Artykuł metodologiczny

Analiza makrofagów pochodzących z mikrogleju i monocytów z ośrodkowego układu nerwowego za pomocą cytometrii przepływowej

DOI:

10.3791/55781

⸱

22 czerwca 2017

 ,  ,  , 
1Inserm U 1227, CNRS UMR 7225, 2Sorbonne Universités, UPMC, University of Paris, 3Institut du Cerveau et de la Moelle épinière, ICM, 4AP-HP, Hôpital de la Pitié Salpêtrière;

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół zapewnia analizę subpopulacji makrofagów w ośrodkowym układzie nerwowym dorosłej myszy za pomocą cytometrii przepływowej i jest pomocny w badaniu wielu markerów wyrażanych przez te komórki.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Liczne badania wykazały rolę komórek odpornościowych, w szczególności makrofagów, w patologiach ośrodkowego układu nerwowego (OUN). W OUN istnieją dwie główne populacje makrofagów: (i) mikroglej, który jest makrofagami rezydującymi w OUN i pochodzi z komórek progenitorowych woreczka żółtkowego podczas embriogenezy, oraz (ii) makrofagi pochodzące z monocytów (MDM), które mogą infiltrować OUN podczas choroby i pochodzą z komórek progenitorowych szpiku kostnego. Role każdej subpopulacji makrofagów różnią się w zależności od badanej patologii. Ponadto nie ma zgody co do markerów histologicznych lub kryteriów wyróżniających stosowanych dla tych subpopulacji makrofagów. Jednak analiza profili ekspresji markerów CD11b i CD45 za pomocą cytometrii przepływowej pozwala nam odróżnić mikroglej (CD11b+CD45med) od MDM (haj CD11b+CD45). W tym protokole pokazujemy, że wirowanie w gradionym gradiencie gęstości i analiza cytometrii przepływowej mogą być wykorzystane do scharakteryzowania tych subpopulacji makrofagów OUN oraz do zbadania kilku markerów zainteresowania wyrażanych przez te komórki, jak niedawno opublikowaliśmy. W związku z tym technika ta może pogłębić naszą wiedzę na temat roli makrofagów w mysich modelach chorób neurologicznych, a także może być wykorzystana do oceny wpływu leków na te komórki.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroglej to makrofagi ośrodkowego układu nerwowego (OUN) rezydujące w tkance miąższowej. Odgrywają dwie kluczowe role funkcjonalne: obronę immunologiczną i utrzymanie homeostazy OUN. W przeciwieństwie do MDM, które są stale odnawiane z hematopoetycznych komórek macierzystych w szpiku kostnym, komórki mikrogleju różnicują się od prymitywnych hematopoetycznych komórek progenitorowych pochodzących z woreczka żółtkowego (YS), który skolonizował mózg podczas rozwoju embrionalnego1,2,3. U gryzoni czynnik transkrypcyjny Myb odgrywa kluczową rolę w rozwoju wszystkich monocytów i makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego, ale w przypadku mikrogleju pochodzącego z YS czynnik ten jest zbędny, a różnicowanie pozostaje zależne od czynnika transkrypcyjnego PU.14.

W zdrowym OUN, mikroglej to dynamiczne komórki, które nieustannie próbkują swoje środowisko, skanując i badając w poszukiwaniu atakujących patogenów lub uszkodzeń tkanek5. Wykrycie takich sygnałów inicjuje drogę do rozwiązania urazu. Mikroglej szybko przechodzi z morfologii rozgałęzionej na ameboidalną, po której następuje fagocytoza i uwalnianie różnych mediatorów, takich jak cytokiny pro- lub przeciwzapalne. Tak więc, w zależności od swojego mikrośrodowiska, aktywowany mikroglej może uzyskiwać spektrum różnych stanów primingu6.

Mikroglej ma ogromny wpływ na rozwój i postęp wielu zaburzeń neurologicznych. W modelach gryzoni choroby Alzheimera (AD)7, stwardnienia zanikowego bocznego (ALS)8, stwardnienia rozsianego (MS)9 lub choroby Parkinsona (PD)10, wykazano, że mikroglej odgrywa podwójną rolę, albo wywołując szkodliwą neurotoksyczność, albo działając w sposób neuroprotekcyjny, który zależy od konkretnej choroby, stadium choroby i tego, czy na chorobę miał wpływ układowy układ odpornościowy compartment7,8,9,10,11. Większość zmian w OUN obserwowanych w wyżej wymienionych chorobach zawiera niejednorodną populację komórek szpikowych, w tym nie tylko mikroglej miąższowy, ale także makrofagi okołonaczyniowe i oponowo-rdzeniowe, a także MDM naciekający OUN. Te typy komórek mogą w różny sposób przyczyniać się do mechanizmów patofizjologicznych związanych z uszkodzeniem i naprawą7,12,13,14,15. Obecnym wyzwaniem dla badaczy, którzy badają te modele chorób, jest ustalenie, czy obwodowe monocyty i makrofagi infiltrują OUN, a jeśli tak, to odróżnienie rezydującego mikrogleju od tych komórek. Rzeczywiście, komórki mikrogleju są bardzo plastyczne; Po ich aktywacji mikroglej ponownie wyraża markery, które zwykle są wyrażane przez obwodowe monocyty i makrofagi. Problem polega zatem na zidentyfikowaniu markerów, które mogą odróżnić rezydujący mikroglej od naciekających monocytów i makrofagów.

Dyskryminacja tych populacji na wycinkach mózgu za pomocą aplikacji immunohistologicznych jest ograniczona ze względu na brak specyficznych przeciwciał. Jednak analiza cytometrii przepływowej jest skuteczną techniką oceny ekspresji kilku markerów i rozróżniania populacji komórek (na przykład limfocytów, makrofagów/MDM CD11b+CD45 high i microglea CD11b+CD45med), a także subpopulacji komórek16,17,18. Protokół ten opisuje procedury izolowania komórek jednojądrzastych od mysiego OUN w modelach chorób neurologicznych przy użyciu zoptymalizowanej, enzymatycznej dysocjacji tkanek i wirowania w gradiacji gęstości; a także metodę różnicowania populacji mikrogleju i MDM w OUN za pomocą cytometrii przepływowej.

Innym podejściem jest wyeliminowanie mieliny i oczyszczenie komórek za pomocą kulek magnetycznych sprzężonych z określonymi przeciwciałami19,20,21. Usuwanie mieliny za pomocą kulek magnetycznych antymielinowych jest droższe i wpływa na żywotność i wydajność izolowanych komórek22. Ten krok i następująca po nim immunomagnetyczna separacja mikrogleju ograniczają dalsze badania określonych populacji komórek odpornościowych21,22.

Te procedury zapewniają łatwy sposób na badanie subpopulacji makrofagów w rozwoju choroby oraz na określenie efektów leków lub modyfikacji genów na fenotypy makrofagów i stany aktywacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Instytucie ICM oraz przez Francuski Komitet Etyki Zwierząt Darwina i są objęte protokołem 01407.02.

1. Przygotowanie

  1. Przygotuj koktajl wytrawiający w probówce o pojemności 1,5 ml, łącząc następujące składniki dla każdej myszy: 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS); 123 μl enzymu wytrawiającego (patrz tabela materiałów) w stężeniu 13 wunsch/ml (roztwór podstawowy), stężenie końcowe 1,6 wunsch/ml; i 5 μl DNazy I (patrz tabela materiałów) w stężeniu 100 mg/ml (roztwór podstawowy), stężenie końcowe 0,5 mg/ml.

2. Perfuzja i rozwarstwienie

  1. Poddaj myszy eutanazji śmiertelną dawką pentobarbitalu (100 μl przy 400 mg/ml).
  2. Ułóż zwierzę w pozycji leżącej na plecach i zwilż ciało 70% etanolem.
  3. Przetnij skórę brzuszną cienkimi nożyczkami tuż poniżej wyrostka ksylowego, aby odsłonić klatkę piersiową.
  4. Wykonaj nacięcie w przeponie i przetnij boczne aspekty klatki piersiowej cienkimi nożyczkami w kierunku ogonowym do rostralnego, aby odsłonić serce (i uniknąć cięcia innych narządów). Zidentyfikuj lewą komorę (LV) i prawy przedsionek (RA).
  5. Wprowadzić cewnik motylkowy z igłą 25 G do wnętrza LV. Wykonać nacięcie na RZS cienkimi nożyczkami i na początku przepływu krwi rozpocząć perfuzję z szybkością przepływu 10 ml / min przez LV z 20 ml PBS w celu usunięcia komórek i krwi z naczyń; udaną perfuzję obserwuje się poprzez blanszowanie płuc i wątroby w miarę przemieszczania się krwi.
  6. Odetnij głowę zwierzęcia średnimi nożyczkami. Wypreparuj kręgosłup cienkimi nożyczkami i oddziel go od ciała, wycinając mięśnie ściany brzucha po brzusznej stronie kręgosłupa i przecinając kręgosłup u podstawy ogona.
  7. Włożyć strzykawkę o pojemności 10 ml zawierającą PBS i zamontowaną końcówkę pipety o pojemności 200 μl do odcinka lędźwiowego kręgosłupa i przepłukać rdzeń kręgowy po stronie szyjnej.
    UWAGA: Końcówkę pipety o pojemności 200 μl przecina się nożyczkami na jej najszerszym końcu (około 1 cm) i szczelnie wkłada na strzykawkę o pojemności 10 ml uprzednio wypełnioną PBS.
  8. Usuń skórę nad czaszką i użyj kleszczy, aby odsłonić mózg. Włóż ostrze nożyczek u podstawy czaszki i przetnij czaszkę zgodnie ze szwem strzałkowym. Włóż małe kleszcze do nacięcia i delikatnie unieś czaszkę. Wypreparuj mózg z głowy myszy i usuń opuszkę węchową i móżdżek.
  9. Zebrać mózg i rdzeń kręgowy do probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 1,128 ml PBS z koktajlem trawiennym (od kroku 1.1).

3. Dysocjacja komórek

  1. Za pomocą małych nożyczek drobno przeciąć mózg i rdzeń kręgowy w probówce o pojemności 1,5 ml (krok 2.9) na1-2 mm 3 części (Rysunek 1).
  2. Inkubować probówkę o pojemności 1,5 ml zawierającą rozdrobnione tkanki przez 30 minut w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2,
    UWAGA: Na tym etapie przygotuj gradient gęstości.
  3. Dodać 20 μl 0,5 M EDTA (roztwór podstawowy), końcowe stężenie 10 mM, do probówki o pojemności 1,5 ml, aby zatrzymać reakcję enzymatyczną.
  4. Delikatnie przygotować zawiesinę komórek, pipetując w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 5 ml.
  5. Przepuścić zawiesinę komórek przez nylonową siatkę (porów o wielkości 70 μm) w probówce o pojemności 50 ml za pomocą tłoka strzykawki o pojemności 10 ml.
  6. Umyj nylonową siatkę 20 ml 5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS)-PBS.
  7. Wirować przez 7 minut (300 x g) w temperaturze pokojowej (18 °C). Odrzuć supernatant przez aspirację i przejdź do następnego kroku. Zachowaj szczególną ostrożność podczas usuwania supernatantu; Nie należy naruszać osadu, który można łatwo zassać za pomocą pipety zasysającej.

4. Gradient gęstości

  1. Przygotować roztwór podstawowy pożywki o gradinie gęstości, dodając odpowiednią ilość 10x PBS do podłoża o gradiencie gęstości.
    UWAGA: Dodaj jedną część 10X PBS do dziewięciu części gradientu gęstości.
  2. Rozcieńczyć podłoże o gradiencie gęstości materiałem 1x PBS dla różnych wartości procentowych, jak opisano w tabeli 1.
  3. Zawiesić osad (z kroku 3.7) za pomocą 4 ml pożywki o gradiencie gęstości 30% i przenieść do probówki o pojemności 15 ml.
  4. Umieść pipetę Pasteura na dnie probówki o pojemności 15 ml i powoli nałóż 4 ml pożywki o gradiencie gęstości 37%.
  5. Dodaj 4 ml pożywki o gradiencie gęstości 70%, jak opisano powyżej.
  6. Odwirowywać gradient przez 40 minut (800 x g) w temperaturze pokojowej (18 °C). Upewnij się, że wirówka zatrzymuje się z minimalnym hamulcem lub bez hamulca, aby interfaza nie została zakłócona.
    UWAGA: Rurka będzie wyglądać na rozwarstwioną. Komórki ułożone warstwowo na granicy gradientu gęstości 70% - 37% to jednojądrzaste komórki odpornościowe (subpopulacje mikrogleju i makrofagów); górne poziomy to odpowiednio szczątki komórkowe i mielina (Rysunek 2).
  7. Za pomocą pipety transferowej delikatnie usuń warstwę mieliny.
  8. Zbierz 3-4 ml interfazy gradientu gęstości 70-37% zawierającej komórki subpopulacji makrofagów do czystej probówki o pojemności 15 ml.
  9. Umyj komórki 3x PBS o łącznej objętości 15 ml. Upewnij się, że pożywka o gradiencie gęstości zawierająca komórki jest rozcieńczona co najmniej trzykrotnie PBS i wirować przez 7 minut (500 x g, 4 °C) przy włączonym hamulcu.
  10. Zawiesić osad komórkowy za pomocą 1 ml PBS w celu znakowania komórek lub do innych testów funkcjonalnych.

5. Oznaczanie komórek do cytometrii przepływowej

  1. Przenieść komórki (krok 4.10) do probówki do cytometrii przepływowej.
  2. Dodać 1 μl możliwego do utrwalenia odczynnika do barwienia martwych komórek do każdej próbki komórek otrzymanej w kroku 4.10. Inkubować przez 30 minut na lodzie, chronić przed światłem.
  3. Przemyć komórki raz 2 ml PBS i odwirować przez 5 minut (300 x g, 4 °C).
  4. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą 400 μl PBS 1% BSA, 0,1% azydku.
  5. Dodać 1 μg przeciwciał CD16/CD32 do 100 μl komórek, aby zablokować receptory Fc. Inkubować 10-15 minut na lodzie, chronić przed światłem.
  6. Przygotować pierwszorzędową mieszaninę przeciwciał w PBS 1% BSA, 0,1% azydku lub PBS 1% BSA, 0,1% azydku, 0,25% saponiny, do przenikania komórek do barwienia wewnątrzkomórkowego.
  7. Dodać 100 μl mieszanki przeciwciał pierwszorzędowych (2x) i inkubować przez 30 minut na lodzie, chroniąc przed światłem.
    UWAGA: Wszystkie przeciwciała powinny być miareczkowane przed przeprowadzeniem eksperymentu, aby zapewnić optymalne wyniki.
  8. Przemyć komórki 2 ml PBS i odwirować przez 5 minut (300 x g, 4 °C). Powtórz ten krok trzy razy.
  9. Dodać 100 μl przeciwciała drugorzędowego, jeśli przeciwciała pierwszorzędowe nie są bezpośrednio sprzężone z fluoroforem, i inkubować przez 30 minut na lodzie, chroniąc przed światłem.
  10. Przemyć komórki 2 ml PBS i odwirować przez 5 minut w temperaturze 300 x g w temperaturze 4 °C). Powtórz ten krok trzy razy.
  11. Utrwalić komórki 100 μl 1% PFA przez 15 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.
    UWAGA: Uwaga: PFA jest toksyczny. Stosować w dygestorium i nosić środki ochrony osobistej.
  12. Przemyć komórki 2 ml PBS i odwirować przez 5 minut w temperaturze 300 x g w temperaturze 4 °C. Powtórzyć ten krok trzy razy.
  13. Zawiesić osad komórkowy za pomocą 200 μl PBS i przystąpić do akwizycji i analizy cytometrii przepływowej. Postępuj zgodnie ze strategią bramkowania w Rysunek 3.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po odwirowaniu gradientu gęstości i barwieniu przeciwciałami, komórki zostały pobrane na cytometrze przepływowym i przeanalizowane przy użyciu strategii bramkowania morfologicznego w następujący sposób. Pierwsza bramka została zdefiniowana na wykresie kropkowym Forward-Scattered-Area (FSC-A) versus Forward-Scattered-Height (FSC-H) w celu odróżnienia pojedynczych komórek od dubletów (Rysunek 3A). Pojedyncze komórki zostały następnie bramkowane na wykresach punk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykazano, że mikroglej i MDM mają różne funkcje i fenotypy w OUN, a zatem identyfikacja i analiza tych subpopulacji makrofagów są niezbędne do lepszego zrozumienia chorób neurologicznych 9,18,25. Analiza cytometrii przepływowej przy użyciu dwóch markerów (CD11b i CD45) pozwala na rozróżnienie każdej subpopulacji (ryc. 3C). Strategia ta została wcześniej zwalidowana przy użyciu innych specyficznych m...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty z Agence Nationale pour la Recherche (ANR-12-MALZ-0003-02-P2X7RAD), Association France Alzheimer i Bpifrance. Nasze laboratorium jest również wspierane przez Inserm, CNRS, Université Pierre et Marie-Curie oraz program "Investissements d'avenir" ANR-10-IAIHU-06 (IHU-A-ICM). Chcielibyśmy podziękować za pomoc ze strony CELIS cell culture core facility.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
5-miesięczne myszyJanvierC57BL/6J
Liberase TL Research GradeSigma-Aldrich5401020001Enzym trawienny
Deoksyrybonukleaza I z trzustki bydlęcejSigma-AldrichDN25
PercollGE Healthcare Life Sciences17-0891-01Gradient gęstości średni
Rozmiar sitka komórkowego 70 i mikro; m NylonCorning731751
Venofix 25 GBRAUN4056370
Strzykawka tłokowa 10 mlTerumoSS+10ES1
Pipeta Pasteura 230 mmDustcher20420
Probówka 1,5 mlEppendorf0030 123.328
15 ml tubkaTPP91015
50 mltubka TPP91050
5 ml polistyrenowa rurka okrągłodennaBD Falcon352054
D-PBS (1x) bez Ca2+/Mg2+Thermo Fisher Scientific14190-094
D-PBS (10x) bez Ca2+/Mg2+Thermo Fisher Scientific14200-067
Płodowa surowica bydlęcaThermo Fisher Scientific10270-106
EDTASigma-AldrichE4884
Roztwór albuminy surowicy bydlęcej 30%Sigma-AldrichA7284
Paraformaldehyd 32% roztwórMikroskopia elektronowa Sciences15714-SUwaga -Toksyczna
saponinaSigma-AldrichS2002
Azydek soduSigma-Aldrich47036
PerCPCy5.5 Szczur anty-mysz CD11b (klon M1/70)eBioscience45-0112
Kontrola izotypu szczura IgG2b K PerCP-cyjanina5.5eBioscience45-4031
BV421 Szczur anty-mysz CD45 (klon 30-F11)BD Biosciences563890
BV421 Szczur IgG2b, κ Kontrola izotypu RUOBD Biosciences562603
(klon28 - 3)Abcamab209064
AlexaFluor 647 Osioł anty-królik IgGLife TechnologiesA31573
Anti-Mouse CD16/CD32 OczyszczonyeBioscience14-0161Mysz Fc Block
Naprawialne zestawy do barwienia martwych komórekInvitrogenL34969
Mysie przeciwciało sprzężone z APC CCR2R& DFAB5538A
Szczur IgG2B Kontrola izotypu sprzężona z APCR& DIC013A
Mysz CX3CR1 Przeciwciało sprzężone z PER& DFAB5825P
Kozie przeciwciało sprzężone IgG PER& DIC108P
WirówkaEppendorf5804R
Analizator komórekBD BiosciencesBD FACSVERSE
Oprogramowanie do analizy danychFlowJo LLCFlowJo
Drobne nożyczkiFST14090-11
Kleszcze o standardowym wzorzeFST11000-13
Nożyczki MayoFST14010-15
Kleszcze Dumont #5FST11251-20
Królik przeciw myszom TMEM119

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
  2. Ginhoux, F., Lim, S., Hoeffel, G., Low, D., Huber, T. Origin and differentiation of microglia. Front Cell Neurosci. 7, 45(2013).
  3. Ginhoux, F., Jung, S. Monocytes and macrophages: developmental pathways and tissue homeostasis. Nat Rev Immunol. 14 (6), 392-404 (2014).
  4. Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
  5. London, A., Cohen, M., Schwartz, M. Microglia and monocyte-derived macrophages: functionally distinct populations that act in concert in CNS plasticity and repair. Front Cell Neurosci. 7, 34(2013).
  6. Miron, V. E., Franklin, R. J. Macrophages and CNS remyelination. J Neurochem. 130 (2), 165-171 (2014).
  7. Mildner, A., et al. Distinct and non-redundant roles of microglia and myeloid subsets in mouse models of Alzheimer's disease. J Neurosci. 31 (31), 11159-11171 (2011).
  8. Boillee, S., et al. Onset and progression in inherited ALS determined by motor neurons and microglia. Science. 312 (5778), 1389-1392 (2006).
  9. Yamasaki, R., et al. Differential roles of microglia and monocytes in the inflamed central nervous system. J Exp Med. 211 (8), 1533-1549 (2014).
  10. Wu, D. C., et al. Blockade of microglial activation is neuroprotective in the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine mouse model of Parkinson disease. J Neurosci. 22 (5), 1763-1771 (2002).
  11. Cartier, N., Lewis, C. A., Zhang, R., Rossi, F. M. The role of microglia in human disease: therapeutic tool or target? Acta Neuropathol. 128 (3), 363-380 (2014).
  12. Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., McNagny, K. M., Rossi, F. M. Infiltrating monocytes trigger EAE progression, but do not contribute to the resident microglia pool. Nat Neurosci. 14 (9), 1142-1149 (2011).
  13. Funk, N., et al. Characterization of peripheral hematopoietic stem cells and monocytes in Parkinson's disease. Mov Disord. 28 (3), 392-395 (2013).
  14. Butovsky, O., et al. Modulating inflammatory monocytes with a unique microRNA gene signature ameliorates murine ALS. J Clin Invest. 122 (9), 3063-3087 (2012).
  15. Lewis, C. A., Solomon, J. N., Rossi, F. M., Krieger, C. Bone marrow-derived cells in the central nervous system of a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis are associated with blood vessels and express CX(3)CR1. Glia. 57 (13), 1410-1419 (2009).
  16. Sedgwick, J. D., et al. Isolation and direct characterization of resident microglial cells from the normal and inflamed central nervous system. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (16), 7438-7442 (1991).
  17. Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigen presentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared. J Immunol. 154 (9), 4309-4321 (1995).
  18. Martin, E., Boucher, C., Fontaine, B., Delarasse, C. Distinct inflammatory phenotypes of microglia and monocyte-derived macrophages in Alzheimer's disease models: effects of aging and amyloid pathology. Aging Cell. , (2016).
  19. Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), E1738-E1746 (2016).
  20. Jin, L. W., et al. Dysregulation of glutamine transporter SNAT1 in Rett syndrome microglia: a mechanism for mitochondrial dysfunction and neurotoxicity. J Neurosci. 35 (6), 2516-2529 (2015).
  21. Bedi, S. S., Smith, P., Hetz, R. A., Xue, H., Cox, C. S. Immunomagnetic enrichment and flow cytometric characterization of mouse microglia. J Neurosci Methods. 219 (1), 176-182 (2013).
  22. Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. J Neuroinflammation. 9, 147(2012).
  23. Mizutani, M., et al. The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood. J Immunol. 188 (1), 29-36 (2012).
  24. Lecoeur, H., Ledru, E., Gougeon, M. L. A cytofluorometric method for the simultaneous detection of both intracellular and surface antigens of apoptotic peripheral lymphocytes. J Immunol Methods. 217 (1-2), 11-26 (1998).
  25. Richter, N., et al. Glioma-associated microglia and macrophages/monocytes display distinct electrophysiological properties and do not communicate via gap junctions. Neurosci Lett. 583, 130-135 (2014).
  26. Mahad, D., et al. Modulating CCR2 and CCL2 at the blood-brain barrier: relevance for multiple sclerosis pathogenesis. Brain. 129 (Pt 1), 212-223 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Makrofagi mikroglejalnemakrofagi OUNwirowanie w gradiencie g sto cimarkery CD11b CD45izolacja kom rekanaliza cytometrycznakom rki odporno ciowe OUNekspresja marker w

Powiązane artykuły