. Znormalizuj poziomy ekspresji mRNA do poziomów 28S19.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wyniki przedstawiono jako średnią ± odchylenie standardowe średniej i porównano za pomocą analizy wariancji (ANOVA). Zastosowano dwuczynnikową analizę ANOVA oraz test post hoc de Scheffé, który jest testem parametrycznym.

Maksymalna wytrzymałość na rozciąganie (UTS) wymagana do wywołania przerwania nieuszkodzonych ścięgien Achillesa u szczurów wynosiła 42,0 ± 5,7 N (n = 10). Wytrzymałość na rozciąganie wzrosła istotnie ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Płytki krwi są niezbędne we wczesnej fazie zapalnej procesu gojenia się ścięgien. Kiedy te płytki krwi są wystawione na działanie tkanki wiążącej lub czynników indukujących krzepnięcie, uwalniają czynniki wzrostu, które są przechowywane w α granulkach. W wyniku tej interakcji syntetyzowane są makrocząsteczki macierzy zewnątrzkomórkowej i namnażają się komórki mezenchymalne. Płytki krwi mają również działanie chemotaktyczne na komórki progenitorowe w krążeniu krwi, zwiększając angiogenezę i stymulując różnicowanie komórko...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez granty Standard de Liège i Lejeune- Lechien z Leon Frédéricq Funds.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Ksylazyna (Xyl-M)VMDbrakznieczulający
Ketamin (Jé tamine 1000 CEVA)CEVA Santé Animalebrakznieczulenia
Buprenorfina (Vetergé sic Multidosis)ALSTOEbrakPrzeciwbólowy
iso-BetadineMEDA-PharmabrakOdkażająca
przędza resorbowalna Vicryl 6/0Johnson & Johnson
NembutalCEVA Santé AnimalebrakZnieczulenie
ParaformaldehydSigma-AldrichP6148Zachowuje strukturę tkanki
Izopropanol 100%VWR20,922,364
Etanol 95%VWR20,823,362
KsylenVWR28973.363
ParafinaVWRLEIC3950.1006
HematoksylinaMillipore1.15938.0025Barwnik
EosinMillipore1.15935.0100Barwnik
EukittSigma-Aldrich3989Podłoże montażowe
CaCl2

Bibliografia

  1. Kaux, J., Degrave, N., Crielaard, J. Platelet rich plasma traitement des tendinopathies chroniques? Revue de la littérature. Platelet rich plasma treatment of chronic tendinopathies? Review of literature. J. Traumatol. du Sport. 24, 99-102 (2007).
  2. Anitua, E., et al. Autologous preparations rich in growth factors promote proliferation and induce VEGF and HGF production by human tendon cells in culture. J. Orthop. Res. 23, 281-286 (2005).
  3. Bosch, G., et al. Effects of platelet-rich plasma on the quality of repair of mechanically induced core lesions in equine superficial digital flexor tendons: A placebo-controlled experimental study. J. Orthop. Res. 28, 211-217 (2010).
  4. Kaux, J. F., Drion, P., Croisier, J. L., Crielaard, J. M. Tendinopathies and platelet-rich plasma (PRP): From pre-clinical experiments to therapeutic use. J. Stem Cells Regen. Med. 11, P7-P17 (2015).
  5. Maffulli, N., Wong, J., Almekinders, L. C. Types and epidemiology of tendinopathy. Clin. Sports Med. 22, 675-692 (2003).
  6. Molloy, T., Wang, Y., Murrell, G. The roles of growth factors in tendon and ligament healing. Sports Med. 33, 381-394 (2003).
  7. Lyras, D. N., et al. The effect of platelet-rich plasma gel in the early phase of patellar tendon healing. Arch. Orthop. Trauma Surg. 129, 1577-1582 (2009).
  8. Aspenberg, P., Virchenko, O. Platelet concentrate injection improves Achilles tendon repair in rats. Acta Orthop. Scand. 75, 93-99 (2004).
  9. Visser, L. C., et al. Growth Factor-Rich Plasma Increases Tendon Cell Proliferation and Matrix Synthesis on a Synthetic Scaffold: An In Vitro Study. Tissue Eng. Part A. 16, 1021-1029 (2010).
  10. Zhang, J., Wang, J. H. -C. Platelet-Rich Plasma Releasate Promotes Differentiation of Tendon Stem Cells Into Active Tenocytes. Am. J. Sports Med. 38, 2477-2486 (2010).
  11. Kajikawa, Y., et al. Platelet-rich plasma enhances the initial mobilization of circulation-derived cells for tendon healing. J. Cell. Physiol. 215, 837-845 (2008).
  12. Pasternak, B., Aspenberg, P. Metalloproteinases and their inhibitors-diagnostic and therapeutic opportunities in orthopedics. Acta Orthop. 80, 693-703 (2009).
  13. Dell, R. B., Holleran, S., Ramakrishnan, R. Sample size determination. ILAR J. 43, 207-213 (2002).
  14. Mähler Convenor, M., et al. FELASA recommendations for the health monitoring of mouse, rat, hamster, guinea pig and rabbit colonies in breeding and experimental units. Lab. Anim. 48, 178-192 (2014).
  15. Kaux, J. -F., et al. Étude comparative de cinq techniques de préparation plaquettaire (platelet-rich plasma). Pathol. Biol. 59, 157-160 (2011).
  16. Wieloch, P., Buchmann, G., Roth, W., Rickert, M. A cryo-jaw designed for in vitro tensile testing of the healing Achilles tendons in rats. J. Biomech. 37, 1719-1722 (2004).
  17. Kaux, J. -F., et al. Vascular Endothelial Growth Factor-111 (VEGF-111) and tendon healing: preliminary results in a rat model of tendon injury. Muscles. Ligaments Tendons J. 4, 24-28 (2014).
  18. Docheva, D., Hunziker, E. B., Fässler, R., Brandau, O. Tenomodulin is necessary for tenocyte proliferation and tendon maturation. Mol. Cell. Biol. 25, 699-705 (2005).
  19. Lambert, C. A., Colige, A. C., Munaut, C., Lapière, C. M., Nusgens, B. V. Distinct pathways in the over-expression of matrix metalloproteinases in human fibroblasts by relaxation of mechanical tension. Matrix Biol. 20, 397-408 (2001).
  20. Nurden, A. T., Nurden, P., Sanchez, M., Andia, I., Anitua, E. Platelets and wound healing. Front. Biosci. 13, 3532-3548 (2008).
  21. Woodall, J., Tucci, M., Mishra, A., Benghuzzi, H. Cellular effects of platelet rich plasma: a study on HL-60 macrophage-like cells. Biomed. Sci. Instrum. 43, 266-271 (2007).
  22. Taylor, D. W., Petrera, M., Hendry, M., Theodoropoulos, J. S. A systematic review of the use of platelet-rich plasma in sports medicine as a new treatment for tendon and ligament injuries. Clin. J. Sport Med. 21, 344-352 (2011).
  23. Mazzocca, A. D., et al. The positive effects of different platelet-rich plasma methods on human muscle, bone, and tendon cells. Am. J. Sports Med. 40, 1742-1749 (2012).
  24. McCarrel, T. M., Minas, T., Fortier, L. A. Optimization of leukocyte concentration in platelet-rich plasma for the treatment of tendinopathy. J. Bone Joint Surg. Am. 94 (1-8), e143(2012).
  25. Boswell, S. G., et al. Increasing platelet concentrations in leukocyte-reduced platelet-rich plasma decrease collagen gene synthesis in tendons. Am. J. Sports Med. 42, 42-49 (2014).
  26. Virchenko, O., Aspenberg, P. How can one platelet injection after tendon injury lead to a stronger tendon after 4 weeks?: Interplay between early regeneration and mechanical stimulation. Acta Orthop. 77, 806-812 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

ci gno Achillesagojenie ci gienbadania biomechaniczneanaliza histologicznaprzygotowanie PRPuszkodzenie chirurgicznewytrzyma o na rozci ganiebarwienie kolagenumodel szczurzy

Powiązane artykuły