Produkcja chemikaliów przez Klebsiella pneumoniae z wykorzystaniem hydrolizatu bambusa jako surowca

Podsumowanie

Proszek bambusowy został wstępnie potraktowany NaOH i enzymatycznie hydrolizowany. Hydrolizat bambusa został wykorzystany jako surowiec do produkcji 2,3-butanodiolu, R-acetoiny, kwasu 2-ketoglukonowego i kwasu ksylonowego przez Klebsiella pneumoniae.

Streszczenie

jest ważną biomasą, a hydrolizat bambusa jest używany przez Klebsiella pneumoniae jako surowiec do produkcji chemicznej. Tutaj proszek bambusowy został wstępnie potraktowany NaOH i umyty do neutralnego pH. Celulaza została dodana do wstępnie przetworzonego proszku bambusowego w celu wytworzenia hydrolizatu, który zawierał 30 g/l glukozy i 15 g/l ksylozy i został wykorzystany jako źródło węgla do przygotowania podłoża do produkcji chemicznej. Podczas hodowli w warunkach mikrotlenowych 12,7 g/l 2,3-butanodiolu było wytwarzane przez K. pneumoniae typu dzikiego. W warunkach tlenowych 13,0 g/l R-acetoiny było wytwarzane przez mutanta budC K. pneumoniae. Mieszanina 25,5 g/l kwasu 2-ketoglukonowego i 13,6 g/l kwasu ksylonowego została wytworzona przez mutanta budA K. pneumoniae w dwuetapowej fermentacji o kontrolowanym pH z dużą ilością powietrza. W pierwszym etapie fermentacji kultura była utrzymywana w neutralnym pH; Po wzroście komórek fermentacja przeszła do drugiego etapu, podczas którego kultura mogła stać się kwaśna.

Wprowadzenie

Klebsiella pneumoniae to bakteria, która dobrze rośnie zarówno w warunkach tlenowych, jak i beztlenowych. K. pneumoniae jest ważnym mikroorganizmem przemysłowym wykorzystywanym do produkcji wielu chemikaliów. 1,3-propanodiol jest cenną substancją chemiczną, która jest używana głównie jako monomer do syntezy politereftalanu trimetylenu. Politereftalan trimetylenu jest biodegradowalnym poliestrem, który wykazuje lepsze właściwości niż 1,2-propanodiol, butanodiol lub glikol etylenowy¹. 1,3-propanodiol jest wytwarzany przez K. pneumoniae przy użyciu glicerolu jako substratu w warunkach ograniczonej ilości tlenu². 2,3-butanodiol i jego pochodne mają zastosowanie w dziedzinie tworzyw sztucznych, produkcji rozpuszczalników i kauczuku syntetycznego i mają potencjał do wykorzystania jako biopaliwo³. Z glukozą jako substratem, 2,3-butanodiol jest głównym metabolitem szczepu typu dzikiego⁴. 2,3-butanodiol jest syntetyzowany z pirogronianu. Po pierwsze, dwie cząsteczki pirogronianu kondensują się, dając α-acetomleczan; Reakcja ta jest katalizowana przez syntazę α-acetomleczanu. α-acetomleczan jest następnie przekształcany w acetoinę przez dekarboksylazę α-acetomleczanu. R-acetoina może być dalej zredukowana do 2,3-butanodiolu, gdy jest katalizowana przez dehydrogenazę butanodiolu. Zbadano skuteczną metodę zastępowania genów odpowiednią dla K. pneumoniae i skonstruowano wiele mutantów^5,6,7. Mutant budC, który utracił aktywność dehydrogenazy 2,3-butanodiolu, gromadzi wysoki poziom acetoiny w bulionie hodowlanym. Acetoina jest stosowana jako dodatek wzmacniający smak żywności⁸. Kiedy budA, który koduje dekarboksylazę α-acetomleczanu, jest zmutowany, kwas 2-ketoglukonowy gromadzi się w bulionie. Kwas 2-ketoglukonowy jest używany do syntezy kwasu erytrobowego (kwasu izoaskorbinowego), przeciwutleniacza stosowanego w przemyśle spożywczym9. Kwas 2-ketoglukonowy jest produktem pośrednim szlaku utleniania glukozy; W tym szlaku, zlokalizowanym w przestrzeni peryplazmatycznej, glukoza jest utleniana do kwasu glukonowego, a następnie dalej utleniana do kwasu 2-ketoglukonowego. Kwas glukonowy i kwas 2-ketoglukonowy wytwarzane w peryplazmie mogą być transportowane do cytoplazmy w celu dalszego metabolizmu. Akumulacja kwasu 2-ketoglukonowego jest zależna od warunków kwaśnych, a wyższa suplementacja powietrzem sprzyja produkcji kwasu 2-ketoglukonowego¹⁰. Dehydrogenaza glukoniianowa, kodowana przez , katalizuje przemianę kwasu glukonowego w kwas 2-ketolgukonowy. Mutant K. pneumoniae wytwarzał wysoki poziom kwasu glukonowego zamiast kwasu 2-ketoglukonowego, a proces ten jest również zależny od warunków kwaśnych. Kwas glukonowy jest kwasem organicznym luzem i jest stosowany jako dodatek zwiększający właściwości cementu¹¹. Utlenianie glukozy do kwasu glukonowego jest katalizowane przez dehydrogenazę glukozy. Ksyloza jest również odpowiednim substratem dehydrogenazy glukozowej. Gdy ksyloza jest używana jako substrat, K. pneumoniae wytwarza ksylon¹².

Produkcja chemiczna z wykorzystaniem biomasy jako surowca jest gorącym tematem w biotechnologii¹³. Głównymi składnikami biomasy są celuloza, hemiceluloza i lignina. Jednak te związki wielkocząsteczkowe nie mogą być bezpośrednio katabolizowane przez większość mikroorganizmów (w tym K. pneumoniae). Celuloza i hemicelulozy w biomasie muszą zostać zhydrolizowane do glukozy i ksylozy, a następnie mogą być wykorzystane przez mikroorganizmy. Obecność ligniny w lignocelulozach tworzy barierę ochronną, która zapobiega hydrolizie biomasy przez enzymy. Tak więc proces obróbki wstępnej, który usuwa ligninę i hemicelulozy oraz zmniejsza krystaliczność celulozy, jest zawsze wykonywany podczas wykorzystania biomasy przez mikroorganizmy. Opracowano wiele metod obróbki wstępnej: powszechne są obróbki wstępne kwasowe, zasadowe, amoniakalne i parowe.

występuje obficie w regionach tropikalnych i subtropikalnych i jest ważnym zasobem biomasy. Przedstawiono tutaj otrzymywanie hydrolizatu bambusa oraz produkcję chemiczną z wykorzystaniem hydrolizatu bambusa

Protokół

1. Przygotowanie hydrolizatu bambusa

1. Dodać 5 g proszku bambusowego do 40 ml roztworu NaOH, aby osiągnąć 10% (g/g) stężenie końcowe w kolbie o pojemności 250 ml. Stosować szereg roztworów NaOH w zakresie od 0,05 M do 0,50 M w odstępach co 0,05 M.
   1. Inkubować mieszaninę przez 60 minut w temperaturze 60 °C lub 100 °C w łaźni wodnej. Inkubować w temperaturze 121 °C w autoklawie.
2. Po inkubacji pozostawić mieszaninę na 4 godziny w temperaturze pokojowej. Następnie usunąć supernatant. Dodaj 100 ml świeżej wody i wymieszaj.
   1. Powtórz to płukanie 5-6 razy, aż pH supernatantu osiągnie 6,8. Otrzymane ciało stałe należy wykorzystać do kolejnego etapu hydrolizy enzymatycznej.
3. Do hydrolizy dostosować 50 ml powyższej mieszaniny do pH 5,0 przy użyciu 98% H₂SO₄. Następnie dodaj 0,5 ml 200 aktywności bibuły filtracyjnej (FPU)/ml celulazy.
   UWAGA: Ostateczny stosunek celulazy do bambusa powinien wynosić 20 FPU na 1 g bambusa.
4. Inkubować mieszaninę w temperaturze 50 °C przez 36 godzin w shakerze.
   UWAGA: Po hydrolizie w mieszaninie pozostanie trochę ciała stałego.
5. Otrzymać klarowny hydrolizat przez odwirowanie przy 7,690 x g przez 5 min.
6. Określ ilościowo glukozę, ksylozę i inne substancje chemiczne za pomocą wysokociśnieniowego systemu chromatografu cieczowego wyposażonego w detektor indeksu refrakcji i detektor matrycowy fotodiody. Użyj kolumny HPX-87H (300 mm x 7,8 mm) i fazy ruchomej roztworu 5 mM H₂SO₄ przy natężeniu przepływu 0,8 ml/min¹².
7. Aby uzyskać dużą objętość preparatu hydrolizatu, wymieszaj 2 kg proszku bambusowego i 18 l 0,25 M NaOH w 30-litrowym zbiorniku ze stali nierdzewnej.
   1. Inkubować zbiornik w temperaturze 121 °C w autoklawie przez 60 minut. Po inkubacji umyj mieszaninę 40 l wody w plastikowym zbiorniku o pojemności 60 l. Powtórz to pranie 5 razy.
   2. Użyj wody, aby dostosować całkowity umyty do objętości 20 L. Dostosuj pH mieszaniny do 5,0 za pomocą 98% H₂SO₄.
   3. Enzymatycznie hydrolizować mieszaninę w zmodyfikowanej łaźni wodnej z wytrząsaniem, wyposażonej w mieszadło mechaniczne, aby zapewnić dobre rozprowadzenie mieszaniny. Dodać 200 ml 200 FPU/ml celulazy i inkubować mieszaninę w temperaturze 50 °C przez 36 godzin.
   4. Po hydrolizie odwirować mieszaninę o sile 4 700 x g przez 10 minut.

2. Produkcja 2,3-butanodiolu przez dzikie typy K. pneumoniae

1. Użyj 3 l hydrolizatu bambusa jako rozpuszczalnika do przygotowania podłoża.
2. Przygotować pożywkę fermentacyjną zawierającą 4 g/l stromego ługu kukurydzianego, 2 g/L (NH₄)₂SO₄, 6 g/L K₂HPO₄, 3 g/L KH₂PO₄ i 0,2 g/L_MgSO4. Dostosuj pH pożywki do obojętnego za pomocą 2,5 M NaOH. Do fermentacji należy użyć bioreaktora o pojemności 5 litrów zawierającego 3 litry autoklawizowanej pożywki fermentacyjnej.
3. Używaj komórek K. pneumoniae przechowywanych w lodówce o niskiej temperaturze -80 °C.
4. W przypadku kultury nasiennej inkubować kolbę o pojemności 250 ml zawierającą 50 ml pożywki Luria-Bertani (LB) przez noc w temperaturze 37 °C, wytrząsając przy 200 obr./min. Użyj pożywki LB zawierającej 10 g/l tryptonu, 5 g/l ekstraktu drożdżowego i 10 g/l NaCl.
   UWAGA: Gęstość komórek kultury nasiennej powinna osiągnąć OD 2 (gęstość optyczna przy 600 nm).
5. Zaszczepić jedną kolbę zawierającą 50 ml kultury nasion w bioreaktorze. Utrzymuj kulturę na poziomie pH 6,0 i 37 °C. Stosuj dawkę dozowania powietrza 2 l/min i szybkość mieszania 250 obr./min, tworząc warunki mikrotlenowe.
6. Zbieraj 5 ml próbek co 2 godziny podczas fermentacji i analizuj je za pomocą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej w celu określenia stężeń chemicznych w bulionie⁴.
   1. Monitoruj alkalia dodawane do bioreaktora online za pomocą MFCS/DA.
      UWAGA: W procesie fermentacji wytwarzane są kwasy organiczne, a NaOH dodaje się w celu utrzymania stabilnego pH kultury. Objętość dodanej zasady reprezentuje ilość wyprodukowanego kwasu. Kiedy linia dodana do alkaliów ustabilizuje się, proces jest zakończony, albo z powodu wyczerpania źródła węgla, albo śmierci komórki.

3. Produkcja R-acetoiny przez budC Mutant K. pneumoniae

1. Przygotować pożywkę do produkcji acetoiny zawierającą 4 g/l nalewki kukurydzianej stromej, 2 g/l (NH₄)_2SO4, 3 g/l octanu sodu, 0,4 g/l KCl i 0,1 g/L_MgSO4.
2. Użyj K. pneumoniae-ΔbudC do produkcji R-acetoiny. Powtórz kroki 2.4-2.5.
   UWAGA: budC koduje dehydrogenazę 2,3-butanodiolu. K. pneumoniae-ΔbudC traci aktywność dehydrogenazy 2,3-butanodiolu i wytwarza R-acetoinę zamiast 2,3-butanodiolu.
3. Utrzymuj kulturę na poziomie pH 6,0 i 37 °C. Stosuj dawkę 4 l/min i szybkość mieszania 450 obr./min, co jest warunkiem tlenowo
   UWAGA: Suplementacja tlenem jest wyższa niż w przypadku produkcji 2,3-butanodiolu.
4. Oznaczyć próbki jak w kroku 2.6.

4. Produkcja kwasu 2-ketoglukonowego przez zmutowany budA K. pneumoniae

1. Do produkcji kwasu 2-ketoglukonowego należy użyć tego samego podłoża, co do produkcji R-acetoiny.
2. Użyj K. pneumoniae-ΔbudA do produkcji kwasu 2-ketoglukonowego. Powtórz kroki 2.4-2.5.
   UWAGA: budA koduje dekarboksylazę α-acetomleczanu. K. pneumoniae-ΔbudA traci aktywność dekarboksylazy α-acetomleczanu i wytwarza kwas 2-ketoglukonowy, wykorzystując glukozę jako substrat.
   UWAGA: Synteza kwasu 2-ketoglukonowego jest procesem zależnym od stanu kwaśnego. Do produkcji kwasu 2-ketoglukonowego opracowano dwuetapową fermentację¹⁰; W pierwszym etapie kultura nasion jest zaszczepiana w bioreaktorze.
3. Utrzymuj kulturę na poziomie pH 7,0 i 37 °C. Stosuj dawkę 4 l/min i szybkość mieszania 500 obr./min.
   UWAGA: W tych warunkach komórki rosną bardzo szybko (gęstość komórek osiąga OD 7 w ciągu około 4 godzin). Następnie fermentacja przechodzi do drugiego etapu, podczas którego pH kultury spada do 5,0. Nie dodaje się kwasu; kwasy organiczne wytwarzane w kulturze w naturalny sposób prowadzą do obniżenia pH. W tych kwaśnych warunkach wzrost komórek zatrzymuje się, ale kwas 2-ketoglukonowy jest syntetyzowany i gromadzi się w bulionie.
4. Oznaczyć próbki jak w kroku 2.6. Wykorzystanie hydrolizatu bambusa jako źródła węgla.
   UWAGA: Glukoza w pożywce jest przekształcana w kwas 2-ketoglukonowy, a ksyloza jest przekształcana w kwas ksylonowy. W ten sposób otrzymuje się mieszaninę kwasu 2-ketoglukonowego i kwasu ksylonowego.

Wyniki

W niniejszym protokole bambus został poddany obróbce wstępnej za pomocą alkaliów. Optymalne parametry inkubacji – temperatura 121 °C oraz 0,25 M NaOH – zostały określone na Rysunkach 1 i 2. Poddany obróbce wstępnej bambus został poddany hydrolizie enzymatycznej, a następnie zmierzono stężenia glukozy i ksylozy w otrzymanym hydrolizacie. Wyższe temperatury sprzyjały produkcji cukrów, dlatego jako temperaturę optymalną wybrano 121 °C. Ilość glukozy i ksyloz...

Dyskusja

K. pneumoniae należy do rodzaju Klebsiella z rodziny Enterobacteriaceae. K. pneumoniae jest szeroko rozpowszechniony w środowiskach naturalnych, takich jak gleba, roślinność i woda¹⁴. Szczep K. pneumoniae typu dzikiego wykorzystany w tych badaniach został wyizolowany z gleby i jest używany do produkcji 1,3-propanodiolu¹⁵. K. pneumoniae i mutanty tego gatunku wytwarzają wiele substancji chemicznych w różnych warunkach.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
autoklaw	Bioreaktor SANYO	3780
	Sartorius stedim biotech	Bostat Aplus
Wytrząsarka do kąpieli wodnej
wysokowydajny system chromatografu cieczowego	Wirówka Shimadzu Corp	20AVP
		CR22G III
Proszek bambusowy	zakupiony w prowincji Zhejiang, Chiny		numer oczek, 50
celulazy	Youtell Biochemical, Shandong, Chiny		200 PFU / ml

Mieszadło IKA RW 20 Zhicheng ZWY-110X50 Hitachi