Artykuł metodologiczny

Techniki laboratoryjne stosowane do utrzymania i różnicowania biotypów izolatów klinicznych i środowiskowych Vibrio cholerae

DOI:

10.3791/55760

⸱

30 maja 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Plymouth State University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten manuskrypt opisuje prawidłowe techniki utrzymania Vibrio cholerae wraz z serią testów biochemicznych, wspólnie wykorzystywanych do szybkiego i niezawodnego rozróżniania klinicznego i środowiskowego V. biotypy w warunkach laboratoryjnych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wodna bakteria Gram-ujemna Vibrio cholerae jest czynnikiem etiologicznym zakaźnej choroby przewodu pokarmowego. Ze względu na globalne rozpowszechnienie i nasilenie tej choroby, V. była szeroko badana zarówno w warunkach środowiskowych, jak i laboratoryjnych, wymagając odpowiedniej konserwacji i technik hodowli. Klasyczny i El Tor to dwa główne biotypy, które składają się na V. Serogrupa O1, z których każda wykazuje unikalne cechy genotypowe i fenotypowe, które zapewniają wiarygodne mechanizmy charakterystyki biotypu i wymagają odrębnych warunków hodowli indukujących zjadliwość. Niezależnie od biotypu szczepu wywołującego daną infekcję lub epidemię, standardowe leczenie choroby obejmuje terapię nawadniającą uzupełnioną schematem antybiotyków. Jednak klasyfikacja biotypów może być konieczna do badań laboratoryjnych i może mieć szersze oddziaływanie w dziedzinie biomedycyny. Na początku 2000 roku zidentyfikowano izolaty kliniczne, które wykazują cechy genotypowe i fenotypowe zarówno z biotypów klasycznych, jak i El Tor. Nowo zidentyfikowane hybrydy, nazwane wariantami El Tor, spowodowały, że kliniczna i środowiskowa identyfikacja biotypu izolatu stała się bardziej złożona niż poprzednie tradycyjne protokoły identyfikacji pojedynczych testów. Oprócz opisania V. techniki ogólnego utrzymania i hodowli , ten manuskrypt opisuje serię specyficznych dla genów (ctxB i tcpA) genetycznych badań przesiewowych opartych na PCR i testów fenotypowych (oporność na polimyksynę B, metabolizm cytrynianu, aktywność proteolityczna, aktywność hemolityczna, ruchliwość i metabolizm glukozy za pomocą testu Vogesa-Proskauera) wspólnie stosowanych do charakteryzowania i / lub rozróżniania biotypów klasycznych i El Tor. Razem testy te zapewniają skuteczne systematyczne podejście, które można stosować jako alternatywę lub dodatkowo do kosztownych, pracochłonnych eksperymentów w charakterystyce V. Izolaty kliniczne (i środowiskowe) .

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

jest chorobą dystalnego jelita cienkiego spowodowaną spożyciem skażonej żywności lub wody zawierającej wodną bakterię Gram-ujemną Vibrio cholerae. Objawy obejmują wymioty i niekontrolowaną wodnistą biegunkę, prowadzącą do ciężkiego odwodnienia, które, jeśli nie jest odpowiednio leczone, spowoduje śmierć. V. Cholerę można podzielić na ponad 200 serogrup w oparciu o strukturę lipopolisacharydowego antygenu O na powierzchni komórki. Jednak tylko 2 serogrupy, O1 i O139, wykazały potencjał epidemiczny lub pandemiczny1,2. Co więcej, serogrupa O139 została wyizolowana głównie do Azji Południowo-Wschodniej3,4, podczas gdy serogrupa O1 występuje na całym świecie. Ponadto serogrupę O1 można podzielić na 2 główne biotypy: klasyczny i El Tor. Klasyczny biotyp był odpowiedzialny za pierwsze 6 pandemii w latach 1817-1923. Trwająca siódma pandemia jest wynikiem biotypu El Tor, który globalnie wyparł klasyczny biotyp w środowisku5,6,7. Ostatnio pojawiły się szczepy, które zawierają cechy wyróżniające zarówno biotypy klasyczne, jak i El Tor8,9,10,11,12,13,14,15,16,17i od tego czasu są określane jako warianty El Tor13,17. Niektóre warianty El Tor wykazały podwyższone zdolności do wirulencji z szybszym i cięższym postępem choroby niż wcześniej obserwowano, podkreślając potrzebę bardziej kompleksowego podejścia do identyfikacji czynników oraz zapobiegania chorobom i ich leczenia8,9,18. Chociaż identyfikacja biotypu nie od razu dyktuje leczenie, dalsze postępy w opracowywaniu szczepionek i przyszłych środków terapeutycznych mogą skorzystać na rozróżnieniu biotypów.

Pierwsza seria protokołów wymienionych tutaj umożliwi śledczym prawidłowe utrzymanie V. szczepy w warunkach laboratoryjnych. Spójność i późniejsza analiza wymaga przygotowania stada i wzrostu izolatów, co nie jest zależne od biotypu. Jednakże, aby optymalnie indukować ekspresję genów wirulencji, wymagane są niezależne techniki hodowli specyficzne dla biotypu19. Ponadto w tym manuskrypcie przedstawiono przygotowanie do różnych testów genetycznych i biochemicznych.

Toksyna (CT) i pilus współregulowany przez toksynę (TCP) to dwa główne czynniki wirulencji kontrolowane przez główny regulator ToxT w obu biotypach V. O1 serogroup20. CT jest dwuczęściową toksyną składającą się z pięciu podjednostek CtxB otaczających pojedynczą podjednostkę CtxA i jest odpowiedzialna za szybką utratę elektrolitów związaną z. TCP jest pilusem typu IV kodowanym przez operon tcp (tcpABQCRDSTEF) i bierze udział w przyczepianiu i kolonizacji dystalnego jelita cienkiego. tcpA jest pierwszym genem operonu tcp, który koduje poszczególne podjednostki pilin niezbędne do budowy pilus8. Sekwencja genu dla ctxA jest całkowicie konserwatywna między biotypami klasycznymi i El Tor, podczas gdy ctxB i tcpA różnią się w obu biotypach, ale są konserwatywne w każdym biotype8. ctxB jest całkowicie konserwatywny między biotypami, z wyjątkiem dwóch pozycji podstawowych (115 i 203). W biotypie El Tor tymina znajduje się w pozycjach podstawowych 115 i 203, podczas gdy klasyczny biotyp zawiera cytozynę w tych zasadach. tcpA jest całkowicie konserwatywny w każdym biotypie, ale różni się na wielu zasadach między biotypami. Te różnice genetyczne służą jako podstawowe markery identyfikacji biotypu, a po zsekwencjonowaniu produktu amplifikacji reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) obejmującego te miejsca, sekwencje izolatów można porównać z klasycznym O395 typu dzikiego (WT) lub WT El Tor N16961 w celu określenia tła biotypu odpowiednio CT i TCP w danym izolacie V. cholerae.

Liczne protokoły zostały opracowane w celu scharakteryzowania fenotypowych różnic między biotypami klasycznymi a biotypami El Tor21,22,23. Polimyksyna B jest antybiotykiem peptydowym, który narusza integralność zewnętrznej błony komórkowej u bakterii Gram-ujemnych, a oporność na polimyksynę B można uwidocznić za pomocą testu oporności na polimyksynę B21. Cytrynian jest podstawowym substratem cyklu Kreba, a zdolność do metabolizowania cytrynianu jako jedynego źródła węgla można określić za pomocą testu metabolizmu cytrynianu22. hapR koduje globalny regulator i główny regulator quorum-sensing w V. cholerae, HapR, który wiąże się z różnymi regionami promotora i reguluje ekspresję genów i operonów24. Niektóre patogenne szczepy V. cholerae mają naturalnie występującą mutację przesunięcia ramki odczytu w genie hapR, która spowodowała utratę tej zależnej od gęstości regulacji ekspresji genów wirulencji24,25. Pomiar aktywności proteazy regulowanej przez HapR za pomocą pożywki z agarem mlecznym pozwala badaczowi określić, czy dany izolat zawiera funkcjonalny HapR23. Test hemolizy testuje zdolność szczepu do wydzielania enzymów hemolitycznych, które lizują czerwone krwinki; Stopień hemolizy można zobrazować na płytkach z agarem do krwi23. Ruchliwość jest często związana z wirulencją u V. cholerae i może być analizowana za pomocą płytek agarowych o ruchliwości23. Test Vogesa-Proskauera testuje zdolność szczepu do fermentacji glukozy jako jedynego źródła węgla i wytwarzania produktu ubocznego acetoina21. Wraz z pojawieniem się wariantów El Tor trudno jest przewidzieć wyniki któregokolwiek z testów fenotypowych bez szeroko zakrojonych badań przesiewowych genotypu i przed wydedukowaniem tła biotypu V. izolatów, zaleca się wykonanie tego zestawu testów23 i porównanie wyników ze szczepami referencyjnymi, jak w tabeli 2.

Tutaj rozwinęliśmy szereg protokołów, wspólnie wykorzystując wyżej wymienione testy genotypowe i fenotypowe dla bardziej wszechstronnego podejścia do charakterystyki V. biotypy . Ponadto opisaliśmy genotypowe i fenotypowe różnice znanego V. Warianty El Tor (MQ1795 i BAA-2163), w porównaniu z powszechnie stosowanymi szczepami referencyjnymi biotypu (WT classical O395, WT El Tor C6706 i WT El Tor N16961; Tabela 1). Pojawienie się wariantów El Tor stanowiło wyzwanie dla wiarygodności wcześniej stosowanych protokołów charakterystyki biotypu w pojedynczym teście; jednak ten system identyfikacji wielokrotnych testów pozwoli na bardziej wiarygodną charakterystykę klinicznej i środowiskowej V. izolaty .

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uwaga: Dla każdego testu należy wziąć pod uwagę czas, ponieważ poszczególne przygotowania pożywek wymagają różnych czasów. Na przykład stałe podłoże z płytkami agarowymi należy pozostawić do wystarczającego ostygnięcia i wyschnięcia (1-2 dni). Dodatkowe czynniki czasowe (tj. pojedynczy wzrost kolonii i hodowli przez noc) są określone w każdym protokole i znajdują się w tabeli 2.

1. Przygotowanie mediów

  1. 1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)
    1. Zważ 4,0 g NaCl, 0,1 g KCl, 0,72 g Na2HPO4 i 0,12 g KH2PO4. Połączyć składniki w kolbie Erlenmeyera o pojemności 1 l, dostosować objętość do 500 ml wodą dejonizowaną, dostosować pH do 7,2 za pomocą pH-metru i dodawać kroplami HCl do roztworu, a następnie sterylizować w autoklawie lub filtrze za pomocą filtra 0,22 μm. 1x PBS może być przechowywany w temperaturze pokojowej przez czas nieokreślony.
      UWAGA: HCl jest stężonym kwasem i należy postępować z nim zgodnie z przepisami instytucjonalnymi, lokalnymi, stanowymi i federalnymi. Aby uzyskać odpowiednie wskazówki dotyczące obchodzenia się, należy zapoznać się z kartą charakterystyki dostarczoną przez producenta.
  2. Rosół Luria-Bertani (LB)
    1. Zważ 5,0 g tryptonu, 2,5 g ekstraktu drożdżowego i 2,5 g NaCl. Połącz składniki w butelce o pojemności 1 l, dostosuj objętość do 500 ml z wodą dejonizowaną, autoklaw i przechowuj w temperaturze pokojowej do 6 miesięcy. W przypadku klasycznych warunków indukujących wirulencję biotypu, przed autoklawowaniem należy dostosować pH do 6,5 za pomocą HCl.
  3. AKI Medium zawierające 0,03% (w/v) NaHCO3
    1. Dla składnika 1 (pożywka AKI): zważyć 7,5 g peptonu, 2,0 g ekstraktu drożdżowego i 2,5 g NaCl. Połącz składniki w butelce o pojemności 1 l, dostosuj objętość do 450 ml z wodą dejonizowaną i autoklawem. Pożywka AKI może być przechowywana w temperaturze pokojowej do 6 miesięcy.
    2. Dla składnika 2 (NaHCO3): zważyć 1,5 g NaHCO3 i dostosować objętość do 50 ml wodą dejonizowaną w sterylnym pęcherzyku. Filtr sterylizuje NaHCO3 za pomocą filtra 0,22 μm. NaHCO3 należy przygotować bezpośrednio przed użyciem.
    3. Połączyć te dwa składniki w sposób aseptyczny, tworząc stosunek 1:10, filtrując składnik 2 do składnika 1 przed użyciem.
  4. Płytki agarowe Luria-Bertani (LB)
    1. Zważ 5,0 g tryptonu, 2,5 g ekstraktu drożdżowego, 2,5 g NaCl i 7,5 g agaru. Połączyć składniki w kolbie Erlenmeyera o pojemności 1 l, dostosować objętość do 500 ml wodą dejonizowaną, przelać w autoklawie i przygotować na sterylnych szalkach Petriego o standardowych wymiarach 100 mm x 15 mm. Platerowane nośniki można przechowywać zawinięte w folię przez okres do 6 miesięcy, pokrywką do góry w temperaturze 4 °C.
  5. Płytki agarowe LB uzupełnione polimyksyną B
    1. Dla składnika 1 (agar LB): zważyć 5,0 g tryptonu, 2,5 g ekstraktu drożdżowego, 2,5 g NaCl i 7,5 g agaru. Połączyć składniki w kolbie Erlenmeyera o pojemności 1 l, dostosować objętość do 500 ml wodą dejonizowaną i przelać do autoklawu.
    2. Dla składnika 2 (polimyksyna B): rozpuścić polimyksynę B w dejonizowanej wodzie w sterylnej probówce mikrowirówkowej o pojemności 2 ml do stężenia 50 000 IU/μl i wysterylizować filtrem za pomocą filtra 0,22 μm.
    3. Gdy składnik 1 ostygnie w dotyku, ale nie jest jeszcze zestalony, należy w asepcie dodać 500 μl składnika 2 do składnika 1, tworząc końcowe stężenie 50 j.m./μl i dokładnie wymieszać. Przygotować sterylne szalki Petriego o standardowych wymiarach 100 mm x 15 mm, wlewając do nich zmieszane podłoża agarowe. Platerowane nośniki można przechowywać zawinięte w folię przez okres do 3 miesięcy, pokrywką do góry nogami w temperaturze 4 °C.
  6. Minimalna zawartość cytrynianu Średnie płytki agarowe
    1. Dla składnika 1 (agar z błękitem bromotymolowym): odważyć 7,5 g agaru i 0,02 g błękitu bromotymolowego. Połączyć składniki w kolbie Erlenmeyera o pojemności 1 l, dostosować objętość do 450 ml wodą dejonizowaną i złożyć mieszaninę w autoklawie.
    2. Dla składnika 2 (10x VBMM): zważyć 1,0 gMgSO47H2O, 10,0 g kwasu cytrynowegoH2O, 50,0 g bezwodnegoK2HPO4 i 17,5 g NaNH4HPO44H2O. Połączyć składniki w 1 l kolbie Erlenmeyera, dostosować objętość do 500 ml wodą dejonizowaną i sterylizować w autoklawie lub filtrze za pomocą filtra 0,22 μm. 10x VBMM można przechowywać w temperaturze pokojowej do 6 Miesiące.
    3. Dodać 50 ml składnika 2 do składnika 1 i przygotować na sterylnych szalkach Petriego o standardowych wymiarach 100 mm x 15 mm, wlewając do nich zmieszane podłoże agarowe. Platerowane nośniki można przechowywać zawinięte w folię przez okres do 6 miesięcy, pokrywką do góry w temperaturze 4 °C.
  7. Płytki agarowe do mleka
    1. W przypadku składnika 1 (mleko): odważyć 8,0 g odtłuszczonego mleka w proszku instant w kolbie Erlenmeyera o pojemności 1 l, dostosować objętość do 200 ml wodą dejonizowaną i przeszukać w autoklawie.
    2. Dla składnika 2 (agar z naparem mózgowo-sercowym): zważyć 3,68 g naparu mózgowo-sercowego i 6,0 g agaru. Połączyć składniki w kolbie Erlenmeyera o pojemności 500 ml, dostosować objętość do 200 ml wodą dejonizowaną i przelać do autoklawu.
    3. Połączyć oba składniki, wlewając składnik 2 do składnika 1, po autoklawowaniu i dokładnie wymieszać. Przygotuj na sterylnych szalkach Petriego o wymiarach 150 mm x 15 mm. Płytki mleczne można przechowywać do tygodnia zawinięte w folię, pokrywką do dołu w temperaturze 4 °C. Przygotować na sterylnych szalkach Petriego o wymiarach 150 mm x 15 mm, wlewając do nich zmieszane podłoża agarowe.
  8. Płytki agarowe o ruchliwości
    1. Dla składnika 1 (agar LB): zważyć 5,0 g tryptonu, 2,5 g ekstraktu drożdżowego, 2,5 g NaCl i 2,0 g agaru. Połączyć składniki w kolbie Erlenmeyera o pojemności 1 l, dostosować objętość do 500 ml wodą dejonizowaną i przelać do autoklawu.
    2. Dla składnika 2 (1 % (w/v) chlorku trifenylotetrazolu; TTC): ważyć 0,25 g TTC. Dostosuj objętość do 25 ml wodą dejonizowaną w sterylnym pęcherzyku i przefiltruj, sterylizuj za pomocą filtra 0,22 μm. Przechowywać do 6 miesięcy w temperaturze pokojowej zawinięty w folię, aby zminimalizować ekspozycję na światło.
    3. Dodać 2,5 ml sterylnego TTC o stężeniu 1% (w/v) do pożywki autoklawowanej.
    4. Wlać pożywkę tak gęstą, jak to możliwe (≥50 ml/płytkę) do dużych sterylnych szalek Petriego o wymiarach 150 mm x 15 mm. Platerowane podłoża można przechowywać zawinięte w folię przez okres do jednego tygodnia, pokrywką do góry nogami w temperaturze 4 °C. Przygotować na sterylnych szalkach Petriego o wymiarach 150 mm x 15 mm, wlewając do nich zmieszane podłoża agarowe.
  9. Voges-Proskauer (wiceprezes)
    1. Dla składnika 1 (bulion czerwieni metylowej–Voges-Proskauer; MR–VP): zważyć 1,7 g pożywki MR-VP w kolbie Erlenmeyera o pojemności 500 ml, dostosować objętość do 100 ml wodą dejonizowaną i przeszukać w autoklawie. Sterylny bulion MR-VP można przechowywać w temperaturze pokojowej do 6 miesięcy.
    2. Dla składnika 2 (5% (w/v) alfa(α) naftolu): zważyć 1,0 g α-naftolu w sterylnym pęcherzyku i dostosować objętość do 20 ml z 95% etanolem. α-naftol można przechowywać w temperaturze pokojowej do 1 tygodnia, zawinięty w folię, aby zminimalizować ekspozycję na światło.
    3. Dla składnika 3 (40% (w/v) wodorotlenku potasu; KOH): zważyć 20,0 g KOH w sterylnym pęcherzyku, dostosować objętość do 50 ml sterylną wodą dejonizowaną. KOH można przechowywać do 6 miesięcy w temperaturze pokojowej w plastikowym naczyniu.

2. Utrzymanie i rozwój V. Szczepów

  1. Przygotowanie i stosowanie mrożonych kultur bakterii
    1. Osad 1,8 ml płynnej kultury przez noc przez 2 minuty przez odwirowanie (≥8 600 x g) w sterylnej probówce do mikrowirówki o pojemności 2 ml, usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 900 μl świeżego bulionu LB przez pipetowanie.
    2. Dodać 900 μl sterylnego 60% (v/v) glicerolu do kultury i wymieszać przez wirowanie.
    3. Przenieść mieszaninę do sterylnej probówki kriogenicznej o pojemności 2 ml i przechowywać przez czas nieokreślony w temperaturze -80 °C.
    4. Aby użyć, usuń niewielką ilość zamrożonego bulionu za pomocą sterylnej pętli zaszczepiającej i smugi dla pojedynczych kolonii na płytkach agarowych LB. Po użyciu zamrożony bulion należy natychmiast przywrócić do temperatury -80 °C, aby zapobiec całkowitemu rozmrożeniu kultur. Inkubować płytki pokrywką do dołu przez 12-16 godzin w temperaturze 37 °C.
  2. Wzrost nocnych kultur w płynnym podłożu
    1. Smugi dla pojedynczych kolonii (zgodnie z sekcją 2.1.4) z zamrożonego stada na płytki agarowe LB. Inkubować płytki pokrywką do dołu przez 12-16 godzin w temperaturze 37 °C.
    2. Zaszczepić 4 ml płynnego bulionu LB w sterylnej probówce hodowlanej o pojemności 10 ml z pojedynczą kolonią, dotykając powierzchni pojedynczej kolonii sterylnym aplikatorem w patyczku i przenosząc kolonię do płynnego bulionu.
    3. Inkubować z napowietrzaniem w inkubatorze z wytrząsarką przy 225 obr./min przez 12-16 godzin w temperaturze 37 °C.
  3. Krzywa wzrostu
    1. Przygotować kulturę przez noc w płynnym bulionie LB, jak wcześniej stwierdzono w protokole 2.2.
    2. Przeprowadzić rozcieńczenie nocnej kultury w stosunku 1:100, przenosząc 250 μl nocnej kultury do 25 ml świeżego bulionu LB w sterylnej kolbie Erlenmeyera o pojemności 250 ml.
    3. Mierzyć gęstość optyczną ciekłych kultur przy 600 nm (OD600) co godzinę, począwszy od momentu inokulacji (T0).
    4. Inkubować rozcieńczoną przez noc kulturę w stosunku 1:100 z napowietrzaniem w inkubatorze z wytrząsarką przy 225 obr./min przez maksymalnie 30 godzin w temperaturze 37 °C lub do momentu, gdy kultura osiągnie maksymalną gęstość.
    5. Sporządź wykres OD600 w funkcji czasu i użyj regresji liniowej, aby określić przybliżony czas podwojenia dla każdego szczepu.
  4. Warunki indukujące zjadliwość biotypu El Tor
    1. Smuga dla pojedynczych kolonii z zamrożonego stada na płytkach agarowych LB. Inkubować płytki pokrywką do dołu przez 12–16 godzin w temperaturze 37 °C.
    2. Zaszczepić 10 ml pożywki AKI zawierającej 0,03% (w/v) NaHCO3 z pojedynczą kolonią.
    3. Inkubować kulturę bez napowietrzania w temperaturze 37 °C przez 3,5 godziny.
    4. Usunąć 7 ml kultury i inkubować pozostałe 3 ml kultury z napowietrzaniem w inkubatorze z wytrząsarką z prędkością 225 obr./min przez dodatkowe 4 godziny.
  5. Klasyczne warunki indukujące wirulencję biotypu
    1. Smuga dla pojedynczych kolonii z zamrożonego stada na płytkach agarowych LB. Inkubować płytki pokrywką do dołu przez 12-16 godzin w temperaturze 37 °C.
    2. Zaszczepić 4 ml płynnego bulionu LB (pH 6,5) pojedynczą kolonią.
    3. Inkubować z napowietrzaniem w inkubatorze z wytrząsarką przy prędkości 225 obr./min przez 12–16 godzin w temperaturze 30 °C.
  6. Granulat komórki myjącej w 1x PBS
    1. Osad 1,8 ml kultury przez noc przez 2 minuty przez odwirowanie (≥8 600 x g) w sterylnej probówce do mikrowirówki o pojemności 2 ml i usuń supernatant za pomocą pipety. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 1,8 ml 1x PBS przez pipetowanie.
    2. Powtórzyć procedurę mycia trzy razy, a następnie ponownie zawiesić w 1,8 ml 1x PBS.

3. Charakterystyka V. Biotypy

  1. Genetyczne badania przesiewowe oparte na PCR przy użyciu ctxB i tcpA
    1. Zaprojektuj zestaw starterów, które wyżarzają około 50-70 pz przed i za miejscami rozpoczęcia i zakończenia translacji odpowiednio ctxB i tcpA.
    2. Przygotować kulturę przez noc w płynnym bulionie LB, jak wcześniej stwierdzono w protokole 2.2.
    3. Wyizoluj chromosomalne DNA za pomocą dostępnego w handlu zestawu przeznaczonego dla bakterii Gram-ujemnych. Oczyszczone chromosomalne DNA można przechowywać w nieskończoność w temperaturze -20 °C. Izolacja chromosomalnego DNA przy użyciu dostępnych na rynku zestawów trwa zazwyczaj około 4 godzin.
    4. Użyj spektrofotometru mikroobjętościowego, aby upewnić się, że próbka chromosomalnego DNA jest wysokiej jakości (A260/280 >1.8).
    5. Dla każdego izolatu chromosomalnego DNA przygotuj reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) na lodzie w sterylnej probówce (probówkach) PCR o pojemności 200 μl i amplifikuj regiony ctxB i tcpA przy użyciu standardowych składników PCR: polimerazy Taq i buforu (lub równoważnych), roztworu dNTP i starterów do przodu/do tyłu. Użyj standardowych parametrów PCR (~3 h). Na przykład użyj następującego protokołu:
      1. Wstępna denaturacja w temperaturze 95 °C przez 120 s.
      2. Denaturacja w temperaturze 95 °C przez 60 s.
      3. Podkłady wyżarzające w temperaturze 60 °C przez 45 s.
      4. Rozciągać w temperaturze 72 °C przez 90 s.
      5. Powtórz kroki od 3.1.5.2 do 3.1.5.4 przez 34 cykle.
      6. Przedłużenie końcowe 72 °C przez 600 s.
      7. Nieskończone utrzymywanie w temperaturze 4 °C.
    6. Zabarwić 5 μl odpowiednich produktów PCR za pomocą standardowego barwnika ładującego żel 6x DNA i załadować około 10 μl drabinki 1 kb i 10 μl produktu PCR na 1% żel agarozowy w buforze 1x Tris-Boran-EDTA (TBE).
    7. Uruchom elektroforezę żelu pod napięciem 130 V, aż czoło barwnika dotrze do końca, ale nie do końca żelu (około 90 min). Zalecane jest stałe monitorowanie, ponieważ napięcie i czas pracy mogą się różnić w zależności od sprzętu.
    8. Po zweryfikowaniu udanej amplifikacji PCR w oczekiwanej wielkości, należy oczyścić pozostałe 45 μl produktu (produktów) PCR za pomocą dostępnego na rynku zestawu do czyszczenia i koncentratora DNA.
    9. Sekwencjonuj oczyszczone produkty PCR przy użyciu tych samych starterów, które są używane do amplifikacji PCR, i przygotuj zgodnie z lokalnymi wytycznymi zakładu sekwencjonowania.
    10. Porównaj format FASTA sekwencji genów z każdego izolatu z sekwencją opublikowaną na stronie internetowej NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/), wyszukując następujące numery dostępu w polu zapytania wyszukiwania.
    11. ctxB: (klasyczny) region między VC0395_A1059 a VC0395_A1060 (El Tor) VC_1456
    12. tcpA: (klasyczny) VC0395_A0353 (El Tor) VC_0828
  2. Testy fenotypowe do klasyfikacji biotypu poprzez plamienie
    1. Przygotować kulturę przez noc w płynnym bulionie LB, jak wcześniej stwierdzono w protokole 2.2.
    2. Umyć osad(y) komórek w sposób określony w protokole 2.6.
    3. Za pomocą pipety narysować 1 μl umytej kultury na odpowiednim podłożu. Specyfikacje dotyczące selekcji pożywek i inkubacji znajdują się w tabeli 2.
  3. Test ruchliwości
    1. Przygotować kulturę (hodowle) przez noc w płynnym bulionie LB, jak wcześniej stwierdzono w protokole 2.2.
    2. Umyć osad(y) komórek w sposób określony w protokole 2.6.
    3. Zaszczepić płytki agarowe o ruchliwości, wkładając zaszczepiaczkę do przemytej płynnej kultury i "wbijać" pionowo w pożywkę. Pomiędzy każdym zaszczepieniem wysterylizuj dźgnięcie drutem za pomocą palnika Bunsena, a podczas dźgania agaru upewnij się, że dźgnięcie zaszczepiające nie wygina się, ponieważ może to zmienić wyniki.
    4. Inkubować płytki pokrywą do góry przez 14–24 godzin w temperaturze 37 °C. Po 14 godzinach uważnie monitoruj płytki ruchliwości, aby zapobiec przerostowi kultur.
  4. Test Vogesa-Proskauera (VP)
    1. Przygotować kulturę (hodowle) przez noc w płynnym bulionie LB, jak wcześniej stwierdzono w protokole 2.2.
    2. Zaszczepić 4 ml czerwonego metylowego bulionu Voges-Proskauer lub MR-VP, pipetując 10 μl wcześniej przygotowanej kultury przez noc do 4 ml bulionu MR-VP w sterylnej probówce hodowlanej i inkubować z napowietrzaniem w inkubatorze z wytrząsarką przy 225 obr./min przez 12-16 godzin w temperaturze 37 °C.
    3. Dodać odpowiednio 150 μl 5% (w/v) α-naftolu i 50 μl 40% (w/v) KOH do 1 ml podwielokrotności nocnej hodowli MR-VP w sterylnych probówkach hodowlanych.
    4. Krótko zwirować i odstawić w temperaturze pokojowej do 4 godzin, aż nastąpi zmiana koloru.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dla prawidłowego utrzymania i użytkowania jakiegokolwiek szczepu bakteryjnego, zaleca się znajomość czasu podwojenia interesującego szczepu (szczepów). W tym przypadku różne tempo wzrostu powszechnie stosowanego V. Szczepy wykazano za pomocą krzywej wzrostu, a przybliżone czasy podwojenia obliczono za pomocą regresji liniowej. WT El Tor N16961 i wariant El Tor MQ1795 wykazały krótsze czasy podwajania (odpowiednio ~1 h i ~1 h) niż klasyczny WT O395 (~2 h) (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Spośród ponad 200 zidentyfikowanych V. serogrupy, tylko O1 i O139 mają potencjał epidemiczny. Serogrupę O1 można podzielić na dwa biotypy: klasyczny i El Tor. Pojawiły się jednak szczepy hybrydowe, określane jako warianty El Tor13,17, które posiadają tło biotypu El Tor i mają klasyczne cechy 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania wspierane przez New Hampshire-INBRE poprzez Nagrodę Rozwoju Instytucjonalnego (IDeA), P20GM103506, od Narodowego Instytutu Ogólnych Nauk Medycznych NIH.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1 kb Drabina DNANew England BiolabsN3232Shttps://www.neb.com/products/n3232-1-kb-dna-ladder
60% gliceroluCalbiochem356352http://www.emdmillipore.com/US/en/product/Glycerol%2C-Molecular-Biology-Grade---CAS-56-81-5---Calbiochem,EMD_BIO-356352
AgarBecto, Dickinson and Co.214030
http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=214030&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D214030%26typeOfSearch%3DproductSearch Agar z naparem mózgowo-sercowymBecto, Dickinson and Co.237500http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=237500&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D237500%26typeOfSearch%3DproductSearch
AgarozaPeqlab732-2789https://de.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=732-2789&_DARGS=/store/cms/de.vwr.com/de_DE/header_2016111711383215.jsp_AF&_dynSessConf=1766917479792147141&targetURL=/store/catalog/product.jsp%3Fcatalog_number%3D732-2789&lastLanguage=en&/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale=&_D%3AcurrentLanguage=+¤tLanguage=en&_D%3AlastLanguage=+&_D%3A/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale=+
Bezwodne K2HPO4Fisher ScientificP288-500https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-phosphate-dibasic-anhydrous-crystalline-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/p288500?searchHijack=true&searchTerm=P288500&searchType=RAPID
Płytki agarowe do krwiRemelR01200Przechowywać w temperaturze 4 & deg; C;  Kwas
borowyhttp://www.remel.com/Catalog/Item.aspx?name=Blood+Agar Fisher ScientificA73-500https://www.fishersci.com/shop/products/boric-acid-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-6/a73500?searchHijack=true&searchTerm=A73500&searchType=RAPID
Bromothymol BlueFisher ScientificB388-10https://www.fishersci.com/shop/products/bromothymol-blue-certified-acs-fisher-chemical/b38810?searchHijack=true&searchTerm=B38810&searchType=RAPID
Kwas cyrtrynowy · H2OFisher ScientificS72836-3https://www.fishersci.com/shop/products/citric-acid-monohydrate-4/s728363#?keyword=s728363
Zestaw roztworów deoksynukleotydu (dNTP) NewEngland BiolabsN0446SPrzechowywać w temperaturze -20 stopni; C;  https://www.neb.com/products/n0446-deoxynucleotide-solutionset
Disodowy EDTAFisher ScientificS311-500https://www.fishersci.com/shop/products/ethylenediaminetetraacetic-acid-disodium-salt-dihydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-7/s311500?searchHijack=true&searchTerm=S311500&searchType=RAPID
DNA Czyste i Koncentrator i handel; -25 ZestawZymo ResearchD4007http://www.zymoresearch.com/dna/dna-clean-up/zymoclean-gel-dna-recovery-kit
GelGreen Barwnik kwasów nukleinowychBiotium41005https://biotium.com/product/gelgreentm-nucleic-acid-gel-stain-10,000x-in-water/
Spektrofotometr Genesys 10SUV-VISThermo Scientific840-208100https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/840-208100?ICID=search-840-208100
Gentra Puregene Drożdże/Bact. ZestawQiagen158567https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/dna/dna-preparation/gentra-puregene-yeastbact-kit/#orderinginformation
HCl FisherScientificA144-212;   https://www.fishersci.com/shop/products/hydrochloric-acid-certified-acs-plus-fisher-chemical-10/a144212?searchHijack=true&searchTerm=A144212&searchType=RAPID
KClFisher ScientificP217-500https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-chloride-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-4/p217500?searchHijack=true&searchTerm=P217500&searchType=RAPID
KH< sub>2PO4Fisher ScientificP285-500https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-phosphate-monobasic-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-5/p285500?searchHijack=true&searchTerm=P285500&searchType=RAPID
KOHFisher ScientificP250-500https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-hydroxide-pellets-certified-acs-fisher-chemical-5/p250500?searchHijack=true&searchTerm=P250500&searchType=RAPID
Le LoopDecon Labs Inc.MP190-25http://deconlabs.com/products/leloop/
Le StabDecon Labs Inc.MP186-5http://deconlabs.com/products/lestab/
MgSO4· 7H2OFisher ScientificM63-500
https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?searchHijack=true&searchTerm=M63500&searchType=RAPID Mini-Sub Cell GT Poziomy system elektroforezyBio Rad Labs1704406http://www.bio-rad.com/en-us/product/mini-sub-cell-gt-cell?WT.srch=1&WT.mc_id=aw-cbb-NA-sub_cell_systems_brand_gold&WT.knsh_id=7eb1981f-a011-42a3-aece-1236ff453373
MR-VP BulionDifco216300
http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=216300&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3Dmr-vp%2Bmedium%26typeOfSearch%3DproductSearch Na2HPO4Fisher ScientificS374-500https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-phosphate-dibasic-anhydrous-granular-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/s374500?searchHijack=true&searchTerm=S374500&searchType=RAPID
NaClFisher ScientificS271-10https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-chloride-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-6/s27110?searchHijack=true&searchTerm=S27110&searchType=RAPID
NaHCO3Fisher ScientificS233-500https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-bicarbonate-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/s233500?searchHijack=true&searchTerm=S233500&searchType=RAPID
NaNH4HPO4· 4H2OFisher ScientificS218-500https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-ammonium-phosphate-tetrahydrate-crystalline-certified-fisher-chemical/s218500?searchHijack=true&searchTerm=S218500&searchType=RAPID
Spektroftometr NanoDrop LiteThermo ScientificND-LITE-PRhttps://www.thermofisher.com/order/catalog/product/ND-LITE-PR?ICID=search-ND-LITE-PR
Odtłuszczone mleko w proszkuNestle GoździkN/AN/A
PeptoneBecto, Dickinson and Co.211677http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=211677&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D211677%26typeOfSearch%3DproductSearch
szalki Petriego (100 mm x 15 mm)Fisher ScientificFB0875712https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875712#?keyword=FB0875712
szalki Petriego (150 mm x 15 mm)Fisher ScientificFB0875714https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875714?searchHijack=true&searchTerm=FB0875714&searchType=RAPID
Sól siarczanu polimyksyny BSigma-AldrichP1004-10MUPrzechowywać w temperaturze 2-4 stopni; C;
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p1004?lang=en®ion=USTaq Polimeraza DNANew England BiolabsM0273SPrzechowywać w temperaturze -20 & C; Bufor
reakcyjny https://www.neb.com/products/m0273-taq-dna-polymerase-with-standard-taq-bufferTaqEngland BiolabsM0273SPrzechowywać w temperaturze -20 stopni; C;  https://www.neb.com/products/m0273-taq-dna-polymerase-with-standard-taq-buffer
Termocykler Bio-Rad C1000 Touch™  Bio Rad Labs1840148http://www.bio-rad.com/evportal/evolutionPortal.portal?_nfpb=true&_pageLabel=search_page&sfMode=search&sfStartNumber=1&clearQR=true&js=1&searchString=1840148&database=productskus+productcategories+productdetails+abdProductDetails+msds+literatures+inserts+faqs+downloads+webpages+assays+genes+pathways+plates+promotions&tabName=DIVISIONNAME
Chlorek trifenylotetrazoluAlfa AesarA10870https://www.alfa.com/en/catalog/A10870/
Tris BaseFisher ScientificBP152-1https://www.fishersci.com/shop/products/tris-base-white-crystals-crystalline-powder-molecular-biology-fisher-bioreagents-7/bp1521?searchHijack=true&searchTerm=BP1521&searchType=RAPID
TryptonBecto, Dickinson i Współ.211705
http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=211705&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D211705%26typeOfSearch%3DproductSearch Ekstrakt drożdżowyBecto, Dickinson and Co.212750http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=212750&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D212750%26typeOfSearch%3DproductSearch
α-naptholMP Biomedicals204189http://www.mpbio.com/product.php?pid=05204189
New

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shimada, T., et al. Extended serotyping scheme for Vibrio cholerae. Curr. Microbiol. 28 (3), 175-178 (1994).
  2. Yamai, S., Tadayuki, O., Toshio, S., Yasuji, K. Distribution of serogroups of Vibrio cholerae non-O1 non-O139 with specific reference to their ability to produce cholera toxin, and addition of novel serogroups. Jpn. J. Infect. Dis. 71 (10), 1037-1045 (1997).
  3. Karaolis, D. K., Lan, R., Reeves, P. R. The sixth and seventh cholera pandemics are due to independent clones separately derived from environmental, nontoxigenic, non-O1 Vibrio cholerae. J. Bacteriol. 177 (11), 3191-3198 (1995).
  4. Albert, M. J., et al. Large epidemic of cholera-like disease in Bangladesh caused by Vibrio cholerae O139 synonym Bengal. Lancet. 342 (8868), 387(1993).
  5. Barua, D. History of Cholera. Cholera. Barua, D., Greenough III, W. B. , Plenum Publishing Corporation. 1-36 (1992).
  6. Morales, R., Delgado, G., Cravioto, A. Population Genetics of Vibrio cholerae. Vibrio cholerae-Genomics and Molecular Biology. Faruque, S. M., Nair, G. B. , Caister Academic Press. 29-47 (2008).
  7. Samadi, A. R., Chowdhury, M. K., Huq, M. K., Khan, M. U. Seasonality of classical and El Tor cholera in Dhaka, Bangladesh: 17-year trends. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 77 (6), 853-856 (1983).
  8. Son, M. S., Megli, C. J., Kovacikova, G., Qadri, F., Taylor, R. K. Characterization of Vibrio cholerae O1 El Tor biotype variant clinical isolates from Bangladesh and Haiti, including a molecular genetic analysis of virulence genes. J. Clin. Microbiol. 49 (11), 3739-3749 (2011).
  9. Ghosh-Banerjee, J., et al. Cholera toxin production by the El Tor variant of Vibrio cholerae O1 compared to prototype El Tor and classical biotypes. J. Clin. Microbiol. 48 (11), 4283-4286 (2010).
  10. Ansaruzzaman, M., et al. The Mozambique cholera vaccine demonstration project coordination group. Cholera in Mozambique, variant of Vibrio cholerae. Emerg. Infect. Dis. 10 (11), 2057-2059 (2004).
  11. Ansaruzzaman, M., et al. Genetic diversity of El Tor strains of Vibrio cholerae O1 with hybrid traits isolated from Bangladesh and Mozambique. Int. J. Med. Microbiol. 297 (6), 443-449 (2007).
  12. Lan, R., Reeves, P. R. Pandemic spread of cholera: genetic diversity and relationships within the seventh pandemic clone of Vibrio cholerae determined by amplified fragment length polymorphism. J. Clin. Microbiol. 40 (1), 172-181 (2002).
  13. Nair, G. B., Faruque, S. M., Bhuiyan, N. A., Kamruzzaman, M., Siddique, A. K., Sack, D. A. New variants of Vibrio cholerae O1 biotype El Tor with attributes of the classical biotype from hospitalized patients with acute diarrhea in Bangladesh. J. Clin. Microbiol. 40 (9), 3296-3299 (2002).
  14. Nair, G. B., et al. Isolation of Vibrio cholerae O1 strains similar to pre-seventh pandemic El Tor strains during an outbreak of gastrointestinal disease in an island resort in Fiji. J. Med. Microbiol. 55 (11), 1559-1562 (2006).
  15. Nair, G. B., Mukhopadhyay, A. K., Safa, A., Takeda, Y. Emerging hybrid variants of Vibrio cholerae O1. Vibrio cholerae—Genomics and Molecular Biology. Faruque, S. M., Nair, G. B. , Horizon Scientific Press. 179-190 (2008).
  16. Safa, A., et al. Genetic characteristics of Matlab variants of Vibrio cholerae O1 that are hybrids between classical and El Tor biotypes. J. Med. Microbiol. 55 (11), 1563-1569 (2006).
  17. Nusrin, S., et al. Diverse CTX phages among toxigenic Vibrio cholerae O1 and O139 strains isolated between 1994 and 2002 in an area where cholera is endemic. J. Clin. Microbiol. 42 (12), 5854-5856 (2004).
  18. Carignan, B. M., Brumfield, K. D., Son, M. S. Single nucleotide polymorphisms in regulator-encoding genes have an additive effect on virulence gene expression in a Vibrio cholerae clinical isolate. mSphere. 1 (5), e00253(2016).
  19. Iwanaga, M., Yamamoto, K., Higa, N., Ichinose, Y., Nakasone, N., Tanabe, M. Culture conditions for stimulating cholera toxin production by Vibrio cholerae O1 El Tor. Microbiol. Immunol. 30 (11), 1075-1083 (1986).
  20. DiRita, V. J., Claude, P., Georg, J., Mekalanos, J. J. Regulatory cascade controls virulence in Vibrio cholerae. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88 (12), 5403-5407 (1991).
  21. Kovacikova, G., Lin, W., Skorupski, K. Duel regulation of genes involved in acetoin biosynthesis and motility/biofilm formation by the virulence activator AphA and the acetate-responsive Lys-R type regulator AlsR in Vibrio cholerae. Mol. Microbiol. 57 (2), 420-433 (2005).
  22. Vogel, H. J., Bonner, D. M. Acetylornithinase of Escherechia coli: partial purification and some properties. J. Biol. Chem. 218 (1), 97-106 (1956).
  23. Son, M. S., Taylor, R. K. Genetic screens and biochemical assays to characterize Vibrio cholerae O1 biotypes: classical and El Tor. Curr. Protoc. Microbiol. , 6A.2.1-6A.2.17 (2011).
  24. Kovacikova, G., Skorupski, K. Regulation of virulence gene expression in Vibrio cholerae by quorum sensing: HapR functions at the aphA promoter. Mol. Microbiol. 46 (4), 1135-1147 (2002).
  25. Wang, Y., et al. The prevalence of functional quorum-sensing systems in recently emerged Vibrio cholerae toxigenic strains. Environ. Microbiol. Rep. 3 (2), 218-222 (2011).
  26. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques. J. Vis. Exp. (63), e3064(2012).
  27. Martinez, R. M., Megli, C. J., Taylor, R. K. Growth and laboratory maintenance of Vibrio cholerae. Curr. Protoc. , 6A.1.1-6A.1.6 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Charakterystyka biotypugenetyczne badania przesiewowe PCRtesty fenotypoweoporno na polymyksyn Bpr ba Vogesa Proskaurapod o a agarowe do badania ruchliwo ciprzechowywanie w stokach glicerynowychp ytki z agarem LBprotok wirowania

Powiązane artykuły