Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja pierwotnych mysich komórek zwojowych siatkówki (RGC) za pomocą cytometrii przepływowej

15.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55785

⸱

5 lipca 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, Hamilton Eye Institute, University of Tennessee Health Science Center, 2Department of Microbiology, Immunology and Biochemistry, University of Tennessee Health Science Center, 3Department of Anatomy and Neurobiology, University of Tennessee Health Science Center, 4Department of Pharmaceutical Sciences, University of Tennessee Health Science Center

W tym artykule

Podsumowanie

Miliony ludzi cierpią na choroby zwyrodnieniowe siatkówki, które prowadzą do nieodwracalnej ślepoty. Wspólnym elementem wielu z tych chorób jest utrata komórek zwojowych siatkówki (RGC). Ten szczegółowy protokół opisuje izolację pierwotnych mysich RGC przez selekcję dodatnią i ujemną za pomocą cytometrii przepływowej.

Streszczenie

Choroby neurodegeneracyjne często mają niszczący wpływ na osoby dotknięte chorobą. Utrata komórek zwojowych siatkówki (RGC) jest związana z szeregiem chorób, w tym retinopatią cukrzycową i jaskrą, a także z normalnym starzeniem się. Pomimo swojego znaczenia, RGC były do tej pory niezwykle trudne do zbadania, częściowo ze względu na fakt, że stanowią one tylko niewielki procent szerokiej gamy komórek w siatkówce. Ponadto obecne metody izolacji wykorzystują markery wewnątrzkomórkowe do identyfikacji RGC, które wytwarzają komórki niezdolne do życia. Techniki te obejmują również długie protokoły izolacji, więc brakuje praktycznych, ustandaryzowanych i niezawodnych metod uzyskiwania i izolowania RGC. Praca ta opisuje wydajną, kompleksową i niezawodną metodę izolowania pierwotnych RGC z siatkówki myszy przy użyciu protokołu opartego zarówno na pozytywnych, jak i negatywnych kryteriach selekcji. Przedstawione metody pozwalają na przyszłe badania RGC, mające na celu lepsze zrozumienie znacznego spadku ostrości wzroku, który wynika z utraty funkcjonalnych RGC w chorobach neurodegeneracyjnych.

Wprowadzenie

RGC są nieuleczalnie zróżnicowanymi neuronami, dlatego do eksperymentów potrzebne są komórki pierwotne. Opracowanie protokołu izolacji i wzbogacania pierwotnych mysich komórek zwojowych siatkówki (RGC) ma zasadnicze znaczenie dla ujawnienia mechanizmów zdrowia i degeneracji RGC in vitro. Jest to szczególnie ważne w przypadku badań, które mają na celu wygenerowanie potencjalnych terapii promujących funkcję RGC i minimalizujących ich śmierć. Zwyrodnienie RGC jest związane z chorobami zwyrodnieniowymi siatkówki, takimi jak jaskra, retinopatia cukrzycowa i normalne starzenie się. Chociaż konkretne mechanizmy komórkowe leżące u podstaw utraty RGC są niejasne, zidentyfikowano szereg czynników ryzyka. Brak dotlenienia w głowie nerwu wzrokowego1,2,3 powoduje śmierć RGC4 i działa jako zaburzenie homeostazy między aktywacją receptorów pobudzających i hamujących w obrębie poszczególnych RGCs5,6. Szereg wyzwań hamuje postęp w kierunku wykorzystania tych komórek do dogłębnych badań. Po pierwsze, liczba RGC obecnych w siatkówce myszy jest niewielka. RGC stanowią mniej niż 1% wszystkich komórek siatkówki7,8,9. Po drugie, większość markerów specyficznych dla RGC to białka wewnątrzkomórkowe10,11,12. Selekcja na podstawie tych markerów sprawia, że komórki są niezdolne do życia, co wyklucza dalsze analizy funkcjonalne. Wreszcie, obecnie dostępne protokoły są długie i brakuje im standaryzacji13,14. Wczesne protokoły izolacji RGC opierały się na metodach immunopanningu. Barres i wsp.15 zaadaptował klasyczną technikę immunopanningu i dodał drugi krok, który wykluczał monocyty i komórki śródbłonka z większości komórek siatkówki przed pozytywną selekcją opartą na immunopozytywności anty-tymocytu antygenu (aka Thy1), markera powierzchni komórki. Wiele lat później Hong i in. połączyli techniki izolacji kulek magnetycznych ze strategiami sortowania komórek, aby wyizolować RGC o wyższej czystości16. Zastosowanie kulek magnetycznych jest nadal wykorzystywane w wielu zastosowaniach naukowych. Razem kulki magnetyczne i protokoły cytometrii przepływowej poprawiły czystość wyizolowanych komórek. Jednak te systemy oczyszczania nie zostały jeszcze znormalizowane do izolacji mysich RGC od zdysocjowanych siatkówk.

Cytometria przepływowa to potężna metoda analityczna, która mierzy charakterystyki optyczne i fluorescencyjne zawiesin komórkowych. Komórki są analizowane zarówno ilościowo, jak i jakościowo z wysokim poziomem czułości, zapewniając wielowymiarową analizę populacji komórek. Dyskryminacja komórkowa opiera się na dwóch głównych właściwościach fizycznych: rozmiarze lub powierzchni komórki oraz ziarnistości lub złożoności wewnętrznej17. Analizę wielowymiarową można przeprowadzić, łącząc przeciwciała oznaczone fluorochromami, które mają podobne długości fal wzbudzenia i różne emisje. Cytometria przepływowa jest szybka, powtarzalna i czuła. Lasery Multitpe pozwalają na jeszcze większe wielowymiarowe analizy pojedynczych komórek za pomocą cytometrii przepływowej. Jest to więc atrakcyjna metodologia badania próbek cytologicznych. Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) wykorzystuje wielowymiarowe różnice fenotypowe zidentyfikowane za pomocą cytometrii przepływowej do sortowania pojedynczych komórek w odrębne subpopulacje.

W ostatnim dziesięcioleciu wiele białek powierzchniowych i wewnątrzkomórkowych zostało zidentyfikowanych jako potencjalne biomarkery dla selekcji komórek, w tym neuronów. Początkowe badania, które miały na celu wyizolowanie RGC od szczurów, wykorzystywały Thy1 jako marker komórek zwojowych. Niestety, Thy1, znany również jako CD90, ma wiele izoform u innych gatunków gryzoni18,19,20 i jest wyrażany przez wiele typów komórek siatkówki19,20, co czyni go niespecyficznym markerem dla RGC. Inny marker powierzchniowy, CD48, znajduje się w populacjach monocytowych siatkówki, w tym makrofagach i mikrogleju. Korzystając z tych dwóch znaczników powierzchniowych, opracowano zmodyfikowaną sygnaturę RGC - komórkineg Thy1+ i CD48 - 15,16,21,22. Niestety, te dwa kryteria selekcji nie są wystarczające do selekcji dla wysoce wzbogaconej populacji RGC. Aby odpowiedzieć na tę niezaspokojoną potrzebę, opracowano protokół cytometrii przepływowej23 oparty na wielowarstwowych kryteriach selekcji dodatniej i ujemnej przy użyciu znanych markerów powierzchni komórek w celu wzbogacenia i oczyszczenia pierwotnych mysich RGC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury szczegółowo opisane w poniższym protokole zostały zatwierdzone przez komisję rewizyjną Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) w Centrum Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Tennessee (UTHSC) i były zgodne z Oświadczeniami Stowarzyszenia Badań nad Wzrokiem i Okulistyką (ARVO) dotyczącymi wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych, oprócz wytycznych dotyczących eksperymentów na zwierzętach laboratoryjnych (Instytut Zasobów Zwierząt Laboratoryjnych, Polityka publicznej służby zdrowia w zakresie humanitarnej opieki i wykorzystywania zwierząt laboratoryjnych).

1. Przygotowanie instrumentów, roztworów i mediów

Uwaga: Wszystkie informacje o materiałach, odczynnikach, narzędziach i instrumentach zgłoszone w protokole są określone w Tabeli Materiałów.

  1. Wszystkie narzędzia preparacyjne należy przeznaczyć na autoklaw i przechowywać w sterylnym miejscu. Użyj następujących narzędzi: 4 standardowe kleszcze (2 długie i 2 krótkie) i 2 nożyczki, a także 2 kleszczyki (1 długi i 1 krótki) oraz 1 nożyczki do sekcji; Zachowaj dodatkowy zestaw jako kopię zapasową.
  2. Przygotuj 100 ml sterylnego roztworu PBS/1% FBS do użycia podczas mycia, procedur znakowania immunologicznego i etapów sortowania komórek. Roztwór przechowywać w stanie schłodzonym w temperaturze 4 °C.
    nuta: Nie należy dodawać azydku sodu (NaN3) do roztworu, ponieważ może on być toksyczny dla żywych komórek.
    1. Przygotuj 100 ml PBS/1% FBS z 99 ml PBS i 1 ml FBS.
  3. Przygotować 100 ml sterylnej pożywki z komórek nerwowych uzupełnionej 3% FBS (patrz tabela materiałów) do użycia jako pożywka do pobierania i hodowli. Utrzymywać pożywkę do hodowli komórkowych w sterylnej temperaturze 4 °C. Przed użyciem należy go ogrzać tylko do temperatury pokojowej (RT).
    1. Przygotuj 100 ml pożywki z komórek nerwowych uzupełnionej 3% FBS, używając 97 ml pożywki z komórek nerwowych i 3 ml FBS.
  4. Probówki zbiorcze do wstępnego schładzania (probówki o pojemności 15 ml) wstępnie pokryte 5 ml pożywki zbiorczej poprzez umieszczenie ich w wiaderku na lód. Używaj wyłącznie rurek polipropylenowych, aby zapobiec przywieraniu komórek do powierzchni rurki.
  5. Umieść 40-milimetrowe szalki, nylonowe sitka 70 μm, strzykawki, tłuczki do sitka komórkowego i sterylne probówki polipropylenowe w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Wysterylizuj wszystkie przedmioty przed zabiegami i utrzymuj je w sterylny sposób przez cały czas trwania zabiegów.
    nuta: Wszystkie czynności po pobraniu siatkówki zostaną wykonane w komorze bezpieczeństwa biologicznego.

2. Wyłuszczenie

Uwaga: W sumie 10 młodych (5-7 tygodni) myszy C57BL/6J zostało wyizolowanych w tym eksperymencie 1,0 x 106 RGC o fenotypie CD90.2+CD48negCD15negCD57neg.

  1. Poddaj myszy eutanazji za pomocą inhalacji CO2, a następnie zwichnięcia szyjki macicy. Zawsze stosuj wtórną metodę eutanazji, aby upewnić się, że uśpione zwierzę jest martwe.
    nuta: Izofluoran może być stosowany jako alternatywa dla CO2 . Ketamina nie jest zalecana, ponieważ wiąże się ze wzrostem ciśnienia wewnątrzgałkowego (IOP), gdy jest stosowana jako induktor znieczulenia24,25.
  2. Włóż kleszcze pod gałkę oka, chwyć nerw wzrokowy i pociągnij do góry; gałka zostanie wyłuszczona, z nienaruszonym nerwem wzrokowym. Umieścić pobrane oczy w fiolce zawierającej PBS i trzymać fiolkę na lodzie do następnego kroku.
    nuta: Każdy personel może wykonać ten krok po otrzymaniu odpowiedniego szkolenia od Zakładu Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi (LACU).

3. Przygotowanie zawiesiny komórek siatkówki

  1. Umieść zebrane oko na płycie podstawy mikroskopu preparacyjnego, aby rozpocząć sekcję rogówki. Przeanalizuj każde oko z osobna.
  2. Ostrożnie przytrzymaj gałkę u podstawy nerwu wzrokowego za pomocą kleszczy. Na tym etapie użyj jednego długiego i jednego krótkiego standardowego kleszcza.
  3. Użyj ostrej igły o rozmiarze 30 (30G), aby przebić rogówkę, aby umożliwić ewakuację cieczy wodnistej z oka, co ułatwia trzymanie oka kleszczami.
  4. Przytrzymaj rogówkę kleszczami i użyj nożyczek, aby wykonać małe nacięcie w rogówce. Delikatnie obierz rogówkę i twardówkę za pomocą kleszczy. Gdy gałka jest oderwana do połowy, rozwałkuj siatkówkę i soczewkę za pomocą kleszczy. Wyrzuć rogówkę, twardówkę i soczewkę.
    nuta: Ta metoda zapewnia, że siatkówka całkowicie odrywa się od pozostałej części oka.
  5. Umieść siatkówkę na małej 40-milimetrowej szalce Petriego zawierającej PBS/1% FBS.
    nuta: Jako alternatywę dla szalki Petriego można użyć szalki do hodowli komórkowych. Upewnij się, że siatkówka jest zawsze wilgotna, tak jak w warunkach fizjologicznych.
    1. Umyj każdą siatkówkę trzy razy świeżym sterylnym PBS/1% FBS w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
  6. Umieść do 12 siatkówek na sterylnym nylonowym sitku o grubości 70 μm zwilżonym PBS/1% FBS. Używając końcówki strzykawki o pojemności 10 ml, delikatnie maceruj siatkówkę, wykonując okrężne ruchy, aby odłączyć komórki.
    1. Alternatywnie, użyj tłuczka do maceracji sitka komórkowego lub użyj trawienia enzymatycznego z kombinacją 15 IU/ml papainy, 5 mM L-cysteiny i 200 U/ml DNazy I przez 15 minut w temperaturze 37 °C, a następnie inaktywacji PBS/10% FBS.
      nuta: Nie zaobserwowano zmian w odsetku odzyskanych komórek, gdy trawienie enzymatyczne porównano z maceracją za pomocą tylnej części strzykawki lub tłuczka.
  7. Aby przenieść izolowane komórki, umieść sterylne nylonowe sitko o średnicy 70 μm na probówce do pobierania polipropylenu. Przepuść zebrane komórki przez sitko za pomocą pipety P1000. Przepłukać sitko (krok 3.6) PBS/1% FBS, aby uwolnić pozostałe komórki i przenieść je do probówki zbiorczej.
  8. Dodaj PBS/1% FBS, aby uzyskać końcową objętość 1 ml na siatkówkę. Odwirowywać zawiesinę komórek przez 7 minut przy 200 x g i RT.
    nuta: W zależności od liczby macerowanych siatkówek (< 6 siatkówek) osad komórkowy może być zbyt mały, aby był widoczny.
    1. Odrzucić supernatant komórkowy i ponownie zawiesić osad komórkowy w PBS/1% FBS, stosując proporcję 1 ml na 5 siatkówk.
  9. Policz komórki za pomocą hemocytometru.
    1. Wyczyść szklany hemocytometr i szkiełko nakrywkowe 70% alkoholem. Delikatnie zakręć rurką zawierającą komórki, aby upewnić się, że zawiesina komórek siatkówki jest równomiernie rozprowadzona. Umieścić 20 μl 0,4% błękitu trypanowego w probówce do mikrowirówki i wymieszać z 20 μl zawiesiny komórek.
    2. Delikatnie wymieszać i nanieść 10 μl mieszaniny 0,4% błękitu trypanowego i zawiesiny komórek do hemocytometru, wypełniając obie komory; działanie kapilarne wciągnie 0,4% mieszaninę zawiesiny błękitu trypanowego/komórek pod szkiełko nakrywkowe. Za pomocą mikroskopu policz wszystkie trypanowe komórki niebiesko-ujemne; Ta liczba reprezentuje żywe komórki.
    3. Określ żywotność komórek za pomocą następującego wzoru: liczba żywych komórek / całkowita liczba komórek = % żywotności.
      nuta: Jeśli żywotność komórek jest mniejsza niż 95%, podczas FACS wymagane jest użycie barwnika fluorescencyjnego do dyskryminacji żywotności komórek.
  10. Użyj fluorescencyjnego barwnika żywotności, który nie jest przepuszczalny dla żywych komórek. Umyj komórki PBS, aby usunąć wszelkie ślady surowicy. Dodać 1 μl barwnika fluorescencyjnego w celu rozróżnienia żywotności komórek na 5,0 x 106 komórek w 100 μl końcowej objętości. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut, chroniąc przed światłem. Dodaj 10 razy większą objętość PBS/1% FBS. Wirować przez 5 minut przy 200 x g i RT.
  11. W razie potrzeby inkubować zawiesinę komórkową przez noc w temperaturze 4 °C. Jeśli tak się stanie, napełnij rurkę z zawiesiną komórek pożywką z komórek nerwowych, a nie PBS/1% FBS. Umieścić probówkę poziomo i utrzymywać ją w temperaturze 4 °C.

4. Znakowanie immunologiczne komórek siatkówki

  1. Użyj następującej konwersji, aby określić objętość przeciwciała na liczbę komórek: 2 μl przeciwciała na 5,0 x 106 komórek w objętości 100 μl.
  2. Umyj komórki i utrzymuj je w PBS/1% FBS. Weź małą porcję komórek (5,0 x 106 komórek), aby użyć jej jako kontroli ujemnej (nieoznakowanej) w czasie konfiguracji sortowania.
    nuta: Ta negatywna kontrola ma kluczowe znaczenie dla prawidłowej kalibracji sortera komórek.
  3. Aby zminimalizować nieswoiste wiązanie przeciwciał z komórkami, które wyrażają receptory Fcγ II i III, dodaj 1 μl przeciwciała anty-mysiego CD16/32 na 1,0 x 106 komórek w 50-μl końcowej objętości przy użyciu PBS / 1% FBS. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Dodać koktajl przeciwciał do próbki i delikatnie wymieszać pipetując. Inkubować przez 30 minut w wiaderku z lodem. Upewnij się, że pojemnik na lód jest przykryty, ponieważ światło może zagrozić eksperymentowi z powodu fotowybielania oznaczonych fluoroforów.
    1. Przygotuj koktajl przeciwciał, używając następujących fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał przeciw myszy: CD90.2 AF-700, CD48 PE-cyjanina7, CD15 PE i nieoznakowana CD57.
      nuta: Dla każdego przeciwciała należy zastosować następujące stężenia na 5,0 x 106 komórek: CD90,2 AF700, 1 μg; CD48 PE-cyjanina7, 0,4 μg; CD15 PE, 0,02 μg; i nieoznakowany CD57, 0,4 μg.
      1. Należy użyć objętości zgodnie z poniższymi obliczeniami (w oparciu o dostępne na rynku przeciwciała wymienione w Tabeli materiałów): łącznie 5,0 x 107 komórek do znakowania; 2 μL na 5,0 x 106 komórek = 20 μL każdego przeciwciała; 4 różne przeciwciała = 80 μL koktajlu przeciwciał; końcowa objętość = [(5,0 x 10 7 całkowitych komórek)/5,0 x 106 komórki] x 100 = 1 000 μL ; 80 μL Abs + 50 μL anty-mysiego CD16/32 + 870 μL PBS/1% FBS = 1 000 μL.
        nuta: Ta kombinacja zapewniła optymalną kombinację fluorochromów dla konfiguracji instrumentu. Następujące parametry podsumowują emisję i wzbudzenie: AF-700, emisja 719 nm po wzbudzeniu czerwonym laserem diodowym o długości 638 nm; PE-cyjanina7, emisja 767 nm przy wzbudzeniu niebieskim laserem diodowym 488 nm; i PE, emisja 575 nm po wzbudzeniu niebieskim laserem diodowym o długości 488 nm.
  5. Po 30-minutowej inkubacji zwiększyć objętość do 5 ml za pomocą PBS/1% FBS. Przemyć próbki, odwirowując je przez 7 minut przy 200 x g i RT. Powtórzyć procedurę raz, aby usunąć wszystkie niezwiązane przeciwciała.
  6. Dodaj 2 μl przeciwciała drugorzędowego (0,1 μg), które zwiąże CD57 z 5,0 x 106 komórek. Inkubować przez 30 minut w wiaderku z lodem, jak w kroku 4.4. Umyj komórki dwukrotnie, jak w kroku 4.5.
    1. Oznacz komórki przeciwciałem drugorzędowym, jeśli w kroku 4.4.
      użyto nieoznakowanego przeciwciała pierwszorzędowego. nuta: Przeciwciało drugorzędowe z wyboru dla tej konfiguracji jest wymienione w Tabeli materiałów; Ma długość fali emisji 421 nm. Używaj go z filtrem pasmowoprzepustowym 450/50 nm po wzbudzeniu fioletowym laserem diodowym przy 405 nm.
    2. Objętości należy stosować zgodnie z poniższymi obliczeniami (w oparciu o dostępne na rynku przeciwciało wymienione w tabeli materiałów): 2 μL na 5,0 x 106 komórek = 20 μL przeciwciała drugorzędowego; objętość końcowa = [(5,0 x 10 7 komórek ogółem)/5,0 x 106 komórek] x 50 = 500 μL; 20 μL Abs + 480 μL PBS/1% FBS = 500 μL.
  7. Zachowaj oznaczone komórki w PBS/1% FBS. Policz komórki za pomocą hemocytometru; zastosować końcowe stężenie komórek siatkówki 3,0 - 4,0 x 107 komórek/ml.
    nuta: Nie używaj pożywki do hodowli komórkowych do rozcieńczania komórek, ponieważ czerwień fenolowa może zwiększyć autofluorescencję, zmniejszając w ten sposób rozdzielczość między komórkami ujemnymi i dodatnimi. Końcowe stężenie ogniwa na objętość w dużym stopniu zależy od objętościowego natężenia przepływu w konfiguracji urządzenia.
  8. Podczas konfiguracji używaj jednokolorowych elementów sterujących, aby zminimalizować rozlewanie się fluorescencji.
    nuta: Ten krok, znany również jako kompensacja, jest stosowany w celu skorygowania szumu powstałego w wyniku połączenia fluoroforów. Mikrosfery polistyrenowe w PBS/0,1% BSA/2 mM NaN3 ze zdolnością wiązania znakowanych fluorescencyjnie izotypów immunoglobulin (Ig) z wielu gatunków zapewniają pozytywne kontrole w celu ustalenia kompensacji.
    1. Umieść 3 krople mikrosfer polistyrenu w sterylnych probówkach FACS, przydzielając po jednej na fluorofor. Dodać 1 μg odpowiedniego fluoroforu do każdej probówki. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej, chronić przed światłem. Dodać 3 ml PBS/1% FBS do probówek z próbkami. Wirować przez 5 minut przy 200 x g i RT. Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić w 250 μl PBS/1% FBS.
    2. Aby ustawić kontrole negatywne, użyj mikrosfer polistyrenu, które nie wiążą się z Ig. W razie potrzeby wykonaj ten krok dzień wcześniej.

5. Strategia sortowania komórek

Uwaga: Szczegółowe instrukcje dotyczące konfiguracji przyrządów dla FACS z 355 nm, UV; 405 nm, fioletowy; 488 nm, niebieski; i 640 nm, czerwone lasery z odpowiednio 2, 2, 5 i 3 kanałami fluorescencji. Oprogramowanie operacyjne to DIVA w wersji 8.0.1. Sortowanie komórek przeprowadzono za pomocą dyszy 70 μm, ciśnienia osłony 70 psi, częstotliwości 87,5, amplitudy 48,6 z zerwaniem pierwszej kropli przy 333, ustawieniu odstępu 6, precyzji sortowania ustawionej na czystość czterokierunkową z domyślną (32) maską czystości i opóźnieniem upuszczania dostosowanym do 42,98 za pomocą koralików.

  1. Użyj stożkowych probówek polipropylenowych o pojemności 15 ml jako naczyń zbiorczych. Dodaj 5 ml pożywki zbiorczej (pożywki do hodowli komórkowych) do każdej probówki i obróć probówkę, aby pokryć ścianki.
    nuta: Ten krok zapobiega przywieraniu komórek do boków probówki zbiorczej. Alternatywnie tuba może być pokryta nierozcieńczonym FBS.
  2. Weź pod uwagę wydajność sortera komórek, aby oszacować ostateczną wydajność komórek.
    nuta: Wydajność sortowania różni się w zależności od zastosowanego cytometru przepływowego. RGC z fenotypem CD90.2 + CD48negCD15negCD57neg stanowią około 1% wszystkich komórek siatkówki.
  3. Zleć sortowanie komórek przeszkolonemu operatorowi (zwykle w głównym obiekcie). Upewnij się, że instrument jest oczyszczony i wysterylizowany 70% etanolem przed pobraniem próbki. Ostrożnie przetrzyj zewnętrzną część probówek zbiorczych również 70% etanolem.
  4. Jeśli komórki osiadły lub zagregowały się, przed pobraniem należy je pipetować w górę i w dół, a następnie przefiltrować zawiesinę przez sterylne nylonowe sitko o średnicy 40 μm. Upewnij się, że kontrolujesz temperaturę i utrzymujesz ją na poziomie 4 °C podczas sortowania komórek; Niezastosowanie się do tego spowoduje zmniejszenie wydajności komórek.
  5. Omów szczegóły sortowania z operatorem sortera komórek przed wykonaniem eksperymentów.
    nuta: W czasie eksperymentu operator sortownika komórek kliknie serię przycisków na pasku narzędzi Obszar roboczy oprogramowania do akwizycji cytometru. Są to przeglądarka, cytometr, inspektor, arkusz roboczy i pulpit nawigacyjny pozyskiwania. Zastosowana tutaj strategia sortowania komórek jest znana jako sortowanie 2-kierunkowe. Zbierane są dwie populacje: wzbogacone RGC i wszystkie inne typy komórek. Jeśli mają zostać zebrane dodatkowe populacje, można wyizolować do dwóch dodatkowych populacji jako sortowanie 4-kierunkowe. Jeśli zostaną zebrane dodatkowe populacje, sortownik komórek wymaga różnych probówek i konfiguracji.
  6. Wykonaj kompensację, aby skorygować nakładanie się widma od fluoroforów.
    nuta: Proces ten można wykonać ręcznie, dostosowując każde ustawienie, lub można go wykonać automatycznie w ramach używanego oprogramowania. Większość programów do sortowania komórek ma opcję automatycznej kompensacji. Jest uważany za złoty standard i najdokładniejszy rodzaj rekompensaty. Na tym etapie zostanie wykorzystana próbka ujemna (bez fluoroforu) i pojedyncze kontrole przygotowane z mikrosfer polisternowych (kulki kompensacyjne) specjalnie wytworzonych w celu związania wszystkich istotnych przeciwciał monoklonalnych użytych w doświadczeniu.
    1. Wybierz opcję Eksperymentuj > konfiguracji wynagrodzenia> utworzyć kontrolki wynagrodzenia. Dodaj kontrolki specyficzne dla fluoroforu z listy wyświetlanej na ekranie. Kliknij przycisk OK.
      nuta: Zostanie wyświetlona rurka kompensacyjna dla każdego z elementów sterujących.
      1. Użyj nieznakowanej kontroli (bez fluoroforu, krok 4.2), aby zweryfikować światło rozproszone do przodu (FSC), światło rozproszone bocznie (SSC) i bramkować początkową populację (P1).
    2. Zamontuj rurkę kontroli ujemnej na cytometrze i kliknij Załaduj. Sprawdź, czy jest wyświetlana interesująca nas populacja, i wybierz ją. To jest populacja 1 (P1). Kliknij prawym przyciskiem myszy bramkę P1 i wybierz polecenie Zastosuj do wszystkich kontrolek kompensacji. Kliknij przycisk Nagraj dane. Po zakończeniu nagrywania kliknij Rozładuj i wyjmij rurkę.
    3. Zainstaluj następną rurkę na cytometrze, jak pokazano na ekranie. Powtarzaj krok 5.6.2, aż wszystkie dane z kontrolek zostaną zarejestrowane.
    4. Wybierz opcję Experiment > Compensation Setup (Eksperymentuj Konfiguracja wynagrodzenia> Oblicz kompensację. Zapisz konfigurację i nazwij eksperyment. Kliknij Link & Save.
      nuta: Kompensacja jest niezbędnym krokiem, ponieważ usuwa nakładanie się widma między detektorami.
    5. Jeśli potrzebna jest kompensacja ręczna, należy to zrobić, dostosowując średnie sygnałów dodatnich tak, aby były równe ujemnym dla każdego z użytych fluorochromów.
      nuta: Ten krok jest wykonywany przez operację sortowania komórek i może potrwać 30 minut.
  7. Strategia bramkowania ( Rysunek 3A).
    1. Ustaw P1, wykreślając FSC w stosunku do SSC; FSC wskazuje rozmiar, a SSC wskazuje wewnętrzną złożoność komórek. Zobacz Rysunek 3A.
    2. Narysuj wykres pseudokolorowy SSC-H (wysokość) w porównaniu z SSC-W (szerokość) przy użyciu wybranej populacji w kroku 5.7.1 (P1); wykres pseudokolorowy pozwala na wizualną reprezentację gęstości komórek względem siebie.
      nuta: Niższa gęstość komórek jest reprezentowana przez kolor niebieski i zielony, podczas gdy obszary czerwone i pomarańczowe reprezentują wysoką gęstość komórek.
      1. Wykonaj ten krok, aby zebrać tylko pojedyncze komórki; bramka pojedynczej komórki nazywa się P2. Zobacz Rysunek 3A.
    3. Powtórzyć krok 5.7.2, aby wykreślić FSC-H w stosunku do FSC-W przy użyciu P2. Upewnij się, że wybór pojedynczych komórek jako "dubletów" lub skupisk komórek zawiera zarówno pozytywny, jak i ujemny marker, zapewniając fałszywie dodatnią pozytywność.
    4. Narysuj wykres pseudokolorowy CD90.2 i CD48. Wybierz wszystkiekomórki neg CD90.2 + CD48, aby wyeliminować monocyty ze wzbogacenia RGC; nazwij tę bramkę CD90.2 + CD48neg lub P3. Zobacz Rysunek 3A.
    5. Korzystając z wybranej populacjineg CD90.2 + CD48 lub bramki P3, narysuj pseudokolorowy wykres CD57 w porównaniu z CD15, aby wyeliminować zanieczyszczenia komórek amakrynowych ze wzbogacenia RGC. Bramka populacjineg CD15CD57. Zobacz Rysunek 3A.
  8. Zdefiniuj populacje, które mają zostać zebrane dla próbki w oknie "Układ sortowania" i kontynuuj sortowanie komórek; próbka do pobrania to CD90.2+CD48negCD15negCD57neg.
    nuta: Populację do sortowania wybiera się z rozwijanego menu Dodaj w oknie sortowania. Po dodaniu populacji zapyta o zdarzenia docelowe lub ile zdarzeń ma zostać zebranych. W dowolnym momencie układ sortowania można edytować, klikając pole Lokalizacja sortowania zawierające populację. 0,9% ± 0,3 RGC o fenotypie CD90.2+CD48negCD15negCD57neg uzyskuje się od młodych (5-7 tygodni) i 0,5% ± 0,3 i starych (>12 miesięcy) myszy C57BL/6J23.
  9. Korzystając z 25 000 komórek, wykonaj kontrolę czystości23. Zobacz Rysunek 3B-E.
    nuta: Kontrola czystości to proces ponownej analizy posortowanych komórek w celu sprawdzenia dokładności sortowania komórek. Niewielka porcja posortowanych komórek zostanie załadowana do cytometru w celu sprawdzenia skuteczności sortowania.

6. Potwierdzenie na markerach wewnątrzkomórkowych RGC

  1. Etykietowanie wewnątrzkomórkowe.
    1. Utrwalić posortowane komórki przez 1 godzinę i przepuszczalność w temperaturze 4 °C, aby komórki stały się metabolicznie nieaktywne i aby umożliwić przenikanie wewnątrzkomórkowych przeciwciał.
    2. Rozcieńczyć następujące przeciwciała w roztworze permeabilizacyjnym: białko wiążące anty-RNA z wielokrotnym splicingiem (RBPMS) w rozcieńczeniu 1:100 w zapasie 100 μg/ml; anty-synukleina gamma (SNCG) 1:100 w 1 mg/ml podstawy; specyficzne dla mózgu białko homeobox/domena POU 3A (BRN3A), 1:100 w 200 μg/ml zapasu; i beta-tubulina specyficzna dla neuronów klasy III (TUJ1), 1:100 w zapasie 1 mg/ml. Inkubować komórki i roztwory przeciwciał przez 1 godzinę w przykrytym wiadrze z lodem.
    3. Próbki należy przemyć dwukrotnie PBS/1% FBS.
    4. Ponownie zawiesić komórki w odpowiednim przeciwciałie drugorzędowym znakowanym AF488 w rozcieńczeniu 1:200 przez 30 minut w wiadrze z lodem.
    5. Umyć próbki jak w kroku 6.1.3. Przechowuj komórki w PBS/1% FBS (250 μl) do momentu, gdy będą gotowe do analizy.

7. Walidacja sortowania komórek za pomocą analizy qPCR

Uwaga: Zobacz Rysunek 4.

  1. Ekstrakcja RNA23.
    1. Ekstrahuj RNA z5,0 x 10 5 posortowanych komórek przez lizę komórek i homogenizację, a następnie dodanie chloroformu.
    2. Przenieś górną, bezbarwną fazę do czystej mikroprobówki w celu wytrącenia alkoholu, a następnie zatężenia ekstraktu w kolumnie wirowej. Przeprowadzić trawienie DNAzy na kolumnie.
    3. Przemyć kolumnę wodą wolną od RNaz w celu elucji RNA.
    4. Ocenić stężenie RNA za pomocą spektrofotometrii.
  2. Synteza i wstępna amplifikacja cDNA.
    1. Użyć 100 ng materiału RNA i wymieszać z roztworem zawierającym enzym odwrotnej transkryptazy, rekombinowany inhibitor rybonukleazy (w celu uniknięcia degradacji RNA), chlorek magnezu (MgCl2) i deoxynukleotydy.
    2. Wymieszać zawartość probówki i inkubować przez 10 minut w temperaturze 25 °C, a następnie 60 minut w temperaturze 42 °C. Zakończyć reakcję 5-minutową inkubacją w temperaturze 85 °C. Otrzymany cDNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu przygotowania do użycia><. Uwaga: materiał cDNA może być przechowywany w temperaturze -20 °C przez okres do miesiąca, jeśli etap wstępnej amplifikacji nie może być przeprowadzony natychmiast.
  3. Wstępna amplifikacja cDNA.
    1. Wstępna amplifikacja materiału cDNA przy użyciu serii starterów specyficznych dla wielu typów komórek siatkówki, w tym: komórek zwojowych siatkówki, komórek amakrynowych, astrocytów, komórek Müllera, dwubiegunowych, poziomych, fotoreceptorów i komórek nabłonka barwnikowego siatkówki, jak wyszczególniono w Piśmiennictwie 23 i w Tabeli materiałów.
      nuta: Reakcja przed amplifikacją jest przygotowywana w celu zwiększenia czułości detekcji do oznaczania ilościowego. Reakcja wstępnego amplifikacji zawiera mieszaninę mieszanek starterów z tabeli materiałów; 2,5 μl cDNA, które zaczynało się od 100 ng RNA; enzym odwrotnej transkryptazy; i woda wolna od nukleaz w końcowej objętości 10 μl.
    2. Przeprowadzić etap aktywacji enzymu w temperaturze 95 °C przez 10 minut, następnie 14 cykli w temperaturze 95 °C przez 15 s, a następnie w temperaturze 60 °C przez 4 minuty. Rozcieńczyć wstępnie wzmocniony materiał w stosunku 1:10 w buforze Tris EDTA i utrzymywać go w temperaturze -20 °C do momentu przygotowania do użycia.
  4. 7,4 Reakcja qPCR.
    1. Przygotować wszystkie reakcje qPCR w końcowej objętości 10 μl, używając rozcieńczonego, wstępnie amplifikowanego cDNA (2,5 μl), starterów (wymienionych w Tabeli Materiałów), wody wolnej od nukleaz i koncentratu z polimerazą DNA i deoksynukleotydami.
    2. Do przeprowadzenia qPCR należy zastosować następujące warunki przyrządu: krok wstrzymania 50 °C przez 2 minuty, a następnie 95 °C przez 10 minut. Uruchomić łącznie 40 cykli w temperaturze 95 °C przez 15 s, a następnie 60 °C przez 1 minutę. Wykonać wszystkie pomiary w powtórzeniach po trzy.
    3. Przeprowadzić względną kwantyfikację przy użyciu progu porównawczego (CT) po określeniu wartości CT dla genu porządkowego i genów docelowych w każdej próbce. Oblicz względną zmianę krotności (Rq) za pomocą następującego równania: Rq = 2T –∆C, gdzie ∆CT = CT gen docelowy – gen referencyjny CT23.
      nuta: CT definiuje się jako cykl PCR, w którym sygnał fluorescencyjny barwnika reporterowego przekracza arbitralnie umieszczony próg26. CT jest odwrotnie proporcjonalne do ilości amplikonu (produktu PCR) w reakcji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Pogłębione badanie RGC jest utrudnione przez wiele czynników, w tym ich niską częstotliwość występowania oraz brak solidnej i standaryzowanej metodologii ich izolacji. Rysunek 1 przedstawia metodologię stosowaną do izolacji siatkówek. Istnieją różnice w procedurze enukleacji w zależności od rodzaju analizy, na przykład gdy enukleacja jest częścią eksperymentu in vivo27. Enukleacja w niniejszym protokole jest przeprowadzana na ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

FACS jest techniką z wyboru do oczyszczania populacji komórek. Inne metody izolacji obejmują immunopanting, kulki magnetyczne i zubożenie fiksacji dopełniacza. Przewaga FACS nad innymi metodologiami opiera się na jednoczesnej identyfikacji markerów na powierzchni komórki o różnym stopniu intensywności. Intensywność fluorescencji cząsteczki jest proporcjonalna do ilości ekspresji białka. Do tej pory izolacja RGC opierała się wyłącznie na dodatnim Thy1 (CD90) i ujemnym CD48 15,16,22,34, n...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Panu Timowi Higginsowi, Starszemu Ilustratorowi z Wydziału Mikrobiologii, Immunologii i Biochemii, za techniczną pomoc wideo; Dr. Matthew W. Wilsonowi za dyskusje oraz członkom laboratoriów Jablonskiego i Moralesa-Tirado za ich pomocne komentarze. Prace te były wspierane przez Alcon Research Institute Young Investigator Award (VMM-T), University of Tennessee Research Foundation (VMM-T), National Eye Institute EY021200 (MMJ), Gerwin Fellowship (VMM-T); stypendium Gerwin Pre-doctoral Fellowship (ZKG), Dowództwo Badań Medycznych i Materiałowych Departamentu Obrony Armii (VMM-T) oraz Unrestricted Grant from Research to Prevent Blindness.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Anty-mysz CD15 PEBioLegend125606Clone MC-480
Anty-mysz CD48 PE-Cy7BioLegend103424Clone HM48-1
Anty-mysz CD57Sigma AldrichC6680-100TSTKlon VC1.1
Anty-mysz CD90.2 AF700BioLegend105320Klon 30-H12
Brylantowy fiolet 421 Koza Anty-mysz IgGBioLegend405317Clone Poly4053
Oczyszczony blok przeciw myszom CD16/32BioLegend101302FcgRII/III, klon 93
Zombie Aqua BioLegend423102Dyskryminacja żywych komórek/martwych komórek
Płodowa surowica bydlęcaHyclonSH30071.03Pochodzenie amerykańskie
Zestaw kulek do całkowitej kompensacji przeciwciał AbCThermo Fisher ScientificA10497Wielogatunkowy Ig
Neurobasal MediumThermo Fisher Scientific21103049Dodaj surowicę do pożywki przed hodowlą.
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Thermo Fisher Scientific10010049roztwór soli
fizjologicznej Mikroskop preparacyjnyOlympusSZ-PT ModelMikroskop stereoskopowy
Wirówka SorvallThermo ScientificST 16RWszystkie wirowanie wykonane  na
płycie bazowej RT – Patelnia preparcyjnaFisher ScientificSB15233FIMMożna również użyć płytki woskowej
KleszczeAesculap5002-74 i frac12; cale
Nożyczki do tęczówki, prosteAesculap13605 i frac12; cale
Falcon 15 mL probówki stożkoweFisher Scientific352097Rurki polipropylenowe
Falcon 50 mL rurki stożkoweFisher Scientific352098Rurki polipropylenowe
Rurki BD FACS FisherScientific352003Rurki polipropylenowe Szalki
40 mmMidSciTP93040Hodowla tkankowa poddana działaniu
70 μ m nylonowe sitkoMidSci70ICSsterylne
40 μ m nylonowe sitkoMidSci40ICSsterylne
  Strzykawka BD 10 mlFisher Scientific301604Jednorazowa strzykawka bez igły
TłuczkiMidSciPESTsterylne
fiolki WheatonFisher Scientific986734Bez wkładki
Igła BD 30 GFisher Scientific 3051281 cal
Hausser Scientific Bright-Line Szklana komora liczącaFisher Scientific0267151BHemocytometr
Gibco Trypan niebieski 0,4% roztwórFisher Scientific15250061Viability Dye
Probówki EppendorfaFisher Scientific05-402-251,5 ml
EVOS Obrazowanie komórek floidowychThermo Fisher Scientific447113Obrazowanie fluorescencyjne z obiektywem 20X
100% etanoluFisher Scientific04-355-452Służy do produkcji 70% etanolu
Pipeta Pipet-Lite LTS L-1000XLS+Pipeta Rainin17014282LTS
Pipeta Pipet-Lite LTS Pipeta L-200XLS+Pipeta Rainin17014391LTS Pipeta
Pipet-Lite LTS Pipeta L-20XLS+Rainin17014392LTS Stojak na pipety
LTS 1000 ml GPS-L1000SRainin17005088Stojak na sterylne końcówki z niebieskim stojakiem
LTS 250 ml – GPS-L250SRainin17005092Zielony stojak na sterylne końcówki
LTS 20 ml – GPS-L10SRainin17005090Red Rack Sterylne końcówki
FACSAria II Sorter komórekBD BiosciencesN/AZamówienie niestandardowe
Cytometr LSR IIBD BiosciencesN/AZamówienie niestandardowe
Abca8aThermo Fisher ScientificMm00462440_m1Mü Komórki
Aldh1alThermoFisher ScientificMm00657317_m1Mü Ller cells
Aqp4Thermo Fisher ScientificMm00802131_m1Astrocyty
Calb2Thermo Fisher ScientificMm00801461_m1amakrynowe, poziome
Cd68Thermo Fisher ScientificMm03047340_m1Komórki nabłonka barwnikowego siatkówki
Gad2Thermo Fisher ScientificMm00484623_m1Amacrine
HprtThermo Fisher ScientificMm01545399_m1Utrzymanie domu gene
Lhx1Thermo Fisher ScientificMm01297482_m1Horizontal
Lim2Thermo Fisher ScientificMm00624623_m1Horizontal
NrlTermo Fisher ScientificMm00476550_m1Fotoreceptory
Ntrk1Thermo Fisher ScientificMm01219406_m1
PoziomePcp4Thermo Fisher Scientific Mm00500973_m1Bipolarne, Amacrine
Pou4f1Thermo Fisher ScientificMm02343791_m1Komórki
Prdx6Thermo Fisher ScientificMm00725435_s1Astrocyty
PrkcaThermo Fisher ScientificMm00440858_m1Bipolarny
Prox1Thermo Fisher ScientificMm00435969_m1
PoziomyPvalbThermo Fisher ScientificMm00443100_m1Amacrine
RbpmsThermo Fisher ScientificMm02343791_m1Komórki zwojowe siatkówki
Rom1Thermo Fisher ScientificMm00436364_g1Fotoreceptory
Rpe65Thermo Fisher ScientificMm00504133_m1Barwnik siatkówki Komórki nabłonkowe
Slc1a3Thermo Fisher NaukoweMm00600697_m1Astrocyty
Slc6a9Thermo Fisher ScientificMm00433662_m1Amacrine
SncgThermo Fisher ScientificMm00488345_m1Komórki zwojowe siatkówki
Tubb3Thermo Fisher ScientificMm00727586_s1Komórki zwojowe siatkówki
VimThermo Fisher ScientificMm01333430_m1Mü Komórki
tlenowe Taqman Universal Master MixThermo Fisher Scientific4440047odczynnik qPCR
miRNeasy Mini KitQiagen217004Zestaw do izolacji
RNA SuperScript VILO ThermoFisher Scientific11754250syntezy cDNA
Taqman PreAmp Master MixThermo Fisher Scientific4391128etap wstępnej amplifikacji
BD Cytofix/ CytopermBD Biosciences554714Utrwalanie/Bufor permeabilizacji
BD Perm/ WashBD Biosciences554723Roztwór do przenikania
RBPMSSanta Cruz BiotechnologySC-86815Przeciwciało wewnątrzkomórkowe
SNCGGene TexGTX110483Przeciwciało wewnątrzkomórkowe
BRN3ASanta Cruz Biotechnologysc-8429przeciwciało wewnątrzkomórkowe
TUJ1BioLegend801202przeciwciało wewnątrzkomórkowe
zwojowe siatkówki

Bibliografia

  1. Flammer, J., Orgul, S. Optic nerve blood-flow abnormalities in glaucoma. Prog Retin Eye Res. 17 (2), 267-289 (1998).
  2. Bathija, R. Optic nerve blood flow in glaucoma. Clin Exp Optom. 83 (3), 180-184 (2000).
  3. Osborne, N. N., Melena, J., Chidlow, G., Wood, J. P. A hypothesis to explain ganglion cell death caused by vascular insults at the optic nerve head: possible implication for the treatment of glaucoma. Br J Ophthalmol. 85 (10), 1252-1259 (2001).
  4. Morgan, J. E. Circulation and axonal transport in the optic nerve. Eye (Lond). 18 (11), 1089-1095 (2004).
  5. Tian, N., Hwang, T. N., Copenhagen, D. R. Analysis of excitatory and inhibitory spontaneous synaptic activity in mouse retinal ganglion cells. J Neurophysiol. 80 (3), 1327-1340 (1998).
  6. Schmidt, K. G., Bergert, H., Funk, R. H. Neurodegenerative diseases of the retina and potential for protection and recovery. Curr Neuropharmacol. 6 (2), 164-178 (2008).
  7. Dreher, B., Sefton, A. J., Ni, S. Y., Nisbett, G. The morphology, number, distribution and central projections of Class I retinal ganglion cells in albino and hooded rats. Brain Behav Evol. 26 (1), 10-48 (1985).
  8. Williams, R. W., Strom, R. C., Rice, D. S., Goldowitz, D. Genetic and environmental control of variation in retinal ganglion cell number in mice. J Neurosci. 16 (22), 7193-7205 (1996).
  9. Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. The major cell populations of the mouse retina. J Neurosci. 18 (21), 8936-8946 (1998).
  10. Surgucheva, I., Weisman, A. D., Goldberg, J. L., Shnyra, A., Surguchov, A. Gamma-synuclein as a marker of retinal ganglion cells. Mol Vis. 14, 1540-1548 (2008).
  11. Nadal-Nicolas, F. M., et al. Brn3a as a marker of retinal ganglion cells: qualitative and quantitative time course studies in naive and optic nerve-injured retinas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (8), 3860-3868 (2009).
  12. Kwong, J. M., Caprioli, J., Piri, N. RNA binding protein with multiple splicing: a new marker for retinal ganglion cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (2), 1052-1058 (2010).
  13. Van Bergen, N. J., et al. Recharacterization of the RGC-5 retinal ganglion cell line. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (9), 4267-4272 (2009).
  14. Wood, J. P., Chidlow, G., Tran, T., Crowston, J. G., Casson, R. J. A comparison of differentiation protocols for RGC-5 cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (7), 3774-3783 (2010).
  15. Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning. Neuron. 1 (9), 791-803 (1998).
  16. Hong, S., Iizuka, Y., Kim, C. Y., Seong, G. J. Isolation of primary mouse retinal ganglion cells using immunopanning-magnetic separation. Mol Vis. 18, 2922-2930 (2012).
  17. Julius, R. S. The sensitivity of exponentials and other curves to their parameters. Comput Biomed Res. 5 (5), 473-478 (1972).
  18. Reif, A. E., Allen, J. M. The Akr Thymic Antigen and Its Distribution in Leukemias and Nervous Tissues. J Exp Med. 120, 413-433 (1964).
  19. Watanabe, M., Noguchi, T., Tsukada, Y. Regional, cellular, and subcellular distribution of Thy-1 antigen in rat nervous tissues. Neurochem Res. 6 (5), 507-519 (1981).
  20. Haeryfar, S. M., Hoskin, D. W. Thy-1: more than a mouse pan-T cell marker. J Immunol. 173 (6), 3581-3588 (2004).
  21. Sahagun, G., Moore, S. A., Fabry, Z., Schelper, R. L., Hart, M. N. Purification of murine endothelial cell cultures by flow cytometry using fluorescein-labeled griffonia simplicifolia agglutinin. Am J Pathol. 134 (6), 1227-1232 (1989).
  22. Shoge, K., et al. Rat retinal ganglion cells culture enriched with the magnetic cell sorter. Neurosci Lett. 259 (2), 111-114 (1999).
  23. Chintalapudi, S. R., et al. Isolation and Molecular Profiling of Primary Mouse Retinal Ganglion Cells: Comparison of Phenotypes from Healthy and Glaucomatous Retinas. Front Aging Neurosci. 8, 93(2016).
  24. Nagdeve, N. G., Yaddanapudi, S., Pandav, S. S. The effect of different doses of ketamine on intraocular pressure in anesthetized children. J Pediatr Ophthalmol Strabismus. 43 (4), 219-223 (2006).
  25. Ding, C., Wang, P., Tian, N. Effect of general anesthetics on IOP in elevated IOP mouse model. Exp Eye Res. 92 (6), 512-520 (2011).
  26. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nat Protoc. 3 (6), 1101-1108 (2008).
  27. Aerts, J., Nys, J., Arckens, L. A highly reproducible and straightforward method to perform in vivo ocular enucleation in the mouse after eye opening. J Vis Exp. (92), e51936(2014).
  28. Li, X., et al. Loss of AP-2delta reduces retinal ganglion cell numbers and axonal projections to the superior colliculus. Mol Brain. 9 (1), 62(2016).
  29. Moshiri, A., et al. Near complete loss of retinal ganglion cells in the math5/brn3b double knockout elicits severe reductions of other cell types during retinal development. Dev Biol. 316 (2), 214-227 (2008).
  30. Danias, J., et al. Quantitative analysis of retinal ganglion cell (RGC) loss in aging DBA/2NNia glaucomatous mice: comparison with RGC loss in aging C57/BL6 mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (12), 5151-5162 (2003).
  31. Jakobs, T. C., Ben, Y., Masland, R. H. CD15 immunoreactive amacrine cells in the mouse retina. J Comp Neurol. 465 (3), 361-371 (2003).
  32. Uusitalo, M., Schlotzer-Schrehardt, U., Kivela, T. Ultrastructural localization of the HNK-1 carbohydrate epitope to glial and neuronal cells of the human retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (3), 961-964 (2003).
  33. Jackson, C. J., Garbett, P. K., Nissen, B., Schrieber, L. Binding of human endothelium to Ulex europaeus I-coated Dynabeads: application to the isolation of microvascular endothelium. J Cell Sci. 96 ( Pt 2), 257-262 (1990).
  34. Pennartz, S., Perraut, M., Pfrieger, F. Purification of retinal ganglion cells from postnatal rats by magnetic cell sorting. MACSmore. 12 (2), 16-18 (2010).
  35. Nadal-Nicolas, F. M., et al. Displaced retinal ganglion cells in albino and pigmented rats. Front Neuroanat. 8, 99(2014).
  36. Nadal-Nicolas, F. M., Salinas-Navarro, M., Vidal-Sanz, M., Agudo-Barriuso, M. Two methods to trace retinal ganglion cells with fluorogold: from the intact optic nerve or by stereotactic injection into the optic tract. Exp Eye Res. 131, 12-19 (2015).
  37. Barnstable, C. J., Drager, U. C. Thy-1 antigen: a ganglion cell specific marker in rodent retina. Neuroscience. 11 (4), 847-855 (1984).
  38. Chiu, K., Lau, W. M., Yeung, S. C., Chang, R. C., So, K. F. Retrograde labeling of retinal ganglion cells by application of fluoro-gold on the surface of superior colliculus. J Vis Exp. (16), (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Izolacja komórekpierwotne komórki mysiesortowanie komórekimmunoznakowanieCD90.2 dodatnieCD48 ujemnekontrole kompensacjiżyjąca populacja komórek
Izolacja pierwotnych mysich komórek zwojowych siatkówki (RGC) za pomocą cytometrii przepływowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.