Artykuł metodologiczny

Badania strukturalne układów makromolekularnych w skali atomowej za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego w ciele stałym

16.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55779

⸱

17 września 2017

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Chemistry, Biology of Membranes, Nanoobjects, UMR5248 CNRS, Université de Bordeaux

W tym artykule

Podsumowanie

Struktury supramolekularnych zespołów białkowych w rozdzielczości atomowej mają duże znaczenie ze względu na ich kluczowe role w różnych zjawiskach biologicznych. W niniejszym artykule przedstawiamy protokół do wykonywania wysokorozdzielczych badań strukturalnych nierozpuszczalnych i niekrystalicznych zespołów białek wielkocząsteczkowych za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego w stanie stałym z wirowaniem pod magicznym kątem (MAS SSNMR).

Streszczenie

Zespoły białek supramolekularnych odgrywają fundamentalne role w procesach biologicznych, począwszy od interakcji gospodarz-patogen, poprzez infekcję wirusową, aż po rozprzestrzenianie się chorób neurodegeneracyjnych. Takie zespoły składają się z wielu podjednostek białkowych zorganizowanych w sposób niekowalencyjny, tworząc duże obiekty makromolekularne, które mogą wykonywać różne funkcje komórkowe lub powodować szkodliwe konsekwencje. Wgląd atomowy w mechanizmy składania i funkcjonowanie tych zespołów makromolekularnych pozostaje często rzadki, ponieważ ich nieodłączna nierozpuszczalność i niekrystaliczność często drastycznie obniżają jakość danych uzyskanych z większości technik stosowanych w biologii strukturalnej, takich jak krystalografia rentgenowska i roztwór magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR). Przedstawiamy tutaj spektroskopię NMR w ciele stałym z wirowaniem pod magicznym kątem (SSNMR) jako potężną metodę badania struktur zespołów makromolekularnych w rozdzielczości atomowej. SSNMR może ujawnić szczegóły atomowe na złożonym kompleksie bez ograniczeń rozmiaru i rozpuszczalności. Przedstawiony tutaj protokół opisuje podstawowe etapy od produkcji wielkocząsteczkowych zespołów białek znakowanych izotopem 13C/15N do uzyskania standardowych widm SSNMR oraz ich analizy i interpretacji. Jako przykład pokazujemy przebieg analizy strukturalnej SSNMR zespołu białek nitkowatych.

Wprowadzenie

Postępy w spektroskopii stanu stałego magnetycznego rezonansu jądrowego (SSNMR) z wykorzystaniem wirowania pod kątem magicznym stanowią wydajne narzędzie do charakterystyki strukturalnej makromolekularnych kompleksów białkowych w rozdzielczości atomowej. Kompleksy białkowe te są powszechnymi systemami, które pełnią kluczowe role w wielu procesach biologicznych. Ich struktury molekularne, oddziaływania i dynamika są dostępne dzięki badaniom SSNMR, co wykazano w przypadku mechanizmów infekcji wirusowych (kapsydy1) i bakteryjnych (systemy wydzielnicze2,3, pili4), kompleksów białek błonowych5,6,7,8 oraz funkcjonalnych amyloidów 9,10,1. Ten typ organizacji molekularnej może również wywoływać patologie, na przykład w chorobach neurodegeneracyjnych, gdzie białka łączą się w błędnie sfałdowane stany amyloidowe, co prowadzi do aberrantnego zachowania komórek lub ich śmierci 12,13. Kompleksy białkowe są często tworzone poprzez symetryczną oligomeryzację wielu kopii podjednostek białkowych w duże obiekty supramolekularne o różnych kształtach, w tym włókna, filamenty, pory, rurki lub nanocząsteczki. Architektura czwartorzędowa jest definiowana przez słabe oddziaływania między podjednostkami białkowymi, które organizują składanie w czasie i przestrzeni oraz umożliwiają zaawansowane funkcje biologiczne. Badania strukturalne tych kompleksów w skali atomowej stanowią wyzwanie dla technik wysokiej rozdzielczości, ponieważ ich immanentna nierozpuszczalność, a bardzo często brak krystaliczności, ograniczają zastosowanie konwencjonalnej krystalografii rentgenowskiej lub metod NMR w roztworach. SSNMR z wirowaniem pod kątem magicznym (MAS) jest rozwijającą się techniką pozwalającą na uzyskanie danych o rozdzielczości atomowej dla nierozpuszczalnych kompleksów makromolekularnych i udowodniła swoją skuteczność w wyznaczaniu trójwymiarowych modeli atomowych dla coraz większej liczby złożonych systemów biomolekularnych, w tym bakteryjnych filamentów, kompleksów amyloidowych i cząstek wirusowych 14,15,16,17,18,19,20,21,2. Postępy techniczne w zakresie wysokich pól magnetycznych, rozwój metodologiczny oraz przygotowanie próbek uczyniły z MAS SSNMR solidną metodę badania nierozpuszczalnych białek w różnych środowiskach, zwłaszcza w ich biologicznie istotnym stanie zorganizowanym w makromolekuły lub w błonach komórkowych, co czyni tę technikę wysoce komplementarną względem krio-mikroskopii elektronowej. W wielu przypadkach kompleksy białkowe charakteryzują się bardzo wysokim stopniem symetrii. MAS SSNMR wykorzystuje tę cechę, ponieważ wszystkie podjednostki białkowe w kompleksie homomolekularnym mają taką samą strukturę lokalną, a zatem praktycznie identyczną sygnaturę SSNMR, co drastycznie zmniejsza złożoność analizy.

W niniejszym filmie przedstawiono wydajny protokół badań strukturalnych makcząsteczkowych kompleksów białkowych przy użyciu SSNMR z umiarkowanym MAS (<25 kHz), który można podzielić na kilka etapów (Rycina 1). Zademonstrujemy krytyczne etapy procesu badawczego struktury SSNMR na przykładzie włóknistego kompleksu białkowego (patrz wyróżnione kroki na Rycynie 1), z wyłączeniem oczyszczania podjednostek białkowych, które różni się dla każdego kompleksu białkowego, lecz ma kluczowe znaczenie dla badań strukturalnych, oraz bez zagłębiania się w szczegóły techniczne i metodologiczne spektroskopii SSNMR i obliczeń strukturalnych, do których dostępne są w sieci specjalistyczne tutoriale. Choć obecny protokół będzie koncentrował się przede wszystkim na eksperymentach NMR w stanie stałym przeprowadzanych w warunkach MAS, zastosowanie uporządkowanych środowisk biologicznych 23,24,25,26,27, takich jak uporządkowane bicele, umożliwia badanie konformacji białek i dynamicznych oddziaływań białko-białko w mediach przypominających błony bez użycia technologii MAS. Przedstawimy etapy ekspresji i składania białek, a także rejestrację kluczowych widm SSNMR oraz ich analizę i interpretację. Naszym celem jest przybliżenie przebiegu analizy strukturalnej, umożliwiając czytelnikowi przeprowadzenie badania struktury kompleksu makcząsteczkowego w rozdzielczości atomowej przy użyciu technik SSNMR.

Protokół obejmuje 3 sekcje:

1. Przygotowanie próbek do NMR w stanie ciało

Jako warunek wstępny do analizy NMR w stanie stałym, komponenty białkowe kompleksu makromolekularnego muszą zostać wyekspresowane, znakowane izotopowo, oczyszczone i zmontowane in vitro w stan kompleksu zbliżony do natywnego (przykład przedstawiono na Rysunku 2). Aby zapewnić wysoką czułość NMR, wymagane jest wzbogacenie izotopowe w znakowaniu 13C i 15N poprzez zastosowanie minimalnych pożywek do ekspresji bakteryjnej uzupełnionych o źródła 13C i 15N, takie jak odpowiednio jednorodnie znakowana 13C glukoza/glicerol oraz 15NH4Cl. Na późniejszym etapie protokołu, w celu ułatwienia analizy NMR, stosowane są próbki selektywnie znakowane 13C, otrzymane z selektywnie znakowanych źródeł 13C, takich jak (1,3-13C)- i (2-13C)-glicerol (lub (1-13C)- i (2-13C)-glukoza). W celu opisania detekcji oddziaływań międzycząsteczkowych wprowadzono próbki o mieszanym znakowaniu, odpowiadające ekvimolarnym mieszaninom albo 50% znakowanej 15N i 50% znakowanej 13C, albo 50% (1,3-13C)- i 50% (2-13C)-glukozy. Wysoki stopień czystości białka oraz rygorystyczne warunki podczas etapu montażu są kluczowymi czynnikami zapewniającymi jednorodny uporządkowanie strukturalne końcowej próbki.

2. Wstępna charakterystyka strukturalna w oparciu o jednowymiarowy (1D) NMR w stanie ciało

Przedstawiamy kluczowe eksperymenty służące do analizy strukturalnej za pomocą SSNMR. Jednowymiarowe (1D) eksperymenty polaryzacji krzyżowej (CP) oraz INEPT / RINEPT28, z detekcją jąder 13C, są wykorzystywane odpowiednio do wykrywania sztywnych i elastycznych segmentów białek w kompleksie oraz do oszacowania stopnia homogeniczności strukturalnej i polimorfizmu lokalnego (przykład znajduje się na Rysunku 3).

3. Analiza konformacyjna i wyznaczanie struktury 3D

Podrozdziały 1 i 2 dotyczą analizy konformacyjnej, która opiera się na przypisaniu rezonansów SSNMR dla wszystkich sztywnych reszt kompleksu białkowego, ponieważ przesunięcia chemiczne są bardzo czułymi sondami środowiska lokalnego i mogą być wykorzystane do przewidywania kątów dihedralnych phi/psi, a tym samym do określenia struktury drugorzędowej. Rysunek 4 przedstawia przykład sekwencyjnego przypisania rezonansów w sztywnym rdzeniu kompleksu białkowego. Wyznaczenie struktury 3D opiera się na gromadzeniu danych strukturalnych, takich jak ograniczenia odległości kodujące bliskie sąsiedztwo (<7 - 9 Å), zawierających informacje zarówno wewnątrzcząsteczkowe, jak i międzycząsteczkowe. Podrozdziały 3 i 4 opisują gromadzenie i interpretację dalekozasięgowych ograniczeń odległości. Kontakty dalekozasięgowe definiuje się jako wewnątrzcząsteczkowe sąsiedztwa 13C-13C powstające między resztą i a j, gdzie |i-j| ≥4, co definiuje trzeciorzędowe sfałdowanie białka podjednostki monomeru, lub jako międzycząsteczkowe sąsiedztwa 13C-13C, definiujące interfejsy międzycząsteczkowe pomiędzy podjednostkami białkowymi w kompleksie. Interfejsy wewnątrz- i międzycząsteczkowe przedstawiono na Rysunku 5. Ograniczenia SSNMR wykrywane w eksperymentach re-sprzęgania 13C-13C oraz 15N-13C zazwyczaj kodują odległości międzyjądrowe < 1 nm. Podrozdział 4 wyjaśnia wykrywanie międzycząsteczkowych ograniczeń odległości. W symetrycznych kompleksach białkowych zastosowanie próbek homogenicznie znakowanych (tj. 10% jednolicie lub selektywnie znakowanych) do identyfikacji międzycząsteczkowych oddziaływań podjednostka-podjednostka jest ograniczone, ponieważ zarówno kontakty wewnątrz-, jak i międzycząsteczkowe prowadzą do wykrywalnych sygnałów. Jednoznaczne wykrywanie sąsiedztw międzycząsteczkowych osiąga się poprzez zastosowanie próbek mieszanych, zawierających ekvimolarną mieszaninę dwóch próbek różnie znakowanych, połączonych przed agregacją. Podrozdział 5 krótko wprowadza w zagadnienie modelowania struktury.

Ekspresja białka znakowanego, montaż in vitro, NMR w stanie stałym; schemat analizy struktury białka.
Rysunek 1: Przebieg badania strukturalnego o rozdzielczości atomowej z wykorzystaniem NMR w stanie stałym.13C, 15Przedstawiono produkcję białka znakowanego izotopem N, oczyszczanie podjednostek, składanie podjednostek, kontrolę formowania kompleksów, eksperymenty SSNMR, analizę eksperymentów SSNMR i wyznaczanie ograniczeń odległości oraz modelowanie struktury. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Protokół

1. Przygotowanie próbek do NMR w stanie stałym

  1. Produkcja jednorodnie znakowanych 13C/ 15N podjednostek białkowych
    1. Należy użyć świeżo transformowanych komórek E. coli BL21 (DE3) zawierających plazmid pET24-peptide-6his, pobierając je z przygotowanej płytki agarowej.
    2. Zaszczepić jedną kolonię do 15 mL prekultury w podgrzanym medium LB. Inkubować w temperaturze 37 °C przy wstrząsaniu z prędkością 20 rpm przez noc.
    3. Przenieść prekulturę do 1 L głównej kultury w podgrzanym medium M9 (skład podano w Tabeli 1), zawierającym wymagane znakowane izotopowo źródła węgla i azotu.
      UWAGA: Może to być jednorodnie znakowana 13C glukoza, selektywnie znakowana (1-13C)- lub (2-13C)-glukoza 29,30,31 lub (1,3-13C)- lub (2-13C)-znakowany glicerol32,3.
    4. Inkubować w temperaturze 37 °C i zmierzyć OD60, gdy tylko kultura stanie się mętna. Po osiągnięciu wartości OD60 równej 0,8 indukować ekspresję białka za pomocą 0,75 mM IPTG przez 4 h.
      UWAGA: Optymalne warunki indukcji mogą różnić się w zależności od białka.
    5. Odzyskać komórki poprzez wirowanie przez 30 min przy 60 x g i w temperaturze 4 °C.
  2. Schemat oczyszczania (niewidoczny w protokole wideo)
    1. Zlizować komórki, stosując standardowe techniki, takie jak sonikacja lub traktowanie lizozymem, a następnie oczyścić podjednostkę białkową za pomocą technik ustalonych lub dostosowanych do badanego kompleksu białkowego.
      UWAGA: Białko może być wyrażane w ciałkach inkluzyjnych; lokalizację białka należy sprawdzić poprzez lizę komórek i następujące po niej wirowanie. Jeśli białko znajduje się w osadzie wraz z detrytusem komórkowym, oznacza to, że zgromadziło się w ciałkach inkluzyjnych.
    2. Sprawdzić ekspresję i czystość próbki białka, na przykład za pomocą standardowej elektroforezy SDS-PAGE 12-15% Tris-Tricine, patrz Rycina 2A. Jeśli czystość jest wystarczająca, białko można poddać montażowi, w przeciwnym razie należy przeprowadzić dodatkowy etap oczyszczania.
  3. Montaż włókien białkowych in vitro
    1. Sprawdzić stężenie białka w oczyszczonym roztworze. Jeśli białko zawiera reszty absorbujące, zmierzyć absorpcję w spektrofotometrze UV przy 280 nm. Wprowadzić czysty bufor do spektrofotometru w celu kalibracji, a następnie zmierzyć absorbancję białka.
    2. Obliczyć stężenie białka, korzystając ze współczynnika absorpcji podjednostki białkowej zgodnie z dostosowanym prawem Beer-Lambert: Aλ=ελ x l x c; gdzie A to gęstość optyczna przy danej długości fali λ; ε to właściwy współczynnik absorpcji; l to długość drogi optycznej w cm; c to stężenie w mol/L.
    3. Skoncentrować białko do stężenia 1 mM w jednostce filtra wirowarkowego. Wprowadzić próbkę do jednostki filtra wirowarkowego i wirować przy 400 x g przez 30 min, delikatnie mieszając roztwór w jednostce filtra pipetą, aby uniknąć osadzania się białka na filtrze. Powtarzać procedurę do osiągnięcia pożądanego stężenia.
      UWAGA: Optymalne stężenie montażu zależy od systemu i wymaga optymalizacji (zazwyczaj między 0,1 - 1 mM). Jeśli przygotowywana jest ekvimolarna mieszana próbka znakowana z dwóch różnych partii znakowanego białka (np. (50/50) (U-15N)-/(U-13C)-znakowana), mieszanie musi nastąpić przed lub bezpośrednio po etapie koncentracji, aby zapewnić homogenizację zmieszanego roztworu.
    4. Przenieść próbkę do probówki i inkubować pod stałym mieszaniem przez jeden tydzień w temperaturze pokojowej.
    5. Zazwyczaj polimeryzacji podjednostek w włókna towarzyszy zmętnienie roztworu. Sprawdzić morfologię i homogeniczność włókien, na przykład za pomocą mikroskopii elektronowej (powiększenie 6300X - 4500X), patrz Rycina 2B.
    6. Wirować próbkę przez 1 h przy 20 x g i w temperaturze 4 °C. Usunąć większość supernatantu, pozostawiając tylko tyle cieczy, aby przykryć powierzchnię i zapobiec wyschnięciu próbki. Sprawdzić obecność niezmontowanych podjednostek w supernatancie za pomocą spektrofotometru UV.
    7. Przemyć próbkę, dodając H2O i ostrożnie resuspender zawartość pipetą. Nie używać vortexa. Wirować próbkę przez 30 min przy 20 x g i w temperaturze 4 °C. Powtórzyć etap płukania 3 razy. Podczas wszystkich etapów płukania sprawdzać, czy osad zachowuje swój wygląd po wirowaniu oraz kontrolować obecność niezmontowanych podjednostek w supernatancie w spektrofotometrze UV.
    8. Dodać 0,02% (w/v) azotku sodu (NaN3), aby uniknąć kontaminacji bakteryjnej, i przechowywać próbkę do czasu pomiaru w temperaturze 4 °C.
  4. Napełnianie rotora do NMR w fazie stałej
    1. Wirować dwukrotnie przez 30 min przy 20 x g i w temperaturze 4 °C. Usunąć maksymalną ilość supernatantu; końcowa konsystencja próbki zależy od montażu białka i zazwyczaj jest to osad o strukturze żelu.
    2. Użyć pipety kapilarnej, aby wprowadzić próbkę do rotora SSNMR.
      UWAGA: W tym miejscu prezentujemy procedurę dla rotora o średnicy 4 mm.
      1. Wirować rotor w wirówce stołowej, aby delikatnie wprowadzić próbkę do wnętrza. Powtarzać procedurę aż do całkowitego zapełnienia rotora. Pozostawić minimalną przestrzeń niezbędną do zamknięcia rotora nakrętką. Jeśli ilość próbki jest niewystarczająca, wprowadzić dostępny w handlu wkład, aby wypełnić pozostałą przestrzeń i zapewnić homogeniczność rozkładu próbki w rotorze.
        UWAGA: W zależności od konsystencji zmontowanej próbki, bardziej odpowiednie może być użycie ciennej szpatułki, szczególnie w przypadku próbek bardzo gęstych. Rotory o średnicach od 2,5 do 4 mm są stosowane przy umiarkowanych częstotliwościach MAS.
    3. Dodać śladowe ilości kwasu 4,4-dimetylu-4-silapentano-1-sulfonowego (DSS) w celu kalibracji przesunięcia chemicznego i temperatury.
    4. Zamknąć nakrętkę za pomocą urządzenia zamykającego.
    5. Sprawdzić pod powiększeniem, czy nakrętka została prawidłowo włożona i całkowicie zamknięta.

Elektroforeza żelowa SDS-PAGE, prążki białkowe, obraz EM włókien, skala 0,5 µm.
Rysunek 2Reprezentatywne wyniki oczyszczania i składania podjednostek białkowych. A) 15% SDS-PAGE w buforze Tris-tricyna podjednostek białkowych (w tym His6-tag) na różnych etapach oczyszczania. Ścieżka 1 – marker masy cząsteczkowej białek; ścieżka 2 – E. coli kontrolny zestaw nieindukowanych komórek BL21 (DE3); ścieżka 3 - *E. coli* komórki BL21 (DE3) indukowane 0,75 mM IPTG; ścieżka 4 – solubilizowane ciałka inkluzyjne; ścieżka 5 – frakcje nadsączu lizatu komórkowego; ścieżka 6 – frakcja oczyszczona po chromatografii powinowactwa do zimmobilizowanych jonów metali (IMAC) w systemie FPLC i odsoleniu. B) Włókna białkowe barwione negatywnie w obrazowaniu TEM. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

2. Wstępna charakterystyka strukturalna w oparciu o jednowymiarowe (1D) NMR w stanie ciałym

  1. Wstępna konfiguracja i jednowymiarowa polaryzacja krzyżowa (CP)
    1. Wprowadź rotor do magnesu NMR
    2. Rozpocznij wirowanie rotora z częstotliwością 5 kHz i poczekaj na stabilizację w zakresie ±10 Hz, a następnie przyspiesz do 7 kHz. Dostrój i dopasuj kanały 1H, 13C i 15N. Ustaw temperaturę w zakresie 2-10 °C (275-283 K); nagrzewanie próbki przy MAS 7 kHz jest niewielkie i regulacja temperatury przy tej częstotliwości MAS zazwyczaj nie jest wymagana.
    3. Zarejestruj jednowymiarowe widmo 1H z pojedynczym impulsem, stosując 16 skanów.
      UWAGA: Poziomy mocy muszą zostać wcześniej zoptymalizowane na związku referencyjnym (takim jak 13C/15N histydyna lub glicyna), aby dostarczyć wartości początkowe do optymalizacji poziomów mocy w eksperymentach na próbce docelowej; procedura ta jest rutynowym zadaniem i dlatego wykracza poza zakres niniejszego protokołu.
    4. Utrzymuj temperaturę podczas wszystkich eksperymentów w zakresie 2-10 °C; w próbkach uwodnionych temperatura odzwierciedlona jest w relatywnym przesunięciu rezonansu 1H wody objętościowej względem sygnału DSS34. Mierz temperaturę zgodnie z zależnością δ(H2O) = 7.83- T/96.9 z dokładnością 1 - 2 °C35.
    5. Ustaw pożądaną częstotliwość MAS i poczekaj na stabilizację w zakresie ±10 Hz.
      UWAGA: Tutaj zademonstrowano to dla częstotliwości 1 kHz.
    6. Ponownie dostrój i dopasuj kanały 1H oraz 13C i skoryguj temperaturę za pomocą eksperymentu 1D 1H.
    7. Skonfiguruj jednowymiarowy eksperyment 1H-13C CP36.
      UWAGA: Eksperymenty CP wykazują sygnały pochodzące z reszt w konformacji sztywnej. Kalibrację impulsów i parametry rozsprzęgania można zoptymalizować bezpośrednio na próbce, gdy czułość jest wystarczająco wysoka, aby zaobserwować sygnały po mniej niż ~32 skanach. Początkowe wartości optymalizacji są przejęte ze standardowej optymalizacji na związku referencyjnym. Czas kontaktu CP i poziomy mocy dobiera się na podstawie maksymalnej intensywności sygnału. W próbkach białkowych optymalny czas kontaktu CP wynosi zazwyczaj od 20 µs do 2 ms. Parametry rozsprzęgania powinny zostać również ponownie dostosowane na podstawie kalibracji na związku referencyjnym.
      1. Uważnie obserwuj lokalizację pasm bocznych wirowania przy danej częstotliwości MAS.
    8. Zarejestruj referencyjne widmo 1D 13C CP, które służy jako jednowymiarowy odcisk palca widma. Typowe parametry to 128 skanów, czas kontaktu CP 1 ms, siła rozsprzęgania 10 kHz, opóźnienie recyklingu 3 s oraz czas akwizycji 25 ms.
    9. Skalibruj przesunięcia chemiczne 1H i 13C zgodnie z zaleceniami IUPAC37. Wyznacz częstotliwość rezonansową sygnału 1H DSS (przesunięcie chemiczne 0 ppm); przesunięcia chemiczne 13C są odnoszone do przesunięć 1H (zazwyczaj ~0.2514, wyliczane z stosunku częstotliwości rezonansowej 13C do częstotliwości 1H37).
    10. Przetwórz eksperyment 1D 1H-13C CP bez funkcji apodyzacji (patrz Rysunek 3A i B w przypadku detekcji w homogenicznie dobrze uporządkowanym kompleksie białkowym). Wybierz izolowany pik, aby oszacować szerokość linii w próbce, co jest wskaźnikiem uporządkowania strukturalnego i homogeniczności. Typowe szerokości linii 13C dla dobrze uporządkowanych biologicznych kompleksów białkowych w warunkach MAS przy wysokich polach magnetycznych mieszczą się w zakresie 20 - 150 Hz (mierzone jako pełna szerokość połówki maksymalnej (FWHH)).
    11. Oszacuj stosunek sygnału do szumu (S/N) w widmie CP.
      UWAGA: Stosunek S/N zależy od wielu czynników, w tym głównie od ilości próbki w rotorze, stopnia sztywności struktury białka oraz obecności pojedynczej konformacji molekularnej. Przyjmując ogólną zasadę, próbka powinna być odpowiednia do wielowymiarowej spektroskopii SSNMR, jeśli sygnał jest obserwowany w zoptymalizowanym widmie 1D 1H-13C CP zarejestrowanym przy 64 skanach.
    12. Powiększ obszar widma rezonansów grup karbonylowych szkieletu białkowego (głównie) zlokalizowanych między 165 - 180 ppm. Oszacuj zawartość struktury drugorzędowej w kompleksie na podstawie położenia rezonansów grup karbonylowych szkieletu białkowego, gdzie rezonanse z reszt w konformacji α-helikalnej lub β-kartki są przesunięte odpowiednio w stronę pól słabszych (downfield) lub silniejszych (upfield) (patrz Rysunek 3B dla podjednostki głównie α-helikalnej)38.
  2. Eksperyment 1D INEPT
    1. Skonfiguruj eksperyment 1D 1H-13C INEPT, aby zbadać wysoce mobilne części (sub-µs) kompleksu białkowego.
      UWAGA: Powszechnie stosuje się rozsprzęganie GARP o wartości kilku kHz podczas akwizycji39, aby umożliwić krótkie opóźnienia między skanami (typowo 1 s) bez uszkodzenia sondy.
    2. Zarejestruj referencyjne widmo INEPT, które służy jako odcisk palca dla mobilnych segmentów białka; typowe parametry to 128 skanów i czas akwizycji 25 ms.
    3. Przetwórz eksperyment 1H-13C INEPT. Liczba i położenie sygnałów są odpowiednio wskaźnikami liczby mobilnych reszt oraz składu aminokwasowego.
      UWAGA: Zarejestruj również eksperyment 2D 1H-13C INEPT, jeśli w widmie 1D INEPT obecne są sygnały (patrz Rysunek 3C jako przykład), aby umożliwić bardziej specyficzną identyfikację aminokwasów. W przypadkach niejednoznacznego przyporządkowania zalecamy sprawdzenie pozycji sygnałów składników buforu za pomocą NMR w roztworze.
    4. Skorzystaj z bazy danych BMRB40 oraz opublikowanych danych38, aby przypisać rezonanse do odpowiadających im aminokwasów w konformacji zbliżonej do losowego kłobka (random coil); widmo zawiera jedynie mobilne składniki buforu, jeśli żadne z reszt nie znajduje się w reżimie wysokiej mobilności.

Wykresy z spektroskopii NMR przedstawiające dane w dziedzinie czasu i w dziedzinie częstotliwości dla analizy węgla-13.
Rysunek 3Reprezentatywne wyniki akwizycji widm SSNMR dla dobrze ustrukturyzowanego kompleksu białkowego. A) 13FID z detekcją węgla dla 1H-13C eksperyment polaryzacji krzyżowej. B) 1H-13eksperyment przekroczenia polaryzacji C. C) 1H-13eksperyment C INEPT sztywnego kompleksu białkowego; widoczne są tylko składniki buforu. Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

3. Analiza konformacyjna i wyznaczenie struktury 3D

  1. Sekwencyjne przypisanie rezonansów
    1. Przygotowanie układu 2D 13C-13protonowo-napędzana dyfuzja spinowa (PDSD)41 eksperyment w celu wykrycia wewnątrzresztowej 13C-13korelacje C, w tym łańcuchów bocznych. Przyjmij wartości dla stanu początkowego 1H-13Krok polaryzacji krzyżowej C z widma 1D 1H-13Eksperyment C CP.
      1. Ustaw czas mieszania na 50 ms w celu uzyskania jednorodności 13próbki znakowane węglem i do 10 ms w celu selektywnego 13próbki znakowane C. Ustaw czas akwizycji pośredniej w zakresie od 5 do 25 ms, a czas akwizycji bezpośredniej w zakresie od 15 do 25 ms, w zależności od wewnętrznej rozdzielczości widmowej, którą można oszacować na podstawie widocznego sygnału w długości swobodnego zaniku indukcji (FID) (przykład w Rysunek 3A).
      2. Przetestuj kilka parametrów przetwarzania, aby znaleźć optymalne wartości w odniesieniu do stosunku sygnału do szumu oraz rozdzielczości widma; zazwyczaj odpowiednie przetwarzanie można osiągnąć, stosując funkcję okna qsine z przesunięciem dzwonu sinusoidalnego (SSB) wynoszącym 2,5–4.
    2. Konfiguracja, rejestracja i przetwarzanie obrazu 2D 13C-13Eksperyment C PDSD z pośrednim czasem mieszania w celu wykrycia sekwencyjnej 13C-13Korelacje C łączące głównie reszty i – i±1, ale także i±2 i±3, w zależności od sztywności szkieletu białkowego i elementów struktury drugorzędowej. Czas mieszania dla próbek z jednorodnym znakowaniem należy ustawić w zakresie 10–20 ms. Wszystkie pozostałe wartości można przenieść z eksperymentu 2D z krótkim czasem mieszania. 13C-13C PDSD.
    3. Konfiguracja, rejestracja i przetwarzanie obrazu 2D 15N-13C NiCAi oraz NiTlenek węglai eksperyment z wykorzystaniem CP 1H-15N oraz specyficzne CP 15N-13transfer C42Zoptymalizować 15N-13Transfer polaryzacji C w sposób jednowymiarowy bezpośrednio na próbce badaną, w oparciu o maksymalną intensywność odpowiednio w obszarze CA lub grupy karbonylowej. Typowe wartości specyficznego czasu kontaktu CP mieszczą się w zakresie 2–6 ms.
    4. Przygotowanie, rejestracja i przetwarzanie serii obrazów 2D 15N-(13C-)13Eksperymenty w języku C na potrzeby zadania.
      Uwaga: Pierwszy 15N-13Wartość parametru transferu polaryzacji C można przejąć z NiCAi / NiCOi eksperymentów. Korelacje w obrębie pojedynczego pozostałości ustalono na podstawie Ni(CAi)CBi oraz Ni(CAi)COiz wykorzystaniem odpowiednio DREAM43 oraz PDSD 13C-13Przeniesienia polaryzacji C. Sekwencyjna łączność między resztą (i) a resztą (i-1) jest uzyskiwana z Ni(COi-1)CAi-1 oraz Ni(COi-1)CXi-1 eksperymenty, zarówno z wykorzystaniem PDSD 13C-13Transfer polaryzacji węgla C.
    5. Wybierz program do analizy NMR, taki jak CcpNmr Analysis44 lub SPARKY45
    6. Wczytaj widma 2D do oprogramowania (na przykładzie CcpNmr analysis) oraz wczytaj sekwencję pierwotną białka.
    7. Rozpocznij od identyfikacji typów aminokwasów widocznych w krótkim mieszaniu 13C-13Widmo C PDSD. Połącz atomy węgla układów spinowych, aby umożliwić przypisanie specyficzne dla „typu reszty”; patrz Rysunek 4A w celu przypisania reszty treoniny. Należy zidentyfikować jak najwięcej reszt; będzie to zależeć od rozmiaru podjednostki białkowej, rozdzielczości widmowej oraz dyspersji.
    8. Nałóż mieszanie krótkie na mieszanie pośrednie 13C-13Widmo C PDSD.
      UWAGA: dodatkowe piki widoczne w PDSD przy pośrednim mieszaniu wynikają głównie z kontaktów sekwencyjnych (pozostałość i – pozostałość i±1). Przykład przypisania sekwencyjnego dla dwóch pozostałości przedstawiono w Rysunek 4B.
      1. Oznacz piki rezonansowe układu spinowego i znajdź korelacje w PDSD z mieszaniem pośrednim z częstotliwościami rezonansowymi innych układów spinowych. W przypadku małych białek lub peptydów możliwe może być przeprowadzenie pełnego sekwencyjnego przypisania rezonansów na podstawie widm 2D 13C-13Eksperymenty PDSD.
        UWAGA: W motywach struktur drugorzędowych typu beta-kartka reszta i – reszta i±2 13C-13Kontakty typu C mogą wykazywać silniejsze sygnały niż kontakty sekwencyjne ze względu na ich bliskość w przestrzeni; w motywach struktur drugorzędowych typu alfa-helisa są to kontakty między resztą i a resztą i±3 13C-13Kontakty typu C mogą również prowadzić do powstania intensywnych sygnałów.
    9. Jeśli eksperymenty PDSD z mieszaniem pośrednim w warunkach selektywnego 13Dostępne są próbki znakowane C, nałóż je na widmo krótkiego mieszania (jeśli jest dostępne w opcji selektywnej) 13próbkę znakowaną węglem C) i przypisać dodatkowe piki, biorąc pod uwagę selektywność 13wzór znakowania C (1,3-13C i 2-13glicerol C32,33 lub 1-13C i 213glukoza C29,30,31.
      UWAGA: Na przykład w przypadku 2-13W próbce znakowanej węglem w glicerolu znakowanych jest kilka typów aminokwasów w pozycji Cα, bez znakowania sąsiednich węgli (Cβ i C'), co sprzyja transferowi Cα-Cα między sąsiednimi resztami. W próbkach selektywnie znakowanych, dalekozasięgowe 13C-13Korelacje C mogą narastać już w fazie mieszania pośredniego 13C-13eksperymenty C PDSD. Jeśli piku nie można wyjaśnić korelacją sekwencyjną, może on wynikać z kontaktu dalekosiężnego. W przypadku wysoko uporządkowanych, jednorodnych struktur podjednostek w kompleksie makromolekularnym, w widmach oczekiwane jest widoczność tylko jednego zestawu rezonansów. Jeśli widoczne są podwojone (lub dalej zwielokrotnione) rezonanse dla 13istnieją dwie (lub więcej) konformacje odpowiednio dla atomu C lub fragmentu szkieletu białkowego w obrębie kompleksu.
    10. Użyj widma 2D NCA zawierającego sygnały wewnątrzresztkowe 15N-13korelacje Cα w celu identyfikacji 15częstotliwości rezonansowe N dla każdego resztu. Jeśli rozdzielczość w 13Wymiar C jest niewystarczający; należy wykorzystać informacje uzupełniające dotyczące rezonansu Cβ w 2D NCACB w celu identyfikacji wewnątrzresztowej 15Częstotliwość rezonansowa N.
    11. Należy wykorzystać widma 2D NCACB i NCACO zawierające korelacje wewnątrzresztkowe 15N-13C-13korelacje C w celu (i) zidentyfikowania wewnątrzreszdukowych 15częstotliwość N i (ii) w celu rozstrzygnięcia niejednoznaczności w 13C-13C PDSD z pomocą dodatkowego 15wymiar N. Inwersja sygnału wynikająca z transferu DREAM prowadzi do obserwacji typowych korelacji Cα-Cβ, w których sygnał Cα jest dodatni, a sygnał Cβ ujemny. Dalsze łańcuchy boczne 13C, jeśli są widoczne w widmie, ponownie wykazują wynik dodatni.

Wykres widm 2D NMR, analiza korelacji przesunięć chemicznych, 13C, mapowanie oddziaływań.
Rycina 4dwuwymiarowy 13C- 13eksperymenty C SSNMR PDSD na uporządkowanej, jednorodnie 13C, 15Montaż białka znakowanego azotem. A) PDSD z krótkim czasem mieszania (czas mieszania 50 ms). B) Przypisanie odcinka składającego się z 2 reszt Ile32 – Thr3 z wykorzystaniem nałożenia widm PDSD z krótkim czasem mieszania i PDSD z długim czasem mieszania (czas mieszania 20 ms). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

  1. Wyznaczanie struktury drugorzędowej
    1. Wykorzystaj wartości przesunięć chemicznych 13Cα i 13Cβ do obliczenia drugorzędowego przesunięcia chemicznego 46ΔδCα-ΔδCβ, które wskazuje na strukturę drugorzędową. Oblicz różnice 13Cα(przypisane)-13Cα(random coil) oraz 13Cβ(przypisane)-13Cβ(random coil).
      UWAGA: Wartości przesunięć chemicznych dla reszt w konformacji kłębka statystycznego (random coil) można uzyskać z 38.
      1. Przedstaw ΔδCα-ΔδCβ na wykresie; wartości ujemne lub dodatnie dla > 3 kolejnych reszt wskazują odpowiednio na konformację pasm β lub helisy α; reszty glicyny i proliny mogą wykazywać nietypowe wartości przesunięć chemicznych, ponieważ często pełnią rolę „łamaczy struktury drugorzędowej”.
    2. Przewiduj kąty dihedralne białka na podstawie przypisanych przesunięć chemicznych, używając programów TALOS+47,48 lub PREDITOR49,50. Przewidziane kąty dihedralne Phi/Psi odzwierciedlają strukturę drugorzędową podjednostki białkowej i są wykorzystywane jako więzy strukturalne w całym procesie modelowania.
  2. Gromadzenie więzów strukturalnych
    1. Przygotuj i zarejestruj eksperyment 2D 13C-13C PDSD z długim czasem mieszania w celu wykrycia dalekozasięgowych korelacji 13C-13C. Typowe czasy mieszania wynoszą od 40 ms do 1 s. Używaj próbek selektywnie znakowanych 13C, ponieważ rozcieńczenie spinowe znacznie poprawia transfer polaryzacji między odległymi atomami węgla.
    2. Nałóż spektrum 2D 13C-13C PDSD z długim czasem mieszania, zarejestrowane na próbce selektywnie znakowanej, na spektrum 13C-13C PDSD z pośrednim czasem mieszania, najlepiej zarejestrowane na tej samej selektywnie znakowanej próbce. Dodatkowe sygnały wynikają z korelacji między bardziej oddalonymi atomami 13C. Podczas przypisywania rezonansów uwzględnij schemat znakowania selektywnego.
    3. Dokładnie oceń rozdzielczość widma, aby zdefiniować okno tolerancji przypisania, t.j. w zależności od rozdzielczości widma rezonanse w określonym zakresie ppm mogą przyczyniać się do sygnału. Odchylenie standardowe precyzji przypisania jest automatycznie obliczane w programach do przypisywania NMR, takich jak CcpNmr analysis lub SPARKY.
    4. Jeśli sygnał można wyjaśnić kontaktem 13C-13C sekwencyjnym (reszta i – reszta i±1) lub średniozasięgowym (reszta i – reszta i ± 2, 3 lub 4), zachowaj to przypisanie, ponieważ przekaźnikowy transfer polaryzacji może wyjaśnić korelację nawet wtedy, gdy odległość 13C-13C przekracza oczekiwany widoczny zakres kontaktów.
    5. Zaklasyfikuj przypisania dalekozasięgowych kontaktów 13C-13C na sygnały jednoznaczne i niejednoznaczne pod względem częstotliwości. W przypadku przypisań jednoznacznych tylko jedno przypisanie rezonansu jest możliwe w odniesieniu do okna tolerancji przypisania.
      UWAGA: Przypisania niejednoznaczne zawierają wszystkie możliwe przypisania rezonansów w obrębie okna tolerancji. Niejednoznaczności mogą być usuwane jednocześnie podczas obliczeń struktury w iteracyjnych rundach disambiguacji na podstawie wstępnych struktur obliczonych przy użyciu tylko jednoznacznych więzów, co jest realizowane w procedurach obliczeniowych takich jak ARIA51 lub UNIO52. Ponadto dane strukturalne z różnych źródeł biofizycznych (np. struktura podjednostki zmutowanej lub skróconej uzyskana za pomocą NMR w roztworze lub krystalografii rentgenowskiej, pomiary masy na jednostkę długości, mapy cryo-EM) mogą być również wykorzystane do zmniejszenia poziomu niejednoznaczności; przykłady znajdują się w 1,3,53,54,5,56,57,58.
  3. Wykrywanie międzycząsteczkowych więzów odległości w symetrycznym kompleksie białkowym
    1. Przygotuj eksperyment 2D 15N-13C PAIN-CP59 na mieszanej (50/50) próbce znakowanej U-15N- / U-13C-. Sygnały wykryte na widmie PAIN-CP powinny wynikać z międzycząsteczkowych sąsiedztw 15N-13C. Wykorzystaj wcześniej przypisane rezonanse do przeprowadzenia przypisania kontaktów międzycząsteczkowych.
    2. Przygotuj 2D 13C-13C PDSD z długim czasem mieszania (>60 ms) na mieszanej (50/50) próbce (1,3-13C)- / (2-13C)-glicerolu lub (1-13C)- / (2-13C)-glukozy.
      UWAGA: Sygnały wykryte w tym widmie 13C-13C wynikają z wewnątrz- i międzycząsteczkowych sąsiedztw 13C-13C. Jednak wysoka komplementarność dwóch schematów znakowania pozwala na jednoznaczne przypisanie określonych par rezonansów do kontaktów międzycząsteczkowych, np. CA seryny w podjednostkach znakowanych (2-13C)-glukozą, która koreluje z CB seryny w podjednostkach znakowanych (1-13C)-glukozą.
      1. Nałóż widmo mieszanej próbki na widma 2D 13C-13C zarejestrowane na próbkach homogenicznie znakowanych (próbkach znakowanych (1,3-13C)- i (2-13C)-glicerolem lub (1-13C)- i (2-13C)-glukozą). Dodatkowe sygnały w widmie zarejestrowanym na mieszanej próbce powinny wynikać z oddziaływań międzycząsteczkowych.
  4. Modelowanie struktury na podstawie danych SSNMR
    1. Przygotuj listy więzów SSNMR niezbędne do obliczeń struktury: (1) sekwencja białka; (2) wewnątrzcząsteczkowe jednoznaczne więzy odległości; (3) wewnątrzcząsteczkowe niejednoznaczne więzy odległości; (4) więzy kątów dihedralnych na podstawie TALOS; (5) międzycząsteczkowe jednoznaczne więzy odległości; (6) międzycząsteczkowe niejednoznaczne więzy odległości; (7) dodatkowe dane z innych technik biofizycznych (np. masa na jednostkę długości, parametry symetrii).
    2. Kilka przeglądów dostarcza informacji na temat modelowania struktury w oparciu o dane SSNMR oraz w połączeniu z komplementarnymi danymi strukturalnymi 14,60,15,19,61,62. Należy pamiętać, że niejednoznaczne więzy odległości mogą być rozstrzygane podczas obliczeń struktury w odniesieniu do wstępnych modeli strukturalnych opartych na jednoznacznych więzach odległości. Aby zapewnić dokładność struktury, uważnie obserwuj, czy struktura zbiega do pojedynczego zwinięcia.

Diagram dyfuzji węgla; znakowanie izotopowe; 13C; ścieżki kinetyczne; wizualizacja procesu; eksperyment.
Rycina 5Kontakty wewnątrz- i międzycząsteczkowe w symetrycznych kompleksach białkowych. Schematyczne przedstawienie wewnątrz- kontra międzycząsteczkowy 13C-13Kontakty dalekiego zasięgu w helikalnym zgromadzeniu makromolekularnym. Podjednostki są zabarwione na biało i czerwono, aby zilustrować mieszane znakowanie podjednostek; tj. przed montażem wykonano mieszaninę 1:1 dwóch różnych schematów znakowania (np. 1-13glukoza C i 1-13C glukozy). A) wewnątrzcząsteczkowy 13C-13dalekosiężne kontakty C (niebieska przerywana strzałka); Bmiędzycząsteczkowy 13C-13Kontakty dalekiego zasięgu C (czerwone przerywane strzałki). Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wyniki

Typowy schemat pracy SSNMR obejmuje kilka etapów przedstawionych na Rysunku 1. Zazwyczaj podjednostki białkowe są otrzymywane poprzez heterologiczną ekspresję in vitro w E. coli, oczyszczane i składane w warunkach wstrząsania, choć czasami również w warunkach statycznych. Po ekspresji i oczyszczaniu podjednostki białkowej wykonuje się chromatografię żelową SDS (Rysunek 2A). Powstanie kompleksów makromolekularnych można następnie potwierdzić za pomocą analizy z wykorzystaniem mikroskopii elektronowej (EM) (przykład kompleksu włóknistego przedstawiono na Rysunku 2B).

Po wprowadzeniu kompleksu białkowego do rotora SSNMR, rotor jest umieszczany w spektrometrze, regulowane są częstotliwość MAS oraz temperatura, a następnie rejestrowane są widma. Pierwsze informacje można uzyskać za pomocą technik 1D SSNMR. Rysunek 3 przedstawia typowy sygnał FID SSNMR wykryty na kanale 13C dla strukturalnie homogennej próbki białka, widmo 1H-13C CP, ujawniające rezonanse 13C obecne w sztywnym rdzeniu podjednostki białkowej w kompleksie, oraz widmo 2D 1H-13C INEPT, reprezentujące mobilne reszty. Aby uzyskać szczegółowe informacje o strukturze atomowej sztywnego rdzenia kompleksu, należy zarejestrować wielowymiarowe eksperymenty SSNMR na próbkach znakowanych jednorodnie i selektywnie, aby najpierw przypisać rezonanse SSNMR, a następnie wykryć dalekozasięgowe zbliżenia (patrz Rysunek 4).

Wszystkie widma są przetwarzane i analizowane za pomocą odpowiedniego oprogramowania w celu przypisania rezonansów SSNMR oraz wyłonienia międzycząsteczkowych i wewnątrz-cząsteczkowych ograniczeń odległości (Rysunek 5). Ograniczenia odległości SSNMR są wykorzystywane samodzielnie lub w połączeniu z danymi z technik komplementarnych, które mogą zostać zintegrowane z programem do modelowania.

Przedstawiając reprezentatywne struktury atomowe kompleksów makromolekularnych rozwiązanych za pomocą technik SSNMR, Rysunek 6 ilustruje kilka kompleksów filamentowych z bakteryjnych wyrostków oraz włókien amyloidowych.

Trójwymiarowe struktury białek, modele wstążkowe, diagram, biologia strukturalna, analiza konformacji molekularnej.
Rysunek 6:Włókniste struktury makromolekularne wyznaczone metodą NMR w stanie stałym: filamenty bakteryjne i włókna białek amyloidowych.A) Pilus typu 1 bakterii uropatogennych E. coli, kod PDB 2N7H 4; B) filament ASC, kod PDB 2N1F 63; C) igły systemu wydzielniczego typu III, kody PDB 2MME, 2LPZ i 2MEX 2,3,64; D) Włókna amyloidu-beta AB42, kody PDB 2NAO, 5KK3, 2MXU 65,66,67 or mutant Osaka, kod PDB 2MVX 57mutant z Iowa, kod PDB 2MPZ 58; EWłókna alfa-synukleiny, kod PDB 2N0A 68; F) domena prionowa HET-s, kod PDB 2RNM, 2KJ3 69,70. Aby wyświetlić tę figurę w powiększeniu, kliknij tutaj.

Dyskusja

NMR w stanie stałym (SSNMR) jest metodą z wyboru do charakteryzowania wielkocząsteczkowych zespołów białek na poziomie atomowym. Jednym z centralnych zagadnień w wyznaczaniu struktury w oparciu o SSNMR jest jakość spektralna badanego układu, która pozwala na tworzenie modeli strukturalnych 3D o różnej precyzji, zwykle od modeli o niskiej rozdzielczości (zawierających drugorzędowe elementy struktury i niewiele informacji 3D) do pseudoatomowych struktur 3D. Ilość i jakość informacji strukturalnych uzyskanych z wielowymiarowych eksperymentów SSNMR jest kluczem do obliczenia struktury NMR zespołu o wysokiej rozdzielczości.

Opisany protokół opiera się na wykryciu 13ograniczeń strukturalnych C-13C i 15 N-13C, wymagających rejestracji kilku widm 2D (a czasami 3D) o wysokim stosunku sygnału do szumu. Przy umiarkowanych częstotliwościach MAS (<25 kHz) próbka jest wprowadzana do wirników o średnicy 3,2-4 mm, co pozwala na uzyskanie ilości białka do ~50 mg, w zależności od uwodnienia próbki. Ilość próbki wewnątrz wirnika jest wprost proporcjonalna do stosunku sygnału do szumu w widmach SSNMR, co jest decydującym czynnikiem dla wykrywania ograniczeń odległości dalekiego zasięgu i ich jednoznacznego przypisania.

Rozdzielczość spektralna jest kluczowym parametrem podczas sekwencyjnego przypisywania rezonansu i zbierania uwięzi. Aby uzyskać optymalne wyniki, należy zoptymalizować parametry przygotowania próbki, szczególnie w zakresie oczyszczania podjednostki i warunków montażu (pH, bufor, wstrząsanie, temperatura itp.). W celu optymalizacji próbki zaleca się przygotowanie nieoznakowanych próbek dla kilku różnych warunków, dla których zaobserwowano składanie, oraz zarejestrowanie widma 1D 1 H-13C CP (opisanego w kroku 2.1) na każdej przygotowanej próbce. Widma służą do porównania rozdzielczości spektralnej i dyspersji między różnymi preparatami, na podstawie których można określić optymalne warunki.

Jakość danych SSNMR zależy w dużym stopniu od wyboru parametrów akwizycji NMR, zwłaszcza dla etapów transferu polaryzacji. Zastosowanie pola magnetycznego o wysokim natężeniu (częstotliwość ≥600 MHz 1H) jest niezbędne do uzyskania wysokiej czułości i rozdzielczości spektralnej, wymaganych w przypadku złożonych obiektów, takich jak wielkocząsteczkowe zespoły białek.

Czynnikiem ograniczającym w wielu przypadkach jest dostępność spektrometru. W związku z tym rozsądny wybór próbek, które mają być przygotowane, powinien poprzedzać sesję spektrometru. W każdym razie, jednolicie 13C, 15N próbka jest warunkiem wstępnym do wykonania sekwencyjnego i wewnątrzresztkowego przypisania rezonansu. Dla białek przypisywanych technikami NMR w stanie stałym patrz71. Oznaczanie struktury zespołów makromolekularnych przy umiarkowanych częstotliwościach MAS wymaga selektywnie 13próbek znakowanych C; do wykrywania kontaktów dalekiego zasięgu 13 C-13C i 13 C-15N powszechnie stosuje się próbki oparte na 1,3-13 C- i 2-13C-gylcerolu i/lub 1-13C i 2-13C-glukozie, jak opisano powyżej. Wybór między tymi dwoma schematami etykietowania opiera się na spektralnym stosunku sygnału do szumu i rozdzielczości. Aby rozróżnić wewnątrz- i międzycząsteczkowe kontakty dalekiego zasięgu, mieszane znakowane i rozcieńczone próbki okazały się skuteczne.

Krótko mówiąc, kluczowymi etapami atomowego badania strukturalnego SSNMR są: (i) przygotowanie podjednostek i montaż muszą być zoptymalizowane w celu uzyskania doskonałej ilości i jakości próbki, (ii) natężenie pola spektrometru i parametry akwizycji muszą być starannie dobrane; (iii) do określenia struktury 3D wymagane są strategie selektywnego etykietowania, a ilość wymaganych danych zależy od jakości danych i dostępności danych uzupełniających.

Pomimo możliwości zastosowania w szerokim zakresie układów supramolekularnych, od białek błonowych po homomultimeryczne nanoobiekty, SSNMR jest często ograniczony przez zapotrzebowanie na ilości mg materiału znakowanego izotopowo. Najnowsze osiągnięcia technologiczne w zakresie ultraszybkiego MAS (≥100 kHz) SSNMR otwierają drogę do NMR z detekcją 1H i przesuwają granicę minimalnej ilości próbki do poziomu poniżej 72,73,74. Niemniej jednak, dla szczegółowych badań strukturalnych niezbędne jest 13próbek znakowanych C, co ogranicza zastosowanie SSNMR do próbek złożonych in vitro lub do systemów ulegających ekspresji w organizmach, które przeżywają na minimalnej pożywce, gdzie SSNMR w komórce jest nową metodą (przeglądy patrz 75,76,77,78).

Ważnym czynnikiem w zastosowaniu SSNMR do uzyskiwania struktur 3D o wysokiej rozdzielczości jest rozdzielczość spektralna: wewnętrzna niejednorodność konformacyjna w zespole może ograniczać rozdzielczość spektralną i analizę widm. Oznaczanie 13C specyficznych dla pozostałości może w niektórych przypadkach stanowić alternatywę dla uzyskania szczegółowych informacji o odległości od pozostałości strategicznych w celu uzyskania modeli strukturalnych (najnowsze przykłady znajdują się w 79,80).

SSNMR do określania struktury 3D nadal wymaga zebrania kilku zestawów danych z często długim czasem zbierania danych na zaawansowanych instrumentach, w zależności od podejścia i systemu, od kilku dni do tygodni na spektrometrze 600-1000 MHz (częstotliwość 1H). W związku z tym dostęp do czasu spektrometru może być czynnikiem ograniczającym w dogłębnym badaniu SSNMR.

W przypadku homomultimerycznych zespołów białkowych, prowadzących do uzyskania danych SSNMR o wystarczającej jakości, aby zidentyfikować dużą liczbę ograniczeń strukturalnych, takich jak w 3,57,64,70, SSNMR nadal nie daje dostępu do mikroskopijnych wymiarów. W związku z tym, w przypadku wyznaczania de novo struktury SSNMR zespołu homomultimerycznego, dane EM lub masa na długość (MPL) idealnie uzupełniają dane SSNMR w celu wyprowadzenia parametrów symetrii. Same dane SSNMR dostarczają atomowych interfejsów wewnątrz- i międzycząsteczkowych

SSNMR jest wysoce komplementarny z technikami strukturalnymi, takimi jak pomiary EM lub MPL, ale dane można również doskonale łączyć ze strukturami atomowymi uzyskanymi za pomocą krystalografii rentgenowskiej lub roztworu NMR na zmutowanych lub skróconych podjednostkach. W literaturze można znaleźć coraz więcej badań, w których połączenie różnych danych strukturalnych pozwoliło na wyznaczenie atomowych modeli 3D zespołów makromolekularnych (patrz rysunek 6 dla reprezentatywnych przykładów).

W dziedzinie biologii strukturalnej SSNMR jawi się jako obiecująca technika badania nierozpuszczalnych i niekrystalicznych zespołów na poziomie atomowym, tj. dostarczania danych strukturalnych w skali atomowej. Pod tym względem SSNMR jest pendantem do roztworu NMR i krystalografii rentgenowskiej dla zespołów molekularnych, w tym białek błonowych w ich naturalnym środowisku i zespołów białkowych, takich jak otoczki wirusowe, włókna bakteryjne lub amyloidy, a także RNA i kompleksy RNA-białko (patrz na przykład81). Jego wysoce wszechstronne zastosowania in vitro i w kontekście komórkowym, takie jak śledzenie drugorzędowych, trzeciorzędowych i czwartorzędowych zmian strukturalnych, identyfikacja powierzchni interakcji z cząsteczkami partnerskimi w skali atomowej (na przykład 82) oraz mapowanie dynamiki molekularnej w kontekście złożonych kompleksów, wskazują na istotny potencjał SSNMR w przyszłych badaniach strukturalnych nad złożonymi zespołami biomolekularnymi.

SkładnikM9 średni
Zawartość NaCl0,5 g/l
KH2PO43 g/l
Na2HPO46,7 g/l
MgSO41 mM
ZnCl210 μM
FeCl31 μM
CaCl2100 μM
Mieszanka witamin MEM 100X10 ml/l
13C-glukoza2 g/l
15NH4Cl1 g/L

Tabela 1: Skład minimalnej pożywki ekspresyjnej do produkcji rekombinowanych białek w komórkach E. coli BL21.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca jest finansowana przez ANR (13-PDOC-0017-01 do B.H. i ANR-14-CE09-0020-01 do A.L.), program "Inwestycje dla przyszłości" IdEx Bordeaux/CNRS (PEPS 2016 do B.H.) numer ANR-10-IDEX-03-02 do B.H., Fondation pour la Recherche Médicale (FRM-AJE20140630090 do A.L.), program FP7 (FP7-PEOPLE-2013-CIG do A.L.) oraz Europejską Radę ds. Badań Naukowych (ERBN) w ramach programu Unii Europejskiej Horyzont 2020 w zakresie badań naukowych i innowacji (ERC Starting Grant dla A.L., umowa nr 639020) oraz projekt "WEAKINTERACT".

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Instruments
NMR Spectrometer (> 11,7 Tesli)Głowica
 Wirniki Bruker-SSNMR
Wirówka BrukerK1910
5804 R Spektrometr Eppendorf5805000629
GeneQuant 1300Dutscher28-9182-13
IGS60 INKUBATOR HERATHERM 75 LDutscher
MaxQ 4450Dutscher78376
Mieszadło rewolwerowe rurkoweDutscher79547
sonopuls HD 3100Bandelin3680
Elektroporator MicroPulserBiorad165-2100 
system tetrakomórkowy mini-PROTEANBiorad165-8000
AKTA pure systemGE Healthcare29-0182-24
pipeta kapilarna microman M25Gilson F148502
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Materiały
amiconR ultra-15sigmaZ740199-8EA
kapilary i tłokiGilson 
szpatułkaFisher13263799
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Reodczynniki
D-glucose 13C6Sigma389374
Chlorek amonu-15NSigma299251
1,3 13C2 glicerolSigma492639
2 13C glicerolSigma489484
KanamycynaSigmaK1876
KarbenicylinaSigmaC3416
Fosforan sodu dwuzasadowySigmaS7907
Fosforan potasu jednozasadowySigmaP5655
Chlorek soduSigma71380
Chlorek wapniaSigmaC1016
Siarczan magnezuSigma208094
Chlorek żelazaSigma157740
ChlorekSigma793523
MEM Roztwór witaminowy (100 razy;)SigmaM68954
IPTGFisherBP1755
Podstawa Trizma SigmaT1503
TricineSigmaT0377
SDSSigma436143
azydek soduSigma71289
Kwas 4,4-dimetylo-4-silapentano-1-sulfonowy Sigma178837
Nazwa<strong>FirmaNumer katalogowyKomentarze
Softwares
Unicorn 6.3GE HealthcareAkta systems
ccpNMRCCPN systemy spektrometryczne
sondy MAS SSNMR z potrójnym rezonansem Brukera4mm Wytrząsarka orbitalna 228001 F148112

Bibliografia

  1. Morag, O., Sgourakis, N. G., Baker, D., Goldbourt, A. The NMR-Rosetta capsid model of M13 bacteriophage reveals a quadrupled hydrophobic packing epitope. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (4), 971-976 (2015).
  2. Loquet, A., et al. Atomic model of the type III secretion system needle. Nature. 486 (7402), 276-279 (2012).
  3. Demers, J. P., et al. High-resolution structure of the Shigella type-III secretion needle by solid-state NMR and cryo-electron microscopy. Nat Commun. 5 (4976), (2014).
  4. Habenstein, B., et al. Hybrid Structure of the Type 1 Pilus of Uropathogenic Escherichia coli. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (40), 11691-11695 (2015).
  5. Cady, S. D., et al. Structure of the amantadine binding site of influenza M2 proton channels in lipid bilayers. Nature. 463 (7281), 689-692 (2010).
  6. Park, S. H., et al. Structure of the chemokine receptor CXCR1 in phospholipid bilayers. Nature. 491 (7426), 779-783 (2012).
  7. Kaplan, M., et al. Probing a cell-embedded megadalton protein complex by DNP-supported solid-state NMR. Nat Methods. 12 (7), 649-652 (2015).
  8. Wang, S., et al. Solid-state NMR spectroscopy structure determination of a lipid-embedded heptahelical membrane protein. Nat Methods. 10 (10), 1007-1012 (2013).
  9. Daskalov, A., et al. Signal transduction by a fungal NOD-like receptor based on propagation of a prion amyloid fold. PLoS Biol. 13 (2), e1002059(2015).
  10. Daskalov, A., et al. Identification of a novel cell death-inducing domain reveals that fungal amyloid-controlled cell death is related to necroptosis. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2016).
  11. Li, J., et al. The RIP1/RIP3 necrosome forms a functional amyloid signaling complex required for programmed necrosis. Cell. 150 (2), 339-350 (2012).
  12. Knowles, T. P., Vendruscolo, M., Dobson, C. M. The amyloid state and its association with protein misfolding diseases. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (6), 384-396 (2014).
  13. Aguzzi, A., Lakkaraju, A. K. Cell Biology of Prions and Prionoids: A Status Report. Trends Cell Biol. 26 (1), 40-51 (2016).
  14. Habenstein, B., Loquet, A. Solid-state NMR: An emerging technique in structural biology of self-assemblies. Biophys Chem. , (2015).
  15. Meier, B. H., Bockmann, A. The structure of fibrils from 'misfolded' proteins. Curr Opin Struct Biol. 30, 43-49 (2015).
  16. Miao, Y., Cross, T. A. Solid state NMR and protein-protein interactions in membranes. Curr Opin Struct Biol. 23 (6), 919-928 (2013).
  17. Tang, M., Comellas, G., Rienstra, C. M. Advanced solid-state NMR approaches for structure determination of membrane proteins and amyloid fibrils. Acc Chem Res. 46 (9), 2080-2088 (2013).
  18. Weingarth, M., Baldus, M. Solid-state NMR-based approaches for supramolecular structure elucidation. Acc Chem Res. 46 (9), 2037-2046 (2013).
  19. Loquet, A., Habenstein, B., Lange, A. Structural investigations of molecular machines by solid-state NMR. Acc Chem Res. 46 (9), 2070-2079 (2013).
  20. Yan, S., Suiter, C. L., Hou, G., Zhang, H., Polenova, T. Probing structure and dynamics of protein assemblies by magic angle spinning NMR spectroscopy. Acc Chem Res. 46 (9), 2047-2058 (2013).
  21. Tycko, R., Wickner, R. B. Molecular structures of amyloid and prion fibrils: consensus versus controversy. Acc Chem Res. 46 (7), 1487-1496 (2013).
  22. Hong, M., Zhang, Y., Hu, F. Membrane protein structure and dynamics from NMR spectroscopy. Annu Rev Phys Chem. 63, 1-24 (2012).
  23. Jelinek, R., Ramamoorthy, A., Opella, S. J. High-Resolution Three-Dimensional Solid-state NMR Spectroscopy of a Uniformly 15N-Labeled Protein. J Am Chem Soc. 117, 12348-12349 (1995).
  24. Xu, J., et al. Bicelle-enabled structural studies on a membrane-associated cytochrome B5 by solid-state MAS NMR spectroscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 47 (41), 7864-7867 (2008).
  25. Durr, U. H., Gildenberg, M., Ramamoorthy, A. The magic of bicelles lights up membrane protein structure. Chem Rev. 112 (11), 6054-6074 (2012).
  26. Yamamoto, K., et al. Probing the transmembrane structure and topology of microsomal cytochrome-p450 by solid-state NMR on temperature-resistant bicelles. Sci Rep. 3, 2556(2013).
  27. Huang, R., et al. Probing the transmembrane structure and dynamics of microsomal NADPH-cytochrome P450 oxidoreductase by solid-state NMR. Biophys J. 106 (10), 2126-2133 (2014).
  28. Durr, U. H., Yamamoto, K., Im, S. C., Waskell, L., Ramamoorthy, A. Solid-state NMR reveals structural and dynamical properties of a membrane-anchored electron-carrier protein, cytochrome b5. J Am Chem Soc. 129 (21), 6670-6671 (2007).
  29. Hong, M. Determination of multiple phi-torsion angles in proteins by selective and extensive (13)C labeling and two-dimensional solid-state NMR. J Magn Reson. 139 (2), 389-401 (1999).
  30. Lundstrom, P., et al. Fractional 13C enrichment of isolated carbons using [1-13C]- or [2- 13C]-glucose facilitates the accurate measurement of dynamics at backbone Calpha and side-chain methyl positions in proteins. J Biomol NMR. 38 (3), 199-212 (2007).
  31. Loquet, A., Lv, G., Giller, K., Becker, S., Lange, A. 13C spin dilution for simplified and complete solid-state NMR resonance assignment of insoluble biological assemblies. J Am Chem Soc. 133 (13), 4722-4725 (2011).
  32. Castellani, F., et al. Structure of a protein determined by solid-state magic-angle-spinning NMR spectroscopy. Nature. 420 (6911), 98-102 (2002).
  33. Higman, V. A., et al. Assigning large proteins in the solid state: a MAS NMR resonance assignment strategy using selectively and extensively 13C-labelled proteins. J Biomol NMR. 44 (4), 245-260 (2009).
  34. Bockmann, A., et al. Characterization of different water pools in solid-state NMR protein samples. J Biomol NMR. 45 (3), 319-327 (2009).
  35. Cavanagh, J., Fairbrother, W. J., Palmer, A. G., Skelton, N. J. Protein NMR spectroscopy, principles and practice. , Academic. San Diego. (1996).
  36. Hartman, S. R., Hahn, E. L. Nuclear Double Resonance in the Rotating Frame. Phys Rev. 128 (5), 2042-2053 (1962).
  37. Harris, R. K., et al. Further conventions for NMR shielding and chemical shifts IUPAC recommendations 2008. Solid State Nucl Magn Reson. 33 (3), 41-56 (2008).
  38. Wang, Y., Jardetzky, O. Probability-based protein secondary structure identification using combined NMR chemical-shift data. Protein Sci. 11 (4), 852-861 (2002).
  39. Shaka, A. J., Baker, P. B., Freeman, R. Computer-Optimized Scheme for Wideband Applications and Low-Level Operation. J Magn Reson. 64, 547-552 (1985).
  40. BMRB - Biological Magnetic Resonance Bank. , http://bmrb.wisc.edu/ (2017).
  41. Szeverenyi, N. M., Sullivan, M. J., Maciel, G. E. Observation of Spin Exchange by Two-Dimensional Fourier-Transform C-13 Cross Polarization-Magic-Angle Spinning. J Magn Reson. 47, 462-475 (1982).
  42. Baldus, M., Petkova, A. T., Herzfeld, J., Griffin, R. G. Cross polarization in the tilted frame: assignment and spectral simplification in heteronuclear spin systems. Mol Phys. 95 (5), 1197-1207 (1998).
  43. Verel, R., Ernst, M., Meier, B. H. Adiabatic dipolar recoupling in solid-state NMR: the DREAM scheme. J Magn Reson. 150 (1), 81-99 (2001).
  44. CcpNmr Analysis — Collaborative Computational Project for NMR. , http://www.ccpn.ac.uk/software/analysis (2017).
  45. Sparky - NMR Assignment and Integration Software. , https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/ (2017).
  46. Luca, S., et al. Secondary chemical shifts in immobilized peptides and proteins: a qualitative basis for structure refinement under magic angle spinning. J Biomol NMR. 20 (4), 325-331 (2001).
  47. TALOS+: Prediction of Protein Backbone Torsion Angles from NMR Chemical Shift. , http://spin.niddk.nih.gov/bax/software/TALOS/ (2017).
  48. Shen, Y., Bax, A. SPARTA+: a modest improvement in empirical NMR chemical shift prediction by means of an artificial neural network. J Biomol NMR. 48 (1), 13-22 (2010).
  49. SHIFTOR Dihedral angles from chemical shifts and homology. , http://wishart.biology.ualberta.ca/shiftor/ (2017).
  50. Berjanskii, M. V., Neal, S., Wishart, D. S. PREDITOR: a web server for predicting protein torsion angle restraints. Nucleic Acids Res. 34 (Web Server issue), W63-W69 (2006).
  51. Bardiaux, B., Malliavin, T., Nilges, M. ARIA for solution and solid-state NMR. Methods Mol Biol. 831, 453-483 (2012).
  52. Guerry, P., Herrmann, T. Comprehensive automation for NMR structure determination of proteins. Methods Mol Biol. 831, 429-451 (2012).
  53. Vasa, S., et al. beta-Helical architecture of cytoskeletal bactofilin filaments revealed by solid-state NMR. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (2), E127-E136 (2015).
  54. He, L., et al. Structure determination of helical filaments by solid-state NMR spectroscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (3), E272-E281 (2016).
  55. Tang, M., et al. High-resolution membrane protein structure by joint calculations with solid-state NMR and X-ray experimental data. J Biomol NMR. 51 (3), 227-233 (2011).
  56. Paravastu, A. K., Leapman, R. D., Yau, W. M., Tycko, R. Molecular structural basis for polymorphism in Alzheimer's beta-amyloid fibrils. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18349-18354 (2008).
  57. Schutz, A. K., et al. Atomic-resolution three-dimensional structure of amyloid beta fibrils bearing the Osaka mutation. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (1), 331-335 (2015).
  58. Sgourakis, N. G., Yau, W. M., Qiang, W. Modeling an in-register, parallel "iowa" abeta fibril structure using solid-state NMR data from labeled samples with rosetta. Structure. 23 (1), 216-227 (2015).
  59. Lewandowski, J. R., De Paepe, G., Griffin, R. G. Proton assisted insensitive nuclei cross polarization. J Am Chem Soc. 129 (4), 728-729 (2007).
  60. Carlon, A., et al. How to tackle protein structural data from solution and solid state: An integrated approach. Prog Nucl Magn Reson Spectrosc. 92-93, 54-70 (2016).
  61. Judge, P. J., Taylor, G. F., Dannatt, H. R., Watts, A. Solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy for membrane protein structure determination. Methods Mol Biol. 1261, 331-347 (2015).
  62. Wang, S., Ladizhansky, V. Recent advances in magic angle spinning solid state NMR of membrane proteins. Prog Nucl Magn Reson Spectrosc. 82, 1-26 (2014).
  63. Sborgi, L., et al. Structure and assembly of the mouse ASC inflammasome by combined NMR spectroscopy and cryo-electron microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (43), 13237-13242 (2015).
  64. Loquet, A., et al. Atomic structure and handedness of the building block of a biological assembly. J Am Chem Soc. 135 (51), 19135-19138 (2013).
  65. Walti, M. A., et al. Atomic-resolution structure of a disease-relevant Abeta(1-42) amyloid fibril. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (34), E4976-E4984 (2016).
  66. Colvin, M. T., et al. Atomic Resolution Structure of Monomorphic Abeta42 Amyloid Fibrils. J Am Chem Soc. 138 (30), 9663-9674 (2016).
  67. Xiao, Y., et al. Abeta(1-42) fibril structure illuminates self-recognition and replication of amyloid in Alzheimer's disease. Nat Struct Mol Biol. 22 (6), 499-505 (2015).
  68. Tuttle, M. D., et al. Solid-state NMR structure of a pathogenic fibril of full-length human alpha-synuclein. Nat Struct Mol Biol. 23 (5), 409-415 (2016).
  69. Wasmer, C., et al. Amyloid fibrils of the HET-s(218-289) prion form a beta solenoid with a triangular hydrophobic core. Science. 319 (5869), 1523-1526 (2008).
  70. Van Melckebeke, H., et al. Atomic-resolution three-dimensional structure of HET-s(218-289) amyloid fibrils by solid-state NMR spectroscopy. J Am Chem Soc. 132 (39), 13765-13775 (2010).
  71. BMRB Solid-state NMR entries. , http://www.bmrb.wisc.edu/data_library/solidstate.shtml (2017).
  72. Lamley, J. M., et al. Solid-state NMR of a protein in a precipitated complex with a full-length antibody. J Am Chem Soc. 136 (48), 16800-16806 (2014).
  73. Agarwal, V., et al. De novo 3D structure determination from sub-milligram protein samples by solid-state 100 kHz MAS NMR spectroscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (45), 12253-12256 (2014).
  74. Stanek, J., et al. NMR Spectroscopic Assignment of Backbone and Side-Chain Protons in Fully Protonated Proteins: Microcrystals, Sedimented Assemblies, and Amyloid Fibrils. Angew Chem Int Ed Engl. 55 (50), 15504-15509 (2016).
  75. Baker, L. A., Baldus, M. Characterization of membrane protein function by solid-state NMR spectroscopy. Curr Opin Struct Biol. 27, 48-55 (2014).
  76. Luchinat, E., Banci, L. In-cell NMR: a topical review. IUCrJ. 4 (Pt 2), 108-118 (2017).
  77. Freedberg, D. I., Selenko, P. Live cell NMR. Annu Rev Biophys. 43, 171-192 (2014).
  78. Selenko, P., Wagner, G. Looking into live cells with in-cell NMR spectroscopy. J Struct Biol. 158 (2), 244-253 (2007).
  79. Qiang, W., Yau, W. M., Luo, Y., Mattson, M. P., Tycko, R. Antiparallel beta-sheet architecture in Iowa-mutant beta-amyloid fibrils. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (12), 4443-4448 (2012).
  80. Bateman, D. A., Tycko, R., Wickner, R. B. Experimentally derived structural constraints for amyloid fibrils of wild-type transthyretin. Biophys J. 101 (10), 2485-2492 (2011).
  81. Marchanka, A., Simon, B., Althoff-Ospelt, G., Carlomagno, T. RNA structure determination by solid-state NMR spectroscopy. Nat Commun. 6, 7024(2015).
  82. Schutz, A. K., et al. The amyloid-Congo red interface at atomic resolution. Angew Chem Int Ed Engl. 50 (26), 5956-5960 (2011).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

NMR w stanie cia ymznakowanie izotopowewirowanie pod k tem magicznymmonta filament w bia kowycheksperyment CPeksperyment PDSDprzypisanie rezonans wwi zy odleg o ciowemodelowanie strukturalne
Badania strukturalne układów makromolekularnych w skali atomowej za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego w ciele stałym
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.