Artykuł metodologiczny

Kwantyfikacja gęstości rozgałęzień w całych wierzchowcach gruczołu sutkowego szczura przy użyciu metody analizy Sholla

14.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55789

⸱

12 lipca 2017

 , 
1National Toxicology Program Laboratory, Division of the National Toxicology Program, National Institute of Environmental Health Sciences

W tym artykule

Podsumowanie

Rozwój gruczołu sutkowego u gryzonia był zazwyczaj oceniany za pomocą ocen opisowych lub poprzez pomiar podstawowych cech fizycznych. Gęstość rozgałęzień jest wskaźnikiem rozwoju sutka, który jest trudny do obiektywnego oszacowania. Protokół ten opisuje wiarygodną metodę ilościowej oceny charakterystyki rozgałęzień gruczołu mlekowego.

Streszczenie

Coraz więcej badań wykorzystuje gruczoł sutkowy gryzoni jako punkt końcowy do oceny toksyczności rozwojowej ekspozycji chemicznej. Wpływ tych ekspozycji na rozwój gruczołu sutkowego jest zwykle oceniany przy użyciu podstawowych pomiarów wymiarowych lub poprzez ocenę cech morfologicznych. Jednak szeroki zakres metod interpretacji zmian rozwojowych może prowadzić do niespójnych tłumaczeń w różnych laboratoriach. Potrzebna jest wspólna metoda oceny, aby można było sformułować właściwe interpretacje na podstawie danych porównywanych w różnych badaniach. W niniejszej pracy opisano zastosowanie metody analizy Sholla do ilościowego określenia charakterystyki rozgałęzień gruczołu sutkowego. Metoda Sholla została pierwotnie opracowana do stosowania w ilościowym określaniu neuronalnych wzorców dendrytycznych. Korzystając z ImageJ, pakietu oprogramowania do analizy obrazów o otwartym kodzie źródłowym, oraz wtyczki opracowanej do tej analizy, określono gęstość rozgałęzień gruczołu sutkowego i złożoność gruczołu sutkowego od samicy szczura w okresie okołopokwitaniowym. Opisane tutaj metody umożliwią wykorzystanie analizy Sholla jako skutecznego narzędzia do ilościowego określenia ważnej cechy rozwoju gruczołu sutkowego.

Wprowadzenie

Rozgałęzienie gruczołu sutkowego jest cechą, która jest powszechnie oceniana jako wskaźnik rozwoju gruczołu, ale trudno ją obiektywnie określić. W 1953 roku Sholl1 opisał metodę pomiaru neuronalnej arborycji dendrytycznej w korze wzrokowej i ruchowej kota, a wtyczka do tej techniki została opracowana przez Ferriera i wsp2. Ponieważ zarówno neurony, jak i gruczoły sutkowe wykazują podobną strukturę przypominającą drzewo, wtyczka została wykorzystana do ilościowego określenia gęstości rozgałęzień nabłonka sutka w obrazach 2D gruczołu sutkowego szczura okołopokwitaniowego. Do analizy wybrano etap okołopokwitaniowy, ponieważ odsadzenie od piersi jest etapem życia, który jest często oceniany w laboratoriach akademickich i badaniach opartych na wytycznych testowych. Analiza Sholla to wtyczka dystrybuowana wraz z FIJI, która jest pakietem do przetwarzania obrazów o otwartym kodzie źródłowym ImageJ, z dołączonymi dodatkowymi wtyczkami. Wtyczka tworzy serię koncentrycznych pierścieni otaczających predefiniowane centrum (zwykle somę neuronu lub początek pierwotnego przewodu gruczołu sutkowego) i rozciągających się do najbardziej dystalnej części obiektu (otaczający promień). Następnie zlicza liczbę przecięć (N), które występują na każdym z pierścieni. Wtyczka zwraca również współczynnik regresji Sholla (k), który jest miarą szybkości zaniku rozgałęzień nabłonka.

Za pomocą ImageJ tworzony jest szkieletowy obraz całego gruczołu sutkowego i mierzony jest obszar nabłonka sutka (MEA). Obraz jest analizowany za pomocą wtyczki do analizy Sholl i zwracane są wartości N i k, a także inne wartości, które nie są tutaj używane. Gęstość rozgałęzień nabłonka sutka określa się, obliczając N/MEA. Stopień, w jakim rozgałęzianie się trwa w zewnętrznych obszarach nabłonka gruczołowego, jest złożonością rozgałęzień i jest wskaźnikiem równomiernego wzrostu nabłonka dystalnego. Ponieważ k jest miarą dystalnego spadku rozgałęzień nabłonka, jest skuteczną miarą złożoności rozgałęzień i wiarygodnym wskaźnikiem rozwoju sutka.

Ten protokół opisuje wspomaganą komputerowo metodę tworzenia szkieletowych obrazów całych gruczołów sutkowych i ilościowej oceny cech rozgałęzień gruczołu sutkowego u samców i samic szczurów w okresie okołopokwitaniowym. Metoda ta jest stosunkowo szybka i nie wymaga użycia specjalistycznego sprzętu mikroskopowego. Rozwój i walidacja tej metody zostały opisane w Stanko et al. (2015)3. W tym raporcie opisano również przygotowanie gruczołu sutkowego szczura w całości=wierzchowce. Podobne procedury całego wierzchowania sutka zostały opisane w de Assis et al. (2010)4 i Plante et al. (2011)5.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt i procedury w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych NIEHS i przeprowadzone w akredytowanym obiekcie Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care.

1. Gruczoły mleczne z akcyzy

  1. Wstępnie oznacz wszystkie slajdy metodą ksylenu (najlepiej sprawdza się ołówek). Przykryj je roztworem montażowym na końcu, aby zachować etykietę.
  2. Poddać zwierzę eutanazji metodą zatwierdzoną przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania.
  3. Po eutanazji połóż zwierzę na plecach na desce sekcyjnej (Rysunek 1). Rozciągnij i przygwoźdź wszystkie cztery kończyny, przy czym tylne kończyny utworzą odwrócone V (dobrze sprawdzają się szpilki przytrzymujące lub igły o małej średnicy).
  4. Spryskaj brzuch obficie 70% etanolem, aby włosy nie dostały się do próbki sutka.
  5. Za pomocą kleszczy podciągnij skórę brzucha w linii środkowej i wykonaj małe nacięcie nożyczkami preparującymi, uważając, aby nie przebić otrzewnej.
    1. Zaczynając od nacięcia, przeciąć skórę aż do okolicy szyi, a następnie dystalnie do kończyny przedniej. Wytnij do okolicy pachwinowej, a następnie dystalnie do pierwszego stawu tylnej kończyny po tej samej stronie; To nacięcie zwykle oddziela gruczoły sutkowe 5 i 6. Unikaj przecinania otrzewnej.
    2. Odciągnij skórę z dołączoną poduszeczką tłuszczową sutka za pomocą kleszczy, delikatnie oddzielając ją od otrzewnej za pomocą końca nożyczek preparujących. Oddzielić jak najdalej grzbietowo, aby w pełni odsłonić 4. i 5. pachwinowe gruczoły sutkowe na spodniej stronie skóry; przypnij skórę do deski sekcyjnej (Rysunek 2).
    3. Delikatnie chwyć tkankę sutkową 5. gruczołu zaokrągloną stroną zakrzywionych kleszczy i powoli odetnij gruczoł od skóry, uważając, aby nie naciąć gruczołu ani skóry.
    4. Kontynuuj przycinanie, poruszając się grzbietowo, aż 4. i 5. gruczoły zostaną całkowicie uniesione ze skóry. Upewnij się, że obszar brodawki sutkowej został usunięty wraz z resztą gruczołu, ponieważ służy on jako punkt wyjścia do analizy Sholla. Wytnij tkankę sutka z dala od ciała, gdzie jest przyczepiona w gruczole 4.
  6. Po usunięciu gruczołu ze zwierzęcia rozprowadź go równomiernie na naładowanym elektrostatycznie szkiełku mikroskopowym o wymiarach 25 mm x 75 mm x 1 mm, stroną przylegającą do skóry skierowaną w dół.
    UWAGA: W przypadku gruczołów pochodzących od zwierząt starszych lub w okresie laktacji może być wymagane szkiełko o wymiarach 51 x 75 x 1 mm.
  7. Nosząc rękawiczki, delikatnie wyciśnij wszelkie pęcherzyki powietrza. Przykryj dławik plastikową folią parafinową i innym szkiełkiem mikroskopowym i ściśnij gruczoł, aby przykleił się do szkiełka.
    UWAGA: Stożkowa rurka o pojemności 50 ml wypełniona wodą służy jako odpowiedni ciężar. Czas potrzebny do przyklejenia się do szkiełka zależy od grubości dławika. Cienkie, poporodowe (PND) 4 gruczoły powinny być uciskane przez minimum 30 min, podczas gdy grubsze, dorosłe gruczoły mogą wymagać nawet 2-5 h.

2. Przygotuj całe wierzchowce sutkowe

  1. Roztwór ałunu karminowego należy przygotować co najmniej 24 godziny wcześniej, ponieważ wymaga on gotowania i przechowywania w lodówce.
    1. Rozpuścić 1 g ałunu karminowego i 2,5 g siarczanu glinowo-potasowego (AlK(SO4)2·12H2O) w 500 ml wody destylowanej i gotować przez 20 minut w kolbie o pojemności 1 l. Doprowadzić końcową objętość do 500 ml za pomocą wody destylowanej.
    2. Przefiltrować roztwór przez bibułę filtracyjną pod próżnią i wstawić do lodówki do przechowywania.
      UWAGA: Roztwór ałunu karminowego można użyć ponownie, ale należy go wyrzucić, gdy kolor zacznie blaknąć.
  2. Przed utrwaleniem należy zdjąć folię parafinową z gruczołu, uważając, aby nie ściągnąć dławika ze szkiełka. Umieścić szkiełko (szkiełka) w szklanym słoiku do barwienia szkiełek i zanurzyć w utrwalaczu (100% etanolu, chloroformie i lodowatym kwasie octowym w stosunku 6:3:1) na 12-48 godzin, w zależności od grubości gruczołów.
  3. Odlej utrwalacz i namocz gruczoły w 70% etanolu przez 15 min. Stopniowo nawadniaj gruczoły, wylewając 1/3 roztworu etanolu i zastępując go wodą destylowaną. Moczyć przez 5 min. Powtórz ten proces trzy razy.
  4. Po ostatnim płukaniu odlej cały roztwór etanolu/wody i zastąp go 100% wodą destylowaną. Moczyć gruczoły przez 5 minut.
  5. Odlej wodę destylowaną i zanurz gruczoły w roztworze ałunu karminowego. Bejcowanie gruczołów przez 12-24 h, w zależności od grubości.
    UWAGA: Gruczoły nie mogą być nadmiernie wybarwione, ale czas barwienia dla wielu partii powinien być taki sam, aby intensywność barwienia była taka sama.
  6. Odlej roztwór ałunu karminowego i płucz gruczoły w 100% wodzie destylowanej przez 30 s. Stopniowo odwadniaj gruczoły, mocząc je w 70% etanolu przez 15 min, 95% etanolu przez 15 min i 100% etanolu przez 20 min.
  7. Oczyść gruczoły z tłuszczu, mocząc je w ksylenie przez 12-72 godziny, w zależności od grubości.
    UWAGA: Gruczoły powinny być półprzezroczyste (przezroczyste). Jeśli pozostaną jakiekolwiek nieprzezroczyste (białawe) obszary, kontynuuj moczenie w ksylenie, aż stanie się przezroczyste. Jeśli gruczoły laktacyjne lub w inny sposób bardzo grube są barwione i usuwane, ksylen może wymagać jednokrotnej wymiany, aby w pełni oczyścić gruczoły.
  8. Zamontuj szkiełka za pomocą medium montażowego na bazie ksylenu, pipetując wystarczającą ilość pożywki, aby pokryć dławnicę. Dodaj szkiełko nakrywkowe, upewniając się, że nie tworzą się pęcherzyki powietrza.
  9. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia. Po wyschnięciu medium montażowego skurczy się ono pod szkiełkiem nakrywkowym i może być konieczne dodanie dodatkowego medium montażowego. Gdy dodatkowe podłoże nie jest wymagane, pozwól szkiełkom całkowicie wyschnąć; Może to potrwać 2-3 tygodnie.
  10. Po całkowitym wyschnięciu szkiełek można usunąć wszelkie resztki podłoża montażowego za pomocą bawełnianego wacika i niewielkiej ilości ksylenu. Należy uważać, aby nie użyć zbyt dużej ilości ksylenu, ponieważ może to spowodować rozpuszczenie podłoża montażowego i poluzowanie szkiełka nakrywkowego. Jeśli tak się stanie i pod szkiełkiem nakrywkowym zgromadzą się pęcherzyki powietrza, szkiełko nakrywkowe należy usunąć z ksylenu i powtórzyć proces montażu.

3. Przygotowanie obrazów z całego montażu do analizy

  1. Uchwyć obrazy całych wierzchowców (Rysunek 3) za pomocą makroskopu lub mikroskopu preparacyjnego i kamery cyfrowej z odpowiednim oprogramowaniem.
    UWAGA: Chociaż można wybrać dowolne powiększenie, które obejmuje cały nabłonek gruczołowy, konieczne jest uchwycenie wszystkich obrazów z całego montażu, które będą porównywane ze sobą przy tym samym powiększeniu.
  2. Pobierz oprogramowanie ImageJ (lub oprogramowanie FIJI)6.
  3. Otwórz obraz całego montażu sutka w ImageJ, klikając "Plik" → "Otwórz". Wybierz narzędzie Odręczne i obrysuj wokół nabłonka gruczołowego. Wybierz "Edytuj" → "Wyczyść na zewnątrz".
    1. Usuń węzły chłonne, obrysowując wokół węzła i używając narzędzia Odręczne i "Edytuj" → "Wytnij".
  4. Oddziel kanały kolorów, wybierając "Obraz" → "Kolor" → "Podziel kanały". Wybierz kanał o najlepszym kontraście, zazwyczaj kanał niebieski.
    UWAGA: Obraz RGB składa się ze stosu czerwonych, zielonych i niebieskich składników tego obrazu. Ta akcja rozdziela te składniki na trzy 8-bitowe obrazy w skali szarości.
  5. Odejmij tło, wybierając "Proces" → "Odejmij tło". Wybierz żądane parametry, a następnie kliknij "Podgląd", aby wyświetlić podgląd zmian.
    UWAGA: Opcja "Odejmij tło" usuwa gładkie, ciągłe tła. Dodatkowo do tworzenia kontrastu można użyć opcji "Proces" → "Filtry" → "Maska wyostrzająca".
  6. Wybierz jedną z następujących metod automatycznego usuwania szumu: usuwanie plamek lub usuwanie wartości odstających.
    UWAGA: ImageJ oferuje trzecią metodę automatycznego usuwania szumów: usuń NaN. Jednak polecenie remove NaNs nie ma zastosowania, ponieważ używa obrazów 32-bitowych, a bieżąca metoda używa obrazów 8-bitowych.
    1. Usuń szum za pomocą polecenia despeckle, wybierając "Proces" → "Szum" → "Usuń plamki".
      UWAGA: Jest to równoznaczne z dodaniem filtru mediany, który zastępuje każdy piksel wartością mediany w jego sąsiedztwie 3 × 3.
    2. Usuń szum za pomocą polecenia usuń wartości odstające, wybierając "Przetwarzaj" → "Szum" → "Usuń wartości odstające".
      UWAGA: Ten proces polega na zastąpieniu piksela medianą pikseli w bezpośrednim otoczeniu, jeśli odbiega on od mediany o więcej niż określoną wartość (próg).
  7. Usuń pozostały szum ręcznie (Rysunek 4).
    1. Otwórz kopię oryginalnego obrazu i użyj jej jako przewodnika po tym, co jest, a co nie jest szumem. Kliknij przycisk z podwójną czerwoną strzałką po prawej stronie paska narzędzi. Wybierz narzędzia do rysowania; Przyciski narzędzia do rysowania pojawią się teraz na pasku narzędzi.
    2. Kliknij narzędzie Gumka. Dostosuj średnicę gumki, klikając prawym przyciskiem myszy przycisk narzędzia Gumka. Przytrzymaj lewy przycisk myszy, aby usunąć szum.
      UWAGA: Tylko jedną sesję wymazywania można cofnąć. Po zwolnieniu lewego przycisku myszy i ponownym kliknięciu poprzedniego usunięcia nie można cofnąć.
  8. Dostosuj próg, wybierając "Obraz" → "Dostosuj" → "Próg". Przesuń suwaki, aby dostosować minimalne (górny suwak) i maksymalne (dolny suwak) wartości progowe, aż do uzyskania odpowiedniego odwzorowania gruczołu.
    UWAGA: Ustawienie wartości progowej powoduje segmentację obrazów w skali szarości na interesujące obiekty i tło.
    1. Kliknij przycisk Zastosuj. W razie potrzeby usuń dodatkowy hałas w tym miejscu, wykonując kroki 3.6.1 i 3.6.2.
  9. Zrekonstruuj części nabłonka gruczołowego, które zostały usunięte przez progowanie i usuwanie szumów (Ryc. 5).
    1. Rekonstrukcję obrazu należy przeprowadzać ostrożnie i w minimalnym stopniu, aby zachować integralność oryginalnego obrazu. Zapoznaj się z oryginalnym obrazem, aby dowiedzieć się, co jest, a co nie jest nabłonkiem.
    2. Kliknij narzędzie Spray Can (na pasku narzędzi z narzędziami do rysowania). Dostosuj średnicę i szybkość natrysku, klikając prawym przyciskiem myszy przycisk narzędzia Spray Can (Puszka z aerozolem). Ostrożnie uzupełnij brakujące sekcje gruczołu, klikając lub przytrzymując lewy przycisk myszy.
  10. Utwórz szkieletowy obraz dławika do przeprowadzenia analizy Sholla. Upewnij się, że obraz z progiem jest binarny, wybierając pozycję "Proces" → "Binarny" → "Utwórz plik binarny".
    1. Jeśli obraz jest biały na czarnym tle, wybierz "Proces" → "Binarny" → "Opcje" i odznacz "Czarne tło". Zszkieletuj obraz, wybierając "Proces" → "Binarny" → "Szkieletowy".
      UWAGA: Powoduje to wielokrotne usuwanie pikseli z krawędzi obrazu binarnego, aż zostanie on zredukowany do kształtu o szerokości jednego piksela.
    2. Rozszerz obraz jeden raz, wybierając "Proces" → "Binarny" → "Rozszerz"
      UWAGA: Wypełnia luki powstałe w wyniku progowania i szkieletowania poprzez dodawanie pikseli do krawędzi obrazu binarnego.
  11. Zapisz obraz, wybierając "Plik" → "Zapisz jako". Wybierz typ obrazu (zwykle jpeg), wprowadź nazwę pliku i kliknij "OK".
  12. Sprawdź dokładność szkieletowanego obrazu, nakładając szkieletowany obraz na oryginalny obraz (Rysunek 6).
    1. Utwórz nakładkę, otwierając zarówno oryginalny obraz, jak i obraz szkieletowany. Wybierz "Obraz" → "Nakładka" → "Dodaj obraz". W oknie dialogowym "Dodaj obraz" wybierz obraz szkieletu z menu rozwijanego "Obraz do dodania" i ustaw krycie na 30%.
    2. Zapisz obraz szkieletu nałożony na oryginał, wybierając "Plik" → "Zapisz jako". Wybierz typ obrazu, wprowadź nazwę pliku i kliknij "OK".

4. Przeprowadź analizę Sholla

  1. Otwórz obraz szkieletu i ustaw go jako binarny, wybierając "Proces" → "Binarny" → "Utwórz binarny".
    1. Przed ustawieniem skali powiększenia zmierz liczbę pikseli/mm za pomocą mikrometru dla powiększenia, przy którym obrazy zostały przechwycone.
    2. Ustaw zmierzoną skalę powiększenia, wybierając "Analizuj" → "Ustaw skalę". Wprowadź liczbę pikseli/mm. Ustaw "Znaną odległość" i "Proporcje pikseli" na 1. Wpisz "mm" jako "Jednostkę długości" i zaznacz "Globalny" (zachowuje tę samą skalę dla każdego obrazu).
  2. Określ promień końcowy (promień otaczający) dla analizy Sholla, rysując linię od początku przewodu pierwotnego (środka analizy) do najbardziej dystalnego punktu nabłonka gruczołowego (Rysunek 7).
    1. Użyj narzędzia do rysowania linii na pasku narzędzi, aby narysować linię między interesującymi miejscami. Naciśnij "M", aby wykonać pomiar i zwróć uwagę, że otworzy się okno wyników.
      UWAGA: Wartość w kolumnie "Długość" to długość linii w mm. Ta wartość zostanie automatycznie wprowadzona jako Promień końcowy podczas ustawiania parametrów Sholla. Wtyczka Sholl użyje punktu początkowego linii jako środka pierścieni centrycznych.
  3. Uruchamianie analizy Sholla.
    1. Uruchom analizę, wybierając "Wtyczki" "Zaawansowana analiza Sholla"; " pojawi się okno parametrów.
    2. Ustaw Promień początkowy w "I. Definicja powłok" na 0,00 mm; długość linii zmierzona w kroku 4.2 zostanie automatycznie wprowadzona jako "Promień końcowy".
    3. Ustaw "Rozmiar kroku promienia" na 0.1 mm.
      UWAGA: Rozmiar kroku promienia określa liczbę pierścieni (efektywnie liczbę iteracji); Mniejszy rozmiar kroku zwiększy liczbę pierścieni, podczas gdy większy rozmiar kroku zmniejszy liczbę pierścieni. Promień nie może być ustawiony zbyt mały, chociaż zbyt mały promień spowoduje niepotrzebnie dużą liczbę pierścieni. Może być jednak ustawiony zbyt duży, co spowoduje powstanie mniejszej liczby pierścieni, a następnie niedoszacowanie prawdziwej liczby skrzyżowań. Patrz Stanko et al. (2015) aby uzyskać więcej informacji na temat określania rozmiaru kroku.
    4. Ustaw "# Samples" na 1, a "Integration" na "Mean" w "II. Wiele próbek na promień."
    5. Ustaw "Odcięcie promienia otaczającego" na 1 i zaznacz "wywnioskuj z promienia początkowego" dla "# Rozgałęzienia podstawowe" w "III. Deskryptory i dopasowanie krzywych."
      UWAGA: "Dopasuj profil i deskryptory obliczeniowe" oraz "Pokaż szczegóły dopasowania" można zaznaczyć zgodnie z potrzebami.
    6. Zaznacz "Liniowy" i wybierz "Najlepszy stopień dopasowania" w "Profile bez normalizacji; " zaznacz "Najbardziej pouczające." Wybierz "Obszar dla znormalizowanych profili" w "IV. Metody Sholla".
    7. Zaznacz opcję "Utwórz maskę skrzyżowań" w "V. Opcje wyjściowe", aby utworzyć mapę cieplną skrzyżowań (opcjonalnie).
    8. Kliknij "Por. Segmentacja", aby wygenerować okno podglądu obrazu z pierścieniami potwierdzającymi obszar analizy.
  4. Kliknij "OK", aby uruchomić analizę.

5. Pomiar MEA

  1. Zmierz MEA, śledząc najkrótszą odległość wokół drzewa nabłonkowego (Rysunek 8).
    1. W narzędziu ImageJ z otwartym obrazem szkieletu dławika kliknij narzędzie Wielokąt. Kliknij punkt na obwodzie drzewa nabłonkowego, aby rozpocząć wielokąt, poruszaj się po obwodzie gruczołu i kliknij, aby dodać segment linii.
    2. Gdy cały obszar nabłonka zostanie ominięty, kliknij dwukrotnie, aby zamknąć wielokąt. Naciśnij "M", aby otworzyć okno wyników; wartość w kolumnie "Obszar" to MEA.
  2. W przypadkach, gdy nabłonek gruczołowy wysunął się poza węzeł chłonny, przy obliczaniu gęstości rozgałęzień należy odjąć obszar węzłów chłonnych (LNA) od MEA.
    1. Zmierz LNA, śledząc węzeł chłonny w taki sam sposób, jak drzewo nabłonkowe i naciskając "M."
      UWAGA: W takich przypadkach LNA należy odjąć od MEA, ponieważ węzeł chłonny uniemożliwia analizie zliczenie przecięć w LNA. Gdy nabłonek nie dotarł do węzła chłonnego, LNA wynosi zero.

6. Dane raportowania

  1. Raportuj wartości dla promienia otaczającego, MEA, N, k i gęstości rozgałęzień.
    UWAGA: Promień zamknięcia jest określany w kroku 4.2, a MEA jest określany w kroku 5.1.
    1. Uruchom analizę, aby wygenerować okno wyników Sholl.
      UWAGA: Podane N jest wartością sumy międzyliczbowej. Podane k jest wartością współczynnika regresji Sholla (półlogarytmu). Analiza Sholla zwróci wartość k w dowolnym zmierzonym regionie nabłonka gruczołowego. Aby uzyskać dokładną wartość k na całym nabłonku, muszą być obecne końce przewodów.
    2. Zmodyfikuj analizę Sholla dla gruczołu sutkowego, używając wartości wyjściowej dla N do obliczenia gęstości rozgałęzień (podstawowy punkt końcowy tej metody). Obliczyć gęstość rozgałęzień za pomocą wzoru N/(MEA-LNA) i podać wartość jako N/mm2.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wartości zmierzonego promienia obejmującego, MEA, N, k oraz obliczonej gęstości rozgałęzień dla gruczołu mlekowego analizowanego w niniejszym protokole przedstawiono w Tabeli 1. Analiza Sholla generuje wykresy liniowe i półlogarytmiczne liczby przecięć dla każdego promienia (Rysunek 9) oraz, opcjonalnie, mapę ciepła przecięć (Rysunek 10). Słabiej rozwinięte gruczoły wykazują mniej przecięć w obrębie tego...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Od urodzenia do okresu dojrzewania wzrost gruczołu sutkowego jest allometryczny. Po okresie dojrzewania gruczoł sutkowy rozwija się poprzez rozległe rozgałęzienia i wydłużenie przewodów, które trwają do momentu, gdy nabłonek sutka zajmie całą poduszeczkę tłuszczową. Cechy rozgałęzień są ważnym aspektem rozwoju gruczołu sutkowego, a zdolność do obiektywnego ilościowego określenia tych cech może być bardzo przydatna do oceny normalnego rozwoju gruczołu sutkowego i identyfikacji nieprawidłowego rozwoju po narażeniu na subst...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Dr. Michaelowi Easterlingowi (Social and Scientific Systems, Inc., Durham, NC) za pomoc w walidacji tej metody oraz Dr. Tiago Ferreira (McGill University, Montreal, Quebec, Kanada) za jego ciągłą pomoc przy aplikacji Sholl.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Deska sekcyjnaNANAOdpowiedni jest kawałek styropianu o wymiarach około 10"x12".
Preparowanie T-PinsDaiggerEF7419A
Butelka z rozpylaczem z etanolemNANA70% etanol jest odpowiedni.
Zakrzywione nożyczki preparacyjneFine Science Tools14569-09
Proste nożyczki do rozcinaniaFine Science Tools14568-09
Zakrzywione kleszczeFine Science Tools11003-12
Szkiełka mikroskopowe Superfrost Plus 24 x 75 x 1 mmThermoFisher Scientific4951PLUS-001Thermo Scientific Superfrost Plus & Preparaty Colorfrost Plus utrzymują skrawki tkanek na stałe bez konieczności stosowania drogich powłok w zastosowaniach IHC i patologii anatomicznej. Zabieg ten zmniejsza utratę tkanek podczas barwienia, a także godziny przygotowania preparatów. Szkiełka elektrostatycznie przyciągają zamrożone skrawki tkanek i preparaty cytologiczne i mają skład chemiczny podobny do silanu, ale zoptymalizowany w celu poprawy wydajności aplikacji.
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4951PLUS4. 
Szkło nakrywkowe Fisherfinest Premium 24 x 60 x 1 mmFisher scientific12-548-5P
Bemis Parafilm M Laboratoryjna folia do owijaniaFisher scientific13-374-12
ChloroformSigma-AldrichC2432
Lodowaty kwas octowySigma-AldrichA9967
Absolut etanolu, ≥ 99,8% (GC) Sigma-Aldrich24102
KsylenSigma-Aldrich214736
Karminowy ałun Sigma-AldrichC1022
Siarczan glinowo-potasowy Sigma-AldrichA6435
Nośnik montażowy PermountFisher ScientificSP15
MakroskopLeicaZ16 APO Jest to sprzęt i oprogramowanie do przechwytywania obrazu używane w tym laboratorium.  Ponieważ istnieje wiele różnych opcji, metody i zastosowania mogą się różnić w zależności od laboratorium.
Aparat cyfrowyLeicaDFC295
Oprogramowanie aparatuLeicaLeica Application Suite v3.1 
Oprogramowanie ImageJAnaliza Sholla http://imagej.net/Welcome
 http://imagej.net/Sholl_Analysiso otwartym kodzie źródłowym
Open Source

Bibliografia

  1. Sholl, D. A. Dendritic organization of the neurons in the visual and motor cortices of the cat. J Anat. 87 (4), 387-406 (1953).
  2. Ferreira, T. A., Iacono, L. L., Gross, C. T. Serotonin receptor 1A modulates actin dynamics and restricts dendritic growth in hippocampal neurons. Eur J Neurosci. 32 (1), 18-26 (2010).
  3. Stanko, J. P., Easterling, M. R., Fenton, S. E. Application of Sholl analysis to quantify changes in growth and development in rat mammary gland whole mounts. Reprod Toxicol. 54, 129-135 (2015).
  4. Assis, S., Warri, A., Cruz, M. I., Hilakivi-Clarke, L. Changes in Mammary Gland Morphology and Breast Cancer Risk in Rats. J. Vis. Exp. (44), e2260(2010).
  5. Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models. J. Vis. Exp. (53), e2828(2011).
  6. Ferreira, T. Sholl Analysis. ImageJ. , Available from: http://imagej.net/Sholl_Analysis (2012).
  7. Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ User Guide. IJ 1.46r. ImageJ. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html (2012).
  8. Tucker, D. K., Foley, J. F., Hayes-Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Preparation of High-quality Hematoxylin and Eosin-stained Sections from Rodent Mammary Gland Whole Mounts for Histopathologic Review. Toxicol Pathol. 44 (7), 1059-1064 (2016).
  9. Fenton, S. E., Hamm, J. T., Birnbaum, L. S., Youngblood, G. L. Persistent abnormalities in the rat mammary gland following gestational and lactational exposure to 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD). Toxicol Sci. 67 (1), 63-74 (2002).
  10. Murray, T. J., Maffini, M. V., Ucci, A. A., Sonnenschein, C., Soto, A. M. Induction of mammary gland ductal hyperplasias and carcinoma in situ following fetal bisphenol A exposure. Reprod Toxicol. 23 (3), 383-390 (2007).
  11. Moral, R., Santucci-Pereira, J., Wang, R., Russo, I. H., Lamartiniere, C. A., Russo, J. In utero exposure to butyl benzyl phthalate induces modifications in the morphology and the gene expression profile of the mammary gland: an experimental study in rats. Environ Health. 10 (1), 5(2011).
  12. Johnson, M. D., Mueller, S. C. Three dimensional multiphoton imaging of fresh and whole mount developing mouse mammary glands. BMC Cancer. 13, 373(2013).
  13. Enoch, R. R., Stanko, J. P., Greiner, S. N., Youngblood, G. L., Rayner, J. L., Fenton, S. E. Mammary gland development as a sensitive end point after acute prenatal exposure to an atrazine metabolite mixture in female Long-Evans rats. Environ Health Persp. 115 (4), 541-547 (2007).
  14. Hovey, R. C., Coder, P. S., Wolf, J. C., Sielken, R. L., Tisdel, M. O., Breckenridge, C. B. Quantitative assessment of mammary gland development in female Long Evans rats following in utero exposure to atrazine. Toxicol Sci. 119 (2), 380-390 (2011).
  15. Mandrup, K. R., Hass, U., Christiansen, S., Boberg, J. Perinatal ethinyl oestradiol alters mammary gland development in male and female Wistar rats. Inter J of Androl. 35 (3), 385-396 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Rozga zianie gruczo u mlekowegooprogramowanie ImageJobraz szkieletowyzanik rozga ziepreparat ca ego gruczo u mlekowegoprogowanie obrazuusuwanie szum wobszar nab onka gruczo u mlekowego

Powiązane artykuły