Artykuł metodologiczny

Prosta metoda ekstrakcji frakcjonowanej do kompleksowej analizy metabolitów, lipidów i białek z pojedynczej próbki

37.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55802

⸱

1 czerwca 2017

 ,  ,  , 
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology, Golm, Germany, 2Department of Pharmacognosy, Faculty of Pharmacy, Cairo University

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiono protokół kompleksowej ekstrakcji lipidów, metabolitów i białek z tkanek biologicznych przy użyciu jednej próbki.

Streszczenie

Zrozumienie złożonych systemów biologicznych wymaga pomiaru, analizy i integracji wielu klas związków żywej komórki, zwykle określanych za pomocą pomiarów transkryptomicznych, proteomicznych, metabolomicznych i lipidomicznych. W tym protokole wprowadzamy prostą metodę odtwarzalnej ekstrakcji metabolitów, lipidów i białek z tkanek biologicznych przy użyciu pojedynczej podwielokrotności na próbkę. Metoda ekstrakcji opiera się na eterze metylowo-tert-butylowym: metanol: system wodny do cieczy: ciecz podział metabolitów hydrofobowych i polarnych na dwie niemieszające się fazy wraz z wytrącaniem białek i innych makrocząsteczek w postaci stałego osadu. W związku z tym metoda ta zapewnia trzy różne frakcje o określonym składzie molekularnym, które są w pełni kompatybilne z powszechnymi technologiami "omicznymi" o wysokiej przepustowości, takimi jak chromatografia cieczowa (LC) lub chromatografia gazowa (GC) sprzężona ze spektrometrami masowymi. Mimo że metoda ta została początkowo opracowana do analizy różnych próbek tkanek roślinnych, okazała się w pełni kompatybilna z ekstrakcją i analizą próbek biologicznych z systemów tak różnych, jak glony, owady oraz tkanki i kultury komórkowe ssaków.

Wprowadzenie

Biologia systemów, która pojawiła się w połowie ubiegłego wieku1 i została rozwinięta przez analizę na dużą skalę zestawów danych genomicznych i transkryptomicznych2,3, rozwinęła się w nowe i niezbędne podejście do analizy złożonych systemów biologicznych4,5. Głównym celem biologii systemowej jest rozszyfrowanie interakcji i zależności składowych w systemach biologicznych oraz połączenie między genotypami, ich realizacją, przemianami molekularnymi i wynikającymi z nich fenotypami. W związku z tym integracja kompleksowych zbiorów danych, uzyskanych za pomocą różnych podejść analitycznych na dużą skalę, a mianowicie genomiki, transkryptomiki, metabolomiki, lipidomiki i proteomiki, oraz ich analiza obliczeniowa stała się warunkiem wstępnym dla opisu i zrozumienia złożonych systemów biologicznych.

Opierając się na ogromnej różnorodności chemicznej i złożoności składników biologicznych w każdym systemie żywym, tworzenie dużych i kompleksowych zestawów danych 'omicznych' w dużym stopniu zależy od jakości zastosowanej metody ekstrakcji9. Oprócz jakości metody ekstrakcji ważna jest ekonomia metody; Oznacza to, że pożądane byłoby uzyskanie jak największej ilości informacji molekularnych z jak najmniejszej ilości danych wejściowych do próbki. Często ilości próbek mogą być ograniczające i dlatego wysoce pożądane jest stosowanie metody ekstrakcji, która pozwala uzyskać jak najwięcej klas molekularnych z jednej ekstrakcji danej próbki. Oznacza to, że zamiast stosować kilka specjalistycznych metod ekstrakcji do ekstrakcji różnych klas związków z różnych podwielokrotności próbki tej samej próbki, stosuje się metodę ekstrakcji sekwencyjnej, która frakcjonuje składniki molekularne pojedynczej podwielokrotności na różne frakcje molekularne.

Powszechna metoda stosowana do tych metod ekstrakcji frakcjonowanej opiera się na dwufazowej metodzie ekstrakcji lipidów od Folch et al., opracowanej w 1957 roku10. Metoda ta opiera się na podziale metabolitów polarnych i hydrofobowych chloroform: metanol/woda i miała na celu oczyszczenie i rozkompleksienie próbek w celu przeprowadzenia wysokiej jakości analizy lipidów. Wraz z ewolucją biologii systemów multiomicznych, metoda Folcha została jeszcze bardziej stopniowo ulepszona, wykorzystując ją do partycjonowania próbek białek i polarnych metabolitów oraz lipidów w metabolomice i lipidomice związków polarnych i hydrofobowych opartych na chromatografii gazowej i cieczowej, a także proteomiki opartej na chromatografii cieczowej11,12,13,14. Niestety, wszystkie te metody opierają się na metodzie ekstrakcji opartej na chloroformie, która nie tylko prowadzi do niepożądanego tworzenia się osadu białkowego jako interfazy między fazą polarną a fazą lipidową, ale jest również niepożądanym rozpuszczalnikiem z punktu widzenia zielonej chemii15,16. Jednak rozpuszczalnik eter metylowo-tert-butylowy (MTBE) przezwycięża oba te wyżej wymienione problemy i jest odpowiednim zamiennikiem chloroformu. Opierając się na tych wymaganiach, zdecydowaliśmy się na opracowanie metody ekstrakcji MTBE: metanol : na bazie wody, która spełnia wszystkie wyżej wymienione specyfikacje i dlatego funkcjonuje jako idealny punkt wyjścia do kompleksowej analizy multiomicznej16.

Ten protokół prowadzi użytkownika krok po kroku przez prosty, szybki i powtarzalny przebieg przygotowania próbki, w tym rozwiązywanie często obserwowanych problemów. Ponadto pokrótce przedstawimy przykładowe dane analityczne z lipidomiki, metabolomiki i profilowania proteomicznego opartych na ultrasprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (UPLC-MS) na próbkach tkanek roślinnych. Mimo że podane przykłady pochodzą z 50 mg próbki tkanki liścia Arabidopsis thaliana, protokół ten został zastosowany w przypadku kilku innych próbek biologicznych i tkanek, w tym glonów17,18, insects19 oraz komórki, narządy i tkanki ssaków20,21,22. Zakres przedstawionego protokołu ekstrakcji polega na zapewnieniu jasnego i szczegółowego opisu postępowania z próbką przed ekstrakcją oraz samej procedury ekstrakcji. Mimo że podajemy trzy krótkie przykłady zastosowań analitycznych, szczegółowe informacje na temat obsługi danych przed i po analizie można uzyskać z naszych poprzednich publikacji 16,23,24,25,26.

Protokół

Uwaga: Metanol (MeOH) i eter metylowo-tert-butylowy (MTBE), używane podczas ekstrakcji, są łatwopalne i mogą mieć, przy długotrwałym narażeniu i/lub kontakcie, podrażnienie dróg oddechowych, oczu lub skóry. Należy obchodzić się z nimi ostrożnie tylko w dygestoriach i stosować odpowiednie procedury bezpieczeństwa podczas ekstrakcji (fartuch laboratoryjny, okulary ochronne, rękawice itp.). Ciekły azot i suchy lód, stosowane w kilku etapach tego protokołu, mogą powodować poważne oparzenia przy długotrwałym kontakcie ze skórą. Należy obchodzić się z nimi ostrożnie, nosząc rękawice i okulary ochronne. Użytkownicy mogą używać różnych chemikaliów, odczynników lub wewnętrznych wzorców do analizy próbek, z których niektóre mogą być toksyczne. Prosimy o zapoznanie się z odpowiednimi kartami charakterystyki chemicznej dla wszystkich użytych materiałów.

1. Pobieranie i pobieranie próbek biologicznych

  1. Przygotuj oznakowane probówki do zbioru.
    UWAGA: Tutaj należy pobrać próbki biologiczne w oznakowanych, okrągłodennych probówkach wirówkowych o pojemności 2 ml z bezpiecznym zamkiem, zawierających dwie metalowe kulki o średnicy 5 mm do homogenizatora tkanek.
  2. Przygotuj napełniony dewara ciekłym azotem.
  3. Zbierz próbkę biologiczną i błyskawicznie zamroź tkankę w ciekłym azocie. Wykonaj ten krok tak szybko, jak to możliwe, w ciągu kilku sekund, aby uniknąć zmian metabolicznych wywołanych zranieniem.
    Uwaga: Do celów demonstracyjnych użyj liści rozety z 30-dniowej parówki pospolitej (Col-0) typu dzikiego (Col-0) uprawianej na glebie w warunkach długiego dnia.
  4. Pobrane próbki należy przechowywać w suchym lodzie przez krótkie przerwy lub przechowywać je w temperaturze -80 °C przez dłuższy czas.

2. Mielenie i niszczenie tkanek

  1. Schłodzić wstępnie uchwyty probówek homogenizatora tkankowego w ciekłym azocie przez co najmniej 10 minut. Jeśli homogenizator tkankowy nie jest dostępny, użyj czystych i wstępnie schłodzonych moździerzy i tłuczków.
  2. Pobrać próbki z zamrażarki z ciekłym azotem, suchym lodem lub w temperaturze -80 °C i umieścić je w wstępnie schłodzonych uchwytach probówek.
  3. Szybko umieść uchwyty probówek w homogenizatorze tkankowym.
  4. Zmiel materiał biologiczny na drobny i jednorodny proszek. Użyj 20 Hz przez 1 minutę dla liści.
    Nuta; Czas i szybkość homogenizacji mogą się różnić w zależności od tkanki, należy upewnić się, że próbka jest homogenizowana do drobnego proszku i że proszek ten jest zamrożony na każdym etapie homogenizacji.
  5. Pobrać próbki biologiczne z uchwytów probówek i przechowywać je w stanie zamrożonym do czasu dalszej ekstrakcji.

3. Ważenie tkanek

  1. Użyć wagi analitycznej z wystarczającą precyzją dla wymaganych ilości próbki.
  2. Przygotować oznakowaną probówkę wirówkową z okrągłym dnem o pojemności 2 ml z bezpiecznym zamkiem.
  3. Wstępnie schłodzić probówki i szpatułki w ciekłym azocie.
  4. Porcję potrzebnej ilości sproszkowanej tkanki umieścić w probówce mikrowirówki o pojemności 2 ml z bezpiecznym zamknięciem.
    Ostrzeżenie: Należy unikać rozmrażania materiału roślinnego, minimalizując czas potrzebny na zważenie próbek.
  5. Podane próbki należy natychmiast po zważeniu umieścić w ciekłym azocie.
  6. Dla każdej próbki należy zanotować dokładną masę. Stosuj 10-50 mg ± 10% dla większości tkanek roślinnych.
  7. Przechowywać podane próbki w temperaturze -80 °C do czasu dalszej ekstrakcji.

4. Konfiguracja odczynnika

  1. Użyć mieszaniny ekstrakcyjnej eteru metylowo-tert-butylowego (MTBE)/ metanolu (MeOH).
    1. W celu przygotowania 100 ml rozpuszczalnika ekstrakcyjnego dodać 75 ml MTBE do 25 ml MeOH, aby uzyskać mieszaninę MTBE: MeOH (3:1, obj./obj.).
    2. Dodawanie wewnętrznych standardów normalizacji po analizie zgodnie z potrzebami analitycznymi. Zazwyczaj dodaje się 50 μl 1,2-diheptadecanoilo-sn-glycero-3-fosfocholiny (1 mg/ml w chloroformie) jako wzorzec wewnętrzny do analizy lipidów na podstawie UPLC-MS, dodając jednocześnie 50 μl sorbitolu 13C (1 mg/ml w wodzie) jako wzorce wewnętrzne do analizy pierwotnych metabolitów opartej na GC-MS. Wzorce wewnętrzne do analizy metabolitów na podstawie UPLC-MS to 50 μl kortykosteronu (1 mg/ml w metanolu) i 25 μl ampicyliny (1 mg/ml w metanolu).
    3. Przenieść rozpuszczalnik do czystej szklanej butelki, która została przepłukana mieszaniną MTBE: MeOH.
    4. Mieszaninę ekstrakcyjną należy przechowywać do 1 tygodnia w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Nie przechowuj mieszaniny ekstrakcyjnej przez dłuższy czas, aby zachować powtarzalne wyniki.
  2. Aby wywołać separację faz, użyj wody (H2O)/ metanolu (MeOH).
    1. Do przygotowania 100 ml H2O: MeOH dodaj 75 ml H2O do 25 ml MeOH, aby uzyskać H2O: MeOH (3:1, obj. / obj.).
    2. Przenieść rozpuszczalnik do czystej szklanej butelki, która została przepłukana mieszaninąH2O: MeOH. Rozpuszczalnik ten można przechowywać przez kilka tygodni w temperaturze pokojowej.

5. Pobieranie próbek

  1. Mieszaninę ekstrakcyjną (MTBE: MeOH, 3:1, obj./obj.) należy schłodzić do temperatury -20 °C za pomocą systemu chłodzenia cieczą lub zamrażarki o temperaturze -20 °C.
  2. Wyjąć podane próbki jedna po drugiej i dodać 1 ml wstępnie schłodzonej mieszaniny ekstrakcyjnej do każdej probówki z próbką. Uwaga: Wykonaj ten krok szybko ze względu na niską lepkość MTBE.
  3. Natychmiast wymieszać w mieszalniku wirowym, aż tkanka będzie dobrze homogenizowana w mieszaninie ekstrakcyjnej.
    UWAGA: Ten krok jest bardzo ważny, ponieważ jest wymagany do wytrącenia białek i dezaktywacji ich aktywności enzymatycznej.
  4. Inkubować wszystkie próbki na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 100 obr./min przez 45 minut w temperaturze 4°C.
  5. Sonikować próbki przez 15 minut w kąpieli sonizacyjnej chłodzonej lodem.

6. Frakcjonowanie przez separację faz

  1. Dodać 650 μlH2O: MeOH (3:1, obj./obj.) do każdej probówki z próbką.
  2. Dobrze wymieszaj, wirując przez 1 minutę.
  3. Odwirować próbki z prędkością 20 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Po tym kroku na dnie rurki znajdują się dwie niemieszające się fazy ciekłe ze stałym osadem.
    Ostrzeżenie: Z rurkami należy obchodzić się ostrożnie, aby uniknąć zmieszania dwóch faz ciekłych i nie zakłócić wytrąconego osadu.

7. Podział frakcji polarnych i hydrofobowych

  1. Przenieść 500 μl rozpuszczalnika z górnej, zawierającej lipidy, fazy do znakowanej 1,5 ml probówki mikrowirówkowej.
    UWAGA: Podane próbki lipidów mogą być bezpośrednio zagęszczone do natychmiastowej analizy UPLC-MS (krok 8.1) lub przechowywane przez kilka tygodni w temperaturze -80 °C.
  2. Po usunięciu 500 μl z próbki należy usunąć pozostałą fazę lipidową za pomocą pipety o pojemności 200 μl.
  3. Przenieść 400 μl rozpuszczalnika z dolnej fazy (metabolity polarne i półpolarne) do znakowanej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Podane próbki polarne mogą być bezpośrednio zagęszczane do natychmiastowej analizy UPLC-MS (etap 8.2) lub przechowywane przez kilka tygodni w temperaturze -80 °C.
  4. Weź dodatkową podwielokrotność 200 μl, aby przeprowadzić dodatkową analizę, np. analizę metabolitów opartą na chromatografii gazowej, zgodnie z opisem Preciously16.
  5. Usunąć pozostałą część fazy wodnej, odpipetowując nadmiar objętości.
  6. Otrzymane białko, skrobię, osad ściany komórkowej przemyć 500 μl metanolu, dokładnie wirując go przez 1 min.
  7. Odwirować próbki z prędkością 10 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4°C.
  8. Wykonaj ekstrakcję i trawienie białka (krok 11) lub analizę skrobi/ściany komórkowej zgodnie z wcześniejszym opisem16.
    UWAGA: Jeśli nie zostaną natychmiast wykorzystane, granulki te można przechowywać przez kilka tygodni w temperaturze -80 °C.

8. Koncentracja i przechowywanie frakcji

  1. Odparować rozpuszczalnik z próbek lipidów (od kroku 7.1) w koncentratorze próżniowym bez ogrzewania (przez 1-2 godziny) lub najlepiej użyć parownika przepływowego azotu, aby uniknąć modyfikacji oksydacyjnej lipidów.
    UWAGA: Wysuszone próbki należy natychmiast przeanalizować. Do przechowywania należy pozostawić próbki w roztworze MTBE, najlepiej w szklanych fiolkach (etap 7.1).
  2. Odparować rozpuszczalnik z próbek wodnych (z etapu 7.3 lub 7.4) przez noc w koncentratorze próżniowym bez podgrzewania. UWAGA: wysuszone próbki mogą być przechowywane przez kilka tygodni w temperaturze -80 °C przed analizą.

9. Analiza lipidów za pomocą UPLC-MS24

  1. Ponownie zawiesić wysuszone frakcje lipidowe (z kroku 8.1) w 400 μl acetonitrylu: 2-propanolu (7:3, obj./obj.).
  2. Przenieść wystarczającą ilość płynu do szklanych fiolek i szczelnie zakręcić.
  3. Umieścić szklane fiolki w schłodzonym podajniku próbek (4 °C).
  4. Wstrzyknąć 2 μl na próbkę i oddzielić lipidy w kolumnie C8 z odwróconą fazą (RP) utrzymywaną w temperaturze 60 °C przy użyciu systemu UPLC pracującego z natężeniem przepływu 400 μl/min.
  5. Do rozdzielania chromatograficznego należy użyć faz ruchomych opisanych w tabeli 1.
  6. Uzyskać widma masowe w trybie jonizacji dodatniej i ujemnej za pomocą odpowiedniego przyrządu MS obejmującego zakres mas od 150 do 1,500 m/z.

10. Analiza metabolitów polarnych i półpolarnych za pomocą UPLC-MS25.

  1. Ponownie zawiesić fazę polarną (od kroku 8.2) w 200 μl metanolu klasy UPLC: woda (1:1, obj./obj.).
  2. Przenieść wystarczającą ilość płynu do szklanych fiolek i szczelnie zakręcić.
  3. Umieścić szklane fiolki w schłodzonym podajniku próbek (4 °C).
  4. Wstrzyknąć 2 μl z każdej próbki i oddzielić metabolity w kolumnie RP C18 utrzymywanej w temperaturze 40 °C przy użyciu systemu UPLC pracującego z natężeniem przepływu 400 μl/min.
  5. Do rozdzielania chromatograficznego wykorzystuje się fazy ruchome o parametrach podanych w tabeli 2.
  6. Uzyskaj pełne widma masowe skanowania w trybie jonizacji dodatniej i ujemnej za pomocą odpowiedniego spektrometru mas obejmującego zakres mas od 50 do 1 500 m/z.

11. Ekstrakcja, trawienie i analiza białek16

  1. Ponownie zawiesić przemyty osad białka/skrobi/ściany komórkowej (od kroku 7.8) w 200 μl wybranego buforu do ekstrakcji białek. Uwaga: Używamy buforu mocznikowego/tiomocznikowego (5 M mocznika, 2 mM tiomocznika, 15 mM DTT, 2% CHAPS oraz inhibitory proteazy i fosfatazy)27.
  2. Sonikować próbki przez 10 minut w chłodzonej lodem kąpieli sonicznej.
  3. Inkubować próbki przez 30 minut na wytrząsarce orbitalnej (100 obr./min) w temperaturze pokojowej.
  4. Odwirować rozpuszczone białka w temperaturze 10 000 x g przez 5 minut.
  5. Zebrać supernatant białkowy do nowej probówki.
  6. Określ stężenie białka z zebranego supernatantu28.
  7. Trawić 50 μg białka w roztworze według wybranego protokołu. Zazwyczaj należy stosować mieszankę Trypsyny/Lys-C zgodnie z instrukcją obsługi.
  8. Po mineralizacji należy przeprowadzić odsalanie peptydów przed spektrometrią mas za pomocą końcówek stopnia C18 i wymyć strawione peptydy 29.
  9. Zagęścić próbki do temperatury bliskiej suchości w koncentratorze próżniowym bez podgrzewania.
  10. Ponownie zawiesić próbki w odpowiednim buforze ładującym (np. 5% acetonitrylu, 0,5% kwasu mrówkowego) i przeanalizować mieszaniny peptydów za pomocą LC-MS/MS przy użyciu spektrometru mas o wysokiej rozdzielczości podłączonego do systemu nano LC.
    UWAGA: W przykładowym zestawie danych proteomicznych przedstawionym w tym protokole zastosowaliśmy gradient opisany w Tabeli 3.
  11. Ustaw spektrometr mas, stosując strategię 15 najlepszych, w której po jednym pełnym skanowaniu (FS) następowało do 15 skanów MS/MS zależnych od danych, na następujące parametry: FS mieścił się w zakresie mas 200 - 2 000 m/z przy rozdzielczości 70 000 z wartością docelową 3x106 jonów. Uzyskaj zależne od danych skany MS/MS za pomocą dysocjacji kolizyjnej o wyższej energii (HCD). Ustaw wartości docelowe dla MS/MS na 1e5 jonów, z maksymalnym czasem napełniania jonami 50 ms, oknem izolacyjnym 4,0 m/z, znormalizowaną energią zderzenia (NCE) wynoszącą 30% i współczynnikiem niedopełnienia wynoszącym 1%. Zmierz jony MS/MS w rozdzielczości 17.500, a wyłączenie dynamiczne zostało ustawione na 60 s.

Wyniki

Kompleksowe zestawy danych multiomicznych są nieocenione dla zrozumienia złożonych systemów biologicznych. Strategia udanego eksperymentu biologicznego zazwyczaj rozpoczyna się od sensownego projektu eksperymentalnego, przygotowania i przeprowadzenia badania, a następnie od pobrania próbek, ekstrakcji, pozyskiwania danych analitycznych, przetwarzania danych surowych, statystycznej analizy danych, identyfikacji odpowiednich metabolitów oraz interpretacji danych biologicznych, w tym mapowania i wizualizacji szlaków (Rysunek 1).

W przedstawionym protokole ekstrakcji koncentrujemy się na etapach pobierania, przygotowania i ekstrakcji próbek, które zostały przedstawione w szczegółowym schemacie przepływu pracy na Ryc. 2. Do celów demonstracyjnych wybrano 50 mg tkanki liściowej Arabidopsis. Materiał ten został zebrany, zmielony i poddany ekstrakcji przed analizą na trzech przykładowych platformach analitycznych UPLC-MS, dostarczając danych, które mogą być wykorzystane do celowej i niecelowej analizy lipidomicznej, metabolomicznej oraz proteomicznej. Ryc. 2 oraz Ryc. 6 zawierają dodatkowo reprezentatywne zdjęcia przedstawiające wygląd rozpuszczalnika do ekstrakcji w standardowych warunkach. Ponadto pokazano przykłady próbek zawierających nadmierne ilości wytrąconych makromolekuł (białek i skrobi) oraz próbek z niewłaściwą homogenizacją (Ryc. 3). Rozwiązania tych dwóch powszechnych problemów przedstawiono zwięźle na Ryc. 3, a bardziej szczegółowo omówiono w naszej poprzedniej publikacji16.

Rysunki 4 i 5 przedstawiają przykłady trzech chromatogramów analitycznych uzyskanych z analiz lipidów, metabolitów polarnych/ półpolarnych oraz białek. Lipidy, wyizolowane z górnej fazy MTBE (Rysunek 2), analizowano metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (UPLC) w fazie odwróconej (RP) na kolumnie C8 sprzężonej z wysokorozdzielczą spektrometrią mas. Dane lipidowe można pozyskać, stosując dodatni i ujemny tryb jonizacji MS (Rysunek 4, górny panel)16,24.

Polarnymi i półpolarnymi pierwotnymi oraz wtórnymi metabolitami analizowano fazę polarną (woda/metanol) (Rysunek 2) przy użyciu RP C18UPLC-MS w fazie odwróconej (RP)25. Przedstawiona metoda, wykorzystująca chromatografię w fazie odwróconej, jest wysoce kompatybilna z analizą metabolitów półpolarnych (mianowicie metabolitów z wtórnego metabolizmu roślin), które można analizować w trybach jonizacji dodatniej i ujemnej w MS (Rysunek 4, dolny panel)16. Bardziej hydrofilowe metabolity z tej frakcji (cukry, polarne aminokwasy itp.), które nie wykazują dobrej retencji na materiale w fazie odwróconej, mogą być analizowane za pomocą innych metod analitycznych, takich jak GC-MS16 lub cieczowa chromatografia oddziaływań hydrofilowych30.

Białka, odzyskane z stałego osadu na dnie probówki do ekstrakcji (Rysunek 2), poddano trawieniu w roztworze i analizie za pomocą metody shot gun LC-MS (Rysunek 5), natomiast protokół ekstrakcji skrobi oraz materiału ścian komórkowych można znaleźć w naszym wcześniej opublikowanym protokole16.

Podsumowując, z próbek typu stosowanego w naszym przykładzie można rutynowo zidentyfikować ponad 200 gatunków lipidów, 50 opisanych metabolitów półpolarnych oraz kilka tysięcy białek. Dodatkowo metoda wykazała szerokie zastosowanie w różnych tkankach, organach i materiale z hodowli komórkowych (Rysunek 6).

Schemat workflow metabolomiki: pobieranie próbek, ekstrakcja, pozyskiwanie danych, analiza.
Rycina 1: Ogólny schemat analizy omicznej na dużą skalę w podejściu nietargetowanym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat procesu ekstrakcji metabolitów; pokazuje etapy przygotowania próbek, mieszania w wortexie i wirowania.
Rysunek 2: Schemat przygotowania próbek i ekstrakcji do analizy lipidów, metabolitów i białek z jednej alikwoty próbki biologicznej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Proces ekstrakcji cząstek; metoda mielenia, ponownej ekstrakcji i wirowania; schemat eksperymentu, przygotowanie próbki.
Rysunek 3: Ilustracyjne przykłady problemów często występujących podczas stosowania protokołów ekstrakcji z dwufazowym rozdziałem. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza spektrometrią mas; chromatogram, wykresy kołowe; profilowanie lipidów, względna obfitość, identyfikacja związków.
Rycina 4: Reprezentatywne chromatogramy lipidów i metabolitów półpolarnych z ekstraktów liści Arabidopsis thaliana. Chromatogramy szczytów podstawowych dla lipidów (górny panel) i metabolitów półpolarnych (dolny panel) analizowanych w trybie jonizacji dodatniej16. Wykresy kołowe w prawym górnym rogu każdego chromatogramu przedstawiają liczbę zidentyfikowanych lipidów i metabolitów przypisanych do różnych klas chemicznych. Chl, chlorofile; DAG, diacyloglicerydy; DGDG, digalaktozyldiacyloglicerol; FA, kwasy tłuszczowe; LysoPC, lizofosfatydylocholina; MGDG, monogalaktozyldiacyloglicerol; PC, fosfatydylocholina; PE, fosfatydyloetanoloamina; PG, fosfatydyloglicerol; PI, fosfatydyloinozytol; PS, fosfatydyloseryna; SP, sfingolipidy; SQDG, sulfochinowosyldiacyloglicerol; TAG, triacyloglicerydy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres danych chromatograficznych i wykres kołowy; piki spektrometrii mas; analiza względnej obfitości.
Rysunek 5: Reprezentatywny chromatogram pików podstawowych peptydów z ekstraktów z liści Arabidopsis thaliana.
Wykres kołowy w prawym górnym rogu wskazuje liczbę zidentyfikowanych białek przypisanych do różnych procesów biologicznych16. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Proces ekstrakcji tkanek roślinnych; schemat; liście, kwiaty, strąki, nasiona; analiza pigmentów.
Rysunek 6: Reprezentatywne przykłady ekstrakcji z różnych typów tkanek dzikiego typu Arabidopsis thaliana.
Wszystkie próbki zostały przygotowane poprzez ekstrakcję 50 mg świeżej masy z wskazanych tkanek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Czas (min)% Buforu A do Buforu B
0 do 1 min45% A Bufor A: 1% 1M octanu NH4, 0,1% kwasu octowego w wodzie klasy UPLC MS
od 1 do 4 min Liniowy gradient od 45% A do 25% ABufor B: 1% 1M octanu NH4, 0,1% kwasu octowego w acetonitrylu/izopropanolu 7:3 (v:v)
od 4 do 12 min Liniowy gradient od 25% A do 11% ASzybkość przepływu 400 µL/min
12 do 15 min Gradient liniowy od 11% A do 0% AObjętość iniekcji 2 µL
15 do 19,5 minPrzemywać kolumnę przez 4,5 min przy 0% A
19.50 do 19.51 minUstaw ponownie na 45% A 
19.51 do 24 minRównoważyć przy użyciu 45% A 

Tabela 1: Parametry gradientu dla rozdziału lipidów metodą RP-UPLC.RP, faza odwrócona. UPLC, ultrawydajna chromatografia cieczowa.

Czas (min)% Buforu A do Buforu B
0 do 1 min99% ABufor A: 0,1% kwas mrówkowy w wodzie klasy UPLC
od 1 do 11 minGradient liniowy od 99% A do 60% ABufor B: 0,1% kwas mrówkowy w acetonitrylu klasy UPLC grad
11 do 13 minGradient liniowy od 60% A do 30% ASzybkość przepływu 400 µL/min
13–15 minGradient liniowy od 30% A do 1% AObjętość wstrzykiwania 2 µL
15 do 16 minPrzemyj kolumnę przez 1 min roztworem 1% A 
16 do 17 minGradient liniowy od 1% A do 99% A
17 do 20 minRównoważyć przez 3 min w 99% A 

Tabela 2: Parametry gradientu dla rozdziału metabolitów polarnych i półpolarnych metodą RP-UPLC.RP, faza odwrócona. UPLC, ultra-wydajna chromatografia cieczowa.

Czas (min)% Buforu B do Buforu A
0 do 5 minGradient liniowy od 0 do 10%Bufor A: 0,1% kwas mrówkowy w wodzie klasy UPLC
od 5 do 80 minGradient liniowy od 10% do 40%Bufor B: 0,1% kwasu mrawkowego w 60% acetonitrylu klasy UPLC
80 do 85 minGradient liniowy od 40% do 60% Przepływ 300 nL/min
85 do 86 minGradient liniowy od 60% do 95% Objętość wtrysku 5 µL
86 do 91 minPrzemywać kolumnę przez 5 min roztworem 95% 
91 do 92 minGradient liniowy od 95% do 0% 
93 do 110 minRównoważyć kolumnę przez 17 min przy 0%

Tabela 3: Parametry gradientu dla rozdziału peptydów metodą nano-LC. LC, chromatografia cieczowa.
 

Dyskusja

W tym artykule opisujemy i ilustrujemy prosty i wysoce przydatny protokół ekstrakcji do kompleksowej analizy lipidomicznej, metabolomicznej i proteomicznej z pojedynczej próbki liści o sile 50 mg. Metoda ta była wcześniej stosowana w kilku badaniach, które zostały opublikowane w różnych artykułach 17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,31,32,33,34,35,36 ,37i udowodnione, że oprócz prostego przepływu pracy i wysokiej możliwości zastosowania są solidne i powtarzalne.

Przedstawione tutaj aplikacje pokazują niektóre rutynowe metody wstępnego badania przesiewowego złożonej próbki biologicznej. Te ilustrowane zestawy danych metabolomicznych i lipidomicznych na dużą skalę mogą dostarczyć wyczerpujących informacji na temat szerokich lub specyficznych zmian w metabolizmie analizowanego systemu biologicznego, podczas gdy dane uzyskane z analizy białek dostarczają wglądu w ilościowe (obfitość) i jakościowe (modyfikacje) zmiany enzymów, białek strukturalnych lub czynników transkrypcyjnych (TF) kontrolujących funkcje komórkowe i maszynerię. W związku z tym dane z zakresu integracji omicznej mogą potencjalnie ujawnić wstępne informacje na temat możliwych zmian wywołanych przez genetyczne lub biotyczne i/lub abiotyczne perturbacje systemu biologicznego, poprzez wyjaśnienie zmian molekularnych różnych cząsteczek związanych z określonymi szlakami metabolicznymi lub procesami komórkowymi.

Oczywiście, w dłuższej perspektywie, dla udanej analizy biologii systemowej, bardzo ważne jest, aby zmaksymalizować liczbę analizowanych i opisywanych jednostek molekularnych, co pozwala na jak najpełniejsze monitorowanie funkcji i aktywności komórek. W tym celu otrzymane frakcje mogą być dodatkowo stosowane w różnych metodach analitycznych, ukierunkowanych na kolejne związki lub klasy związków (ryc. 4).

To powiedziawszy, należy wspomnieć, że globalna strategia analizy uzyskanych danych może być realizowana przez dwie różne strategie: z jednej strony kładziemy nacisk na wyjaśnienie funkcji komórkowych poprzez kwantyfikację znanych związków. Z drugiej strony, wiele z mierzonych metabolitów i lipidów nie jest jeszcze znanych ani opisanych. Te, jeszcze nieopatrzone adnotacjami, złożone pomiary zawierają również wiele istotnych informacji, które mogą być wykorzystane przez metody statystyczne do klasyfikacji lub dyskryminacji między grupami lub terapiami 20,21,22.

Mimo to te nieznane związki, zwłaszcza te istotne dla klasyfikacji grupowej lub służące jako biomarkery, muszą zostać zidentyfikowane. Ten proces identyfikacji jest niestety dość żmudny i nie można go osiągnąć bez dodatkowych pomiarów analitycznychlub strategii 38. Jak widać na rysunku 4, liczba związków bez adnotacji jest dość duża (w rzeczywistości jest to zdecydowana większość). Niemniej jednak, jak wspomniano powyżej, te piki chromatograficzne mogą być obsługiwane w ramach analizy danych, a zatem istotnie dotknięte jednostki mogą zostać wyjaśnione i poddane dalszym strategiom identyfikacji.

Podsumowując, możemy stwierdzić, że wprowadzony tutaj protokół zapewnia kilka korzyści zarówno dla biologii systemów eksperymentalnych, jak i dla klasycznych zastosowań statystycznych.

Po pierwsze, ponieważ wszystkie frakcje są ekstrahowane z jednej próbki, różnica między różnymi zestawami danych doświadczalnych (lipidy, metabolity, białka) jest znacznie zmniejszona, ponieważ każdy zestaw danych pochodzi z tej samej podwielokrotności próbki. Prowadzi to w oczywisty sposób do zwiększenia porównywalności uzyskanych wyników.

Po drugie, metoda jest łatwo skalowalna, dzięki czemu jest wysoce kompatybilna z małymi i dużymi ilościami próbek. Rutynowo używamy 10-100 mg próbek tkanek, ale udane badania lipidomiczne przeprowadzono również na zaledwie 20 nasionach Arabidopsis31. Zwłaszcza kompatybilność z małymi ilościami próbek sprawia, że metoda ta ma zastosowanie, jeśli dostępne są ograniczone ilości tkanek biologicznych lub próbek. Mimo to, nawet jeśli dostępna jest wystarczająca ilość materiału próbki, przedstawiona tutaj metoda ma tę zaletę, że pozwala na wykorzystanie tych próbek w większej liczbie powtórzeń eksperymentalnych zamiast wykorzystywania ich do różnych procedur ekstrakcji. Pozwala to na lepszą i dopracowaną analizę danych statystycznych.

Po trzecie, ponieważ metoda ta opiera się na frakcjonowaniu cząsteczek polarnych i niepolarnych cieczą, zapewnia ona, w przeciwieństwie do prostych metod ekstrakcji jednofazowej (np. ekstrakcji metanolem), istotny etap dekompleksowania w procedurze. To skuteczne odkompleksowanie próbki prowadzi do częściowego oczyszczenia poszczególnych frakcji w wyniku oddzielenia od siebie cząsteczek zakłócających działanie chemiczne. W związku z tym proces podziału chemicznego nie tylko zapewnia praktyczną korzyść w zakresie systematycznego dzielenia wyekstrahowanych próbek na różne klasy chemiczne, ale także usprawnia indywidualne pomiary analityczne, ponieważ usuwa związki zanieczyszczające z różnych frakcji. Wyraźnie możemy zaobserwować, że zwłaszcza lipidy, które są podzielone na fazę organiczną i które zwykle negatywnie wpływają na analizę chromatograficzną związków polarnych, będą prawie całkowicie nieobecne we frakcji polarnej. To samo dotyczy analizy lipidów hydrofobowych, które zostaną zubożone ze związków polarnych. Oprócz oczyszczania ze związków polarnych i niepolarnych od siebie, zubożamy i zbieramy białka i inne makrocząsteczki z próbki, co nie tylko zapewnia oddzielną frakcję, którą można wykorzystać do analizy białek, skrobi i ścian komórkowych16, ale także prowadzi do czystszej próbki w poszczególnych frakcjach. Jest to szczególnie istotne, ponieważ wiadomo, że obecność dużych makrocząsteczek prowadzi do uszkodzenia lub przynajmniej skrócenia żywotności kolumn analitycznych.

Wreszcie, opisana metoda ekstrakcji MTBE, która opiera się na mniej niebezpiecznym i korzystniejszym rozpuszczalniku zastępującymchloroform15, została już wykazana w kilku badaniach naszej grupy, że ma szerokie zastosowanie do różnych próbek biologicznych z roślin16, glonów17,18, much19, ale także kilku tkanek, narządów lub komórek ssaków20, Rozdział 21,22.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Podziękowania

M.S. jest wspierany przez pełne stypendium doktoranckie z programu GERLS-DAAD. Dziękujemy dr. Andrzejowi Wiszniewskiemu za korektę i komentarz do manuskryptu. Jesteśmy bardzo wdzięczni wszystkim członkom laboratorium Giavalisco w Instytucie Molekularnej Fizjologii Roślin im. Maxa Plancka w Golm w Niemczech za ich pomoc.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Odczynniki i wzorce
Ampicillin Sigma AldrichA9393-5GWewnętrzny wzorzec metabolitów
Kortykosteron Sigma Aldrich27840-500MGWzorzec wewnętrzny metabolitów, klasa HPLC
13C SorbitolSigma Aldrich605514Wzorzec wewnętrzny dla metabolitów, ISOTEC®   Stabilne izotopy
1,2-diheptadekanoilo-sn-glicero-3-fosfocholiny (17:0 PC) Avanti Polar Lipids850360PWewnętrzny wzorzec lipidów
Metanol (MeOH) Biosolve Chemicals13684102klasy ULC-MS
Chemikalia Biosolve23214102klasy ULC-MS
(MTBE) Biosolve Chemicals13890602
Mieszanina trypsyny/Lys-C klasy HPLC PromegaV5072Enzymatyczne trawienie białek
Equipment
Balance Korporacja Sartorius 14 557 572
Młynek do mielenia tkanek i młynka Retsch, Młynek miksujący MM 30020.746.0001
Moździerz i tłuczek Mieszalnik wirowy Sigma AldrichZ247464-1EA
 Vortex-Genie 2, Model G560SI-0236
Koncentratorpróżniowy Prędkość skanowania Maxi Vac Alpha Parowniki7.008.500.002
2 mL Probówki do mikrowirówek z bezpiecznym zamkiem Eppendorf30120094Służy do ekstracji próbek
1,5 ml probówek mikrowirówkowych Safe-lock Eppendorf30120086Używany do frakcji
ShakerEppendorf Thermomixer 54362050-100-05
Sonicator USC 300 TH142-0084
Mikrowirówka z chłodzeniemEppendorf, model 5427R22620701
system UPLC System Waters Acquity UPLC (Waters, Machester, Wielka Brytania)
 System MS Exactive, typu Orbitrap, MS (Exactive, Thermo-Fisher, Brema, Niemcy).
Kolumna C8 z odwróconą fazą (RP) z mostkiem hybrydowym etylowym (BEH) (100 mm i razy 2,1 mm zawierające 1,7 μ m średnica cząstek)Waters, Machester, Wielka Brytania186002878Analiza lipidów
RP Kolumna T3 z krzemionki o wysokiej wytrzymałości (HSS) (100 mm i razy 2,1 mm zawierające 1,8 μ m średnica cząstek) Waters, Machester, Wielka Brytania186003539Analiza metabolitów
Spektrometr masowy wysokiej rozdzielczości Q ExactivePlus podłączony do systemu EASY-nLC 1000 Thermo-Fisher, Brema, NiemcyAnaliza peptydów
Woda Eter metylowo-tert-butylowy

Bibliografia

  1. Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve. J Physiol. 117 (4), 500-544 (1952).
  2. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
  3. Yang, M. Q., et al. The emerging genomics and systems biology research lead to systems genomics studies. BMC Genomics. 15, Suppl 11 1(2014).
  4. Sheth, B. P., Thaker, V. S. Plant systems biology: insights, advances and challenges. Planta. 240 (1), 33-54 (2014).
  5. Ideker, T., Galitski, T., Hood, L. A new approach to decoding life: Systems biology. Annu Rev Genom Hum G. 2, 343-372 (2001).
  6. Somvanshi, P. R., Venkatesh, K. V. A conceptual review on systems biology in health and diseases: from biological networks to modern therapeutics. Syst Synth Biol. 8 (1), 99-116 (2014).
  7. Oliver, S. G., Winson, M. K., Kell, D. B., Baganz, F. Systematic functional analysis of the yeast genome. Trends Biotechnol. 16 (9), 373-378 (1998).
  8. Tweeddale, H., Notley-McRobb, L., Ferenci, T. Effect of slow growth on metabolism of Escherichia coli, as revealed by global metabolite pool ("metabolome") analysis. J Bacteriol. 180 (19), 5109-5116 (1998).
  9. Kim, H. K., Verpoorte, R. Sample preparation for plant metabolomics. Phytochemical analysis : PCA. 21 (1), 4-13 (2010).
  10. Folch, J., Lees, M., Stanley, G. H. S. A Simple Method for the Isolation and Purification of Total Lipides from Animal Tissues. J Biol Chem. 226 (1), 497-509 (1957).
  11. Weckwerth, W., Wenzel, K., Fiehn, O. Process for the integrated extraction, identification and quantification of metabolites, proteins and RNA to reveal their co-regulation in biochemical networks. Proteomics. 4 (1), 78-83 (2004).
  12. Wienkoop, S., et al. Integration of metabolomic and proteomic phenotypes: analysis of data covariance dissects starch and RFO metabolism from low and high temperature compensation response in Arabidopsis thaliana. Mol Cell Proteomics. 7 (9), 1725-1736 (2008).
  13. Valledor, L., et al. A universal protocol for the combined isolation of metabolites, DNA, long RNAs, small RNAs, and proteins from plants and microorganisms. Plant J. 79 (1), 173-180 (2014).
  14. Nakayasu, E. S., et al. MPLEx: a Robust and Universal Protocol for Single-Sample Integrative Proteomic, Metabolomic, and Lipidomic Analyses. mSystems. 1 (3), (2016).
  15. Alfonsi, K., et al. Green chemistry tools to influence a medicinal chemistry and research chemistry based organisation. Green Chem. 10 (1), 31-36 (2008).
  16. Salem, M. A., Juppner, J., Bajdzienko, K., Giavalisco, P. Protocol: a fast, comprehensive and reproducible one-step extraction method for the rapid preparation of polar and semi-polar metabolites, lipids, proteins, starch and cell wall polymers from a single sample. Plant Methods. 12, 45(2016).
  17. Hemme, D., et al. Systems-wide analysis of acclimation responses to long-term heat stress and recovery in the photosynthetic model organism Chlamydomonas reinhardtii. Plant Cell. 26 (11), 4270-4297 (2014).
  18. Sharma, D. K., et al. UPLC-MS analysis of Chlamydomonas reinhardtii and Scenedesmus obliquus lipid extracts and their possible metabolic roles. J Appl Phycol. 27 (3), 1149-1159 (2015).
  19. Delgado, R., Munoz, Y., Pena-Cortes, H., Giavalisco, P., Bacigalupo, J. Diacylglycerol activates the light-dependent channel TRP in the photosensitive microvilli of Drosophila melanogaster photoreceptors. J Neurosci. 34 (19), 6679-6686 (2014).
  20. Bozek, K., et al. Organization and evolution of brain lipidome revealed by large-scale analysis of human, chimpanzee, macaque, and mouse tissues. Neuron. 85 (4), 695-702 (2015).
  21. Khrameeva, E. E., et al. Neanderthal ancestry drives evolution of lipid catabolism in contemporary Europeans. Nat Commun. 5, 3584(2014).
  22. Bozek, K., et al. Exceptional evolutionary divergence of human muscle and brain metabolomes parallels human cognitive and physical uniqueness. PLoS Biol. 12 (5), 1001871(2014).
  23. Krueger, S., Steinhauser, D., Lisec, J., Giavalisco, P. Analysis of subcellular metabolite distributions within Arabidopsis thaliana leaf tissue: a primer for subcellular metabolomics. Methods Mol Biol. 1062, 575-596 (2014).
  24. Hummel, J., et al. Ultra performance liquid chromatography and high resolution mass spectrometry for the analysis of plant lipids. FrontPlant Sci. 2, 54(2011).
  25. Giavalisco, P., et al. Elemental formula annotation of polar and lipophilic metabolites using (13) C, (15) N and (34) S isotope labelling, in combination with high-resolution mass spectrometry. Plant J. 68 (2), 364-376 (2011).
  26. Caldana, C., et al. Systemic analysis of inducible target of rapamycin mutants reveal a general metabolic switch controlling growth in Arabidopsis thaliana. Plant J. 73 (6), 897-909 (2013).
  27. Giavalisco, P., et al. Proteome analysis of Arabidopsis thaliana by two-dimensional gel electrophoresis and matrix-assisted laser desorption/ionisation-time of flight mass spectrometry. Proteomics. 5 (7), 1902-1913 (2005).
  28. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  29. Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
  30. Spagou, K., et al. Hydrophilic interaction chromatography coupled to MS for metabonomic/metabolomic studies. J Sep Sci. 33 (6-7), 716-727 (2010).
  31. Hauck, O. K., et al. Uric acid accumulation in an Arabidopsis urate oxidase mutant impairs seedling establishment by blocking peroxisome maintenance. Plant Cell. 26 (7), 3090-3100 (2014).
  32. Avin-Wittenberg, T., et al. Global analysis of the role of autophagy in cellular metabolism and energy homeostasis in Arabidopsis seedlings under carbon starvation. Plant Cell. 27 (2), 306-322 (2015).
  33. Watanabe, M., et al. Comprehensive dissection of spatiotemporal metabolic shifts in primary, secondary, and lipid metabolism during developmental senescence in Arabidopsis. Plant physiol. 162 (3), 1290-1310 (2013).
  34. Lambers, H., et al. Proteaceae from severely phosphorus-impoverished soils extensively replace phospholipids with galactolipids and sulfolipids during leaf development to achieve a high photosynthetic phosphorus-use-efficiency. New Phytol. 196 (4), 1098-1108 (2012).
  35. Degenkolbe, T., et al. Differential remodeling of the lipidome during cold acclimation in natural accessions of Arabidopsis thaliana. Plant J. 70, 972-982 (2012).
  36. Bromke, M. A., et al. Liquid chromatography high-resolution mass spectrometry for fatty acid profiling. Plant J. 81 (3), 529-536 (2015).
  37. Li, N., et al. FAX1, a novel membrane protein mediating plastid fatty acid export. PLoS Biol. 13 (2), 1002053(2015).
  38. Kueger, S., Steinhauser, D., Willmitzer, L., Giavalisco, P. High-resolution plant metabolomics: from mass spectral features to metabolites and from whole-cell analysis to subcellular metabolite distributions. Plant J. 70 (1), 39-50 (2012).

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Ekstrakcja metabolitówekstrakcja lipidówekstrakcja białekekstrakcja MTBEanaliza multiomicznachromatografia cieczowachromatografia gazowaspektrometria mashomogenizacja tkanek
Prosta metoda ekstrakcji frakcjonowanej do kompleksowej analizy metabolitów, lipidów i białek z pojedynczej próbki
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.