Testy przesiewowe w celu scharakteryzowania nowych regulatorów śródbłonka zaangażowanych w odpowiedź zapalną

Stan zapalny jest korzystną biologiczną odpowiedzią na czynniki zakaźne, której głównym celem jest eliminacja patogenu i naprawa uszkodzonej tkanki. W pewnych warunkach, takich jak przewlekłe infekcje lub choroby autoimmunologiczne, stan zapalny nie ustępuje. Zamiast tego występuje nieprawidłowa reakcja z ciągłym naciekaniem leukocytów, co skutkuje przedłużoną odpowiedzią immunologiczną, która prowadzi do uszkodzenia tkanek, zwłóknienia, utraty funkcji i ogólnie niepełnosprawności, a w niektórych przypadkach śmierci pacjenta. Wszystkie te ludzkie zaburzenia, skatalogowane jako choroby zapalne, obejmują naczynia krwionośne w celu kontroli wynaczynienia leukocytów^1,2.

Komórki śródbłonka odgrywają fundamentalną rolę w regulacji odpowiedzi zapalnej poprzez kontrolowanie transportu leukocytów. Kiedy warstwa śródbłonka jest wystawiona na działanie mediatorów stanu zapalnego, takich jak LPS, spoczynkowy śródbłonek aktywuje i wyraża cytokiny prozapalne (Cxcl10, Cxcl5, Cxcl1 itp.) oraz cząsteczki adhezyjne (E-selektyna, VCAM-1 i ICAM-1), które sprzyjają rekrutacji krążących leukocytów do miejsca infekcji. Leukocyty zapoczątkowane przez uwolnione cytokiny pośredniczą następnie w toczeniu i interakcji z warstwą śródbłonka poprzez odpowiednie adhezyjne odpowiedniki: PSGL-1 do selektoryny, integrynę α4β1 do VCAM-1 i integrynę αLβ2 do ICAM-1. Na koniec leukocyty migrują przez naczynia krwionośne w kierunku ogniska zapalenia³.

Zasadnicza rola śródbłonka w regulacji odpowiedzi zapalnej została zademonstrowana na myszach, które zostały genetycznie zmodyfikowane w celu ekspresji receptora LPS, receptora toll-podobnego 4 (TLR4), tylko na komórkach śródbłonka. Te śródbłonkowe zwierzęta TLR4 były w stanie zareagować na stan zapalny za pośrednictwem LPS i wykryć infekcję powstałą po zaszczepieniu bakterii, a w konsekwencji osiągnąć rozwiązanie infekcji i przeżycie na podobnym poziomie jak myszy typu dzikiego^4,5.

Dla regulowanego śródbłonkiem szlaku odpowiedzi zapalnej, postulowano, że zahamowanie na niektórych etapach interakcji leukocyt-śródbłonek spowoduje zmniejszenie migracji przezśródbłonkowej i lepsze rokowanie w chorobach związanych z zapaleniem. W rzeczywistości zaprojektowano kilka strategii ukierunkowanych na aktywację śródbłonka i interakcję leukocytów-śródbłonka, aby utrudnić wynaczynienie komórek odpornościowych w leczeniu zaburzeń zapalnych^6,7.

W tym raporcie opisujemy szczegółową grupę technik in vitro, aby w pełni scharakteryzować aktywność śródbłonka w odpowiedzi na bodziec zapalny LPS i jego rolę w aktywacji i adhezji leukocytów do warstwy naczyniowej. Model komórek śródbłonka użyty w tym manuskrypcie to linia komórek śródbłonka płuc myszy (MLEC-04), opisana przez Hortelano i wsp.⁸. Linia komórkowa MLEC-04 została potwierdzona w literaturze jako odpowiedni system do badania aktywacji śródbłonka9^,10. Opierając się na zainteresowaniach badawczych, podejścia te można łatwo ekstrapolować na dowolne systemy śródbłonka lub leukocytów oraz profil zapalny. Po zdefiniowaniu parametrów śródbłonka w wybranych warunkach, system może testować nowe leki na proponowanym eksperymentie w celu oceny aktywacji naczyń krwionośnych. W tym kontekście zapalnym komórki śródbłonka testowane z badanym związkiem mogą być porównane z warunkami kontrolnymi komórek, a wszelkie wynikające z tego różnice mogą informować o wyniku prognostycznym leku w zakresie rozwoju i progresji stanu zapalnego. Podsumowując, proponujemy odpowiedni system do charakteryzowania nowych celów leków dla komórek śródbłonka, co może wpłynąć na projektowanie nowych terapii specyficznych dla naczyń krwionośnych przeciwko chorobom związanym z zapaleniem.

1. Hodowla komórek śródbłonka

1. Płytki poddane działaniu kultur tkankowych
   1. Pokryć 100 mm płytki do hodowli tkankowej 2,5 ml roztworu żelatyny (autoklawizowany, 0,1% żelatyny w wodzie destylowanej) przez 30 minut w temperaturze 37 °C; można to ekstrapolować do wymaganego formatu studzienki. Odessać roztwór żelatyny i pozostawić płytki do wyschnięcia na powietrzu w kapturze do hodowli tkankowych.
2. Warunki hodowli tkankowej
   1. Hoduj komórki MLEC-04 w inkubatorze biologicznym (37 °C, 95% wilgotności, 5% CO_{2 ).} Hoduj komórki w kompletnym pożywce Zmodyfikowanego Eagle Medium firmy Dulbecco: Mieszanka składników odżywczych F-12 (DMEM/F-12) uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 100 jednostkami/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny (P/S).
   2. Policz komórki standardową metodą komory Neubauera i dodaj komórki MLEC-04 do płytek o średnicy 100 mm poddanych działaniu żelatyny w 10 ml kompletnych pożywkach, przy niskiej gęstości 2 - 11 x 10⁴ komórek/cm². Podziel komórki 1:3, gdy dotrą do konfluencji.
      UWAGA: Zwykle dzieje się to po dwóch do trzech dniach w hodowli.
   3. Hodowlę komórek należy przeprowadzić poprzez przemycie płytek 10 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), a następnie dodanie 2 ml roztworu trypsyny-EDTA (0,25% trypsyny, 5 mM EDTA) i inkubować przez 3 minuty w temperaturze 37 °C.
   4. Zatrzymaj reakcję trypsyna-EDTA i odzyskaj zawieszone komórki, dodając 10 ml kompletnej pożywki. Odwirować komórki (300 x g, 5 min), odrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad komórkowy w kompletnej pożywce i odpowiednio subkulturze.

2. Leczenie LPS i mediatory

1. Umieść komórki MLEC-04 w kompletnym pożywce przy konfluencji poniżej do następującego formatu studzienki: 7 x 10⁵ komórek/dołek na płytkach 6-dołkowych i 2,5 x 10⁵ komórek/basenik na płytkach 96-dołkowych.
2. Inkubować kulturę przez 6 godzin w inkubatorze komórkowym (37 °C, 95% wilgotności, 5% CO₂ ). Zamień ogniwa na niekompletne podłoża (DMEM-F12, P/S) i pozostaw na noc (ON) w celu synchronizacji i zmniejszenia aktywności komórek.
3. Usunąć pożywkę i przetestować nowe związki farmakologiczne poprzez inkubację komórek śródbłonka z (lub bez) danego leku (np. DT¹⁰) rozcieńczonego w niekompletnej pożywce (30 min, 37 °C); dodać 1,4 ml/dołek dla płytki 6-dołkowej lub 0,14 ml/dołek dla płytki 96-dołkowej).
4. Zbadaj komórki, dodając LPS do pożywki inkubacyjnej (100 ng/ml, stężenie końcowe) przez okres określony w każdym teście. Użyj PBS jako formantu.

3. Ocena profilu transkrypcyjnego na aktywowanym śródbłonku za pomocą RT-qPCR

1. Wysiewaj komórki MLEC-04 w momencie subkonfluencji na 6-dołkowych płytkach hodowlanych (7 x 10,⁵ komórek/dołek). Inkubować przez 6 godzin (37 °C, 95% wilgotności, 5% CO₂ ), a następnie przejść do głodzenia surowicy (inkubacja ON).
2. Usunąć pożywkę i poddać (lub nie leczyć) hodowle komórek śródbłonka badanym lekiem rozcieńczonym w niekompletnej pożywce (inkubować 30 minut, 37 °C); dodać 1,4 ml/basenik na płytkę 6-dołkową (30 min, 37 °C).
3. Zbadać komórki, dodając 100 ng/ml LPS do inkubowanej pożywki (jak opisano w kroku 2.3) i inkubować przez 6 godzin. Zatrzymać reakcję przez dwukrotne przemycie zimnym PBS i utrzymać płytki w temperaturze -80 °C do czasu przetworzenia próbki.
4. Ekstrakcja RNA
   1. Rozmrozić płytki i dodać 1 ml/basenik buforu do ekstrakcji RNA (38% fenolu i 0,8 M izotiocyjanianu guanidyny; patrz tabela materiałów). Pozostawić na 30 minut w temperaturze pokojowej (RT) pod mieszaniem i zebrać homogenat w probówkach o pojemności 1,5 ml.
   2. Dodać 200 μl chloroformu i delikatnie mieszać przez 15 s. Inkubować przez 3 minuty w temperaturze pokojowej i odwirować (11 600 x g, 15 min, 4 °C).
   3. Przenieść fazę wodną do innej probówki o pojemności 1,5 ml. Wytrącić RNA przez dodanie 500 μl izopropanolu, a następnie 10-minutową inkubację w temperaturze pokojowej, a następnie odwirować (11 600 x g, 4 °C).
   4. Odrzucić supernatant i przemyć osad 75% etanolem przez mieszanie wirowe, a następnie odwirowanie (7 500 x g, 4 °C).
   5. Wysuszyć osad na powietrzu i rozpuścić RNA w 25 μl czystego_H2O, inkubując przez 10 minut w temperaturze 55 °C. Utrzymać RNA w temperaturze -80 °C do czasu przetworzenia próbki.
5. Ilość i czystość RNA
   1. Określić ilościowo stężenie RNA, mierząc absorbancję próbki przy długości fali 260 nm w spektrofotometrze (zob. tabela materiałów).
   2. Mierzyć przy 230 nm i 280 nm, aby określić czystość RNA.
      UWAGA: Stosunek 260/280 wskazuje na zanieczyszczenie białkiem lub fenolem. Dopuszczalny jest stosunek bliski 2. Stosunek 260/230 wskazuje na zanieczyszczenia EDTA, węglowodanami lub fenolami. Dopuszczalne są wartości od 2,0 do 2,2.
6. Sprawdzanie integralności RNA
   1. Przeprowadzić 2 μg całkowitego RNA i drabinkę RNA na 1,5% denaturującym żelu agarozowym; wizualizować w systemie dokumentacji żelu (patrz Tabela Materiałów).
      UWAGA: Stosunek 2:1 wyraźnych i ostrych prążków rRNA 28S i 18S wskazuje na nienaruszone RNA. Częściowo zdegradowane RNA rozpada się jako rozmazany wygląd.
7. RT-qPCR (Protokół RT-qPCR)
   1. Zsyntetyzuj komplementarne DNA (cDNA) z jednoniciowego RNA zgodnie ze standardowym protokołem (patrz Tabela materiałów)¹¹.
8. Ocena ekspresji genów za pomocą RT-qPCR
   1. Przygotować mieszaninę reakcyjną dla każdej próbki: zmieszać 2 μl cDNA, 7 μl związku fluorescencyjnego, starter 300 nM do przodu i starter do tyłu 300 nM (tabela 1) w końcowej objętości 13 μl i dodać do 96-dołkowej płytki reakcyjnej (patrz tabela materiałów).
   2. Uszczelnić płytkę optyczną osłoną z kleju, odwirować (300 x g, 1 min) i uruchomić reakcję w systemie Real-Time PCR (gorący start 95 °C przez 20 s, a następnie 40 cykli: 95 °C przez 3 s i 60 °C przez 30 s) (patrz tabela materiałów).
   3. Przeanalizować wyniki przez względną ocenę ilościową przy użyciu metody porównawczej ^2-ΔΔCt z genami porządkowymi dehydrogenazy gliceraldehydo-3-fosforanowej (GAPDH) lub kwaśnej fosfoproteiny rybosomalnej P0 (36B4)¹².

4. Oceń aktywację śródbłonka za pomocą cytometrii przepływowej

1. Komórki MLEC-04 należy traktować zgodnie z warunkami opisanymi w punkcie 2 i ocenić zmiany w białkach powierzchniowych śródbłonka za pomocą cytometrii przepływowej.
2. Odłączyć komórki po 6 godzinach stymulacji LPS metodą trypsyny-EDTA opisaną w kroku 1.2.3 i przemyć niekompletną pożywką w temperaturze 4 °C.
3. Policz komórki metodą komory Neubauera i umieść 10 x 10⁴ komórki na 96-dołkowych płytkach z dnem w kształcie litery U. Odwirować (300 x g, 5 min) i wyrzucić supernatant poprzez zatrzask nadgarstka o 180° od góry do dołu i szybki powrót do pierwotnej pozycji.
4. Dodać 50 μl wybranego przeciwciała rozcieńczonego w pożywce niekompletnej (10 μg/ml, stężenie końcowe) do komórek i inkubować (30 min, 4 °C).
5. Przemyć komórki dwukrotnie niekompletną pożywką zgodnie z procedurą opisaną w kroku 4.3 i inkubować w 50 μl w stężeniu 10 μg/ml odpowiedniego przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z FITC lub podobnym koniugatem (30 min, 4 °C w ciemnym miejscu).
6. Umyj komórki raz niekompletną pożywką, a następnie przepłucz PBS. Odzyskaj komórki za pomocą 300 μl PBS za pomocą końcówek do pipet o pojemności 1 ml i umieść w probówkach cytometrycznych.
7. Ocenić próbki w systemie cytometrii przepływowej (patrz tabela materiałów). Dostosuj populację komórek według parametrów rozpraszania do przodu i bocznego. Bramka populacji będącej przedmiotem zainteresowania. Dostosuj bramki w oparciu o kontrolę ujemną z komórek inkubowanych z kontrolą izotypu. Przeanalizuj wyniki jako procent komórek dodatnich lub średnią intensywność fluorescencji⁸.

5. Oceń aktywację śródbłonka za pomocą Western Blot

1. Wysiewać śródbłonek w momencie konfluencji na 6-dołkowych płytkach hodowlanych (7 x 10⁵ komórek/dołek) i traktować LPS, jak opisano w sekcji 2. Przeanalizuj ekspresję białka zapalnego za pomocą następującego protokołu western blot.
2. Zatrzymaj stymulację LPS w różnych punktach czasowych, aby wyjaśnić różne aspekty odpowiedzi śródbłonka:
   1. Ustal profil białek zapalnych po 6 godzinach stymulacji LPS.
   2. Określ sygnalizację komórkową co 15 minut przez okres 60 minut.
3. W obu przypadkach należy przerwać reakcję poprzez dwukrotne przemycie zimnym PBS i przechowywać próbki w temperaturze -80 °C do czasu przetworzenia próbki.
4. Liza komórek i ekstrakcja białek
   1. Dodać 200 μl buforu do lizy do każdej studzienki (1% niejonowy środek powierzchniowo czynny, 10 mM Tris-HCl, 1mM EDTA, 150 mM chlorek sodu, 30 mM pirofosforan sodu, 50 mM fluorek sodu, 2,1 mM orthovanadan sodu o pH 7,6, uzupełniony koktajlem inhibitorów proteazy) (patrz tabela materiałów).
   2. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C pod wpływem mieszania, zeskrobać studzienki końcówką pipety i zebrać homogenat do probówek o pojemności 1,5 ml.
   3. Odwirować probówki o stężeniu 11 600 x g w temperaturze 4 °C.
   4. Przechowywać supernatant w czystych probówkach o pojemności 1,5 ml w temperaturze -80 °C do czasu przetworzenia.
5. Zmierzyć stężenie białka za pomocą testu kwasu bicinchoninowego zgodnie ze standardowym protokołem (patrz tabela materiałów)¹³.
6. Rozpuść 30 μg całkowitego lizatu białkowego dla każdej próbki za pomocą standardowej techniki elektroforezy 0,1% dodecylosiarczanu sodu, 10% żelu poliakryloamidowego (SDS-PAGE)¹⁴. Badaj próbki z 10 mM β-merkaptoetanolem (warunki redukujące) lub bez (warunki nieredukujące) w zależności od przeciwciała użytego do wykrycia białka będącego przedmiotem zainteresowania.
7. Przenieść oddzielone białka z żelu poliakryloamidowego do membrany transferowej z polifluorku winylidenu (PVDF) o wielkości porów 0,45 μm przy użyciu standardowej procedury.
8. Po przeniesieniu należy dwukrotnie przemyć membranę PBS, 0,1% polisorbatem-20 (PBS-T) i zablokować niespecyficzne miejsca wiązania, dodając 20 ml 2% BSA rozcieńczonego w PBS-T dla wykrytych fosfoprotein lub 5% beztłuszczowego mleka w proszku w PBS-T dla białek całkowitych, pod mieszaniem (90 min, RT).
9. Rozcieńczyć wybrane przeciwciało w 10 ml odpowiedniego buforu blokującego o zalecanym stężeniu i inkubować błonę w stanie mieszania (ON, 4 °C). Alternatywnie należy umieścić membranę w szczelnie zamkniętych plastikowych torebkach i użyć 5 ml rozcieńczonego przeciwciała.
10. Następnego dnia umyj membranę trzykrotnie (nadmiar PBS-T, 15 min, RT).
11. Inkubować błonę pod wpływem mieszania (30 min, RT) z 10 ml odpowiedniego przeciwciała drugorzędowego związanego z peroksydazą chrzanową (HRP) rozcieńczonego w stosunku 1:10 000 w odpowiednim buforze blokującym.
12. Umyć membranę trzykrotnie pod wpływem mieszania (nadmiar PBS-T, 15 min, RT).
13. Inkubować błonę przez 1 minutę z 0,1 ml/^cm2 substratu peroksydazy wzmocnionej chemiluminescencją (ECL). Umieść opróżnioną membranę między dwoma przezroczystymi arkuszami tworzywa sztucznego i włóż ją do systemu detekcji chemiluminescencji, który zawiera kamerę ze sprzężonym ładunkiem (CCD).
    1. Użyj kamery CCD do wykrycia sygnału i jej oprogramowania do nagrywania obrazów za pomocą programu akumulacyjnego (obrazy wyświetlają skumulowany sygnał co 30 s ekspozycji przez łącznie 15 minut).
14. Określ ilościowo intensywność pasma za pomocą densytometrii za pomocą oprogramowania ImageJ zgodnie z protokołem opisanym w podręczniku użytkownika¹⁵.
    1. Otwórz próbkę w oprogramowaniu ImageJ i wybierz interesujące Cię pasmo za pomocą narzędzia do zaznaczania prostokątnego.
    2. Wybierz jako pierwszy pas ruchu i naciśnij pasy działki, aby uzyskać działki profilu.
    3. Ogranicz obszar szczytów za pomocą zaznaczenia linii prostej.
    4. Zmierz rozmiar każdego pasma, klikając wnętrze każdego szczytu.
    5. Przedstawić wyniki w odniesieniu do kontroli białka obciążenia (β-aktyna, tubulina itp.).

6. Oceń czynnik śródbłonka uwolniony w wyniku aktywacji leukocytów za pomocą testów adhezyjnych

1. Uzyskać pożywki kondycjonowane śródbłonkiem.
   1. Poddać się działaniu komórek MLEC-04 zgodnie ze wskazaniami w sekcji 2 i zebrać supernatant hodowli po 24-godzinnej stymulacji LPS (100 ng / ml).
   2. Zebrać kondycjonowaną pożywkę z poddanych działaniu środka komórek MLEC-04 i odwirować (600 x g). Przechowywać supernatant w podwielokrotnościach o objętości 0,5 ml w temperaturze -80 °C aż do użycia.
2. Test adhezji leukocytów
   1. Pokryj 96-dołkowe płytki 50 μl/basenik wybranych białek macierzy zewnątrzkomórkowej rozcieńczonych w PBS (z wyjątkiem kolagenu, który rozcieńcza się w 0,1 M kwasie octowym): fibronektyna (1 - 10 μg / ml), laminina (1 - 10 μg / ml) i kolagen typu I (10 - 40 μg / ml). Pozostawić włączone w temperaturze 4 °C.
   2. Odrzucić powlekane podłoże i zablokować niespecyficzne miejsca wiązania w studzienkach za pomocą 150 μl PBS, 1 % BSA inaktywowanego termicznie (1 min, 100 °C) przez 90 minut w temperaturze pokojowej.
   3. Przemyć studzienki dwukrotnie PBS i dodać do studzie>
   4. Hodowla mysiej linii komórkowej monocytów-makrofagów J774 w inkubatorze biologicznym (37 °C, 95% wilgotności, 5% CO₂) z pożywką Roswell Park Memorial Institute (RPMI), 10% FBS, 1% P / S.
      UWAGA: Komórki J774 rosną w zawiesinie.
   5. Zebrać komórki J774 do probówki o pojemności 15 ml i odwirować (300 x g, 5 min). Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą 10 ml pożywki niezawierającej surowicy. Policz komórki w komorze Neubauera. Odwirować komórki (300 x g, 5 min), odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w pożywce bez surowicy w proporcji 15 x 10⁴ komórki J774 na 50 μl pożywki.
   6. Dodać 15 x 10⁴ komórek J774 do każdej studzienki w 50 μl pożywki bez surowicy i inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C, a następnie 1 godzinę w temperaturze 37 °C w inkubatorze komórek CO₂.
   7. Umyć studzienki dwukrotnie, delikatnie, dodając ciepły PBS; odwirować (300 x g, 5 min) i wyrzucić supernatant przez pstryknięcie nadgarstka o 180° od góry do dołu i szybko powrócić do pierwotnej pozycji. Utrwalić przyłączone komórki, dodając 100 μl/studzienkę 4% paraformaldehydu (PFA) do PBS i inkubować (10 min, RT).
   8. Delikatnie odrzuć pożywkę i przepuszczaj komórki 2% metanolem w PBS przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Delikatnie wyrzuć pożywkę i zabarwij komórki, dodając 50 μl / studzienkę 0,5% fioletu krystalicznego w 20% metanolu przez 90 s w temperaturze pokojowej.
   9. Umyj talerz dużą ilością bieżącej wody, wylej nadmiar płynu i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Zgłaszaj dołączone komórki za pomocą kamery cyfrowej sprzężonej z mikroskopem świetlnym.
   10. Rozcieńczyć barwienie komórek, dodając 100 μl/basenik 0,1 M cytrynianu sodu, 50% etanolu. Zmierzyć absorbancję przy 545 nm i przedstawić wyniki jako dowolne jednostki absorbancji lub procent adhezji, biorąc pod uwagę 100% jako adhezję komórek osiągniętą do studzienek pokrytych wyższym stężeniem ligandów

7. Test aktywacji śródbłonka za pomocą testu koadhezji leukocytów i śródbłonka

1. Poddać działanie komórek MLEC-04 na 96-dołkowych płytkach, jak opisano w sekcji 2 i inkubować z LPS (6 godzin, 37 °C).
2. Fluorescencyjnie znakuj komórki J774 estrem sukcynimidylu karboksyfluoresceiny (CSFE).
   1. Umyć komórki J774 w PBS zgodnie z procedurą opisaną w ppkt 6.2.5. Policz komórki metodą komory Neubauera i ponownie zawieś w stężeniu 1 x 10⁶ komórek/ml w PBS, 0,1% BSA.
   2. Inkubować komórki z CFSE (5 μM, stężenie końcowe) przez 20 minut w temperaturze 37 °C. Dodać 5 ml niekompletnej pożywki i inkubować (5 min, 4 °C).
   3. Przemyć raz niekompletną pożywką, jak wyjaśniono w ppkt 6.2.5, ponownie zawiesić w 15 x 10⁴ komórek/100 μl i przystąpić do testu koadhezji.
3. Po leczeniu śródbłonka należy trzykrotnie przemyć studzienki niekompletną pożywką. Dodaj komórki CFSE-J774 (15 x 10⁴ komórki/100 μl) do każdej studzienki pokrytej śródbłonkiem. Inkubować płytkę przez 10 minut w temperaturze 4 °C, a następnie przez 60 minut w temperaturze 37 °C.
4. Delikatnie umyć studzienki, jak opisano w ppkt 6.2.7, używając ogrzanego PBS i podać adhezję J774 do warstwy śródbłonka za pomocą następujących dwóch metod:
   1. Lizuj komórki w 0,1 M Tris-HCl pH 8,8, 1% SDS (100 μL/dołek) i zmierz sygnał CFSE-J774 za pomocą fluorometrii (wzbudzenie/emisja = 492 nm/517 nm). Przedstawić wyniki jako dowolne jednostki intensywności fluorescencji lub procentu adhezji w odniesieniu do kontroli pozytywnej (sygnał z całkowitej liczby komórek dodanych do każdej studzienki).
   2. Utrwal komórki w 4% PFA i zgłoś przyłączenie komórek CFSE-J774 do śródbłonka poprzez wizualizację pod mikroskopem fluorescencyjnym (wzbudzenie/emisja = 492 nm/517 nm).

Ocena indukowanej przez LPS aktywacji komórek śródbłonka za pomocą RT-qPCR

Pozbawione surowicy komórki MLEC-04 były stymulowane przez 100 ng/ml LPS przez 6 godzin, a ekspresję genu śródbłonka oceniano za pomocą RT-qPCR, porównując ekspresję markerów aktywacji ze stanem spoczynku. Jak pokazano w Rysunek 1A, inkubowane przez LPS komórki MLEC-04 indukowały ekspresję mRNA wybranych cząsteczek adhezyjnych zaangażowanych w rekrutację leukocytów podczas odpowiedzi zapalnej (E-selektyna, VCAM-1 i ICAM-1). PECAM-1 został użyty jako kontrola wewnętrzna, ponieważ ekspresja nie jest modyfikowana w tym eksperymentalnym leczeniu. Rysunek 1B przedstawia aktywację śródbłonka przez LPS mierzoną zwiększoną ekspresją mRNA cytokin Ccl5, Cxcl10 i Cxcl1. Cząsteczki te biorą udział w aktywacji krążących leukocytów, w tym w ich transporcie do warstwy śródbłonka, a następnie wynaczynieniu do miejsca zapalenia. Cytokina IL4 została użyta jako kontrola wewnętrzna w tym eksperymentalnym leczeniu.

Rycina 1: Ocena aktywacji komórek śródbłonka indukowanej przez LPS za pomocą RT-qPCR. ten Komórki MLEC-04 stymulowano 100 ng/ml LPS przez 6 godzin (czerwone paski) w porównaniu z warunkami kontrolnymi (niebieskie paski), a ekspresję genu analizowano za pomocą RT-qPCR. Wykresy pokazują indukcję krotności mRNA w odniesieniu do stanu kontrolnego wybranych cząsteczek adhezyjnych śródbłonka (A) i cytokin (B) biorących udział w aktywacji i rekrutacji leukocytów podczas odpowiedzi zapalnej. PECAM-1 i IL4 stosowano jako kontrole ujemne w tych warunkach. Wyniki wyrażone są jako średnia ± SEM z jednego z trzech przeprowadzonych eksperymentów przeprowadzonych w trzech egzemplarzach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ekspresja białek cząsteczek adhezyjnych na komórkach śródbłonka traktowanych LPS

Stymulacja zapalna została przeprowadzona na komórkach MLEC-04, jak opisano w poprzedniej sekcji, a ekspresja białka została zbadana techniką western blot. Śródbłonek spoczynkowy prezentuje prawie niewykrywalne poziomy cząsteczek adhezyjnych VCAM-1 i ICAM-1 (oznaczonych jako -). W obecności LPS (+) fenotyp aktywowany śródbłonkiem jest widoczny poprzez regulację w górę ekspresji opisanych markerów (Ryc. 2). Membrany znormalizowano przez detekcję β-aktyny, która została wykorzystana jako kontrola obciążenia do obliczenia względnych gęstości pasm po analizie densytometrycznej.

Rycina 2: Ekspresja białek cząsteczek adhezyjnych na komórkach śródbłonka traktowanych LPS. Reprezentatywny western blot oceniający ekspresję białka VCAM-1 i ICAM-1 w spoczynku (-) w porównaniu z komórkami MLEC-04 traktowanymi LPS (+). β-aktyna była używana jako kontrola obciążenia. Masa cząsteczkowa każdego białka znajduje się w nawiasach. Wartości reprezentują półkwantyfikację względnych gęstości pasm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Markery powierzchni śródbłonka w zapaleniu za pośrednictwem LPS

Aktywacja śródbłonka w kontekście zapalnym została oceniona za pomocą cytometrii przepływowej po 6-godzinnej stymulacji LPS (100 ng/ml). W tym stanie oceniano wykrywanie cząsteczek związanych z adhezją biorących udział w interakcji leukocytów. Lewy panel Rysunek 3A przedstawia podstawową ekspresję określonych markerów w spoczynkowych komórkach MLEC-04 (histogram czerwono-stały) w porównaniu z kontrolą negatywną izotypu (histogram z czarnymi kropkami). Prawy panel Rysunek 3A pokazuje wyniki uzyskane z stymulowanego MLEC-04. Leczenie LPS znacznie zwiększyło ekspresję cząsteczek adhezyjnych E-selektyny, VCAM-1 i ICAM-1 w błonie komórkowej (histogram czerwono-stały) w porównaniu ze stanem spoczynku (histogram z czarnymi kropkami). Jak wykazano w profilach cytometrycznych i cytowanych wcześniej, ekspresja PECAM-1 pozostaje niezmieniona w tych warunkach eksperymentalnych. Rysunek 3B pokazuje wartości ilościowe używane jako punkty odniesienia do oceny możliwych mediatorów śródbłonkowej reakcji zapalnej. %: procent komórek dodatnich; MFI: średnia intensywność fluorescencji.

Rycina 3: Markery powierzchni śródbłonka w zapaleniu za pośrednictwem LPS. Profile cytometrii przepływowej cząsteczek adhezyjnych na komórkach MLEC-04 w spoczynku i stymulowanych LPS. Lewy panel pokazuje ekspresję białka na komórkach spoczynkowych (histogram oznaczony antygenem na czerwono) w odniesieniu do kontroli dopasowanej do izotypu (histogram Ctrl-). Prawy panel porównuje ekspresję białka na powierzchni komórki kontrolnej (czarne histogramy) z komórkami śródbłonka traktowanymi LPS (czerwony histogram). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Szlaki sygnałowe wyzwalane przez stymulację LPS w komórkach śródbłonka

Mechanizmy zaangażowane w aktywację przedziału naczyniowego podczas stanu zapalnego są badane poprzez ocenę kluczowych cząsteczek sygnałowych. Komórki MLEC-04 stymulowane LPS w różnych okresach poddano procesowi ekstrakcji białek, a stopień aktywacji przeanalizowano techniką western blot. Rysunek 4 pokazuje, że represor IκB-α sygnalizacji NF-κB jest fosforylowany po 15 minutach inkubacji LPS i powraca do podstawowego poziomu po 1 godzinie. Z drugiej strony, LPS aktywuje sygnalizację ERK 1/2 po 15 minutach, co ustanawia niezbędny szlak zaangażowany w aktywację śródbłonka podczas odpowiedzi zapalnej. Membrany znormalizowano za pomocą detekcji β-aktyny lub ERK 1/2, które wykorzystano jako kontrolę obciążenia do obliczenia względnych gęstości pasm po analizie densytometrycznej.

Rycina 4: Szlaki sygnałowe wyzwalane przez LPS na komórkach śródbłonka. Komórki MLEC-04 stymulowane 100 ng / ml LPS przez czasy wskazane na rysunku oraz szlaki sygnałowe ERK 1/2 (P-ERK 1/2) i NF-kB (przez P-IκBα) oceniano za pomocą western blot. ERK 1/2 total i β-aktyna były używane jako kontrole obciążenia w każdym stanie. Masa cząsteczkowa każdego białka znajduje się w nawiasach. Wartości reprezentują półkwantyfikację względnych gęstości pasm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Regulacja zachowania leukocytów przez śródbłonek stymulowany LPS

Biologiczne znaczenie regulacji aktywacji śródbłonka na postęp reakcji zapalnej jest determinowane przez funkcjonalne testy wydajności leukocytów. Jak opisano w sekcji Protokół, uwzględniono dwa różne podejścia do badania funkcji leukocytów regulowanej przez komórki śródbłonka. Chociaż testy badają różne aspekty odpowiedzi zapalnej (RT-qPCR dla cytokin śródbłonka uwalnianych przez aktywację leukocytów i western blot dla cząsteczek adhezyjnych śródbłonka w interakcji leukocytów), uzyskane dane oceniają mikroskopijne szczegóły przyczepiania leukocytów. Aktywacja leukocytów przez rozpuszczalne czynniki śródbłonka jest niezbędna do rozwoju skutecznej odpowiedzi zapalnej, ponieważ sprzyja adhezji komórek do kilku substratów. Rysunek 5A pokazuje adhezję komórek J774 do studzienek pokrytych fibronektyną o stężeniu 0,5 μg/ml w odpowiedzi na wcześniej pobrane kondycjonowane podłoże z komórek śródbłonka kontrolnego lub leczonych LPS. Obrazy jasnego pola i pomiary spektrofotometryczne wskazują, że czynniki uwalniane w kondycjonowanych pożywkach ze śródbłonka traktowanego LPS są wystarczające do skutecznego indukowania aktywacji J774, jak pokazuje indukcja przyłączania komórek do fibronektyny. Rysunek 5B przedstawia test koadhezji do oceny zdolności warstwy naczyniowej do wspierania mocnej adhezji leukocytów poprzez nową ekspresję cząsteczek adhezyjnych śródbłonka. Krótko mówiąc, pozbawione surowicy subkonfluentne kultury komórek MLEC-04 stymulowanych LPS przez 6 godzin przemyto kilkakrotnie i inkubowano z linią leukocytów J774 wcześniej znakowaną sondą fluorescencyjną CFSE. Jak pokazano na mikrofotografiach i pomiarach spektrofluorometrycznych, stymulacja naczyniowa LPS sprzyja interakcji komórek CFSE-J774 z monowarstwą śródbłonka.

Ryc. 5: Interakcja leukocytów z monowarstwą śródbłonka inkubowaną przez LPS za pomocą testu koadhezji. (A) Obrazy z mikroskopii świetlnej pokazujące barwienie fioletem krystalicznym komórek J774 przyłączonych do studzienek pokrytych fibronektyną o stężeniu 0,5 μg / ml w odpowiedzi na kondycjonowane pożywki z komórek śródbłonka kontrolnych lub poddanych działaniu LPS. Podziałka, 50 μm. Przedstawiona poniżej analiza spektrofotometryczna wskazuje pomiar absorbancji wyrażony w dowolnych jednostkach (j.a.) ± SEM dla reprezentatywnego doświadczenia przeprowadzonego w trzech egzemplarzach. (B) Mikrofotografie fluorescencyjne pokazują komórki CFSE-J774 przyłączone do komórek kontrolnych lub MLEC-04 traktowanych LPS ocenianych za pomocą testu koadhezji. Podziałka = 50 μm. Przedstawiona poniżej analiza fluorometryczna wskazuje intensywność fluorescencji wyrażoną w dowolnych jednostkach (a.u.) ± SEM dla reprezentatywnego eksperymentu przeprowadzonego w trzech egzemplarzach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Lista starterów użytych w tym badaniu.

Tabela 2: Markery powierzchni śródbłonka w zapaleniu za pośrednictwem LPS. Kwantyfikacja ekspresji cząsteczek adhezyjnych komórek na spoczynkowych i stymulowanych LPS komórkach MLEC-04 za pomocą analizy cytometrii przepływowej. Wartości reprezentatywne dla każdego markera odpowiadające procentowi komórek dodatnich (%) i średniej intensywności fluorescencji (MFI) w komórkach śródbłonka w stanie spoczynku i stymulowanych przez LPS. PECAM-1 zastosowano jako kontrolę ujemną w tych warunkach eksperymentalnych.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.