Artykuł metodologiczny

Zintegrowany system do zdalnego wyzwalania wewnątrzkomórkowej transdukcji sygnału poprzez fotoaktywację kinazy za pośrednictwem nanocząstek w górę

DOI:

10.3791/55769

⸱

30 sierpnia 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Chemistry, Academia Sinica, 2Department of Chemistry, National Taiwan University, 3Department of Materials and Mineral Resources Engineering, National Taipei University of Technology

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym protokole, kinaza białkowa A (PKA), bioefektor transdukcji sygnału komórkowego, została unieruchomiona na powierzchni nanocząsteczki, mikrowstrzyknięta do cytozolu i aktywowana przez przekonwertowane światło UV z bliskiej podczerwieni (NIR), indukując rozpad włókien naprężeniowych w cytozolu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fotoaktywacja za pośrednictwem nanocząsteczek w górę (UCNP) to nowe podejście do zdalnego sterowania bioefektorami o znacznie mniejszej fototoksyczności i głębszej penetracji tkanek. Jednak istniejące na rynku oprzyrządowanie nie jest łatwo kompatybilne z aplikacją do konwersji w górę. W związku z tym modyfikacja dostępnego na rynku instrumentu jest niezbędna dla tych badań. W tym artykule najpierw zilustrowaliśmy modyfikacje konwencjonalnego fluorymetru i mikroskopu fluorescencyjnego, aby były kompatybilne z eksperymentami z konwersją fotonów w górę. Następnie opisujemy syntezę kinazy białkowej w klatce wyzwalanej w bliskiej podczerwieni (NIR) podjednostki katalitycznej (PKA) unieruchomionej na kompleksie UCNP. Podano również parametry dla procedur mikroiniekcji i fotoaktywacji NIR. Po mikrowstrzyknięciu PKA-UCNP w klatce do komórek fibroblastów REF52, napromieniowanie NIR, które jest znacznie lepsze niż konwencjonalne promieniowanie UV, skutecznie uruchamia szlak transdukcji sygnału PKA w żywych komórkach. Ponadto eksperymenty z kontrolą pozytywną i ujemną potwierdzają, że szlak indukowany przez PKA prowadzący do rozpadu włókien stresowych jest specyficznie wyzwalany przez promieniowanie NIR. W związku z tym zastosowanie UCNP modyfikowanego białkiem zapewnia innowacyjne podejście do zdalnego sterowania eksperymentami komórkowymi modulowanymi światłem, w których należy unikać bezpośredniej ekspozycji na światło UV.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chemicznie modyfikowane białka, które mogą być fotoaktywowane (np. białka PKA w klatkach) zostały opracowane jako nowa dziedzina w biologii chemicznej do nieinwazyjnego manipulowania międzykomórkowymi procesami biochemicznymi1,2,3. Wykorzystanie światła jako bodźca zapewnia doskonałą rozdzielczość czasoprzestrzenną podczas aktywacji tych białek zamkniętych w klatkach. Jednak światło UV może powodować niepożądane zmiany morfologiczne, apoptozę i uszkodzenia DNA komórek4,5. W związku z tym ostatnie osiągnięcia w projektowaniu grup fotoklatowania koncentrują się na umożliwieniu fotorozszczepienia przy wzbudzeniu dłuższych fal lub dwóch fotonów w celu zmniejszenia fototoksyczności, a także zwiększenia penetracji tkanek głębokich6,7. Grupy klatkowe, które reagują na dłuższe fale, co pozwala nam wybrać odpowiednie długości fal bez klatki (tj. kanały), aby selektywnie aktywować bioefektory, gdy obecne są dwie lub więcej grup klatkowych7. Biorąc pod uwagę te użyteczne cechy, opracowanie nowych grup fotoklatowania światłem czerwonym jest bardzo ważną pracą przygotowawczą w metodologiach fotochemicznych dla badań biologicznych, począwszy od sondowania mechanizmów reakcji, a skończywszy na kontrolowaniu aktywności komórkowej8. Niemniej jednak grupa klatkownicza składająca się z dwóch fotonów jest zwykle zbyt hydrofobowa ze względu na stopioną strukturę pierścienia aromatycznego, a grupa klatkowania w świetle widzialnym jest zwykle metaloorganiczna z aromatycznymi ligandami. Ta hydrofobowa/aromatyczna właściwość nie jest odpowiednia, gdy bioefektorem jest białko lub enzym, ponieważ denaturuje miejsce aktywacji enzymu/białka i powoduje utratę funkcji, nawet jeśli koniugacja i fotoliza nadal działają na poziomie chemicznym2,9.

UCNP są skutecznymi przetwornikami, które przekształcają światło wzbudzenia NIR na UV. Ta wyjątkowa i fascynująca właściwość UCNP zaoferowała realistyczne rozwiązania, aby sprostać wyzwaniom związanym z fotoaktywacją i wyzwalała kontrolowane uwalnianie małych cząsteczek, w tym kwasu foliowego10, pochodne cisplatyny11, DNA/siRNA12, pęcherzyki kopolimerowe13 i puste cząstki14. Jednak, zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, do tej pory nie przetestowano fotoaktywacji enzymów lub białek wspomaganej przez UCNP. Ponieważ nie ma udanego przypadku użycia czerwonego światła lub NIR do fotoaktywowania enzymu, zostaliśmy poproszeni o przeprowadzenie wywołanej przez NIR aktywacji konstruktu białko/enzymu złożonego z chemicznie zmodyfikowanych kompleksów enzymatycznych w klatkach z pokrytym krzemionką, domieszkowanym lantanowców UCNP15. W tym badaniu UCNP był sprzężony z szybko reagującą kinazą transdukcji sygnału w postaci klatki PKA. PKA kontroluje syntezę glikogenu i regulację cytoszkieletu, który reaguje na bodźce zewnętrzne poprzez cykliczną regulację fosforanu adenozyny (cAMP) w klasie cytozolu16. Badaliśmy wykonalność aktywacji enzymów w sposób czasowy i przestrzenny w eksperymencie komórkowym po napromieniowaniu NIR. Ta platforma fotoaktywacji wspomagana przez UCNP jest nową metodologią fotoaktywacji enzymu za pomocą NIR i pozwala uniknąć niepożądanej odpowiedzi na transdukcję sygnału z komórek spowodowanej konwencjonalnym promieniowaniem UV2,4.

Bardzo trudno jest translokować duże bioefektory (np. białka) przez błonę komórkową w celu kontrolowania aktywności komórkowej. Chociaż białko unieruchomione przez cząstki może być łatwiejsze do translokacji poprzez endocytozę do cytozolu, endocytoza może zostać uszkodzona lub zdegradowana przez uwięzienie endosomalne i wynikającą z tego degradację lizosomalną2,4. Nawet jeśli białko w klatce jest nadal funkcjonalne po translokacji błony, przemieszczone ilości mogą nie wystarczyć do wywołania odpowiedzi komórkowej2,17. W przeciwieństwie do tego, mikroiniekcja jest bezpośrednim i ilościowym podejściem do dostarczania dużych bioefektorów do cytoplazmy komórki. Co więcej, bioefektor unieruchomiony przez UCNP wymaga aktywacji światła przekonwertowanego w górę. Dlatego oprzyrządowanie optyczne wymaga dalszych modyfikacji w celu pomiaru, wizualizacji i wykorzystania światła konwersji w górę. W niniejszej pracy szczegółowo opisane zostanie dostarczenie zamkniętego w klatce kompleksu PKA-UCNP do komórki za pomocą mikroiniekcji oraz następujące niezbędne modyfikacje spektroskopii i mikroskopii do fotoaktywacji NIR.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Protokół opisuje szczegółową modyfikację oprzyrządowania do fotoaktywacji wspomaganej konwersją w górę, syntetyczną procedurę generowania PKA-UCNP w klatce, transmisyjną mikroskopię elektronową (TEM) próbek UCNP pokrytych krzemionką i PKA-UCNP w klatkach, przygotowanie do fotolizy UV i NIR, przygotowanie komórek, mikroiniekcję PKA-UCNP, badanie fotoaktywacji oraz barwienie włókien stresowych komórek REF52.

1. Konfiguracja fluorymetru do pomiaru widma konwersji w górę

  1. Zamontuj soczewkę obiektywu 4X obok uchwytu kuwety spektrometru fluorescencyjnego, tak aby laser skupiał się na środku kuwety.
  2. Umieść przestrajalną diodę laserową 980 nm o mocy od 0,5 do 8 W pod kątem 90° do soczewki obiektywu.
    UWAGA: Operator musi posiadać wiedzę na temat bezpieczeństwa lasera i nosić gogle laserowe NIR.
  3. Zainstaluj lustro z pełnym odbiciem w przecięciu ścieżki światła soczewki obiektywu i lasera. Umieść metalową płytkę anodowaną na czarno, aby zablokować okno wzbudzenia spektroskopii i chronić części wewnętrzne.
  4. Umieść kuwetę z roztworem UCNP pokrytym krzemionką (0,2 - 0,6 mg/ml) w uchwycie kuwety, aby można było uwidocznić jasną wiązkę konwersji w górę i wykorzystać ją do dostosowania najlepszego ustawienia światła do instalacji lustra.
  5. Przełącz spektroskopię w tryb luminescencji z najniższym PMT voltage ustawienie (dostosuj do wyższego ustawienia, jeśli sygnał jest zbyt słaby). Ustaw lustro w najlepszym ustawieniu, gdzie wiązka znajduje się na środku kuwety, a PMT odbiera najsilniejszy sygnał.
  6. Zmierz widmo konwersji w górę, po wyrównaniu, z żądanym ustawieniem mocy. Użyj miernika mocy pala termicznego, aby zbudować krzywą kalibracyjną mocy lasera w stosunku do odczytu prądu elektrycznego na zasilaczu laserowym. Stale sprawdzaj wydajność lasera, aby upewnić się, że wydajność mieści się w skalibrowanym zakresie.

2. Konfiguracja mikroskopu

UWAGA: Następująca konfiguracja działa dla mikroskopów wyposażonych w dwupoziomową ścieżkę optyczną. Jeśli użytkownik zamierza zainstalować przełącznik wzbudzenia źródła światła w tylnym porcie, aby laser NIR i lampa halogenkowa miały ten sam port, kolimator w tylnym porcie znacznie zablokuje NIR, ponieważ został zaprojektowany w celu zmniejszenia nagrzewania się próbki. Użytkownik musi dokonać trudnego wyboru: pozostawić kolimator w środku i cierpieć z powodu bardzo niskiej wydajności konwersji w górę, czy usunąć kolimator i poświęcić intensywność światła wzbudzającego na rzecz epifluorescencji.

UWAGA: Diagram przekroju pokazujący schemat ścieżki światła dla zmodyfikowanego spektrofluorometru, mikroskopii dla upkonwersji luminescencji i trybu fotolizy NIR oraz dla trybu epifluorescencji i fotolizy UV, a także konfiguracja eksperymentalna użyta w tym eksperymencie są zilustrowane w Rysunek 2.

  1. Wyposaż mikroskop fluorescencyjny w metalohalogenkowy światłowód, skierowany do tylnego portu.
    UWAGA: Na tej ścieżce światła wyższego poziomu, gdzie znajduje się wieżyczka sześcienna, jedna pozycja sześcianu musi być pusta, aby umożliwić NIR nadciąganie z dolnej ścieżki światła.
  2. Zainstaluj przestrajalną diodę laserową o mocy od 0,5 do 8,0 W 980 nm w porcie po prawej stronie, przy otwartym kolimatorze portu bocznego.
    UWAGA: Powoduje to powiększenie plamki świetlnej lasera do około 500 μm średnicy, gdy używana jest soczewka obiektywowa 10X. Usunięcie tego kolimatora powoduje powstanie plamki świetlnej o zasięgu mikrometrów i sprawia, że naświetlanie ogniw NIR jest niepraktyczne. Ten kolimator jest przezroczysty dla NIR.
  3. Zainstaluj zwierciadło dichroiczne (krótkoprzepustowe 850 nm) i filtr wzbudzenia (długoprzepustowy 950 nm) w dolnej ścieżce światła.
  4. Użyj rozwiązania UCNP, aby zwizualizować plamkę świetlną NIR. Dostosuj położenie lasera, aby wyśrodkować wiązkę światła NIR w polu view, aby zakończyć wyrównanie.

3. Przygotowanie i charakterystyka konstrukcji PKA-UCNP w klatce

  1. Inkubować rekombinowany PKA (9 μM) z 0,5 mM 2-nitrobenzylbromkiem (NBB) w buforze klatkowym (20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl i 10 mM MgCl2; pH 8,5) przez 1-2 godziny w temperaturze 25 °C. Zgasić nadmiar NBB za pomocą 10 mM dtiotriitolu (DTT), a następnie dializować w buforze kwasu 4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-etanosulfonowego (HEPES) (10 mM, pH 7,5) w celu usunięcia nadmiaru odczynników i soli.
    UWAGA: pH roztworu do sadzenia w sadzach jest obniżane z 8,5 do 7,5 podczas dializy z HEPES pH 7,5 w celu późniejszej reakcji unieruchomienia.
  2. Zmieszać sole lantanowców - Y(CH3CO2)3 hydrat (99,9%, 0,4527 g, 1,38 mmol), Yb(CH3CO2)3 hydrat (99,9%, 0,2533 g, 0,60 mmol) i Tm(CH3CO2)3 hydrat (99,9%, 0,0168 g, 0,02 mmol)-w oktadecenie (30 mL) i kwasie oleinowym (12 ml), podgrzewać mieszaninę do 115 °C przez 30 min, i schłodzić je do temperatury 50 °C. Następnie rozpuść mieszaninę reakcyjną w roztworze metanolowym (20 ml) z 0,2 g (5,0 mmol) osadu NaOH i 0,2964 g (8 mmol) fluorku amonu przez sonikację przez 15 minut. Zwiększ temperaturę reakcji do 300 °C, aby uzyskać nanocząstki rdzenia UCNP (β-NaYF4:1,0% Tm3 + / / 30% Yb3+).
  3. Rozpuść nanocząstki rdzenia (25 mg) w CO-520 (0,5 ml) w cykloheksanie (10 ml). Dodać amoniak (wag. 30% v/v, 0,08 ml) i tetraetyloortokrzemian (TEOS, 0,04 ml) i stosować ciągłe mieszanie przez 12 godzin w temperaturze pokojowej, aby uzyskać pokryte krzemionką nanocząstki rdzenia β-NaYF4:1,0%Tm3+/30%Yb3+.
  4. Inkubować PKA (6 nmol) lub PKA w klatce (6 nmol) z UCNP (1 mg)15 w buforze HEPES (10 mM, pH 7,5) w temperaturze 4 °C przez 3 godziny w celu unieruchomienia PKA na UCNP pokrytym krzemionką poprzez oddziaływania elektrostatyczne.
  5. Przefiltrować mieszaninę za pomocą filtra PVDF (0,45 μm), odwirować przy 17 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i ponownie rozproszyć granulat w HEPES (50 μL, 10 mM, pH 7,5) zawierającym 0,1% stabilizatora białkowego w celu otrzymania oczyszczonego kompleksu PKA-UCNP. Wirować przy 17 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i zebrać supernatant do testu Bradforda w probówce o pojemności 1,5 ml.
  6. Przeanalizuj nieograniczoną PKA w supernatancie zapisanym z kroku 3.5 za pomocą testu Bradforda, aby obliczyć wstecznie poziom podstawienia PKA na cząstkach UCNP, które normalnie mają poziom podstawienia ~ 4,5 nmol PKA na mg cząstki.
    UWAGA: Test Bradforda ujawnia silny niebieski kolor na granulkach, co sugeruje wysoki poziom i stabilną immobilizację białka bez desorpcji, podczas gdy frakcja supernatantowa roztworu PKA-UCNP w sadzce wykazuje kolor podobny do buforu HEPES (Rysunek 4c-4e).

4. Charakterystyka

UWAGA: Test kinazy służy do ilościowego określenia specyficznej aktywności kinazy pirogronianowej. Krótko mówiąc, fosforylacja peptydu, który jest sprzężony z kinazą pirogronianową i dehydrogenazą mleczanową, powoduje utlenianie NADH. Powstawanie tych ostatnich jest monitorowane poprzez pomiar spadku absorbancji NADH przy 340 nm.

  1. Oznaczyć aktywność PKA i PKA-UCNP w 60 μl całkowitej objętości mieszaniny do oznaczania zawierającej kwas 4-morfolinopropanosulfonowy (MOPS, 100 mM, pH 7,5), KCl (100 mM), fosfoenolopirogronian (PEP, 1 mM), trifosforan adenozyny (ATP, 1 mM), dinukleotyd β-nikotynamidoadeninowy, forma zredukowana (NADH, 0,8 mM), chlorek magnezu (MgCl2, 1 mM), kemptyd (0,4 mM), oraz mieszanina kinazy pirogronianowej i dehydrogenazy mleczanowej (30/40 jednostek PK/LDH).
  2. Zmierzyć spadek absorbancji NADH w czasie po dodaniu roztworu PKA (2 μl) do mieszaniny testowej. Oblicz nachylenie linii, aby bezpośrednio odzwierciedlić aktywność mierzonej kinazy.
  3. Zmierz aktywność PKA-UCNP15 i ogólną aktywność, która powinna być dobrze dopasowana do iloczynu mnożenia natywnej aktywności specyficznej dla PKA i obliczonej ilości PKA pokrytej powierzchniowo.

5. Konfiguracja fotolizy

  1. Zmierz całą moc źródeł światła za pomocą termicznego czujnika pala i oblicz gęstość mocy (PD = Moc (W)/Powierzchnia (cm2))18 na podstawie obszaru plamki świetlnej.
  2. Wykonaj eksperymenty fotolizy UV in vitro na komercyjnym systemie z diodą LED 365 nm (200 mW/cm2)15.
  3. W celu fotoaktywacji UV na stoliku mikroskopu, należy oświetlić roztwór PKA-UCNP światłem wzbudzającym przefiltrowanym przez komercyjną kostkę15.
    UWAGA: Gęstość mocy wynosi ~15 mW/cm2, bez ustawiania ostrości obiektywu.
  4. W przypadku fotoaktywacji NIR in vitro na stoliku mikroskopu, należy oświetlić roztwór PKA-UCNP za pomocą lasera 980 nm z niestandardowymi ustawieniami filtra/lustra konwersji w górę, zainstalowanego na dolnej ścieżce światła, zwierciadła dichroicznego (krótkoprzepustowego 850 nm) i filtra wzbudzającego (950 nm długoprzepustowego).
    UWAGA: Gęstość mocy wyjściowej wynosi 5 W/cm2 przed ustawieniem ostrości obiektywu 4X. Gęstość mocy szacuje się na ~ 68 W/cm2 po 4-krotnym ustawieniu ostrości obiektywu.

6. Przygotowanie próbki komórek i mikroiniekcja kompleksów PKA-UCNP

  1. Próbki należy wstępnie przefiltrować przez filtr 0,45 μm po unieruchomieniu PKA (krok 3.5).
  2. Inkubować komórki w 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) zawierającej pożywkę L-15 w okresie mikroiniekcji w celu stabilnej kontroli pH na zewnątrz inkubatora.
    UWAGA: Aby potwierdzić zakończenie mikroiniekcji, należy jednocześnie wstrzyknąć do komórek natywną PKA-UCNP, PKA-UCNP w klatce lub PEGylowaną UCNP (7,5 mg / ml)15 z 5(6)-karboksytetrametylorodaminą (TAMRA) (10 μM) do komórek.
  3. Dostosować stężenie cząstek PKA-UCNP tak, aby po mikroiniekcji stężenie cytozolowe wynosiło 1 - 3 μM PKA - fizjologiczny zakres stężeń dla PKA w komórce, przy założeniu, że objętość wstrzyknięcia wynosi 1/10 objętości komórki.
  4. Wykonaj mikroiniekcję do komórek (krok 6.2) za pomocą urządzenia do mikroiniekcji sprzężonego z jednoosiowym mikromanipulatorem hydraulicznym (Rysunek 3).
  5. Użyj cyfrowego manometru, aby monitorować ciśnienie wywierane przez mikrowtryskiwacz znajduje się w zakresie roboczym (~50-200 hPa) i uszczelnij zawór dozujący w dostosowanej do potrzeb komorze ciśnieniowej, aby zapewnić ciśnienie kompensacyjne dla mikroiniekcji. Odciągnąć igłę za pomocą ściągacza.
  6. Utrzymuj ciśnienie wtrysku między 50 a 75 hPa, z czasem wstrzykiwania 200-300 ms i ciśnieniem kompensacyjnym na poziomie 15 hPa, aby zapobiec cofaniu się pożywki hodowlanej do igły przez działanie kapilarne.
  7. Sprawdź otwory końcówek igieł, aby upewnić się, że mają one średnicę zewnętrzną od 1,3 do 1,5 μm, co można potwierdzić, wykonując zdjęcia za pomocą obiektywu 40x.
  8. Po mikroiniekcji przemyć komórki 2 ml pożywki L-15 zawierającej 10% FBS. Obserwuj obrazowanie fluorescencji komórkowej z 5(6)-karboksytetrametylo-rodaminy (TAMRA), aby potwierdzić zakończenie mikroiniekcji.

7. Fotoaktywacja PKA-UCNP w klatce za pomocą światła UV lub NIR w żywych komórkach

  1. W celu fotoaktywacji UV po mikroiniekcji PKA-UCNP należy wyhodować komórki REF52 na szalce o grubości 3,5 μm, umieścić je na stoliku mikroskopu i naświetlić światłem UV przefiltrowanym przez kostkę przez 3 minuty bez ustawiania ostrości soczewki obiektywu.
    UWAGA: Komórki REF52 utrzymywano w DMEM zawierającym 10% FBS w temperaturze 37 °C w inkubatorze 5% CO2 , a komórki hodowano, gdy konfluencja osiągała 90% co 2-3 dni.
  2. W celu fotoaktywacji NIR po mikroiniekcji PKA-UCNP należy oświetlić ogniwa laserem o długości fali 980 nm z niższych ustawień filtra/lustra, jak opisano w kroku 5.4.
    UWAGA: Gęstość mocy wyjściowej wynosi 5 W/cm2 przed 10-krotnym ustawieniem ostrości obiektywu i szacuje się na 300 W/cm2 po 10-krotnym ustawieniu ostrości obiektywu. Konwersja w górę to proces, który wymaga dużej gęstości fotonów, zwłaszcza gdy potrzebne jest większe przesunięcie anty-Stoke'a. W związku z tym podczas fotoaktywacji potrzebne jest ustawianie ostrości.
  3. Gdy potrzebna jest większa plamka świetlna (650 μm x 520 μm), należy naświetlić te komórki NIR skupionym przez soczewkę obiektywu 10x z kolimatorem przez 15 minut. Pozostawić 5-minutowy odstęp między ciemnościami po każdych 5 minutach napromieniowania, aby uniknąć nagrzewania.
    UWAGA: Gdy potrzebna jest wysoka rozdzielczość przestrzenna (subkomórkowa plamka świetlna), użyj soczewki obiektywowej 40X z otworkiem zainstalowanym na końcu wyjściowym światłowodu, aby wygenerować plamkę świetlną o wymiarze subkomórkowym (5 μm x 4 μm). W tym przypadku 1 s napromieniowania wystarcza do fotoaktywacji NIR ze względu na duży strumień fotonów.
  4. Po fotolizie UV lub NIR pozwól komórkom odzyskać siły w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę w kompletnym pożywce w celu wytworzenia odpowiedzi komórkowych. Następnie utrwal je w 1 ml 4% paraformaldehydu/soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) przez 20 minut przed dalszym barwieniem.
    UWAGA: Paraformaldehyd jest wysoce toksyczny; Unikaj kontaktu ze skórą, oczami lub błonami śluzowymi. Unikać wdychania proszku podczas odmierzania i przygotowywania.

8. Wizualizacja rozpadu włókien naprężeniowych spowodowanego fotoaktywacją NIR

  1. Po utrwaleniu użyj Alexa 594-falloidyny (dodaj 5 μl 6,6 μM roztworu podstawowego do 200 μl PBS w celu barwienia; inkubuj przez 25 minut w temperaturze pokojowej) do barwienia i wizualizacji włókien stresowych. Wizualizuj obrazy Alexy 594-falloidyny (Ex 581 nm/Em 609 nm) za pomocą zestawu filtrów.
  2. Inkubować komórki przez 5 minut w 4',6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI) w temperaturze pokojowej. Po barwieniu umyj próbki PBS i oddzielnie wykonaj obrazy fluorescencyjne włókien i jąder naprężeń.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Projekt konstrukcji enzymatycznego UCNP w klatce jest zilustrowany w Rysunek 1. Enzym PKA został najpierw poddany reakcji z bromkiem 2-nitrobenzylu w celu wytworzenia nieaktywnego PKA w klatce, a następnie został elektrostatycznie unieruchomiony na powierzchni UCNP. UCNP emitują światło przekształcone w górę i w konsekwencji fotolitycznie rozszczepiają grupy o-nitrobenzylowe na Cys 199 i Cys 343, generując aktywowaną PKA. Obrazy TEM i test Bradforda potwierdz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wcześniej Hofmann i współpracownicy odkryli, że po mikrowstrzyknięciu wolnego PKA19 zaobserwowano dramatyczne zmiany morfologiczne w komórkach REF52. W innym badaniu grupa Lawrence'a wykazała, że PKA w klatkach może być aktywowany in vivo, co prowadzi do zmian morfologicznych i rozpadu włókien stresowych po poddaniu fotolizie UV20. Wcześniejsze doniesienia na temat wykorzystania przetworzonego światła UV do fotoaktywacji wykazały aktywację kilku wspomaganych przez ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Programowi Nano Science and Technology Academia Sinica oraz Ministerstwu Nauki i Technologii Tajwanu za dofinansowanie (101-2113-M-001-001-MY2; 103-2113-M-001-028-MY2).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Odczynnik
Tris(hydroksymetylo)aminometanSigma154563
Chlorek magnezu sześciowodnySigmaM9272
MOPSSigmaM1254
HEPESSigmaH4034
Chlorek sodu Sigma31434
Chlorek potasuSigma12636
Octan itru  hydratSigma 326046Y(C2H3CO2)3 · xH2O
Hydrat octanu tulu(III)Alfa Aesar14582Tm(CH3CO2)3 · xH2O
Tetrahydrat octanu iterbu(III)Sigma326011Yb(C2H3O2)3 · 4H2O
1-oktadecenSigmaO806
Kwas oleinowySigma364525
metanol macron304168
Wodorotlenek soduSigma30620
Fluorek amonuJ.T.Baker69804
IGEPAL  CO-520Sigma238643
CykloheksanJ.T.Baker920601
Wodorotlenek amonu (28% - 30%)J.T.Baker972101Ortokrzemian tetraetylu amoniaku
(TEOS)Sigma8658
DL-Ditiothreitol (DTT)SigmaD0632
N-hydroksymaleimid (NHM)Sigma226351PKA odczynnik blokujący aktywność
Roztwór stabilizatora białka Prionex z kolagenu wieprzowegoSigma81662Roztwór stabilizujący białko
Bromek 2-nitrobenzylu (NBB)Sigma107794PKA odczynnik do sadzenia
8-(4-chlorofenylotio)adenozyny 3&prime,5′-cykliczny monofosforan soli sodowejSigmaC39128-CPT-cAMP
Kinaza pirogronianowa/dehydrogenaza mlekowa enzymy z mięśni królikaSigmaP0294PK / LDH
Adenozyno-5'-trifosforan disodowySigmaA2387ATP
& beta;-NADH zredukowany z dipotasuSigmaN4505
FosfoenolopirogronianSigmaP7127PEP
Coomassie Odczynnik do oznaczania białek, 950 mlThermo Scientific23200Odczynnik do oznaczania Bradforda
Kinaza białkowa zależna od cAMPPromegaV5161PKA kontrola aktywności
plazmid pET15b-PKACATAddgene#14921
plazmid pKaede-MC1CoralHueAM-V0012
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), pH 7,4Thermo Scientific10010023
DMEM, wysoka zawartość glukozy, pirogronianGibco12800-017Komórka pożywka
hodowlana Leibovitz L-15 MediumBiological Industries01-115-1APożywka do hodowli komórkowych
Płodowa surowica bydlęcaBiological Industries04-001-1A
ParaformaldehydACROS416785000
DAPIInvitrogenD1306Barwnik do barwienia jądra
Alexa 594-falloidynaInvitrogenA12381Barwnik barwiący F-aktynę
5(6)-karboksytetrametylorodamina Novabiochem8.51030.9999
Pierce Coomassie (Bradford) Zestaw do oznaczania białekThermo Scientific23200
CelluSep T4 Rurki/Nominalna ocena filtra MWCO 12,000 - 14,000 DaMembrane Filtration Products, Inc.1430-33Membrana do dializy
Millex-HV Filtr strzykawkowy, 0,45 &mikro; m, PVDF, 13 mm, sterylizowany promieniami gammaEMD MiliporeSLHVX13NL
Equipment
Dynamic Light Scattering/Zetapotential Zetasizer nano-ZSMalvernM104
JEOLJEM-1400
Agilent Technologies10075200Cary'ego Eclipse'a 
Spektrofotometr UV-VISAgilent Technologies10068900Cary 50 
Mikroskop fluorescencyjnyOlympusIX-71
950 nm filtr długoprzepustowy ThorlabsFEL0950
850 nm zwierciadło dichroiczne krótkie przepustoweChromaNC265609
Kolorowy system CCD RT3SPOTRT2520
Oświetlenie fluorescencyjnePRIORLumen 200
980 nm Laser diodowy na podczerwieńCNIMDL-N-980-8W
UV LED Spot Light SourceUVATAUVATA-UPS412Z diodą LED UPH-056-365 nm o mocy 200 mW/cm2
Termiczny czujnik stosuOPHIR12A-V1-ROHS
Picospritzer IIIParker Hannifin052-0500-900Wewnątrzkomórkowe systemy dozowania mikroiniekcji
PC-10 Ściągacz igiełNarishigePC-10
MANOMETR Cyfrowy manometrLutronPM-9100
Jednoosiowy Mikromanipulator olejowo-hydraulicznyNarishigeMMO-220A
Wirówka Heraeus Fresco 17, chłodzonaThermo Scientific75002421
Transmisyjny mikroskop elektronowy Spektrofotometr fluorescencyjny

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brieke, C., Rohrbach, F., Gottschalk, A., Mayer, G., Heckel, A. Light-Controlled Tools. Angew Chem Int Ed. 51 (34), 8446-8476 (2012).
  2. Lee, H. M., Larson, D. R., Lawrence, D. S. Illuminating the Chemistry of Life: Design, Synthesis, and Applications of "Caged" and Related Photoresponsive Compounds. ACS Chem Biol. 4 (6), 409-427 (2009).
  3. Pavlovic, I., et al. Cellular Delivery and Photochemical Release of a Caged Inositol-pyrophosphate Induces PH-domain Translocation in Cellulo. Nature Commun. 7, 10622-10629 (2016).
  4. Priestman, M. A., Sun, L. A., Lawrence, D. S. Dual Wavelength Photoactivation of cAMP- and cGMP-Dependent Protein Kinase Signaling Pathways. ACS Chem Biol. 6 (4), 377-384 (2011).
  5. Amatrudo, J. M., Olson, J. P., Lur, G., Chiu, C. Q., Higley, M. J., Ellis-Davies, G. C. R. Wavelength-Selective One- and Two-Photon Uncaging of GABA. ACS Chem Neurosci. 5 (1), 64-70 (2014).
  6. Warther, D., et al. Two-Photon Uncaging: New Prospects in Neuroscience and Cellular Biology. Bioorg Med Chem. 18 (22), 7753-7758 (2010).
  7. Priestman, M. A., Shell, T. A., Sun, L., Lee, H. M., Lawrence, D. S. Merging of Confocal and Caging Technologies: Selective Three-Color Communication with Profluorescent Reporters. Angew Chem. Int Ed. 51 (31), 7684-7687 (2012).
  8. Hansen, M. J., Velema, W. A., Lerch, M. M., Szymanski, W., Feringa, B. L. Wavelength-selective cleavage of photoprotecting groups: strategies and applications in dynamic systems. Chem Soc Rev. 44 (11), 3358-3377 (2015).
  9. Klán, P., et al. Photoremovable Protecting Groups in Chemistry and Biology: Reaction Mechanisms and Efficacy. Chem Rev. 113 (1), 119-191 (2013).
  10. Chien, Y. H., et al. Near-Infrared Light Photocontrolled Targeting, Bioimaging, and Chemotherapy with Caged Upconversion Nanoparticles in Vitro and in Vivo. ACS Nano. 7 (10), 8516-8528 (2013).
  11. Min, Y. Z., Li, J. M., Liu, F., Yeow, E. K. L., Xing, B. G. Near-Infrared Light-Mediated Photoactivation of a Platinum Antitumor Prodrug and Simultaneous Cellular Apoptosis Imaging by Upconversion-Luminescent Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 53 (4), 1012-1016 (2014).
  12. Yang, Y. M., Liu, F., Liu, X. G., Xing, B. G. NIR Light Controlled Photorelease of siRNA and Its Targeted Intracellular Delivery Based on Upconversion Nanoparticles. Nanoscale. 5 (1), 231-238 (2013).
  13. Wu, T. Q., Barker, M., Arafeh, K. M., Boyer, J. C., Carling, C. J., Branda, N. R. A UV-Blocking Polymer Shell Prevents One-Photon Photoreactions while Allowing Multi-Photon Processes in Encapsulated Upconverting Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 52 (42), 11106-11109 (2013).
  14. Zhou, L., Chen, Z. W., Dong, K., Yin, M. L., Ren, J. S., Qu, X. G. DNA-mediated Construction of Hollow Upconversion Nanoparticles for Protein Harvesting and Near-Infrared Light Triggered Release. Adv Mater. 26 (15), 2424-2430 (2014).
  15. Gao, H. -D., et al. Construction of a Near-Infrared-Activatable Enzyme Platform To Remotely Trigger Intracellular Signal Transduction Using an Upconversion Nanoparticle. ACS Nano. 9 (7), 7041-7051 (2015).
  16. Wehbi, V. L., Taskén, K. Molecular Mechanisms for cAMP-Mediated Immunoregulation in T cells - Role of Anchored Protein Kinase A Signaling Units. Front Immunol. 7, (2016).
  17. Pitchiaya, S., Heinicke, L. A., Custer, T. C., Walter, N. G. Single Molecule Fluorescence Approaches Shed Light on Intracellular RNAs. Chem Rev. 114 (6), 3224-3265 (2014).
  18. Gao, D., Tian, D., Zhang, X., Gao, W. Simultaneous Quasi-one dimensional Propagationand Tuning of Upconversion Luminescence Through Waveguide Effect. Scientific Rep. 6, 22433-22442 (2016).
  19. Roger, P. P., Rickaert, F., Huez, G., Authelet, M., Hofmann, F., Dumont, J. E. Microinjection of catalytic subunit of cyclic AMP-dependent protein kinases triggers acute morphological changes in thyroid epithelial cells. FEBS Lett. 232 (2), 409-413 (1988).
  20. Curley, K., Lawrence, D. S. Photoactivation of a Signal Transduction Pathway in Living Cells. J Am Chem Soc. 120 (33), 8573-8574 (1998).
  21. Carling, C. J., Nourmohammadian, F., Boyer, J. C., Branda, N. R. Remote-control Photorelease of Caged Compounds Using Near-infrared Light and Upconverting Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 49 (22), 3782-3785 (2010).
  22. Garcia, J. V., et al. NIR-triggered Release of Caged Nitric Oxide Using Upconverting Nanostructured Materials. Small. 8 (24), 3800-3805 (2012).
  23. Liu, G., Zhou, L. Z., Su, Y., Dong, C. M. An NIR-responsive and sugar-targeted polypeptide composite nanomedicine for intracellular cancer therapy. Chem Commun. 50 (83), 12538-12541 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Fotoaktywacja w bliskiej podczerwieniuwi ziona kinaza bia kowa Aprocedura mikrowstrzykiwaniamodyfikacja mikroskopii fluorescencyjnejustawianie lasera NIRtransdukcja sygna u PKAdezintegracja w kien stresowychkompleks nanocz steczkowy enzymurozdzielczo czasowo przestrzenna

Powiązane artykuły