Artykuł metodologiczny

Testy przesiewowe w celu scharakteryzowania nowych regulatorów śródbłonka zaangażowanych w odpowiedź zapalną

6.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55824

⸱

15 września 2017

 ,  ,  ,  , 
1Pharmacological Therapies Unit, Research Institute for Rare Diseases, Institute of Health Carlos III

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Śródbłonek naczyniowy ściśle kontroluje rekrutację leukocytów. Niewystarczające wynaczynienie leukocytów przyczynia się do chorób zapalnych u ludzi. Dlatego poszukiwanie nowych elementów regulacyjnych aktywacji śródbłonka jest niezbędne do projektowania ulepszonych terapii zaburzeń zapalnych. W tym miejscu opisujemy kompleksową metodologię charakteryzującą nowe regulatory śródbłonka, które mogą modyfikować transport leukocytów podczas stanu zapalnego.

Streszczenie

Warstwa śródbłonka jest niezbędna do utrzymania homeostazy w organizmie poprzez kontrolowanie wielu różnych funkcji. Regulacja odpowiedzi zapalnej przez warstwę śródbłonka ma kluczowe znaczenie dla skutecznej walki ze szkodliwymi czynnikami i pomocy w regeneracji uszkodzonych obszarów. Kiedy komórki śródbłonka są wystawione na działanie środowiska zapalnego, takiego jak zewnętrzny składnik błony bakterii Gram-ujemnych, lipopolisacharyd (LPS), wyrażają rozpuszczalne cytokiny prozapalne, takie jak Ccl5, Cxcl1 i Cxcl10, i wyzwalają aktywację krążących leukocytów. Ponadto ekspresja cząsteczek adhezyjnych E-selektyny, VCAM-1 i ICAM-1 na powierzchni śródbłonka umożliwia interakcję i adhezję aktywowanych leukocytów do warstwy śródbłonka, a ostatecznie wynaczynienie w kierunku tkanki objętej stanem zapalnym. W tym scenariuszu funkcja śródbłonka musi być ściśle regulowana, ponieważ nadmierna lub wadliwa aktywacja w rekrutacji leukocytów może prowadzić do zaburzeń związanych ze stanem zapalnym. Ponieważ wiele z tych zaburzeń nie ma skutecznego leczenia, należy zbadać nowe strategie koncentrujące się na warstwie naczyniowej. Proponujemy kompleksowe testy, które są przydatne w poszukiwaniu nowych regulatorów śródbłonka, które modyfikują funkcję leukocytów. Analizujemy aktywację śródbłonka przy użyciu specyficznych celów ekspresyjnych zaangażowanych w rekrutację leukocytów (takich jak cytokiny, chemokiny i cząsteczki adhezyjne) za pomocą kilku technik, w tym: ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (RT-qPCR), western-blot, cytometrii przepływowej i testów adhezyjnych. Podejścia te określają funkcję śródbłonka w kontekście zapalnym i są bardzo przydatne do wykonywania testów przesiewowych w celu scharakteryzowania nowych regulatorów stanu zapalnego śródbłonka, które są potencjalnie cenne dla projektowania nowych strategii terapeutycznych.

Wprowadzenie

Stan zapalny jest korzystną biologiczną odpowiedzią na czynniki zakaźne, której głównym celem jest eliminacja patogenu i naprawa uszkodzonej tkanki. W pewnych warunkach, takich jak przewlekłe infekcje lub choroby autoimmunologiczne, stan zapalny nie ustępuje. Zamiast tego występuje nieprawidłowa reakcja z ciągłym naciekaniem leukocytów, co skutkuje przedłużoną odpowiedzią immunologiczną, która prowadzi do uszkodzenia tkanek, zwłóknienia, utraty funkcji i ogólnie niepełnosprawności, a w niektórych przypadkach śmierci pacjenta. Wszystkie te ludzkie zaburzenia, skatalogowane jako choroby zapalne, obejmują naczynia krwionośne w celu kontroli wynaczynienia leukocytów1,2.

Komórki śródbłonka odgrywają fundamentalną rolę w regulacji odpowiedzi zapalnej poprzez kontrolowanie transportu leukocytów. Kiedy warstwa śródbłonka jest wystawiona na działanie mediatorów stanu zapalnego, takich jak LPS, spoczynkowy śródbłonek aktywuje i wyraża cytokiny prozapalne (Cxcl10, Cxcl5, Cxcl1 itp.) oraz cząsteczki adhezyjne (E-selektyna, VCAM-1 i ICAM-1), które sprzyjają rekrutacji krążących leukocytów do miejsca infekcji. Leukocyty zapoczątkowane przez uwolnione cytokiny pośredniczą następnie w toczeniu i interakcji z warstwą śródbłonka poprzez odpowiednie adhezyjne odpowiedniki: PSGL-1 do selektoryny, integrynę α4β1 do VCAM-1 i integrynę αLβ2 do ICAM-1. Na koniec leukocyty migrują przez naczynia krwionośne w kierunku ogniska zapalenia3.

Zasadnicza rola śródbłonka w regulacji odpowiedzi zapalnej została zademonstrowana na myszach, które zostały genetycznie zmodyfikowane w celu ekspresji receptora LPS, receptora toll-podobnego 4 (TLR4), tylko na komórkach śródbłonka. Te śródbłonkowe zwierzęta TLR4 były w stanie zareagować na stan zapalny za pośrednictwem LPS i wykryć infekcję powstałą po zaszczepieniu bakterii, a w konsekwencji osiągnąć rozwiązanie infekcji i przeżycie na podobnym poziomie jak myszy typu dzikiego4,5.

Dla regulowanego śródbłonkiem szlaku odpowiedzi zapalnej, postulowano, że zahamowanie na niektórych etapach interakcji leukocyt-śródbłonek spowoduje zmniejszenie migracji przezśródbłonkowej i lepsze rokowanie w chorobach związanych z zapaleniem. W rzeczywistości zaprojektowano kilka strategii ukierunkowanych na aktywację śródbłonka i interakcję leukocytów-śródbłonka, aby utrudnić wynaczynienie komórek odpornościowych w leczeniu zaburzeń zapalnych6,7.

W tym raporcie opisujemy szczegółową grupę technik in vitro, aby w pełni scharakteryzować aktywność śródbłonka w odpowiedzi na bodziec zapalny LPS i jego rolę w aktywacji i adhezji leukocytów do warstwy naczyniowej. Model komórek śródbłonka użyty w tym manuskrypcie to linia komórek śródbłonka płuc myszy (MLEC-04), opisana przez Hortelano i wsp.8. Linia komórkowa MLEC-04 została potwierdzona w literaturze jako odpowiedni system do badania aktywacji śródbłonka9,10. Opierając się na zainteresowaniach badawczych, podejścia te można łatwo ekstrapolować na dowolne systemy śródbłonka lub leukocytów oraz profil zapalny. Po zdefiniowaniu parametrów śródbłonka w wybranych warunkach, system może testować nowe leki na proponowanym eksperymentie w celu oceny aktywacji naczyń krwionośnych. W tym kontekście zapalnym komórki śródbłonka testowane z badanym związkiem mogą być porównane z warunkami kontrolnymi komórek, a wszelkie wynikające z tego różnice mogą informować o wyniku prognostycznym leku w zakresie rozwoju i progresji stanu zapalnego. Podsumowując, proponujemy odpowiedni system do charakteryzowania nowych celów leków dla komórek śródbłonka, co może wpłynąć na projektowanie nowych terapii specyficznych dla naczyń krwionośnych przeciwko chorobom związanym z zapaleniem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Hodowla komórek śródbłonka

  1. Płytki poddane działaniu kultur tkankowych
    1. Pokryć 100 mm płytki do hodowli tkankowej 2,5 ml roztworu żelatyny (autoklawizowany, 0,1% żelatyny w wodzie destylowanej) przez 30 minut w temperaturze 37 °C; można to ekstrapolować do wymaganego formatu studzienki. Odessać roztwór żelatyny i pozostawić płytki do wyschnięcia na powietrzu w kapturze do hodowli tkankowych.
  2. Warunki hodowli tkankowej
    1. Hoduj komórki MLEC-04 w inkubatorze biologicznym (37 °C, 95% wilgotności, 5% CO2 ). Hoduj komórki w kompletnym pożywce Zmodyfikowanego Eagle Medium firmy Dulbecco: Mieszanka składników odżywczych F-12 (DMEM/F-12) uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 100 jednostkami/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny (P/S).
    2. Policz komórki standardową metodą komory Neubauera i dodaj komórki MLEC-04 do płytek o średnicy 100 mm poddanych działaniu żelatyny w 10 ml kompletnych pożywkach, przy niskiej gęstości 2 - 11 x 104 komórek/cm2. Podziel komórki 1:3, gdy dotrą do konfluencji.
      UWAGA: Zwykle dzieje się to po dwóch do trzech dniach w hodowli.
    3. Hodowlę komórek należy przeprowadzić poprzez przemycie płytek 10 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), a następnie dodanie 2 ml roztworu trypsyny-EDTA (0,25% trypsyny, 5 mM EDTA) i inkubować przez 3 minuty w temperaturze 37 °C.
    4. Zatrzymaj reakcję trypsyna-EDTA i odzyskaj zawieszone komórki, dodając 10 ml kompletnej pożywki. Odwirować komórki (300 x g, 5 min), odrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad komórkowy w kompletnej pożywce i odpowiednio subkulturze.

2. Leczenie LPS i mediatory

  1. Umieść komórki MLEC-04 w kompletnym pożywce przy konfluencji poniżej do następującego formatu studzienki: 7 x 105 komórek/dołek na płytkach 6-dołkowych i 2,5 x 105 komórek/basenik na płytkach 96-dołkowych.
  2. Inkubować kulturę przez 6 godzin w inkubatorze komórkowym (37 °C, 95% wilgotności, 5% CO2 ). Zamień ogniwa na niekompletne podłoża (DMEM-F12, P/S) i pozostaw na noc (ON) w celu synchronizacji i zmniejszenia aktywności komórek.
  3. Usunąć pożywkę i przetestować nowe związki farmakologiczne poprzez inkubację komórek śródbłonka z (lub bez) danego leku (np. DT10) rozcieńczonego w niekompletnej pożywce (30 min, 37 °C); dodać 1,4 ml/dołek dla płytki 6-dołkowej lub 0,14 ml/dołek dla płytki 96-dołkowej).
  4. Zbadaj komórki, dodając LPS do pożywki inkubacyjnej (100 ng/ml, stężenie końcowe) przez okres określony w każdym teście. Użyj PBS jako formantu.

3. Ocena profilu transkrypcyjnego na aktywowanym śródbłonku za pomocą RT-qPCR

  1. Wysiewaj komórki MLEC-04 w momencie subkonfluencji na 6-dołkowych płytkach hodowlanych (7 x 10,5 komórek/dołek). Inkubować przez 6 godzin (37 °C, 95% wilgotności, 5% CO2 ), a następnie przejść do głodzenia surowicy (inkubacja ON).
  2. Usunąć pożywkę i poddać (lub nie leczyć) hodowle komórek śródbłonka badanym lekiem rozcieńczonym w niekompletnej pożywce (inkubować 30 minut, 37 °C); dodać 1,4 ml/basenik na płytkę 6-dołkową (30 min, 37 °C).
  3. Zbadać komórki, dodając 100 ng/ml LPS do inkubowanej pożywki (jak opisano w kroku 2.3) i inkubować przez 6 godzin. Zatrzymać reakcję przez dwukrotne przemycie zimnym PBS i utrzymać płytki w temperaturze -80 °C do czasu przetworzenia próbki.
  4. Ekstrakcja RNA
    1. Rozmrozić płytki i dodać 1 ml/basenik buforu do ekstrakcji RNA (38% fenolu i 0,8 M izotiocyjanianu guanidyny; patrz tabela materiałów). Pozostawić na 30 minut w temperaturze pokojowej (RT) pod mieszaniem i zebrać homogenat w probówkach o pojemności 1,5 ml.
    2. Dodać 200 μl chloroformu i delikatnie mieszać przez 15 s. Inkubować przez 3 minuty w temperaturze pokojowej i odwirować (11 600 x g, 15 min, 4 °C).
    3. Przenieść fazę wodną do innej probówki o pojemności 1,5 ml. Wytrącić RNA przez dodanie 500 μl izopropanolu, a następnie 10-minutową inkubację w temperaturze pokojowej, a następnie odwirować (11 600 x g, 4 °C).
    4. Odrzucić supernatant i przemyć osad 75% etanolem przez mieszanie wirowe, a następnie odwirowanie (7 500 x g, 4 °C).
    5. Wysuszyć osad na powietrzu i rozpuścić RNA w 25 μl czystegoH2O, inkubując przez 10 minut w temperaturze 55 °C. Utrzymać RNA w temperaturze -80 °C do czasu przetworzenia próbki.
  5. Ilość i czystość RNA
    1. Określić ilościowo stężenie RNA, mierząc absorbancję próbki przy długości fali 260 nm w spektrofotometrze (zob. tabela materiałów).
    2. Mierzyć przy 230 nm i 280 nm, aby określić czystość RNA.
      UWAGA: Stosunek 260/280 wskazuje na zanieczyszczenie białkiem lub fenolem. Dopuszczalny jest stosunek bliski 2. Stosunek 260/230 wskazuje na zanieczyszczenia EDTA, węglowodanami lub fenolami. Dopuszczalne są wartości od 2,0 do 2,2.
  6. Sprawdzanie integralności RNA
    1. Przeprowadzić 2 μg całkowitego RNA i drabinkę RNA na 1,5% denaturującym żelu agarozowym; wizualizować w systemie dokumentacji żelu (patrz Tabela Materiałów).
      UWAGA: Stosunek 2:1 wyraźnych i ostrych prążków rRNA 28S i 18S wskazuje na nienaruszone RNA. Częściowo zdegradowane RNA rozpada się jako rozmazany wygląd.
  7. RT-qPCR (Protokół RT-qPCR)
    1. Zsyntetyzuj komplementarne DNA (cDNA) z jednoniciowego RNA zgodnie ze standardowym protokołem (patrz Tabela materiałów)11.
  8. Ocena ekspresji genów za pomocą RT-qPCR
    1. Przygotować mieszaninę reakcyjną dla każdej próbki: zmieszać 2 μl cDNA, 7 μl związku fluorescencyjnego, starter 300 nM do przodu i starter do tyłu 300 nM (tabela 1) w końcowej objętości 13 μl i dodać do 96-dołkowej płytki reakcyjnej (patrz tabela materiałów).
    2. Uszczelnić płytkę optyczną osłoną z kleju, odwirować (300 x g, 1 min) i uruchomić reakcję w systemie Real-Time PCR (gorący start 95 °C przez 20 s, a następnie 40 cykli: 95 °C przez 3 s i 60 °C przez 30 s) (patrz tabela materiałów).
    3. Przeanalizować wyniki przez względną ocenę ilościową przy użyciu metody porównawczej 2-ΔΔCt z genami porządkowymi dehydrogenazy gliceraldehydo-3-fosforanowej (GAPDH) lub kwaśnej fosfoproteiny rybosomalnej P0 (36B4)12.

4. Oceń aktywację śródbłonka za pomocą cytometrii przepływowej

  1. Komórki MLEC-04 należy traktować zgodnie z warunkami opisanymi w punkcie 2 i ocenić zmiany w białkach powierzchniowych śródbłonka za pomocą cytometrii przepływowej.
  2. Odłączyć komórki po 6 godzinach stymulacji LPS metodą trypsyny-EDTA opisaną w kroku 1.2.3 i przemyć niekompletną pożywką w temperaturze 4 °C.
  3. Policz komórki metodą komory Neubauera i umieść 10 x 104 komórki na 96-dołkowych płytkach z dnem w kształcie litery U. Odwirować (300 x g, 5 min) i wyrzucić supernatant poprzez zatrzask nadgarstka o 180° od góry do dołu i szybki powrót do pierwotnej pozycji.
  4. Dodać 50 μl wybranego przeciwciała rozcieńczonego w pożywce niekompletnej (10 μg/ml, stężenie końcowe) do komórek i inkubować (30 min, 4 °C).
  5. Przemyć komórki dwukrotnie niekompletną pożywką zgodnie z procedurą opisaną w kroku 4.3 i inkubować w 50 μl w stężeniu 10 μg/ml odpowiedniego przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z FITC lub podobnym koniugatem (30 min, 4 °C w ciemnym miejscu).
  6. Umyj komórki raz niekompletną pożywką, a następnie przepłucz PBS. Odzyskaj komórki za pomocą 300 μl PBS za pomocą końcówek do pipet o pojemności 1 ml i umieść w probówkach cytometrycznych.
  7. Ocenić próbki w systemie cytometrii przepływowej (patrz tabela materiałów). Dostosuj populację komórek według parametrów rozpraszania do przodu i bocznego. Bramka populacji będącej przedmiotem zainteresowania. Dostosuj bramki w oparciu o kontrolę ujemną z komórek inkubowanych z kontrolą izotypu. Przeanalizuj wyniki jako procent komórek dodatnich lub średnią intensywność fluorescencji8.

5. Oceń aktywację śródbłonka za pomocą Western Blot

  1. Wysiewać śródbłonek w momencie konfluencji na 6-dołkowych płytkach hodowlanych (7 x 105 komórek/dołek) i traktować LPS, jak opisano w sekcji 2. Przeanalizuj ekspresję białka zapalnego za pomocą następującego protokołu western blot.
  2. Zatrzymaj stymulację LPS w różnych punktach czasowych, aby wyjaśnić różne aspekty odpowiedzi śródbłonka:
    1. Ustal profil białek zapalnych po 6 godzinach stymulacji LPS.
    2. Określ sygnalizację komórkową co 15 minut przez okres 60 minut.
  3. W obu przypadkach należy przerwać reakcję poprzez dwukrotne przemycie zimnym PBS i przechowywać próbki w temperaturze -80 °C do czasu przetworzenia próbki.
  4. Liza komórek i ekstrakcja białek
    1. Dodać 200 μl buforu do lizy do każdej studzienki (1% niejonowy środek powierzchniowo czynny, 10 mM Tris-HCl, 1mM EDTA, 150 mM chlorek sodu, 30 mM pirofosforan sodu, 50 mM fluorek sodu, 2,1 mM orthovanadan sodu o pH 7,6, uzupełniony koktajlem inhibitorów proteazy) (patrz tabela materiałów).
    2. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C pod wpływem mieszania, zeskrobać studzienki końcówką pipety i zebrać homogenat do probówek o pojemności 1,5 ml.
    3. Odwirować probówki o stężeniu 11 600 x g w temperaturze 4 °C.
    4. Przechowywać supernatant w czystych probówkach o pojemności 1,5 ml w temperaturze -80 °C do czasu przetworzenia.
  5. Zmierzyć stężenie białka za pomocą testu kwasu bicinchoninowego zgodnie ze standardowym protokołem (patrz tabela materiałów)13.
  6. Rozpuść 30 μg całkowitego lizatu białkowego dla każdej próbki za pomocą standardowej techniki elektroforezy 0,1% dodecylosiarczanu sodu, 10% żelu poliakryloamidowego (SDS-PAGE)14. Badaj próbki z 10 mM β-merkaptoetanolem (warunki redukujące) lub bez (warunki nieredukujące) w zależności od przeciwciała użytego do wykrycia białka będącego przedmiotem zainteresowania.
  7. Przenieść oddzielone białka z żelu poliakryloamidowego do membrany transferowej z polifluorku winylidenu (PVDF) o wielkości porów 0,45 μm przy użyciu standardowej procedury.
  8. Po przeniesieniu należy dwukrotnie przemyć membranę PBS, 0,1% polisorbatem-20 (PBS-T) i zablokować niespecyficzne miejsca wiązania, dodając 20 ml 2% BSA rozcieńczonego w PBS-T dla wykrytych fosfoprotein lub 5% beztłuszczowego mleka w proszku w PBS-T dla białek całkowitych, pod mieszaniem (90 min, RT).
  9. Rozcieńczyć wybrane przeciwciało w 10 ml odpowiedniego buforu blokującego o zalecanym stężeniu i inkubować błonę w stanie mieszania (ON, 4 °C). Alternatywnie należy umieścić membranę w szczelnie zamkniętych plastikowych torebkach i użyć 5 ml rozcieńczonego przeciwciała.
  10. Następnego dnia umyj membranę trzykrotnie (nadmiar PBS-T, 15 min, RT).
  11. Inkubować błonę pod wpływem mieszania (30 min, RT) z 10 ml odpowiedniego przeciwciała drugorzędowego związanego z peroksydazą chrzanową (HRP) rozcieńczonego w stosunku 1:10 000 w odpowiednim buforze blokującym.
  12. Umyć membranę trzykrotnie pod wpływem mieszania (nadmiar PBS-T, 15 min, RT).
  13. Inkubować błonę przez 1 minutę z 0,1 ml/cm2 substratu peroksydazy wzmocnionej chemiluminescencją (ECL). Umieść opróżnioną membranę między dwoma przezroczystymi arkuszami tworzywa sztucznego i włóż ją do systemu detekcji chemiluminescencji, który zawiera kamerę ze sprzężonym ładunkiem (CCD).
    1. Użyj kamery CCD do wykrycia sygnału i jej oprogramowania do nagrywania obrazów za pomocą programu akumulacyjnego (obrazy wyświetlają skumulowany sygnał co 30 s ekspozycji przez łącznie 15 minut).
  14. Określ ilościowo intensywność pasma za pomocą densytometrii za pomocą oprogramowania ImageJ zgodnie z protokołem opisanym w podręczniku użytkownika15.
    1. Otwórz próbkę w oprogramowaniu ImageJ i wybierz interesujące Cię pasmo za pomocą narzędzia do zaznaczania prostokątnego.
    2. Wybierz jako pierwszy pas ruchu i naciśnij pasy działki, aby uzyskać działki profilu.
    3. Ogranicz obszar szczytów za pomocą zaznaczenia linii prostej.
    4. Zmierz rozmiar każdego pasma, klikając wnętrze każdego szczytu.
    5. Przedstawić wyniki w odniesieniu do kontroli białka obciążenia (β-aktyna, tubulina itp.).

6. Oceń czynnik śródbłonka uwolniony w wyniku aktywacji leukocytów za pomocą testów adhezyjnych

  1. Uzyskać pożywki kondycjonowane śródbłonkiem.
    1. Poddać się działaniu komórek MLEC-04 zgodnie ze wskazaniami w sekcji 2 i zebrać supernatant hodowli po 24-godzinnej stymulacji LPS (100 ng / ml).
    2. Zebrać kondycjonowaną pożywkę z poddanych działaniu środka komórek MLEC-04 i odwirować (600 x g). Przechowywać supernatant w podwielokrotnościach o objętości 0,5 ml w temperaturze -80 °C aż do użycia.
  2. Test adhezji leukocytów
    1. Pokryj 96-dołkowe płytki 50 μl/basenik wybranych białek macierzy zewnątrzkomórkowej rozcieńczonych w PBS (z wyjątkiem kolagenu, który rozcieńcza się w 0,1 M kwasie octowym): fibronektyna (1 - 10 μg / ml), laminina (1 - 10 μg / ml) i kolagen typu I (10 - 40 μg / ml). Pozostawić włączone w temperaturze 4 °C.
    2. Odrzucić powlekane podłoże i zablokować niespecyficzne miejsca wiązania w studzienkach za pomocą 150 μl PBS, 1 % BSA inaktywowanego termicznie (1 min, 100 °C) przez 90 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Przemyć studzienki dwukrotnie PBS i dodać do studzie>
    4. Hodowla mysiej linii komórkowej monocytów-makrofagów J774 w inkubatorze biologicznym (37 °C, 95% wilgotności, 5% CO2) z pożywką Roswell Park Memorial Institute (RPMI), 10% FBS, 1% P / S.
      UWAGA: Komórki J774 rosną w zawiesinie.
    5. Zebrać komórki J774 do probówki o pojemności 15 ml i odwirować (300 x g, 5 min). Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą 10 ml pożywki niezawierającej surowicy. Policz komórki w komorze Neubauera. Odwirować komórki (300 x g, 5 min), odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w pożywce bez surowicy w proporcji 15 x 104 komórki J774 na 50 μl pożywki.
    6. Dodać 15 x 104 komórek J774 do każdej studzienki w 50 μl pożywki bez surowicy i inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C, a następnie 1 godzinę w temperaturze 37 °C w inkubatorze komórek CO2.
    7. Umyć studzienki dwukrotnie, delikatnie, dodając ciepły PBS; odwirować (300 x g, 5 min) i wyrzucić supernatant przez pstryknięcie nadgarstka o 180° od góry do dołu i szybko powrócić do pierwotnej pozycji. Utrwalić przyłączone komórki, dodając 100 μl/studzienkę 4% paraformaldehydu (PFA) do PBS i inkubować (10 min, RT).
    8. Delikatnie odrzuć pożywkę i przepuszczaj komórki 2% metanolem w PBS przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Delikatnie wyrzuć pożywkę i zabarwij komórki, dodając 50 μl / studzienkę 0,5% fioletu krystalicznego w 20% metanolu przez 90 s w temperaturze pokojowej.
    9. Umyj talerz dużą ilością bieżącej wody, wylej nadmiar płynu i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Zgłaszaj dołączone komórki za pomocą kamery cyfrowej sprzężonej z mikroskopem świetlnym.
    10. Rozcieńczyć barwienie komórek, dodając 100 μl/basenik 0,1 M cytrynianu sodu, 50% etanolu. Zmierzyć absorbancję przy 545 nm i przedstawić wyniki jako dowolne jednostki absorbancji lub procent adhezji, biorąc pod uwagę 100% jako adhezję komórek osiągniętą do studzienek pokrytych wyższym stężeniem ligandów

7. Test aktywacji śródbłonka za pomocą testu koadhezji leukocytów i śródbłonka

  1. Poddać działanie komórek MLEC-04 na 96-dołkowych płytkach, jak opisano w sekcji 2 i inkubować z LPS (6 godzin, 37 °C).
  2. Fluorescencyjnie znakuj komórki J774 estrem sukcynimidylu karboksyfluoresceiny (CSFE).
    1. Umyć komórki J774 w PBS zgodnie z procedurą opisaną w ppkt 6.2.5. Policz komórki metodą komory Neubauera i ponownie zawieś w stężeniu 1 x 106 komórek/ml w PBS, 0,1% BSA.
    2. Inkubować komórki z CFSE (5 μM, stężenie końcowe) przez 20 minut w temperaturze 37 °C. Dodać 5 ml niekompletnej pożywki i inkubować (5 min, 4 °C).
    3. Przemyć raz niekompletną pożywką, jak wyjaśniono w ppkt 6.2.5, ponownie zawiesić w 15 x 104 komórek/100 μl i przystąpić do testu koadhezji.
  3. Po leczeniu śródbłonka należy trzykrotnie przemyć studzienki niekompletną pożywką. Dodaj komórki CFSE-J774 (15 x 104 komórki/100 μl) do każdej studzienki pokrytej śródbłonkiem. Inkubować płytkę przez 10 minut w temperaturze 4 °C, a następnie przez 60 minut w temperaturze 37 °C.
  4. Delikatnie umyć studzienki, jak opisano w ppkt 6.2.7, używając ogrzanego PBS i podać adhezję J774 do warstwy śródbłonka za pomocą następujących dwóch metod:
    1. Lizuj komórki w 0,1 M Tris-HCl pH 8,8, 1% SDS (100 μL/dołek) i zmierz sygnał CFSE-J774 za pomocą fluorometrii (wzbudzenie/emisja = 492 nm/517 nm). Przedstawić wyniki jako dowolne jednostki intensywności fluorescencji lub procentu adhezji w odniesieniu do kontroli pozytywnej (sygnał z całkowitej liczby komórek dodanych do każdej studzienki).
    2. Utrwal komórki w 4% PFA i zgłoś przyłączenie komórek CFSE-J774 do śródbłonka poprzez wizualizację pod mikroskopem fluorescencyjnym (wzbudzenie/emisja = 492 nm/517 nm).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ocena aktywacji komórek śródbłonka indukowanej LPS za pomocą RT-qPCR

Komórki MLEC-04 po stymulacji surowiczej zostały pobudzone 100 ng/mL LPS przez 6 h, a ekspresja genów śródbłonka została oceniona za pomocą RT-qPCR poprzez porównanie ekspresji markerów aktywacji z warunkami spoczynku. Jak pokazano na Rysunku 1A, inkubacja komórek MLEC-04 z LPS indukowala ekspresję mRNA wybranych cząsteczek adhezyjnyc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ten protokół śródbłonka opisuje stopniową technologię, która stanowi podstawę do zbadania nowych mechanizmów zaangażowanych w regulację odpowiedzi zapalnej. Podejścia te opierają się na badaniu aktywności śródbłonka stymulowanej przez LPS i oceniają krytyczne etapy związane z rekrutacją leukocytów podczas odpowiedzi zapalnej, w szczególności: uwalnianie cytokin śródbłonka, ekspresję cząsteczek adhezyjnych śródbłonka i adhezję leukocytów do warstwy naczyniowej. Po ustaleniu parametrów śródbłonka system może poszukiwać now...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO) i Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) (grant numer IERPY 1149/16 dla A.L.; MPY 1410/09 do S. Hortelano); przez MINECO za pośrednictwem Fondo de Investigación en Salud (FIS) (przyznaje numery PI11.0036 i PI14.0055 S. Hortelano). S. Herranz był wspierany przez IERPY 1149/16 z ISCIII.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
ŻelatynaSigmaG9391
DMEM-F12LonzaBE12-719F
Płodowa surowica bydlęcaSigmaA4503
Penicylina streptomycynaLonzaDE17-602E
TrypsynaLonzaBE17-160E
EDTASigmaED2SS
LPSSigmaL2880
TrizolSigmaT9424Bufor do ekstrakcji RNA
IzopropanolSigma33539
Etanol absolutoPanreac1,310,861,612
Czysty H2OQiagen1017979RNAzy
AgarozaPronadisa8020
Barwnik do żeli agarozowychInvitrogens33102
SuperScript III First-Nit Synth18080051Odczynniki do RT-PCR
Fast SYBR Green Master MixApplied Biosystems4385610Barwienie fluorescencyjne do qPCR
MicroAmp Fast Optical 96-wellApplied Biosystems4346906Płytki do qPCR
U-bottom 96 dołkówFalcon353072
Probówki cytometryczneFalcon352054
TX100Panreac212314Niejonowy środek powierzchniowo czynny
Tris-HClPanreac1,319,401,211
Chlorek soduMerck1,064,041,000
Pirofosforan soduSigma221368
Fluorek soduSigmaS7920
Ortowanadan sodusigma13721-39-6
Koktajl inhibitorów proteazysigmaP8340
Zestaw do oznaczania białek Pierce BCAPierce23225Odczynniki do oznaczania kwasu bicynchoninowego
i beta;-merkaptoetanolmerck805,740
Membrana transferowa PVDF, 0,45 i mikro; mThermo Scientific88518
Tween-20Panreac1,623,121,611Polisorbat 20
PBSLonzaBE17-515Q
ECL MiliporeWBKLS0500
FibronektynaSigmaF1141
LamininSigmaL2020
Kolagen typu ISigmac8919
Kwas octowyPanreac1,310,081,611
Błękit trypanowySigmaT8154
ParaformaldehydSigmaP6148
MetanolPanreac1,310,911,612
Krystaliczny fioletSigmaHT90132
Cytrynian soduSigmaC7254
Etanol 96%Panreac1,410,851,212
CFSESigma21888
RPMILonzaBE12-115F
SDSBio-Rad161-0418
Infinite M200TecanM200Wielomodowy czytnik mikropłytek
Gel Doc 2000Bio-Rad2000System dokumentacji żelu
StepOnePlusApplied BiosystemsSystem qPCRStepOnePlus
MACSQuant Analyzer 10Miltenyi BiotecAnalyzer 10Aparatura do cytometrii
ChemiDoc MPBio-RadMPSystem detekcji chemiluminescencji
NazwaFirmaNumer katalogowy>Komentarze
Przeciwciała
PECAM-1BD Biosciences553370Stosować przy 10 &mikro; g/ml
ICAM-2Biolegend1054602Stosować w stężeniach 10 &mikro; g/ml
E-selektynaBD Biosciences553749Stosować w 10 &mikro; g/mL
VCAM-1BD Biosciences553330Stosować przy 10 &mikro; g / ml
ICAM-1Becton Dickinson553250Stosować przy 10 &mikro; g / ml
przeciw szczurom IgG-FITCJackson Immuno Research112-095-006Stosować przy 10 &mikro; g / ml
anty chomik ormiański-FITCJackson Immuno Research127-095-160Stosować przy 10 &mikro; g/mL
Kontrola izotyopy IgG szczuraInvitrogen10700Stosować przy 10 &mikro; g/mL
Chomik ormiański Kontrola izotypu IgGInvitrogenPA5-33220Stosować przy 10 &mikro; g/ml
P-Iκ Β-&alfa;Sygnalizacja komórkowa2859Użyj przy 10 &mikro; g / ml
i beta; -AktynaSigmaA5441Stosować w 10 &mikro; Sygnalizacja komórkowa g / mL
P-ERK9101Użyj przy 10 i mikro; g/mL
przeciw myszom HRPGE HealthcareLNXA931/AEStosować w stosunku 1:10 000
przeciw królikom HRPGE HealthcareLNA934V/AGStosować w skali 1:10 000
przeciw szczurom HRPSanta CruzSc-3823stosować w skali 1:10 000
wolny od

Bibliografia

  1. Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Crohn's disease. Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).
  2. Skeoch, S., Bruce, I. N. Atherosclerosis in rheumatoid arthritis: is it all about inflammation? Nat Rev Rheumatol. 11 (7), 390-400 (2015).
  3. Gerhardt, T., Ley, K. Monocyte trafficking across the vessel wall. Cardiovasc Res. 107 (3), 321-330 (2015).
  4. Andonegui, G., et al. Mice that exclusively express TLR4 on endothelial cells can efficiently clear a lethal systemic Gram-negative bacterial infection. J Clin Invest. 119 (7), 1921-1930 (2009).
  5. McDonald, B., Jenne, C. N., Zhuo, L., Kimata, K., Kubes, P. Kupffer cells and activation of endothelial TLR4 coordinate neutrophil adhesion within liver sinusoids during endotoxemia. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305 (11), G797-G806 (2013).
  6. Pober, J. S., Sessa, W. C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation. Nat Rev Immunol. 7 (10), 803-815 (2007).
  7. Chamorro, Á, Dirnagl, U., Urra, X., Planas, A. M. Neuroprotection in acute stroke: targeting excitotoxicity, oxidative and nitrosative stress, and inflammation. Lancet Neurol. 15 (8), 869-881 (2016).
  8. Hortelano, S. ILK mediates LPS-induced vascular adhesion receptor expression and subsequent leucocyte trans-endothelial migration. Cardiovasc Res. 86 (2), 283-292 (2010).
  9. Palazón, A. Agonist anti-CD137 mAb act on tumor endothelial cells to enhance recruitment of activated T lymphocytes. Cancer Res. 71 (3), 801-811 (2011).
  10. Jiménez-García, L. 8,9-Dehydrohispanolone-15,16-lactol diterpene prevents LPS-triggered inflammatory responses by inhibiting endothelial activation. Biochem J. 473 (14), 2061-2071 (2016).
  11. SuperScript® III First-Strand Synthesis System for RT-PCR. , Life Technologies. Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/superscriptIIIfirststrand_pps.pdf (2013).
  12. Livak, K. J., Schmittge, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  13. Pierce BCA Protein Assay Kit. , Thermo Scientific. Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf (2017).
  14. He, F. Laemmli-SDS-PAGE. BIO-PROTOCOL. 1 (11), (2011).
  15. ImageJ User Guide. , ImageJ. Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/user-guide-USbooklet.pdf (2017).
  16. Hohsfield, L. A., Humpel, C. Intravenous infusion of monocytes isolated from 2-week-old mice enhances clearance of Beta-amyloid plaques in an Alzheimer mouse model. PloS One. 10 (4), e0121930(2015).
  17. Hofland, R. W., Thijsen, S. F. T., Verhagen, M. A. M. T., Schenk, Y., Bossink, A. W. J. Tuberculosis during TNF-α inhibitor therapy, despite screening. Thorax. 68 (11), 1079-1080 (2013).
  18. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).
  19. Tedgui, A., Mallat, Z. Anti-inflammatory mechanisms in the vascular wall. Circ Res. 88 (9), 877-887 (2001).
  20. Zheng, Y., Humphry, M., Maguire, J. J., Bennett, M. R., Clarke, M. C. H. Intracellular interleukin-1 receptor 2 binding prevents cleavage and activity of interleukin-1α, controlling necrosis-induced sterile inflammation. Immunity. 38 (2), 285-295 (2013).
  21. Pripp, A. H., Stanišić, M. The correlation between pro- and anti-inflammatory cytokines in chronic subdural hematoma patients assessed with factor analysis. PloS One. 9 (2), e90149(2014).
  22. Guha, M., Mackman, N. LPS induction of gene expression in human monocytes. Cell Signal. 13 (2), 85-94 (2001).
  23. Tabas, I., Glass, C. K. Anti-inflammatory therapy in chronic disease: challenges and opportunities. Science. 339 (6116), 166-172 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

RT qPCRWestern blotcytometria przep ywowatesty adhezjirekrutacja leukocyt wekspresja cytokincz steczki adhezyjnestymulacja LPS

Powiązane artykuły