Badania strukturalne układów makromolekularnych w skali atomowej za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego w ciele stałym

Summary

Struktury supramolekularnych zespołów białkowych w rozdzielczości atomowej mają duże znaczenie ze względu na ich kluczowe role w różnych zjawiskach biologicznych. W niniejszym artykule przedstawiamy protokół do wykonywania wysokorozdzielczych badań strukturalnych nierozpuszczalnych i niekrystalicznych zespołów białek wielkocząsteczkowych za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego w stanie stałym z wirowaniem pod magicznym kątem (MAS SSNMR).

Abstract

Zespoły białek supramolekularnych odgrywają fundamentalne role w procesach biologicznych, począwszy od interakcji gospodarz-patogen, poprzez infekcję wirusową, aż po rozprzestrzenianie się chorób neurodegeneracyjnych. Takie zespoły składają się z wielu podjednostek białkowych zorganizowanych w sposób niekowalencyjny, tworząc duże obiekty makromolekularne, które mogą wykonywać różne funkcje komórkowe lub powodować szkodliwe konsekwencje. Wgląd atomowy w mechanizmy składania i funkcjonowanie tych zespołów makromolekularnych pozostaje często rzadki, ponieważ ich nieodłączna nierozpuszczalność i niekrystaliczność często drastycznie obniżają jakość danych uzyskanych z większości technik stosowanych w biologii strukturalnej, takich jak krystalografia rentgenowska i roztwór magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR). Przedstawiamy tutaj spektroskopię NMR w ciele stałym z wirowaniem pod magicznym kątem (SSNMR) jako potężną metodę badania struktur zespołów makromolekularnych w rozdzielczości atomowej. SSNMR może ujawnić szczegóły atomowe na złożonym kompleksie bez ograniczeń rozmiaru i rozpuszczalności. Przedstawiony tutaj protokół opisuje podstawowe etapy od produkcji wielkocząsteczkowych zespołów białek znakowanych izotopem ¹³C/¹⁵N do uzyskania standardowych widm SSNMR oraz ich analizy i interpretacji. Jako przykład pokazujemy przebieg analizy strukturalnej SSNMR zespołu białek nitkowatych.

Introduction

Postępy w spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (SSNMR) z magicznym kątem wirowania (SSNMR) oferują skuteczne narzędzie do strukturalnej charakterystyki makromolekularnych zespołów białek w rozdzielczości atomowej. Te zespoły białek są wszechobecnymi systemami, które odgrywają istotną rolę w wielu procesach biologicznych. Ich struktury molekularne, interakcje i dynamika są dostępne w badaniach SSNMR, jak wykazano dla mechanizmów infekcji wirusowych (kapsydy¹) i bakteryjnych (systemy wydzielania^2,3, pili⁴), kompleksy białek błonowych^5,6,7,8 i funkcjonalny amyloidy ^9,10,11. Ten rodzaj składania molekularnego może również wywoływać patologie, takie jak choroby neurodegeneracyjne, w których białka gromadzą się w nieprawidłowo sfałdowanych stanach amyloidowych i powodują nieprawidłowe zachowanie komórek lub śmierć komórki ^12,13. Zespoły białkowe są często budowane przez symetryczną oligomeryzację wielu kopii podjednostek białkowych w duże obiekty supramolekularne o różnych kształtach, w tym fibryle, włókna, pory, rurki lub nanocząstki. Architektura czwartorzędowa jest definiowana przez słabe oddziaływania między podjednostkami białkowymi w celu zorganizowania przestrzennego i czasowego złożenia oraz umożliwienia zaawansowanych funkcji biologicznych. Badania strukturalne w skali atomowej na tych zespołach stanowią wyzwanie dla technik o wysokiej rozdzielczości, ponieważ ich wewnętrzna nierozpuszczalność i bardzo często niekrystaliczność ogranicza stosowanie konwencjonalnych metod krystalografii rentgenowskiej lub NMR w roztworze. Magiczny kąt wirowania (MAS) SSNMR to nowa technika uzyskiwania danych o rozdzielczości atomowej na nierozpuszczalnych zespołach makromolekularnych i udowodniła swoją skuteczność w rozwiązywaniu modeli atomowych 3D dla coraz większej liczby złożonych układów biomolekularnych, w tym włókien bakteryjnych, zespołów amyloidowych i cząstek wirusowych ^{14,15,16,17,18,19,20,21,22}. Postęp techniczny w zakresie silnych pól magnetycznych, postęp metodologiczny i przygotowanie próbek sprawiły, że MAS SSNMR stał się solidną metodą badania nierozpuszczalnych białek w różnych środowiskach, zwłaszcza w ich biologicznie istotnym stanie złożenia makromolekularnego lub w błonach komórkowych, co sprawia, że technika ta jest wysoce komplementarna w stosunku do mikroskopii krioelektronowej. W wielu przypadkach takie zespoły białek charakteryzują się bardzo wysokim stopniem symetrii. MAS SSNMR wykorzystuje tę cechę, ponieważ wszystkie podjednostki białkowe w zespole homomolekularnym miałyby tę samą strukturę lokalną, a zatem praktycznie tę samą sygnaturę SSNMR, co drastycznie zmniejsza złożoność analizy.

Skuteczny protokół do badań strukturalnych makromolekularnych zespołów białek za pomocą umiarkowanego MAS (<25 kHz) SSNMR jest prezentowany w tym filmie i może być podzielony na różne etapy (Rysunek 1). Pokażemy krytyczne etapy przepływu pracy badania strukturalnego SSNMR na przykładzie zespołu białek nitkowatych (patrz wyróżnione kroki w Rysunek 1), z wyjątkiem oczyszczania podjednostek białka, różniących się dla każdego zespołu białek, ale mających kluczowe znaczenie dla badań strukturalnych, i bez wchodzenia w techniczne/metodologiczne szczegóły spektroskopii SSNMR i obliczania struktury dla specjalistycznych samouczków dostępnych online. Podczas gdy obecny protokół skupi się przede wszystkim na eksperymentach NMR w stanie stałym przeprowadzanych w warunkach MAS, wykorzystanie dostosowanych środowisk biologicznych ^{23,24,25,26,27}, takie jak wyrównane dwucele, pozwalają na badanie konformacji białek i dynamicznej interakcji białko-białko w pożywkach błonowych bez MAS Technologia. Pokażemy etapy ekspresji i składania białek, a także rejestrację kluczowych widm SSNMR oraz ich analizę i interpretację. Naszym celem jest zapewnienie wglądu w proces analizy strukturalnej, umożliwiając czytelnikowi przeprowadzenie badania strukturalnego zespołu makromolekularnego w rozdzielczości atomowej za pomocą technik SSNMR.

Protokół obejmuje 3 sekcje:

1. Produkcja próbek NMR w stanie stałym

Jako warunek wstępny do analizy NMR w stanie stałym, składniki białkowe zespołu makromolekularnego muszą zostać wyrażone, znakowane izotopowo, oczyszczone i złożone in vitro do natywnego stanu złożonego (dla przykładu zobacz Rysunek 2). Aby zapewnić wysoką czułość NMR, wymagane jest wzbogacenie izotopów w znakowanie ¹³C i ¹⁵N poprzez zastosowanie minimalnych pożywek do ekspresji bakteryjnej uzupełnionych źródłami ¹³C i ¹⁵N, takimi jak jednorodnie ^{znakowana 13}C glukoza/glicerol i ¹⁵NH₄Cl. W późniejszym etapie protokołu wykorzystuje się selektywnie ¹³próbek znakowanych C wytworzonych z selektywnie ¹³źródeł znakowanych C, takich jak (1,3-13 C)- i (^2-13C)-glicerol (lub (^1-13C) i (^2-13C)-glukoza) w celu ułatwienia analizy NMR. Mieszana próbka znakowana odpowiadająca równomolowej mieszaninie 50% ¹⁵N i 50% ¹³znakowanej C lub 50% (1,3-13 C) i 50% (^2-13C)-glukozy wprowadza się w celu opisania wykrywania oddziaływań międzycząsteczkowych. Wysoki stopień czystości białka, a także rygorystyczne warunki na etapie składania są kluczowymi czynnikami zapewniającymi jednorodną kolejność strukturalną próbki końcowej.

2. Wstępna charakterystyka strukturalna na podstawie jednowymiarowego (1D) NMR w stanie stałym

Przedstawiamy niezbędne eksperymenty do analizy strukturalnej za pomocą SSNMR. Jednowymiarowa (1D) polaryzacja krzyżowa (CP) i eksperymenty INEPT / RINEPT²⁸, wykryte na ^{jądrach 13}C, są używane do wykrywania odpowiednio sztywnych i elastycznych segmentów białka w zespole oraz do oszacowania stopnia jednorodności strukturalnej i lokalnego polimorfizmu (dla przykładu patrz Rysunek 3).

3. Analiza konformacyjna i wyznaczanie struktury 3D

Podrozdziały 1 i 2 dotyczą analizy konformacyjnej, która opiera się na rezonansowym przypisaniu wszystkich sztywnych reszt zespołu białkowego, ponieważ przesunięcia chemiczne są bardzo czułymi sondami dla lokalnego środowiska i mogą być używane do przewidywania kątów dwuściennych phi/psi, a tym samym do określania struktury drugorzędowej. Rysunek 4 ilustruje przykład sekwencyjnego przypisywania rezonansu w sztywnym rdzeniu zespołu białkowego. Określenie struktury 3D opiera się na gromadzeniu danych strukturalnych, takich jak ograniczenia odległości kodujące bliskie odległości (<7 - 9 A), zawierających zarówno informacje wewnątrzcząsteczkowe, jak i międzycząsteczkowe. Podrozdziały 3 i 4 opisują zbieranie i interpretację ograniczeń na odległość na dalekie odległości. Kontakty dalekiego zasięgu definiuje się jako wewnątrzcząsteczkowe ^{13 C-13}C bliskość wynikającą z reszty i do j, z |i-j| ≥4, definiując w ten sposób trzeciorzędowe fałdy białkowe podjednostki monomerycznej lub jako międzycząsteczkowe ^{13 C-13 C-13}C, określając międzycząsteczkowe interfejsy między podjednostkami białka w złożeniu. Interfejsy wewnątrz- i międzycząsteczkowe są zilustrowane na Rysunek 5. Ograniczenia SSNMR wykryte w eksperymentach ^{sprzęgania 13 C-13}C i ^{15 N-13}C zwykle kodują odległości międzyjądrowe < 1 nm. W podrozdziale 4 wyjaśniono wykrywanie międzycząsteczkowych ograniczeń odległości. W symetrycznych zespołach białkowych stosowanie jednorodnie znakowanych próbek (tj. w 100% jednorodnie lub selektywnie znakowanych) do identyfikacji interakcji międzycząsteczkowych-podjednostek jest ograniczone, ponieważ zarówno kontakty wewnątrzcząsteczkowe, jak i międzycząsteczkowe prowadzą do wykrywalnych sygnałów. Jednoznaczne wykrywanie bliskości międzycząsteczkowych uzyskuje się przy użyciu mieszanych próbek znakowanych, zawierających równomolową mieszaninę dwóch różnie znakowanych próbek, połączonych przed agregacją. W podrozdziale 5 pokrótce przedstawiono modelowanie konstrukcji.

Rysunek 1: Przebieg badania strukturalnego w rozdzielczości atomowej za pomocą NMR w stanie stałym.¹³Pokazano produkcję białek znakowanych izotopem C, ¹⁵N, oczyszczanie podjednostek, składanie podjednostek, kontrolę tworzenia złożeń, eksperymenty SSNMR, analizę eksperymentu SSNMR i ekstrakcję ograniczeń odległości oraz modelowanie struktury. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Protocol

1. Produkcja próbek NMR w stanie stałym

1. Wytwarzanie jednorodnie ¹³C/ ¹⁵podjednostek białkowych znakowanych N
   1. Użyj świeżo przekształconych komórek E. coli BL21 (DE3) zawierających plazmid peptydu-6 pET24, zbierz je z przygotowanej płytki agarowej.
   2. Zaszczepić 15 ml wstępnej kultury wstępnie podgrzanej pożywki LB jedną kolonią. Inkubować w temperaturze 37 °C z prędkością 200 obr./min, wytrząsając przez noc.
   3. Przenieść kulturę wstępną do 1 l głównej kultury wstępnie ogrzanej pożywki M9 (patrz skład w tabeli 1), zawierającej wymagane źródła węgla i azotu znakowane izotopowo.
      UWAGA: Może to być jednolicie ^{glukoza znakowana 13}C, selektywnie (^1-13C) lub (^2-13C) znakowana glukozą ^29,30,31 lub (1,3-13 C)- lub (2-13 C)- lub (^2-13C)-znakowana glicerolem^32,33.
   4. Inkubować w temperaturze 37 °C i zmierzyć OD₆₀₀, gdy tylko kultura stanie się mętna. Gdy OD₆₀₀ osiągnie wartość 0,8, indukuj ekspresję białka za pomocą 0,75 mM IPTG przez 4 godziny
      UWAGA: Optymalne warunki indukcji mogą się różnić w zależności od białka.
   5. Odzyskać komórki przez odwirowanie przez 30 minut w temperaturze 6000 x g i 4 °C.
2. Szkic oczyszczania (nie pokazany w protokole wideo)
   1. Lizować komórki przy użyciu standardowych technik, takich jak sonikacja lub leczenie lizozymem, i oczyszczać podjednostkę białka przy użyciu technik ustalonych lub dostosowanych do badanego składania białek.
      UWAGA: Białko może ulegać ekspresji w ciałach inkluzyjnych, sprawdź lokalizację białka przez lizę komórek, a następnie odwirowanie. Jeśli białko znajduje się w osadzie ze szczątkami komórkowymi, zostało ono zgromadzone w ciałach inkluzyjnych.
   2. Zbadaj ekspresję i czystość próbki białka, na przykład za pomocą standardowej 12-15% Tris-Tricine SDS-PAGE, patrz Rysunek 2A. Jeśli czystość jest wystarczająca, białko można złożyć, w przeciwnym razie należy wykonać dodatkowy etap oczyszczania.
3. Składanie filamentów białkowych in vitro
   1. Sprawdź stężenie białka w oczyszczonym roztworze. Jeżeli białko zawiera pozostałości absorpcyjne, należy zmierzyć absorpcję w spektrofotometrze UV przy długości fali 280 nm. Wprowadzić czysty bufor do spektrofotometru jako kalibrację, a następnie zmierzyć absorbancję białka.
   2. Obliczyć stężenie białka przy użyciu współczynnika absorpcji podjednostki białka z dostosowanym prawem Beera-Lamberta: A_λ=ε_λ x l x c; tutaj A jest gęstością optyczną przy danej długości fali λ; ε jest współczynnikiem absorpcji właściwej; l jest długością trajektorii optycznej w cm; c jest stężeniem w mol/L.
   3. Skoncentrować białko do stężenia 1 mM w filtrze odśrodkowym. Wprowadzić próbkę do odśrodkowego zespołu filtrującego i odwirować przy 4000 x g przez 30 minut, delikatnie wymieszać roztwór w jednostce filtrującej pipetą, aby uniknąć osadzania się białka na filtrze. Powtarzaj procedurę, aż do osiągnięcia pożądanego stężenia.
      UWAGA: Optymalne stężenie montażowe zależy od systemu i wymaga optymalizacji (zwykle w zakresie 0,1 - 1 mM). Jeżeli przygotowuje się równomolową, mieszaną, znakowaną próbkę z dwóch różnych znakowanych partii białka (np. znakowanej (50/50) (^U-15N)-/(^U-13C)), mieszanie musi odbywać się przed lub zaraz po etapie zatężania, aby zapewnić homogenizację zmieszanego roztworu.
   4. Przenieść próbkę do probówki i inkubować ją pod mieszaniem przez tydzień w temperaturze pokojowej.
   5. Zwykle polimeryzacji podjednostek we włókna towarzyszy zmętnienie roztworu. Sprawdź mikroskopijną morfologię i jednorodność włókienek, na przykład za pomocą mikroskopii elektronowej (powiększenie 6300X - 45000X), patrz Rysunek 2B.
   6. Odwirowywać próbkę przez 1 godzinę w temperaturze 20000 x g i temperaturze 4 °C. Usunąć większość supernatantu, pozostawić tylko tyle płynu, aby pokryć powierzchnię, aby uniknąć wyschnięcia próbki. Sprawdzić, czy w supernatancie nie ma niepołączonych podjednostek na spektrofotometrze UV.
   7. Przemyć próbkę, dodając_H2O, a następnie ostrożnie zawiesić zawartość pipetą. Nie wirować. Wirować próbkę przez 30 minut w temperaturze 22000 x g i temperaturze 4 °C. Powtórzyć etap mycia 3 razy. Podczas wszystkich etapów płukania należy sprawdzić, czy osad zachowuje swój wygląd po odwirowaniu i sprawdzić supernatant pod kątem niezmontowanych podjednostek na spektrofotometrze UV.
   8. Dodać 0,02% (w/v) azydku sodu (NaN₃) w celu uniknięcia zanieczyszczenia bakteryjnego i przechowywać próbkę do czasu pomiaru w temperaturze 4 °C.
4. Półprzewodnikowe wypełnienie wirnika NMR
   1. Wirować dwukrotnie przez 30 minut w temperaturze 22000 x g i temperaturze 4 °C. Usunąć maksymalną ilość supernatantu; uzyskana konsystencja próbki zależy od złożenia białek i jest zwykle osadem przypominającym żel.
   2. Za pomocą pipety kapilarnej wprowadzić próbkę do rotora SSNMR.
      UWAGA: Tutaj przedstawiamy procedurę na wirniku o średnicy 4 mm.
      1. Odwirować wirnik na wirówce stołowej, aby delikatnie wprowadzić próbkę do wirnika. Powtarzaj procedurę, aż wirnik zostanie napełniony. Zachowaj minimalną przestrzeń do zamknięcia wirnika za pomocą pokrywy wirnika. Jeśli ilość próbki jest niewystarczająca, należy wprowadzić dostępną w handlu wkładkę, aby wypełnić pozostałą przestrzeń i zapewnić jednorodność rozkładu próbki w wirniku.
         UWAGA: W zależności od konsystencji zebranej próbki, bardziej odpowiednie może być użycie cienkiej szpatułki, szczególnie w przypadku bardzo gęstych próbek. Wirniki o średnicach od 2,5 do 4 mm są używane przy umiarkowanych częstotliwościach MAS.
   3. Dodać śladowe ilości kwasu 4,4-dimetylo-4-silapentano-1-sulfonowego (DSS) w celu wewnętrznego przesunięcia chemicznego i kalibracji temperatury.
   4. Zamknij nakrętkę za pomocą urządzenia zamykającego.
   5. Sprawdź pod lupą, czy nasadka jest dobrze włożona i całkowicie zamknięta.

Rysunek 2: Reprezentatywne wyniki dla oczyszczania i składania podjednostek białkowych. A) 15% tris-trycyny SDS-PAGE podjednostki białka (w tym His_6-tag) na różnych etapach oczyszczania. Tor 1 - Marker masy cząsteczkowej białka; tor 2 - nieindukowana kontrola komórek E. coli BL21 (DE3); tor 3 - komórki E. coli BL21 (DE3) indukowane 0,75 mM IPTG; Tor 4 - rozpuszczone ciała inkluzyjne Tor 5 - supernatantowe frakcje lizatu komórkowego; Tor 6 - frakcja oczyszczona po chromatografii powinowactwa do immobilizowanego metalu niklem (IMAC), FPLC i odsalaniu. B) Ujemnie barwione włókienka białkowe za pomocą obrazowania TEM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Wstępna charakterystyka strukturalna na podstawie jednowymiarowego (1D) NMR w stanie stałym

1. Wstępna konfiguracja i polaryzacja krzyżowa 1D (CP)
   1. Włóż wirnik do magnesu NMR
   2. Zacznij obracać wirnikiem z częstotliwością 5 kHz i poczekaj na stabilizację ±10 Hz, a następnie przyspiesz do 7 kHz. Dostrajanie i dopasowywanie ^{kanałów 1}H, ¹³C i ¹⁵N. Ustaw temperaturę na 2-10 °C (275-283 K); podgrzewanie próbki przy MAS 7 kHz jest niskie i regulacja temperatury zwykle nie jest wymagana przy tej częstotliwości MAS.
   3. Rejestruj jednopulsacyjne widmo 1D ¹H za pomocą 16 skanów.
      UWAGA: Poziomy mocy muszą być wcześniej zoptymalizowane na związku referencyjnym (takim jak histydyna ¹³C/¹⁵N lub glicyna), aby zapewnić wartości początkowe do optymalizacji poziomów mocy w eksperymentach na próbce docelowej; Procedura ta jest zadaniem rutynowym i dlatego nie wchodzi w zakres niniejszego protokołu.
   4. Utrzymuj temperaturę podczas wszystkich eksperymentów w zakresie 2-10 °C, w próbkach uwodnionych temperatura jest odzwierciedlona we względnym przesunięciu rezonansu wody o ¹H w stosunku do sygnału DSS³⁴. Zmierz temperaturę zgodnie z zależnością δ(H₂O) = 7,83- T/96,9 z dokładnością 1 - 2 °C³⁵.
   5. Ustaw żądaną częstotliwość MAS i poczekaj, aż ustabilizuje się ±10 Hz.
      UWAGA: Tutaj pokazano to dla częstotliwości 11 kHz.
   6. Ponownie dostrój i dopasuj kanały ¹H i ¹³C i dostosuj temperaturę za pomocą eksperymentu 1D ¹H.
   7. Konfigurowanie klasy 1D ^{1 H-13}C CP³⁶.
      UWAGA: Eksperymenty CP pokazują sygnały powstające z reszt w sztywnej konformacji. Parametry kalibracji impulsów i odsprzęgania można bezpośrednio zoptymalizować na próbce, gdy czułość jest wystarczająco wysoka, aby obserwować sygnały po mniej niż ~32 skanach. Początkowe wartości optymalizacji są przejmowane ze standardowej optymalizacji na związku odniesienia. Czas kontaktu CP i poziomy mocy są dobierane na podstawie maksymalnego natężenia sygnału. W próbkach białkowych optymalny czas kontaktu CP wynosi zwykle od 200 μs do 2 ms. Parametry odsprzęgania powinny być również ponownie dostosowane na podstawie kalibracji na związku odniesienia.
      1. Uważnie obserwuj lokalizację wirujących wstęg bocznych przy danej częstotliwości MAS.
   8. Zapisz referencyjne widmo 1D ¹³C CP, które służy jako spektralny odcisk palca 1D. Typowe parametry to 128 skanów, czas kontaktu CP 1 ms, siła odsprzęgania 100 kHz, opóźnienie odtwarzania 3 s i 25 ms akwizycji.
   9. Skalibruj przesunięcia chemiczne ^{o 1}H i ¹³C zgodnie z zaleceniami IUPAC³⁷. Określić częstotliwość rezonansową ^{sygnału 1}H DSS (przesunięcie chemiczne 0 ppm); ¹³Przesunięcia chemiczne C są odnoszone do przesunięć ¹H (zwykle ~0,25144, pochodzących ze stosunku częstotliwości rezonansowej ¹³C do ¹H³⁷).
   10. Przetwórz eksperyment 1D ^{1 H-13}C CP bez funkcji apodyzacji (patrz Rysunek 3A i B dla wykrywania na jednorodnie dobrze uporządkowanym zespole białkowym). Wybierz izolowany pik, aby oszacować szerokość linii w próbce, wskazującą na porządek strukturalny i jednorodność. Typowe szerokości linii ¹³C dla dobrze uporządkowanych biologicznych zespołów białkowych w MAS przy silnych polach magnetycznych wahają się od 20 do 150 Hz (mierzone jako pełna szerokość w połowie wysokości (FWHH)).
   11. Oszacuj stosunek sygnału do szumu (S/N) w widmie CP.
       UWAGA: Stosunek sygnału do szumu zależy od wielu czynników, w tym głównie od ilości próbki w wirniku, stopnia sztywności struktury białka oraz obecności pojedynczej konformacji molekularnej. Z reguły próbka powinna nadawać się do wielowymiarowej spektroskopii SSNMR, jeśli sygnał jest obserwowany w zoptymalizowanym widmie 1D ^{1 H-13}C CP zarejestrowanym za pomocą 64 skanów.
   12. Powiększ obszar spektralny rezonansów karbonylowych szkieletu białka (głównie) zlokalizowanych między 165 - 180 ppm. Oszacuj zawartość struktury drugorzędowej w zespole na podstawie położenia rezonansów karbonylowych szkieletu białka z rezonansami z reszt w konformacji α-helisowej lub β-niciowej przesuniętej odpowiednio w dół lub w górę pola (patrz Rysunek 3B dla podjednostki z przewagą α-helikalnej)³⁸.
2. Eksperyment 1D INEPT
   1. Skonfiguruj eksperyment 1D ^{1 H-13}C INEPT, aby zbadać wysoce mobilne części (sub-μs) zespołu białkowego.
      UWAGA: Odsprzężenie GARP o kilka kHz podczas akwizycji³⁹ jest powszechnie używane, aby umożliwić krótkie opóźnienia między skanami (zwykle 1 s) bez uszkodzenia sondy.
   2. Rejestruje referencyjne widmo INEPT, które służy jako odcisk palca dla ruchomych segmentów białka; typowe parametry to 128 skanów i czas akwizycji 25 ms.
   3. Przetworzyć eksperyment ^{1 H-13}C INEPT. Ilość i położenie sygnałów wskazują odpowiednio na ilość reszt ruchomych i skład aminokwasów.
      UWAGA: Nagraj również eksperyment 2D ^{1 H-13}C INEPT, jeśli sygnały są obecne w widmie 1D INEPT (patrz przykład na rysunku 3C), aby umożliwić bardziej szczegółową identyfikację aminokwasów. W niejednoznacznych przypadkach przypisania zalecamy sprawdzenie pozycji sygnału komponentu bufora za pomocą roztworu NMR.
   4. Użyj bazy danych BMRB⁴⁰ i opublikowanych danych³⁸, aby przypisać rezonanse do odpowiadającego im aminokwasu w niemal losowej konformacji cewki; widmo zawiera tylko ruchome składniki buforowe, jeśli żadne reszty nie są w wysoce mobilnym reżimie.

Rysunek 3: Reprezentatywne wyniki akwizycji widm SSNMR dla dobrze ustrukturyzowanego zespołu białek. A) ¹³FID wykryty przez C w eksperymencie polaryzacji ^{krzyżowej 1 H-13}C. B) ¹eksperyment z polaryzacją krzyżową ^H-13C. C) ^{1 H-13}C INEPT eksperyment sztywnego zespołu białek; Widoczne są tylko komponenty bufora. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Analiza konformacyjna i wyznaczanie struktury 3D

1. Sekwencyjne przypisywanie rezonansu
   1. Skonfiguruj eksperyment 2D ^{13 C-13}C proton-driven spin diffusion (PDSD)⁴¹, aby wykryć korelacje wewnątrz reszty ^{13 C-13}C, w tym łańcuchy boczne. Przejmij wartości początkowego kroku polaryzacji krzyżowej ^{1 H-13}C z eksperymentu 1D ^{1 H-13}C CP.
      1. Ustawić czas mieszania na 50 ms dla ¹³próbek znakowanych jednolicie C i na 100 ms dla selektywnie ¹³próbek znakowanych C. Ustaw czas akwizycji pośredniej w zakresie od 5 do 25 ms, a akwizycję bezpośrednią w zakresie 15-25 ms w zależności od wewnętrznej rozdzielczości widmowej, którą można oszacować za pomocą sygnału widzialnego o długości rozpadu swobodnej indukcji (FID) (zilustrowany w Rysunek 3A).
      2. Przetestuj kilka parametrów przetwarzania, aby znaleźć optymalne wartości w odniesieniu do stosunku sygnału do szumu i rozdzielczości w spektrum, zazwyczaj odpowiednie przetwarzanie można osiągnąć za pomocą funkcji okna qsinus z przesunięciem dzwonka sinusoidalnego (SSB) 2,5-4.
   2. Ustawienie, nagranie i przetworzenie 2D ^{13 C-13}C PDSD z pośrednim eksperymentem czasu mieszania w celu wykrycia sekwencyjnych ^{korelacji 13 C-13}C łączących głównie reszty i - i±1, ale także i±2 i i±3, w zależności od sztywności szkieletu białkowego i drugorzędowych elementów struktury. Czas mieszania należy ustawić w zakresie 100-200 ms dla jednolicie oznakowanych próbek. Wszystkie inne wartości można przejąć z krótkiego czasu mieszania 2D ^{13 C-13}C PDSD.
   3. Skonfiguruj, nagraj i przetwórz eksperyment 2D ^{15 N-13}C N_iCA_i oraz N_iCO_i przy użyciu CP ^{1 H-15}N i określonego CP ^{15 N-13}C transfer⁴². Zoptymalizuj transfer polaryzacji ^{15 N-13}C w sposób 1D bezpośrednio na próbce będącej przedmiotem zainteresowania, w oparciu o maksymalną intensywność odpowiednio w regionie CA lub karbonylu. Typowe wartości dla konkretnego czasu kontaktu CP mieszczą się w przedziale 2-6 ms.
   4. Skonfiguruj, nagraj i przetwórz serię eksperymentów 2D ¹⁵N-(¹³C-)¹³C w celu wykonania zadania.
      Uwaga: Pierwsze ¹⁵wartości parametru przenoszenia polaryzacji ^N-13C można przejąć z eksperymentów N_iCA_i / N_iCO_i. Korelacje wewnątrz-resztowe są ustalane na podstawie N_i(CA_i)CB_i i i N_i(CA_i)CO_i, używając odpowiednio DREAM⁴³ i PDSD ^{13 C-13 C-13}C. Sekwencyjna łączność reszty (i) do reszty (i-1) uzyskuje się z eksperymentów N_i(CO_i-1)CA_i-1 i N_i(CO_i-1)CX_i-1, przy użyciu transferu polaryzacji PDSD ^{13 C-13}C.
   5. Wybierz program do analizy NMR, taki jak CcpNmr analysis⁴⁴ lub SPARKY⁴⁵
   6. Załaduj widma 2D do oprogramowania (na przykładzie analizy CcpNmr) i załaduj pierwotną sekwencję białka.
   7. Zacznij od identyfikacji typów aminokwasów widocznych w widmie ^{13 C-13}C PDSD do krótkiego mieszania. Połącz atomy węgla w układach spinowych, aby umożliwić specyficzne przypisanie "typu pozostałości"; zobacz Rysunek 4A dla przypisania reszty treoniny. Zidentyfikować jak najwięcej pozostałości; Będzie to zależało od wielkości podjednostki białka, rozdzielczości widmowej i dyspersji.
   8. Nałożyć krótkie mieszanie na pośrednie mieszanie ^{13 C-13}C PDSD spectrum.
      UWAGA: Dodatkowe piki widoczne w pośrednim mieszaniu PDSD powstają głównie w wyniku sekwencyjnych (reszta i - reszta i±1) kontaktów. Przykład sekwencyjnego przypisania dwóch reszt jest zilustrowany w Rysunek 4B.
      1. Zaznacz piki rezonansowe układu spinowego i znajdź korelacje w pośrednim mieszaniu PDSD z częstotliwościami rezonansowymi innych układów spinowych. W małych białkach lub peptydach możliwe jest osiągnięcie pełnego sekwencyjnego przypisania rezonansu w oparciu o eksperymenty 2D ^{13 C-13}C PDSD.
         UWAGA: W β-niciowych motywach struktury drugorzędowej reszta i - reszta i±2 ¹³styków ^C-13C może wykazywać bardziej intensywne sygnały niż styki sekwencyjne ze względu na ich bliskość w przestrzeni; w α-helikalnej strukturze drugorzędowej motywy Reszta I - Reszta I±3 ^{13 C-13}Styki C mogą również prowadzić do intensywnych sygnałów.
   9. Jeśli dostępne są eksperymenty PDSD z mieszaniem pośrednim na ^{selektywnie 13}próbkach znakowanych C, nałóż je na krótkie widmo mieszania (jeśli jest to dostępne na selektywnie ¹³próbkach znakowanych C) i przypisz dodatkowe piki, biorąc pod uwagę selektywny wzór znakowania ¹³C (1,3-13 C i ^2-13C glicerol^32,33 lub 1-13 C i 2¹³C glukoza^29,30,31.
      UWAGA: Na przykład w próbce znakowanej glicerolem w temperaturze ^2-13C kilka typów aminokwasów jest znakowanych w pozycji Cα bez znakowania sąsiednich atomów węgla (Cβ i C'), co sprzyja przenoszeniu Cα-Cα między sąsiednimi resztami. W selektywnie znakowanych próbkach korelacje ^{dalekiego zasięgu 13 C-13}C mogą narastać już w eksperymentach z mieszaniem ^{pośrednim 13 C-13}C PDSD. Jeśli piku nie można wyjaśnić za pomocą korelacji sekwencyjnej, może on powstać w wyniku kontaktu dalekiego zasięgu. W przypadku wysoce uporządkowanych jednorodnych struktur podjednostek w zespole makromolekularnym oczekuje się, że w widmach widoczny będzie tylko jeden zestaw rezonansów. Jeśli podwojone (lub dalej zwielokrotnione) rezonanse są widoczne dla ¹³atomów C lub rozciągnięć szkieletu białka, istnieją odpowiednio dwie (lub więcej) konformacje dla atomu lub rozciągnięcia sekwencji pierwotnej w złożeniu.
   10. Widmo 2D NCA zawierające korelacje ^{15 N-13}Cα wewnątrz reszty należy wykorzystać do określenia częstotliwości rezonansowych ¹⁵N dla każdej pozostałości. Jeżeli rozdzielczość w wymiarze ¹³C nie jest wystarczająca, należy skorzystać z dodatkowych informacji o rezonansie Cβ w 2D NCACB, aby określić częstotliwość rezonansową ¹⁵N wewnątrz pozostałości.
   11. Użyj widm 2D NCACB i NCACO zawierających korelacje wewnątrz reszty ^{15 N-13 C-13}C, aby (i) zidentyfikować częstotliwość występowania wewnętrznej reszty ¹⁵N oraz (ii) rozwiązać niejasności w ^{13 C-13}C PDSD za pomocą dodatkowego wymiaru ¹⁵N. Odwrócenie sygnału spowodowane transferem DREAM prowadzi do obserwacji typowych korelacji Cα-Cβ, dla których sygnał Cα jest dodatni, a sygnał Cβ ujemny. Dalsze łańcuchy boczne ¹³C, jeśli są widoczne w spektrum, są ponownie dodatnie.

Rysunek 4: 2-wymiarowe ^{eksperymenty 13}C- ¹³C SSNMR PDSD na dobrze uporządkowanym, jednolicie ¹³C, ¹⁵N-znakowanym zespole białek. A) Krótki czas mieszania PDSD (mieszanie 50 ms). B) Przypisanie 2-resztkowego rozciągliwego Ile32 - Thr33 za pomocą nałożenia krótkiego czasu mieszania PDSD na długi czas mieszania PDSD (mieszanie 200 ms). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Określanie struktury drugorzędowej
   1. Użyj wartości przesunięcia chemicznego ¹³Cα, ¹³Cβ, aby obliczyć wtórne przesunięcie chemiczne ⁴⁶ΔδCα-ΔδCβ, wskazujące na strukturę drugorzędową. Obliczać ¹³Cα (przypisany) -¹³Cα (losowa cewka) i ¹³Cβ (przypisany) -¹³Cβ (losowy cewka).
      UWAGA: Wartości przesunięć chemicznych dla pozostałości w losowej konformacji cewki można uzyskać ze strony³⁸.
      1. Wykres ΔδCα-ΔδCβ, ujemne lub dodatnie wartości dla > 3 reszt w rzędzie wskazują odpowiednio na konformację niciową β lub α-helikalną; reszty glicyny i proliny mogą wykazywać nietypowe wartości przesunięcia chemicznego, ponieważ często działają jako "łamacze struktur drugorzędowych".
   2. Przewiduj kąty dwuścienne białek na podstawie przypisanych przesunięć chemicznych za pomocą TALOS+^47,48 lub PREDITOR^49,50. Przewidywane kąty dwuścienne Phi/Psi odzwierciedlają drugorzędową strukturę podjednostki białka i są wykorzystywane jako ograniczenia strukturalne w całym procesie modelowania.
3. Zbiór ograniczeń strukturalnych
   1. Skonfiguruj i nagraj eksperyment 2D ^{13 C-13}C PDSD z długim czasem mieszania w celu wykrycia korelacji ¹³C ^C-13dalekiego zasięgu. Typowe czasy mieszania wahają się od 400 ms do 1 s. Używaj selektywnie ¹³próbek znakowanych C, ponieważ rozcieńczenie spinu znacznie poprawia przenoszenie polaryzacji między odległymi atomami węgla.
   2. Nałożyć na siebie 2D ^{13 C-13}C PDSD z długiego mieszania nagrany na selektywnie znakowanej próbce na ^{13 C-13}C PDSD z mieszaniem pośrednim, jeśli to możliwe, nagrany na tej samej selektywnie znakowanej próbce. Piki uzupełniające powstają w wyniku korelacji między bardziej odległymi ^{atomami 13}C. Podczas przypisywania rezonansu należy wziąć pod uwagę schemat selektywnego etykietowania.
   3. Dokładnie oceń rozdzielczość widma, aby zdefiniować okno tolerancji przypisania, tj. w zależności od rezonansów rozdzielczości widmowej w określonym zakresie ppm może to przyczynić się do sygnału. Odchylenie standardowe precyzji przypisania jest obliczane automatycznie w programach do przypisywania NMR, takich jak analiza CcpNmr lub SPARKY.
   4. Jeżeli sygnał można wyjaśnić za pomocą kontaktu sekwencyjnego (reszta i - reszta i±1) lub kontaktu średniego zasięgu ^{13 C-13}C (reszta i - reszta i ± 2, 3 lub 4), należy zachować to przypisanie, ponieważ przekazywanie polaryzacji może wyjaśnić korelację, nawet jeśli odległość ^{13 C-13}C jest powyżej oczekiwanego widzialnego zakresu kontaktu.
   5. Klasyfikuj przypisania ^{styków 13 C-13}C dalekiego zasięgu na sygnały jednoznaczne i niejednoznaczne częstotliwościowo. W przypadku jednoznacznych przypisań częstotliwości możliwe jest tylko jedno przypisanie rezonansu w odniesieniu do okna tolerancji przypisania.
      UWAGA: Przypisania niejednoznaczne zawierają wszystkie możliwe przypisania rezonansu w oknie tolerancji. Niejasności mogą być znoszone jednocześnie podczas obliczania struktury przez iteracyjne rundy uściślania oparte na wstępnych strukturach obliczonych przy użyciu tylko jednoznacznych ograniczeń, jak to jest wykonywane w procedurach obliczeniowych, takich jak ARIA⁵¹ lub UNIO⁵². Ponadto dane strukturalne z różnych źródeł biofizycznych (np. zmutowana lub skrócona struktura podjednostek przez roztwór NMR lub krystalografia rentgenowska, pomiary masy na długość, mapa krio-EM) mogą być również wykorzystane do zmniejszenia poziomu niejednoznaczności, na przykład zobacz 1^{,3,53,54,55,56,57,58}.
4. Wykrywanie międzycząsteczkowych ograniczeń odległości w symetrycznym zespole białek
   1. Skonfiguruj eksperyment 2D ^{15 N-13}C PAIN-CP⁵⁹ na mieszanej (50/50) próbce znakowanej ^U-15N / ^U-13C. Sygnały wykrywane w widmie PAIN-CP powinny pochodzić z międzycząsteczkowych ^{15 N-13}C bliskość. Użyj wcześniej przypisanych rezonansów, aby wykonać przypisanie kontaktów międzycząsteczkowych.
   2. Ustawić PDSD 2D ^{13 C-13}C o długim czasie mieszania (>600 ms) na (50/50) mieszanej (1,3-13 C)-/ (^2-13C)-glicerolu lub (^1-13C)-/ (^2-13C)-glukozy.
      UWAGA: Sygnały wykrywane w tym widmie >^{13 C-13}C pochodzą z wewnątrzcząsteczkowych i międzycząsteczkowych ^{odległości 13 C-13}C. Jednak wysoka komplementarność tych dwóch schematów znakowania pozwala na jednoznaczne powstawanie poszczególnych par rezonansowych z kontaktów międzycząsteczkowych, np. CA seryny w podjednostkach znakowanych (^2-13C)-glukozą, które korelują CB seryny w podjednostkach znakowanych (^1-13C)-glukozą.
      1. Nałożyć widmo próbki mieszanej na widma 2D ^{13 C-13}C zarejestrowane na jednorodnie znakowanych próbkach ((1,3-13 C)- i (^2-13C)-glicerol lub (^1-13C) i (^2-13C)-glukoza). Dodatkowe sygnały w widmie zarejestrowanym na zmieszanej próbce powinny pochodzić z oddziaływań międzycząsteczkowych.
5. Modelowanie konstrukcji na podstawie danych SSNMR
   1. Przygotować listy ograniczeń SSNMR potrzebne do obliczenia struktury: (1) sekwencja białka; (2) wewnątrzcząsteczkowe jednoznaczne ograniczenia odległości; (3) wewnątrzcząsteczkowe niejednoznaczne ograniczenia odległości; (4) Utwierdzenia kąta dwuściennego oparte na TALOS; (5) międzycząsteczkowe jednoznaczne ograniczenia odległości; (6) międzycząsteczkowe niejednoznaczne ograniczenia odległości; (7) dodatkowe dane z innych technik biofizycznych (np. stosunek masy do długości, parametry symetrii).
   2. Kilka recenzji dostarcza informacji na temat modelowania konstrukcji w oparciu o dane SSNMR i w połączeniu z uzupełniającymi danymi konstrukcyjnymi ^{14,60,15,19,61,62} Należy pamiętać, że niejednoznaczne umocowania odległości można ujednoznacznić podczas obliczeń konstrukcji w odniesieniu do wstępnych modeli konstrukcyjnych opartych na jednoznacznych ograniczeniach odległości. Aby zapewnić dokładność struktury, uważnie obserwuj, czy struktura zbiega się do jednego zagięcia.

Rysunek 5: Kontakty wewnątrz- i międzycząsteczkowe w symetrycznych zespołach białkowych.Schematyczne przedstawienie wewnątrz- i międzycząsteczkowych kontaktów dalekiego zasięgu ^{13 C-13}C w spiralnym zespole makromolekularnym. Podjednostki są pokolorowane na biało i czerwono, aby zilustrować mieszane oznakowanie podjednostek; tj. przed montażem wykonano mieszaninę 1:1 dwóch różnych schematów znakowania (np. ^1-13C glukozy i ^1-13C glukozy). A) Wewnątrzcząsteczkowe kontakty dalekiego zasięgu ^{13 C-13}C (niebieska przerywana strzałka); B) kontakty międzycząsteczkowe ^{13 C-13}C dalekiego zasięgu (czerwone przerywane strzałki). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Results

Typowy przepływ pracy SSNMR obejmuje kilka kroków zilustrowanych w Rysunek 1. Zwykle podjednostki białka są wytwarzane przez heterologiczną ekspresję in vitro w E. coli, oczyszczane i składane pod wpływem wstrząsania, ale czasami również w warunkach statycznych. Po ekspresji i oczyszczeniu podjednostki białka przeprowadza się chromatografię żelową SDS (Rysunek 2A). Powstawanie zespołów makromolekularnych można następnie potwierdzić za pomocą analizy mikroskopii elektronowej (EM) (patrz Rysunek 2B dla przykładu zespołu nitkowatego).

Po wprowadzeniu zestawu białek do wirnika SSNMR, wirnik jest wprowadzany do spektrometru, częstotliwość i temperatura MAS są regulowane, a widma rejestrowane. Pierwsze spostrzeżenia można uzyskać za pomocą technik 1D SSNMR. Rysunek 3 pokazuje typowy FID SSNMR wykryty na kanale ¹³C na strukturalnie jednorodnej próbce białka, widmo ^{1 H-13}C CP, ujawniające rezonanse¹³C obecne w sztywnym rdzeniu podjednostki białkowej w zespole, oraz widmo 2D ^{1 H-13}C INEPT, reprezentujące ruchome pozostałości. Aby uzyskać atomowy wgląd w sztywny rdzeń struktury zespołu, wielowymiarowe eksperymenty SSNMR muszą być rejestrowane na jednolicie i selektywnie oznakowanych próbkach, aby najpierw przypisać rezonanse SSNMR, a następnie wykryć bliskość dalekiego zasięgu (patrz Rysunek 4).

Wszystkie widma są przetwarzane i analizowane za pomocą odpowiedniego oprogramowania do przypisywania rezonansów SSNMR i wyodrębniania wewnątrz- i międzycząsteczkowych ograniczeń odległości (Rysunek 5). Ograniczenia odległości SSNMR są używane samodzielnie lub w połączeniu z danymi z technik uzupełniających, które można zintegrować z programem do modelowania.

Dla reprezentatywnych struktur atomowych zespołów makromolekularnych rozwiązanych technikami SSNMR Rysunek 6 ilustruje kilka nitkowatych zespołów z bakteryjnych wyrostków i włókienek amyloidowych.

Rysunek 6: Nitkowate struktury makromolekularne wyznaczone metodą NMR w stanie stałym: włókna bakteryjne i fibryle białek amyloidowych.A) Pilus typu 1 uropatogennej E. coli, kod PDB 2N7H ⁴; B) Filament ASC, kod PDB 2N1F ⁶³; C) Igły systemu sekrecji typu III, kody PDB 2MME, 2LPZ i 2MEX ^2,3,64; D) Fibryle Amyloid-beta AB42, kod PDB 2NAO, 5KK3, 2MXU ^65,66,67 i zmutowany Osaka kod PDB 2MVX ⁵⁷, kod PDB mutacji Iowa 2MPZ ⁵⁸; E) Fibryle alfa-synukleinowe, kod PDB 2N0A ⁶⁸; F) Domena prionowa HET-s, kod PDB 2RNM, 2KJ3 ^69,70. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

NMR w stanie stałym (SSNMR) jest metodą z wyboru do charakteryzowania wielkocząsteczkowych zespołów białek na poziomie atomowym. Jednym z centralnych zagadnień w wyznaczaniu struktury w oparciu o SSNMR jest jakość spektralna badanego układu, która pozwala na tworzenie modeli strukturalnych 3D o różnej precyzji, zwykle od modeli o niskiej rozdzielczości (zawierających drugorzędowe elementy struktury i niewiele informacji 3D) do pseudoatomowych struktur 3D. Ilość i jakość informacji strukturalnych uzyskanych z wielowymiarowych eksperymentów SSNMR jest kluczem do obliczenia struktury NMR zespołu o wysokiej rozdzielczości.

Opisany protokół opiera się na wykryciu ¹³ograniczeń strukturalnych ^C-13C i ^{15 N-13}C, wymagających rejestracji kilku widm 2D (a czasami 3D) o wysokim stosunku sygnału do szumu. Przy umiarkowanych częstotliwościach MAS (<25 kHz) próbka jest wprowadzana do wirników o średnicy 3,2-4 mm, co pozwala na uzyskanie ilości białka do ~50 mg, w zależności od uwodnienia próbki. Ilość próbki wewnątrz wirnika jest wprost proporcjonalna do stosunku sygnału do szumu w widmach SSNMR, co jest decydującym czynnikiem dla wykrywania ograniczeń odległości dalekiego zasięgu i ich jednoznacznego przypisania.

Rozdzielczość spektralna jest kluczowym parametrem podczas sekwencyjnego przypisywania rezonansu i zbierania uwięzi. Aby uzyskać optymalne wyniki, należy zoptymalizować parametry przygotowania próbki, szczególnie w zakresie oczyszczania podjednostki i warunków montażu (pH, bufor, wstrząsanie, temperatura itp.). W celu optymalizacji próbki zaleca się przygotowanie nieoznakowanych próbek dla kilku różnych warunków, dla których zaobserwowano składanie, oraz zarejestrowanie widma 1D ^{1 H-13}C CP (opisanego w kroku 2.1) na każdej przygotowanej próbce. Widma służą do porównania rozdzielczości spektralnej i dyspersji między różnymi preparatami, na podstawie których można określić optymalne warunki.

Jakość danych SSNMR zależy w dużym stopniu od wyboru parametrów akwizycji NMR, zwłaszcza dla etapów transferu polaryzacji. Zastosowanie pola magnetycznego o wysokim natężeniu (częstotliwość ≥600 MHz ¹H) jest niezbędne do uzyskania wysokiej czułości i rozdzielczości spektralnej, wymaganych w przypadku złożonych obiektów, takich jak wielkocząsteczkowe zespoły białek.

Czynnikiem ograniczającym w wielu przypadkach jest dostępność spektrometru. W związku z tym rozsądny wybór próbek, które mają być przygotowane, powinien poprzedzać sesję spektrometru. W każdym razie, jednolicie ¹³C, ¹⁵N próbka jest warunkiem wstępnym do wykonania sekwencyjnego i wewnątrzresztkowego przypisania rezonansu. Dla białek przypisywanych technikami NMR w stanie stałym patrz⁷¹. Oznaczanie struktury zespołów makromolekularnych przy umiarkowanych częstotliwościach MAS wymaga selektywnie ¹³próbek znakowanych C; do wykrywania kontaktów dalekiego zasięgu ^{13 C-13}C i ^{13 C-15}N powszechnie stosuje się próbki oparte na 1,3-13 C- i ^2-13C-gylcerolu i/lub ^1-13C i ^2-13C-glukozie, jak opisano powyżej. Wybór między tymi dwoma schematami etykietowania opiera się na spektralnym stosunku sygnału do szumu i rozdzielczości. Aby rozróżnić wewnątrz- i międzycząsteczkowe kontakty dalekiego zasięgu, mieszane znakowane i rozcieńczone próbki okazały się skuteczne.

Krótko mówiąc, kluczowymi etapami atomowego badania strukturalnego SSNMR są: (i) przygotowanie podjednostek i montaż muszą być zoptymalizowane w celu uzyskania doskonałej ilości i jakości próbki, (ii) natężenie pola spektrometru i parametry akwizycji muszą być starannie dobrane; (iii) do określenia struktury 3D wymagane są strategie selektywnego etykietowania, a ilość wymaganych danych zależy od jakości danych i dostępności danych uzupełniających.

Pomimo możliwości zastosowania w szerokim zakresie układów supramolekularnych, od białek błonowych po homomultimeryczne nanoobiekty, SSNMR jest często ograniczony przez zapotrzebowanie na ilości mg materiału znakowanego izotopowo. Najnowsze osiągnięcia technologiczne w zakresie ultraszybkiego MAS (≥100 kHz) SSNMR otwierają drogę do NMR z detekcją ¹H i przesuwają granicę minimalnej ilości próbki do poziomu poniżej 72,73,74. Niemniej jednak, dla szczegółowych badań strukturalnych niezbędne jest ¹³próbek znakowanych C, co ogranicza zastosowanie SSNMR do próbek złożonych in vitro lub do systemów ulegających ekspresji w organizmach, które przeżywają na minimalnej pożywce, gdzie SSNMR w komórce jest nową metodą (przeglądy patrz 75,76,77,78).

Ważnym czynnikiem w zastosowaniu SSNMR do uzyskiwania struktur 3D o wysokiej rozdzielczości jest rozdzielczość spektralna: wewnętrzna niejednorodność konformacyjna w zespole może ograniczać rozdzielczość spektralną i analizę widm. Oznaczanie ¹³C specyficznych dla pozostałości może w niektórych przypadkach stanowić alternatywę dla uzyskania szczegółowych informacji o odległości od pozostałości strategicznych w celu uzyskania modeli strukturalnych (najnowsze przykłady znajdują się w ^79,80).

SSNMR do określania struktury 3D nadal wymaga zebrania kilku zestawów danych z często długim czasem zbierania danych na zaawansowanych instrumentach, w zależności od podejścia i systemu, od kilku dni do tygodni na spektrometrze 600-1000 MHz (częstotliwość ¹H). W związku z tym dostęp do czasu spektrometru może być czynnikiem ograniczającym w dogłębnym badaniu SSNMR.

W przypadku homomultimerycznych zespołów białkowych, prowadzących do uzyskania danych SSNMR o wystarczającej jakości, aby zidentyfikować dużą liczbę ograniczeń strukturalnych, takich jak w 3,57,64,70, SSNMR nadal nie daje dostępu do mikroskopijnych wymiarów. W związku z tym, w przypadku wyznaczania de novo struktury SSNMR zespołu homomultimerycznego, dane EM lub masa na długość (MPL) idealnie uzupełniają dane SSNMR w celu wyprowadzenia parametrów symetrii. Same dane SSNMR dostarczają atomowych interfejsów wewnątrz- i międzycząsteczkowych

SSNMR jest wysoce komplementarny z technikami strukturalnymi, takimi jak pomiary EM lub MPL, ale dane można również doskonale łączyć ze strukturami atomowymi uzyskanymi za pomocą krystalografii rentgenowskiej lub roztworu NMR na zmutowanych lub skróconych podjednostkach. W literaturze można znaleźć coraz więcej badań, w których połączenie różnych danych strukturalnych pozwoliło na wyznaczenie atomowych modeli 3D zespołów makromolekularnych (patrz rysunek 6 dla reprezentatywnych przykładów).

W dziedzinie biologii strukturalnej SSNMR jawi się jako obiecująca technika badania nierozpuszczalnych i niekrystalicznych zespołów na poziomie atomowym, tj. dostarczania danych strukturalnych w skali atomowej. Pod tym względem SSNMR jest pendantem do roztworu NMR i krystalografii rentgenowskiej dla zespołów molekularnych, w tym białek błonowych w ich naturalnym środowisku i zespołów białkowych, takich jak otoczki wirusowe, włókna bakteryjne lub amyloidy, a także RNA i kompleksy RNA-białko (patrz na przykład⁸¹). Jego wysoce wszechstronne zastosowania in vitro i w kontekście komórkowym, takie jak śledzenie drugorzędowych, trzeciorzędowych i czwartorzędowych zmian strukturalnych, identyfikacja powierzchni interakcji z cząsteczkami partnerskimi w skali atomowej (na przykład ⁸²) oraz mapowanie dynamiki molekularnej w kontekście złożonych kompleksów, wskazują na istotny potencjał SSNMR w przyszłych badaniach strukturalnych nad złożonymi zespołami biomolekularnymi.

Składnik	M9 średni
Zawartość NaCl	0,5 g/l
KH2PO4	3 g/l
Na2HPO4	6,7 g/l
MgSO4	1 mM
ZnCl2	10 μM
FeCl3	1 μM
CaCl2	100 μM
Mieszanka witamin MEM 100X	10 ml/l
13C-glukoza	2 g/l
15NH4Cl	1 g/L

Tabela 1: Skład minimalnej pożywki ekspresyjnej do produkcji rekombinowanych białek w komórkach E. coli BL21.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instruments
NMR Spectrometer (> 11,7 Tesli)		Głowica
	Wirniki Bruker-SSNMR
Wirówka Bruker		K1910
5804 R	Spektrometr Eppendorf	5805000629
GeneQuant 1300	Dutscher	28-9182-13
IGS60 INKUBATOR HERATHERM 75 L		Dutscher
MaxQ 4450	Dutscher	78376
Mieszadło rewolwerowe rurkowe	Dutscher	79547
sonopuls HD 3100	Bandelin	3680
Elektroporator MicroPulser	Biorad	165-2100
system tetrakomórkowy mini-PROTEAN	Biorad	165-8000
AKTA pure system	GE Healthcare	29-0182-24
pipeta kapilarna microman M25	Gilson	F148502
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Materiały
amiconR ultra-15	sigma	Z740199-8EA
kapilary i tłoki	Gilson
szpatułka	Fisher	13263799
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Reodczynniki
D-glucose 13C6	Sigma	389374
Chlorek amonu-15N	Sigma	299251
1,3 13C2 glicerol	Sigma	492639
2 13C glicerol	Sigma	489484
Kanamycyna	Sigma	K1876
Karbenicylina	Sigma	C3416
Fosforan sodu dwuzasadowy	Sigma	S7907
Fosforan potasu jednozasadowy	Sigma	P5655
Chlorek sodu	Sigma	71380
Chlorek wapnia	Sigma	C1016
Siarczan magnezu	Sigma	208094
Chlorek żelaza	Sigma	157740
Chlorek	Sigma	793523
MEM Roztwór witaminowy (100 razy;)	Sigma	M68954
IPTG	Fisher	BP1755
Podstawa Trizma	Sigma	T1503
Tricine	Sigma	T0377
SDS	Sigma	436143
azydek sodu	Sigma	71289
Kwas 4,4-dimetylo-4-silapentano-1-sulfonowy	Sigma	178837
Nazwa<	strong>Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Softwares
Unicorn 6.3	GE Healthcare		Akta systems
ccpNMR	CCPN		systemy spektrometryczne