Monitorowanie uwalniania wapnia ER/SR za pomocą ukierunkowanego czujnika Ca2+ CatchER+

Podsumowanie

Prezentujemy protokoły zastosowania naszego ukierunkowanego, genetycznie kodowanego wskaźnika wapnia (GECI) CatchER⁺ do monitorowania szybkich stanów przejściowych wapnia w retikulum endoplazmatycznym/sarkoplazmatycznym (ER/SR) HEK293 i komórkach C2C12 mięśni szkieletowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w czasie rzeczywistym. Omówiono również protokół pomiaru i kalibracji in situ K_d.

Streszczenie

Wewnątrzkomórkowe stany przejściowe wapnia (^Ca2+) wywołane przez bodźce zewnątrzkomórkowe inicjują wiele procesów biologicznych w organizmach żywych. W centrum wewnątrzkomórkowego uwalniania wapnia znajdują się główne wewnątrzkomórkowe organelle magazynujące wapń, retikulum endoplazmatyczne (ER) i bardziej wyspecjalizowana retikulum sarkoplazmatyczne (SR) w komórkach mięśniowych. Dynamiczne uwalnianie wapnia z tych organelli odbywa się za pośrednictwem receptora ryanodyny (RyR) i receptora 1,4,5-trifosforanu inozytolu (IP₃R), przy czym uzupełnianie odbywa się przez pompę ATPazy wapniowej sarko/retikulum endoplazmatycznego (SERCE). Stworzono genetycznie kodowany czujnik wapnia (GECI) o nazwie CatchER w celu monitorowania szybkiego uwalniania wapnia z ER/SR. W tym miejscu przedstawiono szczegółowe protokoły transfekcji i ekspresji ulepszonego, ukierunkowanego na ER / SR GECI CatchER⁺ w komórkach HEK293 i C2C12 oraz jego zastosowanie w monitorowaniu stanów przejściowych wapnia za pośrednictwem pompy IP₃R, RyR i SERCA w komórkach HEK293 za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Wybrany agonista lub inhibitor receptora jest rozpraszany w roztworze komory, a zmiany intensywności są rejestrowane w czasie rzeczywistym. Dzięki tej metodzie obserwuje się spadek wapnia ER z aktywacją RyR za pomocą 4-chloro-m-krezolu (4-cmc), pośrednią aktywacją IP₃R za pomocą trifosforanu adenozyny (ATP) i hamowaniem pompy SERCA za pomocą kwasu cyklopiazonowego (CPA). Omawiamy również protokoły oznaczania in situ K_d i ilościowego określania podstawowego [Ca^{2 +}] w komórkach C2C12. Podsumowując, protokoły te, stosowane w połączeniu z CatchER⁺, mogą wywoływać uwalnianie wapnia z ER za pośrednictwem receptora, co w przyszłości znajdzie zastosowanie w badaniu patologii związanych z wapniem ER/SR.

Wprowadzenie

Czasoprzestrzenne atrybuty wewnątrzkomórkowych stanów przejściowych wapnia (^Ca2+) aktywują różne funkcje biologiczne¹. Te zdarzenia sygnalizacyjne Ca^{2 +} są wyzwalane zewnątrzkomórkowo przez różne bodźce i kontrolowane wewnątrzkomórkowo przez główne organelle magazynujące Ca^{2 +} oraz przez liczne pompy Ca^{2 +}, kanały i białka wiążące Ca^{2 +}. Stan nieustalony Ca²⁺ może ulec znacznej zmianie w wyniku defektów modulacji sygnału, co prowadzi do różnych chorób². Ze względu na szybkość i złożoność systemu sygnalizacyjnego Ca^{2 +}, z retikulum endo- (ER) i retikulum sarkoplazmatycznym (SR) w centrum, genetycznie kodowane sondy Ca^{2 +}, które zostały zoptymalizowane pod kątem ekspresji ssaków z szybką kinetyką, są potrzebne do obserwacji globalnych i lokalnych zmian Ca^{2 +} w różnych komórkach³.

ER i SR, jego odpowiednik w komórkach mięśniowych, są głównymi wewnątrzkomórkowymi organellami magazynującymi Ca²⁺ i działają jak pochłaniacze Ca²⁺, które pomagają wzmocnić sygnał Ca²⁺⁴. ER/SR jest integralną częścią sygnalizacji Ca²⁺ z podwójną rolą jako nadajnik i odbiorca sygnałów⁵. Receptor ryanodynowy (RyR) i receptor 1,4,5-trifosforanu inozytolu (IP₃R) są receptorami uwalniania Ca^{2 +} zlokalizowanymi na błonach ER / SR, które są regulowane przez Ca^{2+ 6}. Inne czynniki bezpośrednio lub pośrednio stymulują funkcję tych receptorów. 4-chloro-m-krezol (4-cmc) jest silnym agonistą RyR, mającym 10-krotnie wyższą czułość niż kofeina na indukowanie uwalniania SR Ca²⁺, gdzie oba są regularnie stosowane do badania uwalniania Ca²⁺ za pośrednictwem RyR w zdrowych i chorych komórkach⁷. ATP zwiększa uwalnianie Ca²⁺ za pośrednictwem IP₃ za pośrednictwem IP₃R⁸. ATP wiąże się z receptorem purynergicznym P2YR, receptorem sprzężonym z białkiem G (GPCR), wyzwalając produkcję IP₃, który wiąże się z IP₃R, aby uwolnić Ca²⁺ z klasy ER^9,10. Pompa ATPazy wapniowej retikulum sarko-endoplazmatycznego (SERCA) jest pompą ATPazy typu P, również umieszczoną na błonie ER/SR, która redukuje cytozolowy Ca²⁺ i uzupełnia ER / SR poprzez aktywne pompowanie jonu do klasy ER / SR lumen¹¹. Specyficznymi inhibitorami pompy SERCA są thapsigargina z Thapsia garganica i kwas cyklopiazonowy (CPA) z Aspergillus i Penicillium. CPA ma niskie powinowactwo do pompy i odwracalnie blokuje punkt dostępowy Ca²⁺¹². Z drugiej strony Thapsigargin nieodwracalnie wiąże się z pompą wolną od Ca²⁺ w reszcie F256 w helisie M3 z powinowactwem nanomolowym¹¹. Analiza i ilościowe określenie zmian związanych ze zdarzeniami stymulowanymi przez Ca²⁺ było i pozostaje wyzwaniem. Ponieważ ER / SR jest głównym subkomórkowym przedziałem zawierającym Ca^{2 +} z centralną funkcją w propagacji sygnału Ca^{2 +}, wiele pracy skoncentrowano na zrozumieniu sygnalizacji ER / SR Ca^{2 +} < klasa sup = "xref">5.

Stworzenie syntetycznych barwników Ca²⁺ przyczyniło się do rozwoju dziedziny i praktyki obrazowania Ca²⁺. Chociaż barwniki, takie jak Mag-Fura-2, są szeroko stosowane do pomiaru Ca²⁺ w różnych komórkach,^13,14,15 mają ograniczenia, takie jak nierównomierne ładowanie barwnika, fotowybielanie i niemożność ukierunkowania na określone organelle. Odkrycie białka zielonej fluorescencji (GFP) i postęp w dziedzinie sond Ca²⁺ opartych na białku fluorescencyjnym pchnął naprzód dziedzinę obrazowania Ca²⁺¹⁶. Niektóre z istniejących GECI to pary transferu energii rezonansu Förstera (FRET) obejmujące żółte białko fluorescencyjne (YFP), cyjanowe białko fluorescencyjne (CFP), kalmodulinę i peptyd wiążący M13^17,18. GECI na bazie troponiny C są również dostępne jako pary FRET CFP i cytrynu oraz jako pojedyncze sondy fluoroforowe^19,20,21. Inne, takie jak GCaMP2 i R-GECO, to pojedyncze czujniki fluoroforowe zawierające kalmodulinę^22,23. Aby przezwyciężyć ograniczenia wąskiego dostrajania K_d i kooperatywnego wiązania związanego z wieloma miejscami wiązania Ca²⁺ znajdującymi się w ich domenach wiązania Ca²⁺²⁴, stworzono nową klasę czujników wapnia poprzez zaprojektowanie miejsca wiązania Ca²⁺ na powierzchni beczki beta w wrażliwym na chromofor miejscu wzmocnionego białka zielonej fluorescencji (EGFP)^{25, 26}. Ten bardzo reklamowany czujnik, zwany Catcher, ma K_d ~ 0,18 mM, k_w pobliżu granicy dyfuzji i k_off 700 ^s-1. CatchER został wykorzystany do monitorowania uwalniania wapnia ER/SR za pośrednictwem receptora w różnych liniach komórkowych ssaków, takich jak HeLa, HEK293 i C2C12²⁵. Ze względu na jego szybką kinetykę, CatchER zastosowano we włóknach mięśniowych zginacza palca brevis (FDB) młodych i starych myszy Friend Virus B NIH Jackson (FVB), aby ujawnić, że więcej Ca^{2 +} pozostaje w SR po 2 s depolaryzacji we włóknach FDB starych myszy w porównaniu do młodych myszy ²⁷. Aby przezwyciężyć jego niską fluorescencję w temperaturze 37 °C, co utrudnia jego zastosowanie w obrazowaniu komórek ssaków wapniem, opracowaliśmy ulepszoną wersję CatchER o nazwie CatchER⁺. CatchER⁺ wykazuje zwiększoną fluorescencję w temperaturze 37 °C, co zapewnia lepsze zastosowanie w komórkach ssaków. Dodatkowe mutacje zostały włączone do CatchER w celu poprawy termostabilności i fluorescencji w temperaturze 37 °C^28,29, aby stworzyć CatchER⁺. CatchER⁺ wykazuje sześciokrotny wzrost stosunku sygnału do szumu (SNR) w porównaniu z CatchER³⁰.

Tutaj przedstawione są protokoły hodowli i transfekcji komórek HEK293 i C2C12 za pomocą CatchER⁺ oraz jego zastosowanie do monitorowania stanów przejściowych wapnia za pośrednictwem receptora ER/SR. Reprezentatywne wyniki przedstawiono dla CatchER⁺ ulegającego ekspresji w komórkach HEK293 poddanych działaniu 4-cmc, CPA i ATP. Udostępniamy również protokół do oznaczania in situ K_d CatchER⁺ w komórkach mioblastów C2C12 i oznaczania ilościowego podstawowego [Ca²⁺].

Protokół

1. Przygotowanie slajdów

1. Umieść szkiełka mikroskopowe o wymiarach 22 mm x 40 mm w 6-centymetrowych naczyniach do hodowli komórkowych, po 1 szkiełku na naczynie.
2. Wystaw każdą stronę każdego szkiełka, a także 6-centymetrową naczynie na działanie światła ultrafioletowego (UV) przez 15-20 minut, aby wysterylizować w sterylnym kapturze.
3. Przykryj naczynia ze szkiełkami w środku folią parafilmową i przechowuj w temperaturze 4 °C do momentu użycia.

2. Przygotowanie pożywki,, roztworów i odczynników

1. Przygotuj 1 l zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS) w wodzie dejonizowanej i dodaj 10 mM HEPES, 5 mM NaHCO₃ i 1 mM EGTA. Dostosuj do pH 7,2-7,3 za pomocą NaOH. Filtruj bufor z filtrem 0,22 μm do autoklawowanej butelki.
2. Przygotuj 900 ml wysokoglukozowego Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) h w wodzie dejonizowanej. Dodać 44 mM NaHCO₃ i dostosować pH do 7,2-7,3 za pomocą HCl. Media filtracyjne z filtrem 0,22 μm umieścić w autoklalawowanej butelce. Dodaj 100 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS) do pożywki, aby stężenie FBS wynosiło 10%. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
3. Przygotuj 1 l buforu wewnątrzkomórkowego (125 mM KCl, 25 mM NaCl, 10 mM HEPES, 0,2 mM CaCl₂, 0,5 mM EGTA, 0,2 mM MgCl₂) w wodzie dejonizowanej i dostosuj pH do 7,25. Końcowe [Ca²⁺] będzie wynosiło ~100 nM. Przed użyciem dodaj 0,5 mM ATP. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
4. Przygotować 1 l buforu Ringera (121 mM NaCl, 2,4 mM K₂HPO₄, 0,4 mM KH₂PO₄, 10 mM HEPES i 1,2 mM MgCl₂) w wodzie dejonizowanej i dostosować pH do 7,2. Przechowywać w temperaturze pokojowej. Aby użyć, podajcie porcję 50 ml do probówki o pojemności 50 ml i dodajcie 1,8 mM Ca²⁺ i 10 mM glukozy.
5. Przygotuj 1 l roztworu do płukania KCl (125 mM KCl, 25 mM NaCl, 10 mM HEPES, 0,2 mM MgCl₂) w wodzie dejonizowanej i dostosuj pH do 7,25.
6. Rozpuścić 5 mg jonomycyny w 1 ml dimetylosulfotlenku (DMSO). Podwielokrotność 30 μl rozlać do mikroprobówek i przechowywać w temperaturze -20 °C.
7. Przygotować zapas kwasu cyklopiazonowego (CPA), rozpuszczając CPA w DMSO. Upewnij się, że końcowy procent DMSO wynosi ≤ 1% dla CPA dodanego do komórek, aby zapobiec apoptozie. Przygotować 20 mM 4-chloro-m-krezolu (4 cmc), rozpuszczając go w przefiltrowanym_H2Oi pozostawiając do rozpuszczenia przez noc przez wstrząsanie w temperaturze 37 °C. Przygotować wywar ATP, rozpuszczając go w przefiltrowanym_H2Odo 100 mM.
8. Aby oznaczyć K_d in situ, przygotuj po 15 ml 1 mM EGTA, 0,2 mM, 0,6 mM, 2 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM, 50 mM i 100 mM Ca²⁺ w buforze KCl, używając 100 mM EGTA i 1 M CaCl₂ rozpuszczonych w wodzie dejonizowanej.

3. Hodowla komórkowa

1. Hodowla komórek mioblastów C2C12 i HEK293 zgodnie z protokołami ATCC dla każdej z nich przy użyciu 10 cm naczyń do hodowli komórkowych w sterylnym kapturze UV.
   UWAGA: Komórki C2C12 nie powinny rosnąć szybciej niż ~70% konfluencji, ponieważ mioblasty zaczną różnicować się w miotuby. Zarówno komórki HEK293, jak i C2C12 rosną łatwo i nie należy dopuścić do wzrostu powyżej 100% zbiegu w celu utrzymania integralności komórek. Ponadto komórki nie powinny być pasażowane więcej niż 10 razy przed użyciem ich do eksperymentu w celu zachowania zdrowia komórek.

4. Transfekcja komórek HEK293

1. Wysiewaj komórki HEK293 na wysterylizowane szklane szkiełka mikroskopowe o wymiarach 22 mm x 40 mm w 6 cm naczyniach, dzięki czemu są one ~ 70% zlewające się w dniu transfekcji.
2. Następnego dnia postępuj zgodnie z protokołem producenta odczynnika do transfekcji, aby transfekować komórki przy użyciu 2 μg cDNA Catcher⁺ i stosunku odczynnika DNA:transfekcja 1:3 (waga/objętość) w zredukowanej pożywce surowicy (np. Opti-MEM).
3. Opróżnij pożywkę DMEM z naczynia i dodaj 3 ml zredukowanej pożywki surowicy. Dodać mieszaninę odczynników do transfekcji DNA do naczynia i inkubować przez 4-6 godzin w temperaturze 37 °C.
4. Po inkubacji przemyj komórki 5-6 ml HBSS. Wyrzucić HBSS z naczynia i zastąpić je 3 ml świeżego DMEM i inkubować w temperaturze 37 °C przez 48 godzin, aby umożliwić ekspresję GECI.
5. Transfekcja komórek mioblastów C2C12
   1. W przypadku komórek mioblastów C2C12 trypsynizuj komórki, dodając tyle trypsyny, aby pokryć dno naczynia (1-2 ml). Umieść naczynie w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 2-6 minut, aby trypsyna mogła rozluźnić komórki z dna naczynia.
   2. Po zakończeniu inkubacji usuń trypsynę i odessaj komórki w 8 ml DMEM. Dokładnie odpipetuj komórki za pomocą DMEM, aby równomiernie rozproszyć i ponownie zawiesić te komórki, a następnie wysiewaj je na sterylnych szkiełkach nakrywkowych w 6-centymetrowych szalkach do hodowli komórkowych zawierających 3 ml DMEM, tak aby końcowe złożenie wynosiło 60%.
   3. Przetransfekuj komórki tego samego dnia, jak opisano w kroku 4.2-4.3. Inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C.
   4. Powtórz krok 4.4.

5. Przygotowanie preparatu do mikroskopu fluorescencyjnego i szkiełek podstawowych

1. Włącz mikroskop i źródło światła, a następnie otwórz prosty program PCI. Pozwól mikroskopowi rozgrzać się przez 15-20 minut lub do momentu, gdy kamera z urządzeniem sprzężonym z ładunkiem (CCD) ostygnie do -65 °C. Przygotuj komorę i szkiełko z komórkami w oczekiwaniu.
2. Przykryj dno niskoprofilowej otwartej komory obrazowania w kąpieli diamentowej cienką warstwą szczeliwa za pomocą bawełnianego wacika.
3. Wyjąć szkiełko z transfekowanymi komórkami z inkubatora i delikatnie przepłukać trzykrotnie 1 ml buforu Ringera z 10 mM glukozy i 1,8 mM Ca²⁺ podgrzanym do temperatury 37 °C.
4. Pozostaw 1 ml buforu Ringera w naczyniu, aby zapobiec wysychaniu komórek, i użyj kleszczyków, aby wyjąć szkiełko z naczynia. Pozwolić, aby nadmiar roztworu wchłonął się na tkankę laboratoryjną, dotykając krawędzią szkiełka tkanki laboratoryjnej. Następnie umieść komorę z boku zawierającej smar z komórkami skierowanymi do góry w kierunku smaru i przymocuj komorę do mocowania stage za pomocą śrubokręta.
5. Dodaj 1 ml buforu Ringera do komory, aby zapobiec wysychaniu komórek podczas montażu komory na stoliku i zakończenia reszty konfiguracji mikroskopu. Po podłączeniu węża ssącego do komory, końcowa objętość, jaką mieści komora, wynosi ~450 μL.
6. Przełącz obiektyw mikroskopu na obiektyw zanurzeniowy z olejkiem 40X.
7. Użyj papieru do soczewek i roztworu do czyszczenia soczewek, aby wyczyścić i wysuszyć obiektyw. Nie pocieraj obiektywu. Delikatnie wklep, aż powierzchnia będzie czysta.
8. Dodaj jedną kroplę olejku immersyjnego do obiektywu.
9. Umieść uchwyt na stoliku mikroskopu i dodaj końcówkę próżniową do komory. Po podłączeniu węża ssącego podciśnienia do komory i włączeniu, końcowa objętość, jaką mieści się w koorze, wynosi ~450 μL. Ta końcowa objętość znajduje się na poziomie boków komory. Konieczne jest, aby roztwór w komorze był wypoziomowany podczas eksperymentu, aby zapobiec rozlaniu się roztworu na obiektyw z powodu przepełnienia.
10. Podnieś obiektyw i użyj zgrubnej regulacji, aż olej na obiektywie dotknie dolnej części zamka.
11. Korzystając z trybu jasnego pola, ustaw wzmocnienie na 175, a czas ekspozycji na 0.03 s, aby ustawić ostrość komórek.
12. Po skupieniu komórek przełącz się w tryb fluorescencji przy użyciu wzbudzenia 488 nm. Zmień czas ekspozycji na 0,07 s. Zlokalizuj pole widzenia, w którym znajduje się wystarczająca liczba zdrowych komórek o odpowiedniej fluorescencji do obrazowania.
13. Po wybraniu pola widzenia rób zdjęcia w trybie fluorescencji i jasnego pola.
14. Zakreśl obszar zainteresowania (ROI) w komórkach lub zakreśl całą komórkę, aby zarejestrować intensywność z wybranego obszaru.

6. Obrazowanie stanów przejściowych Ca²⁺ wywołanych lekami i kalibracja in situ _{k d}

1. Rozpocznij pomiar intensywności z liczbą klatek na sekundę ustawioną na jeden co 5 s.
2. Poczekaj, aż intensywność linii bazowej ustabilizuje się przez 20-30 klatek (100-150 s). W razie potrzeby zmniejsz liczbę klatek na sekundę na tym etapie, aby zapobiec fotowybielaniu.
3. Obliczyć potrzebną ilość 4 cmc z 20 mM materiału wyjściowego na podstawie końcowej objętości komory ~ 450 μL, aby uzyskać końcowe stężenie 200 μM. W razie potrzeby rozcieńczyć podstawę.
4. Ostrożnie pobrać 60 μl buforu Ringera z komory i umieścić w probówce do mikrowirówki. Rozcieńczyć obliczoną ilość 4-cmc tym roztworem i dodać z powrotem do komory, aby wywołać zamierzoną odpowiedź obrazowanych komórek.
5. Dodać obliczoną ilość 4 cmc do probówki mikrowirówki i wymieszać przez pipetowanie.
6. Delikatnie dodaj roztwór nad polem widzenia, jednocześnie dodając znacznik zdarzenia w pomiarze intensywności.
7. Poczekaj, aż lek zwiąże się z receptorem, a następnie zmniejszy się sygnał, a następnie przemyj 3-6 ml buforu Ringera z 1,8 mM Ca²⁺ i 10 mM glukozy, jednocześnie dodając marker zdarzenia. Ponieważ objętość komory wynosi 450 μl i jest podłączona do próżni, dodanie 3-6 ml buforu zapewnia, że poprzedni roztwór zawierający lek został wypłukany i zastąpiony nowo dodanym roztworem.
8. Powtórzyć 6,1-6,7 dla 100 μM ATP i 15 μM CPA, używając nowego szkiełka transfekowanych komórek dla każdego testu.
9. Po zakończeniu pomiaru zakończ zbieranie danych w oknie pomiaru intensywności w programie Simple PCI.
10. Wykonaj zdjęcia fluorescencyjne i w jasnym polu komórek.
11. Otwórz plik danych eksperymentu. W tym miejscu ponownie zakreśl komórki lub obszary zainteresowania, aby w razie potrzeby ponownie obliczyć wartości intensywności.
12. Aby oznaczyć in situ K_d w komórkach mioblastów C2C12, postępuj zgodnie z protokołem opisanym w sekcji 4.2 i sekcji 5 i umieść 1 ml 0 mM Ca²+ buforu Ringera w komorze.
    1. Przepuszczalność komórek za pomocą 0,002-0,005% saponiny w buforze wewnątrzkomórkowym przez 15-30 s, aby opróżnić komórki z dowolnego Catcher ⁺, który może znajdować się w cytozolu. Przemyć komórki 3-6 ml 1 ml EGTA w buforze KCl z 10 μM jonomycyną. Pozwól, aby intensywność zmniejszyła się, aż do osiągnięcia plateau.
    2. Przepłukać 3-6 ml buforu KCl z jonomycyną 10 μM i pozwolić intensywności się ustabilizować, a następnie dodać każdy roztwór Ca²⁺ opisany w kroku 2.7. Pozwól, aby intensywność osiągnęła plateau między każdym dodatkiem.
13. Aby skalibrować elektrodę pod kątem podstawowej kwantyfikacji [Ca²⁺], wykonaj krok 6.12. Użyj EGTA i bufora 100 mM Ca²⁺ z kroku 2.7, aby uzyskać minimalną i maksymalną intensywność fluorescencji.

7. Przetwarzanie danych

1. Pobierz plik arkusza kalkulacyjnego z danymi pomiaru intensywności.
2. Znormalizuj dane dla każdej komórki do intensywności linii bazowej (F/F₀). Wykreśl znormalizowane dane w funkcji czasu w dowolnym programie do tworzenia wykresów.
3. Aby obliczyć zmianę procentową, odejmij znormalizowaną wartość szczytową od 1 i pomnóż przez 100. Obliczanie średniej i odchylenia standardowego w przypadku obrazowania wielu komórek.
4. Aby obliczyć stosunek sygnału do szumu, SNR, otwórz plik obrazu zapisany w eksperymencie w oprogramowaniu do przetwarzania obrazu, takim jak ImageJ, a następnie zmierz sygnał, transfekowane komórki i szum, tło. Oblicz SNR za pomocą równania SNR = sygnał/szum.
5. Aby obliczyć K_d in situ na podstawie zebranych danych obrazowania fluorescencyjnego, należy uśrednić dane dotyczące intensywności, obejmujące płaskowyże, po dodaniu każdego stężenia Ca²⁺ i EGTA (0 mM Ca²⁺). Oblicz ułamkowe nasycenie (intensywność względna) za pomocą θ = (F – F_min)/(F_max- F_min), gdzie θ to intensywność względna, F to fluorescencja w dowolnym punkcie, F_min to minimalna intensywność fluorescencji, a F_max to maksymalna intensywność fluorescencji, aby zobaczyć zmianę intensywności sondy z dodatkiem Ca²⁺ w porównaniu z minimalną intensywnością. Wykreśl dane dotyczące intensywności względnej w stosunku do [Ca²⁺] w dowolnym programie do tworzenia wykresów i dopasowywania krzywych. Użyj równania wiązania 1:1 θ = [M_T]/(K_d + [M_T]) przetłumaczonego dla dowolnego programu do tworzenia wykresów i dopasowywania krzywych, aby obliczyć K_d. MT oznacza całkowite stężenie metalu.
6. Aby określić ilościowo podstawowy wapń na podstawie kalibracji opisanej w ppkt 6.13, należy uśrednić dane dotyczące intensywności, obejmujące płaskowyże, po dodaniu 1 mM EGTA (F_min) i 100 mM Ca²⁺ (F_max). Użyj równania kalibracyjnego [Ca²⁺] = K_d([F – F_min)/(F_max – F)], aby obliczyć podstawowy wapń.

Wyniki

Ta sekcja ilustruje wyniki, które zostały osiągnięte przy użyciu wcześniej opisanych metod przy użyciu zoptymalizowanego GECI CatchER⁺ ukierunkowanego na ER/SR do monitorowania zmian w ER/SR Ca²⁺ poprzez różne szlaki za pośrednictwem receptorów.

Rysunek 1 ilustruje opróżnianie ER przez RyR stymulowany 200 μM 4-cmc. 4-cmc jest agonistą RyR. Dodanie leku powoduje zmniejszenie stę...

Dyskusja

Obrazowanie na żywo pojedynczych komórek za pomocą sond fluorescencyjnych, takich jak CatchER⁺, jest skuteczną techniką analizy skomplikowanych procesów sygnalizacyjnych Ca²⁺ ER/SR w każdej komórce w odpowiedzi na agonistów receptorów lub antagonistów. Technika ta jest również przydatna do obrazowania przy użyciu wielu długości fal jednocześnie, takich jak w przypadku Fura-2 lub do obrazowania CatchER⁺ i Rhod-2 razem w celu monitorowania odpowiednio zmian wapnia ER i cytozolowego. W tym p...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
4-Chloro-3-metylofenol (4-CmC)	Sigma-Aldrich	C55402
515DCXR lustro dichroiczne	Chroma Technology Corp.
Hydrat soli disodowej 5&trifosforanu adenozyny	Sigma-Aldrich	A26209
Dwuwodny chlorek wapnia	EMD Millipore	102382
Naczynia hodowlane Corning (100 mm)		Sigma-Aldrich
Corning (60 mm)	Sigma-Aldrich	CLS430166
Kwas cyklopiazonowy (CPA)	EMD Milipor	239805
D(+)-glukoza	ACROS Organics	41095-0010
Dow Corning 111 Smar do zaworów i Uszczelniacz	Warner Instruments	64-0275
Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D7777
Etylenobis(oksyetylenenitrylo) Kwas tetraoctowy (EGTA)	ACROS Organics	409911000
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	ThermoFisher	26140087
Okulary nakrywkowe Fisherbrand 22x40 mm	Fisher Scientific	12-544B
Hanksa' Sole zrównoważone (HBSS)	Sigma-Aldrich	H4891
- HEPS - Wolny kwas, Biologia molekularna	EMD Millipore	391340
Olejek immersyjny bez autofluorescencji	Leica	11513859
jonomycyna, wolny kwas	Fisher Scientific	50-230-5804
Mikroskop odwrócony Leica DM6100B z chłodzoną kamerą EM-CCD	Hamamatsu	C9100-13
Odczynnik do transfekcji Lipofectamine 2000	Odczynnik	11668019
Lipofectamine 3000		ThermoFisher
Niskoprofilowa otwarta komora obrazowania w kąpieli diamentowej	Warner Instruments	RC-26GLP
Sześciowodny chlorek magnezu	Fisher Scientific	M33-500
Opti-MEM	ThermoFisher	51985034
Chlorek potasu	EMD Milipore	PX1405
Fosforan potasu, Dwuzasadowy	EMD Milipor	PX1570
Fosforan potasu, Monozasadowy	EMD Milipora	PX1565
Saponina	Sigma-Aldrich	47036
SimpleOprogramowanie do analizy obrazu PCI	Hamamatsu	N/A
Wodorowęglan sodu	Fisher Scientific	S233-3
Chlorek sodu	Fisher Scientific	S271-500
Sterivex-GV 0,22 µ m filtr	EMD Millipore	SVGVB1010
Till Polychrome V Lampa ksenonowa	Till Photonics	N/A
Trypsyna (2,5%), bez czerwieni fenolowej (10x)	ThermoFisher	15090046