Opisano protokół określania gęstości fazy szklistej mikro- do pikolitrowych kropli mieszanin wodnych w temperaturach kriogenicznych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Pomiar gęstości szkieł wodnych w temperaturach kriogenicznych
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Demonstrujemy metodę określania gęstości temperatury kriogenicznej w fazie szklistej mieszanin wodnych i innych próbek, które wymagają szybkiego schłodzenia, w celu przygotowania pożądanej fazy temperatury kriogenicznej. Krople o wielkości od mikrolitrów do pikolitrów są schładzane przez projekcję do ciekłej mieszaniny azotu i argonu (N2-Ar). Faza temperatury kriogenicznej kropli jest oceniana za pomocą testu wizualnego, który koreluje z pomiarami dyfrakcji rentgenowskiej. Gęstość ciekłej mieszaniny N2-Ar reguluje się przez dodanie N2 lub Ar do momentu, gdy kropla stanie się neutralnie wyporna. Gęstość tej mieszaniny, a tym samym kropli, określa się za pomocą masy próbnej i zasady Archimedesa. Przy odpowiedniej staranności w przygotowaniu kropli, zarządzaniu gazem nad ciekłą mieszaniną kriogeniczną w celu zminimalizowania oblodzenia oraz regularnemu mieszaniu mieszaniny kriogenicznej w celu zapobieżenia rozwarstwieniu gęstości i separacji faz, można łatwo określić gęstości z dokładnością do <0,5% kropli tak małych jak 50 pL. Pomiary wodnych mieszanin krioprotektantów zapewniają wgląd w działanie krioprotektantów i dostarczają danych ilościowych ułatwiających dopasowanie skurczu termicznego w kriokonserwacji biologicznej.
Wprowadzenie
Właściwości fizyczne wody i mieszanin wodnych w ich różnych fazach są fundamentalne i są ważne dla zrozumienia systemów biologicznych in vivo i in vitro. We współczesnej kriobiologii i kriokonserwacji biologicznej szczególnie interesujące są fazy szkliste lub amorficzne wodnych mieszanin krioprotektantów1,2. Zarodkowanie i wzrost kryształków lodu może zakłócać działanie komórek i tkanek oraz sprzyjać denaturacji i agregacji białek, dlatego coraz bardziej popularne stają się protokoły kriokonserwacji, które witryfikują rozpuszczalnik. W krystalografii biomolekularnej krystalizacja rozpuszczaln....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Przed użyciem należy zapoznać się ze wszystkimi odpowiednimi kartami charakterystyki materiałów (MSDS). Podczas pracy z gazami sprężonymi należy stosować wszelkie właściwe zasady bezpieczeństwa, w tym używać odpowiednio skalibrowanych regulatorów i zaworów dogazowych oraz zatwierdzonych przewodów gazowych. Kontakt z kriogenami w stanie ciekłym może spowodować poważne odmrożenia i martwicę. Należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej (przyłbicę, rękawice, fartuch laboratoryjny, długie spodnie, pełne obuwie), które muszą być nieprzepuszczalne dla ciekłego azotu. Podczas korzystania z kriogenów w stanie ciekłym należy pozostać w pozycji stojącej i zapewni....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Pomiary gęstości w temperaturze T = 77 K dla zeszkliwionych kropel wodnego glicerolu i glikolu etylenowego w funkcji stężenia krioprotektanta przedstawiono odpowiednio na Rysunku 1A oraz Rysunku 1B, a odpowiadającą im zmianę objętości właściwej między T = 298 K a 77 K, obliczoną przy użyciu wcześniej wyznaczone gęstości dla T = 298 K, przedstawiono na
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Obecna aparatura i metody, opracowane głównie przez studentów studiów licencjackich z ograniczonym dostępem do narzędzi i maszyn do budowy instrumentów, dostarczają mimo to bardzo dokładnych pomiarów gęstości poszczególnych kropel cieczy o objętości tak małej jak 50 pL. W zakresie stężeń bliskich i powyżej 50% w/w, gdzie niewielkie szybkości chłodzenia są wystarczające do uzyskania próbek witryfikowanych, wartości gęstości są zgodne z wynikami uzyskanymi w poprzednich pomiarach na próbkach objętościowych. Ekstrapolacje o.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez NSF w ramach nagrody MCB-1330685. DWM potwierdza częściowe wsparcie ze strony Cornell University's Molecular Biophysics Training Grant (NIH T32GM0082567).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| probówka wirówkowa | Falcon | 6029236 | stożkowa probówka wirówkowa 15 ml |
| glicerol, >99,5% | Sigma | G9012-100 ml | |
| glikol etylenowy, >99,8% | Sigma | 324558-100 mL | |
| Mikrowaga analityczna | Mettler | AE240 | , rozdzielczość 0,01 mg, posiada haczyk na spodzie do ważenia poniżej wagi |
| vortexer | Scientific Industries | SI-0236 | Vortex-Genie 2 |
| Obramowanie obudowy aparatury | Unistrut | 1-5/8 "metalowa rama | 48" szerokości x 24" głębokości x 40" wysokości |
| Obudowa aparatu, bariera powietrzna | dowolna przezroczysta folia z tworzywa sztucznego, | ||
| z gumy neoprenowej | średnicy 4 ", kolba Dewara o grubości 1/8" | ||
| Scilogix Dilvac | SS333 | 4,5-litrowa kolba Dewara ze stalową obudową i miedzianą pokrywą | |
| zaciskowąTa wyprodukowana część składa się z miedzianej rurki o średnicy 1,43 cala i grubości ścianki 0,017 cala z solidną cylindryczną miedzianą podstawą przylutowaną w celu uszczelnienia jednego końca. Miedziana podstawa ma wysokość 0,87 cala, a całkowita wysokość komory wynosi 7 cali. | |||
| gaz azotowy | Airgas | NI HP300 | 99,998% czysty gaz N2 |
| argon gazowy | Airgas | AR HP300 | 99,998% czysty rotametr gazowy Ar |
| Omega | FL3692ST | 2,52 l / min maksymalne natężenie przepływu | |
| piankowa pokrywa | Ta część jest wykonana z usieciowanej pianki polietylenowej o wartości 4 funtów / stopę 3< / sup> (dostarczonej przez Technifab, 1355 Chester Industrial Parkway, Avon, OH) i ma średnicę zewnętrzną 2,42 cala i średnicę wewnętrzną 1,52 cala oraz grubość 0,79 cala. | ||
| testowa PTFE | Ta wyprodukowana część to cylinder o średnicy 0,246 cala i wysokości 0,580 cala z otworem o średnicy 0,060 cala biegnącym prostopadle i przecinającym oś cylindra ~ 0,10 cala od jednego końca. | ||
| platforma mikrobalansowa | Unistrut | 1-5/8" metalowa rama o | szerokości 11" x długości 24" x wysokości 24" prostokątna rama z górną blachą aluminiową zawierającą otwór na monofilament i wiszącą masę testową |
| Żyłka monofilamentowa 2 mil (50 um) | Berkley | NF1502-CM | Żyłka wędkarska Nanofil |
| Wężownica wstępnego chłodzenia argonu | VWR | 60985-512 | 1/8" ID x 1/4" OD Rurka PVC |
| Perforowany mieszalnik | o średnicy 1,4 cala, Dysk miedziany o grubości 35 mikronów, wycięty z blachy miedzianej o grubości 1 uncji / ft2< / sup> i perforowany z otworami za pomocą szydła lub innego ostrego spiczastego narzędzia. Włóż sztywny pręt termoizolacyjny (z tworzywa sztucznego lub drewna) o średnicy 1-2 mm do środka i przymocuj za pomocą żywicy epoksydowej w razie potrzeby. | ||
| strzykawka | BD | 309628 | 1 ml końcówka Luer-Lok strzykawka |
| generator podciśnienia | Gast | VG-015-00-00 | sprężone powietrze Venturi jednostopniowy generator podciśnienia |
| hydrofobowa powłoka | RainX | 620036 | plastikowy wodoodporny |
| stereoskopowy o długiej ogniskowej | Bausch and Lomb Stereozoom 6 | 0,67-4 x zoom z okularami 20X, odległość robocza 10 cm& nbsp; | |
| Oświetlacz pierścieniowy LED | Amscope | LED144S | |
| Oświetlacz punktowy LED | Newhouse Lighting | NHCLP-LED | 3W Lampa zaciskowa LED na gęsiej szyi |
| 1,8 ml fiolka kriogeniczna | Nunc | V7634-500EA | Wystarczy dowolny kriowial 1,8 lub 2 ml |
Bibliografia
- Fahy, G. M., Wowk, B. Principles of Cryopreservation by Vitrification. Cryopreservation and Freeze-Drying Protocols. , 21-82 (2015).
- Nagy, Z. P., Nel-Themaat, L., Chang, C. -C., Shapiro, D. B., Berna, D. P. Cryopreservation of eggs. Human Fertility: Methods and Protocols. , 439-454 (2014).
- Kriminski, S., Caylor, C. L., Nonato, M. C., Finkelstein, K. D., Thorne, R. E.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
