Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

In vitro Polimeryzacja F-aktyny na wczesnych endosomach

8.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55829

⸱

28 sierpnia 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Geneva, 2Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne

W tym artykule

Podsumowanie

Wczesne funkcje endosomów zależą od polimeryzacji F-aktyny. W tym miejscu opisujemy oparty na mikroskopii test in vitro, który odtwarza zarodkowanie i polimeryzację F-aktyny na wczesnych błonach endosomalnych w probówkach, czyniąc w ten sposób tę złożoną serię reakcji podatną na manipulacje biochemiczne i genetyczne.

Streszczenie

Wiele wczesnych funkcji endosomów, szczególnie sortowanie białek ładunkowych i deformacja błony, zależy od plam krótkich włókien F-aktyny zarodkowanych na błonie endosomalnej. Opracowaliśmy test in vitro oparty na mikroskopii, który odtwarza zarodkowanie i polimeryzację F-aktyny na wczesnych błonach endosomalnych w probówkach, czyniąc w ten sposób tę złożoną serię reakcji podatną na manipulacje genetyczne i biochemiczne. Frakcje endosomalne są otrzymywane przez flotację w gradientach sacharozy z komórek eksprymujących wczesne białko endosomalne GFP-RAB5. Frakcje cytozolowe przygotowuje się z oddzielnych partii komórek. Zarówno frakcja endosomalna, jak i cytozolowa mogą być przechowywane w stanie zamrożonym w ciekłym azocie, jeśli zajdzie taka potrzeba. W teście frakcje endosomalną i cytozolową miesza się, a mieszaninę inkubuje się w temperaturze 37 °C w odpowiednich warunkach (np. siła jonowa, środowisko redukujące). W pożądanym czasie mieszanina reakcyjna jest utrwalana, a F-aktyna ujawnia się z falloidyną. Zarodkowanie i polimeryzacja aktyny są następnie analizowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. W tym miejscu informujemy, że test ten można wykorzystać do zbadania roli czynników, które są zaangażowane w zarodkowanie aktyny na błonie lub w późniejsze wydłużanie, rozgałęzianie lub sieciowanie włókien F-aktyny.

Wprowadzenie

W wyższych komórkach eukariotycznych białka i lipidy są internalizowane do wczesnych endosomów, gdzie następuje sortowanie. Niektóre białka i lipidy, które są przeznaczone do ponownego wykorzystania, są włączane do kanalikowatych regionów wczesnych endosomów, a następnie transportowane do błony plazmatycznej lub do sieci trans-Golgiego (TGN)1,2. Natomiast inne białka i lipidy są selektywnie pakowane w regiony wczesnych endosomów, które wykazują wygląd wielopęcherzykowy. Regiony te rozszerzają się i po oderwaniu od wczesnych błon endosomalnych ostatecznie dojrzewają do postaci wolnych endosomalnych pęcherzyków nośnych lub ciał wielopęcherzykowych (ECV/MVB), które są odpowiedzialne za transport ładunku w kierunku późnych endosomów1,2.

Aktyna odgrywa kluczową rolę w procesie przebudowy błony związanym ze zdolnością sortowania endosomalnego i biogenezą endosomów. Sortowanie białek wzdłuż szlaków recyklingu do błony plazmatycznej lub do TGN zależy od kompleksu retromerów i powiązanych białek. Ta maszyna sortująca wydaje się być sprzężona z tworzeniem kanalików recyklingowych poprzez interakcje kompleksu retromeru, z kompleksem WASP i homologiem blizny (WASH) oraz rozgałęzioną aktyną 3,4,5. Natomiast cząsteczki przeznaczone do degradacji, w szczególności aktywowane receptory sygnałowe, są sortowane do pęcherzyków śródświetlnych (ILV) przez endosomalne kompleksy sortujące wymagane do transportu (ESCRT)2,6,7. Chociaż możliwa rola aktyny w procesie sortowania zależnym od ESCRT nie jest znana, F-aktyna odgrywa ważną rolę w biogenezie ECV/MVB i w transporcie poza wczesne endosomy. W szczególności odkryliśmy, że aneksyna A2 wiąże wzbogacone w cholesterol regiony wczesnego endosomu i wraz ze spire1 nukleatyzuje polimeryzację F-aktyny. Tworzenie rozgałęzionej sieci aktynowej obserwowane na endosomach wymaga rozgałęzionej aktywności kompleksu 2/3 białka związanego z aktyną (ARP), a także białka ERM mezyny i białka wiążącego aktynę kortaktyny8,9.

Tutaj opisujemy test in vitro oparty na mikroskopii, który odtwarza zarodkowanie i polimeryzację F-aktyny na wczesnych błonach endosomalnych w probówkach. Test ten był wcześniej używany do zbadania roli aneksyny A2 w zarodkowaniu F-aktyny oraz mezyny i kortaktyny w tworzeniu endosomalnych sieci aktynowych8,9. Dzięki temu protokołowi in vitro złożona seria reakcji zachodzących na endosomach podczas polimeryzacji aktyny staje się podatna na analizę biochemiczną i molekularną kolejnych etapów procesu, w tym zarodkowania aktyny, polimeryzacji liniowej, rozgałęziania i sieciowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Roztwory i preparaty

UWAGA: Wszystkie i roztwory powinny być przygotowane w podwójnie destylowanym (dd) H2O. Ponieważ stopień uwodnienia sacharozy jest różny, końcowe stężenie wszystkich roztworów sacharozy należy określić za pomocą refraktometru.

  1. Przygotować sól fizjologiczną buforowaną fosforanami bez kationów dwuwartościowych (PBS-): 137 mM NaCI, 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH2PO4 i 6,5 mM Na2HPO4. Dostosować pH do 7,4. Sterylizować w autoklawie (1 cykl w temperaturze 121 °C przez 15 min) i przechowywać w temperaturze pokojowej.
  2. Przygotować roztwór podstawowy 300 mM imidazolu: 0,204 g imidazolu w 10 ml ddH2O. Dostosować pH do 7,4 w 4 °C za pomocą HCl. Filtrować-sterylizować za pomocą filtra o wielkości porów 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  3. Przygotować bufor homogenizacyjny (HB; przygotować około 100 ml): 250 mM sacharozy w 3 mM imidazolu. Doprowadzić pH do 7,4 w temperaturze 4 °C za pomocą pH-metru. Filtrować-sterylizować za pomocą filtra o wielkości porów 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C. Uzupełnij HB tuż przed użyciem koktajlem inhibitorów proteazy w końcowych stężeniach odpowiadających 10 mM leupeptyny, 1 mM pepstatyny A i 10 ng/ml aprotyniny.
  4. Dla stopniowych gradientów flotacji przygotuj 62%, 39% i 35% roztwory sacharozy w 3 mM imidazolu, pH 7,4, jak opisano poniżej. Precyzyjnie określ końcowe stężenie wszystkich roztworów sacharozy za pomocą refraktometru.
    1. Przygotować 100 ml 62% roztworu sacharozy w 3 mM imidazolu o pH 7,4. Rozpuścić przez wymieszanie 80,4 g sacharozy w ddH2O podgrzanym do 35 °C. Dodać 1 ml 300 mM roztworu podstawowego imidazolu i napełnić do 100 ml ddH2O. Doprowadzić pH do 7,4 w 4 °C. Przefiltrować i wysterylizować za pomocą filtra o wielkości porów 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    2. Przygotować 100 ml 35% roztworu sacharozy w 3 mM imidazolu, pH 7,4. Rozpuścić mieszając 40,6 g sacharozy w ddH2O. Dodać 1 ml 300 ml roztworu podstawowego imidazolu i napełnić do 100 ml ddH2O. Doprowadzić pH do 7,4 w temperaturze 4 °C. Filtrować-sterylizować za pomocą filtra o wielkości porów 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    3. Przygotuj 50 ml 39% sacharozy w 3 mM imidazolu, pH 7,4. Rozcieńczyć 62% roztwór sacharozy 35% roztworem sacharozy. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  5. Rozpuścić 3 g paraformaldehydu (PFA) mieszając w 100 ml PBS podgrzanego do temperatury 60 °C, dodając kroplami 1 M NaOH; dostosować końcowe pH do 7,4 za pomocą NaOH. Sterylizować filtrem za pomocą filtra o wielkości porów 0,22 μm i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    UWAGA: 3% PFA jest odczynnikiem toksycznym.
  6. Przygotować 1 M roztwór podstawowy KCl. Rozpuścić 3,73 g KCl, mieszając z 50 ml ddH2O. Filtrować-sterylizować za pomocą filtra o wielkości porów 0,22 μm i przechowywać w temperaturze pokojowej.
  7. Przygotować 50X stężony roztwór podstawowy zawierający 0,625 M Hepes o pH 7,0 i 75 mM MgOAc2 w ddH2O. Podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  8. Przygotuj podłoże montażowe. Wymieszać mieszając 2,4 g poli(alkoholu winylowego) Mw ~31 000 (PVA) z 6 g glicerolu. Dodać 6 ml ddH2O i pozostawić na co najmniej 2 godziny w temperaturze pokojowej. Dodać 12 ml 0,2 M Tris-Cl (pH 8,5) i podgrzać do temperatury około 53 °C, od czasu do czasu mieszając, aż PVA się rozpuści.
  9. Klarować roztwór przez odwirowanie przy 5 000 x g przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Zebrać supernatant i dodać 2,5% (w/v) 1,4-diazabicyklo-[2.2.2]oktanu (DABCO), aby zapobiec fotowybielaniu podczas wykrywania fluorescencji. Wiruj przez około 30 sekund, aby się rozpuścić. Rozlać do plastikowych probówek o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C.

2. Hodowla komórkowa

  1. Hodowla komórek HeLa w zmodyfikowanym pożywce Eagle firmy Dulbecco uzupełniona 10% płodową surowicą cielęcą, 10% aminokwasami endogennymi, 10% L-glutaminą i 1% penicyliną-streptomycyną. Utrzymywać je w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5%CO2.
  2. Przetransfekuj komórki na 24 godziny przed eksperymentem za pomocą GFP-RAB510, używając dostępnego w handlu odczynnika do transfekcji zgodnie z instrukcjami producenta.
  3. W razie potrzeby przygotuj frakcje endosomalne i cytozol z komórek pozbawionych białka będącego przedmiotem zainteresowania (tj. przy użyciu RNAi lub CRISPR/Cas9) i/lub z nadekspresją dzikiego lub zmutowanego białka będącego przedmiotem zainteresowania.

3. Przygotowanie frakcji endosomalnej

UWAGA: Ten protokół opisuje proste przygotowanie subkomórkowych frakcji zawierających endosomy i inne błony świetlne. W razie potrzeby można również użyć oczyszczonych frakcji endosomów11. Przygotować 2 szalki Petriego (10 cm średnicy zewnętrznej; 57 cm2) ze zlewających się komórek eksprymujących GFP-RAB5 jako materiał wyjściowy. Całkowita liczba zlewających się komórek HeLa w 2 szalkach Petriego odpowiada w przybliżeniu 2,5 x 107 komórek. W razie potrzeby endosomy można również przygotować z komórek pozbawionych białka będącego przedmiotem zainteresowania (tj. przy użyciu RNAi lub CRISPR/Cas9) i/lub z nadekspresją dzikiego lub zmutowanego białka będącego przedmiotem zainteresowania, zawsze wykazującego ekspresję GFP-RAB5.

UWAGA: Wszystkie kroki protokołu frakcjonowania powinny być wykonywane na lodzie.

  1. Umieść szalki Petriego na mokrym metalowym talerzu w płaskim wiaderku z lodem i natychmiast umyj komórki dwukrotnie 5 ml lodowatego PBS-.
  2. Usuń wszystkie PBS z ostatniego prania i dodaj 3 ml lodowatego PBS - na naczynie. Komórki nie powinny wysychać podczas przenoszenia: w razie potrzeby umieść wiaderko z lodem na bujanej platformie, aby odpowiednio pokryć komórki płynem.
  3. Mechanicznie usuń komórki w PBS z szalek Petriego za pomocą elastycznego gumowego policjanta (tj. domowego skrobaka do komórek). Najpierw zeskrob komórki z naczyń szybkimi, okrężnymi ruchami wokół zewnętrznej strony naczynia, a następnie ruchem w dół na środku naczynia. Delikatnie zeskrob, aby uzyskać "arkusze" przyczepionych komórek. Delikatnie przenieś komórki za pomocą plastikowej pipety Pasteura z szerokim otworem do stożkowej probówki polipropylenowej o pojemności 15 ml na lodzie.
  4. Wirować przez 5 minut w temperaturze 175 x g i temperaturze 4 °C.
  5. Delikatnie usunąć supernatant (SN) i dodać 1 - 3 ml HB do granulki. Używając plastikowej pipety Pasteura z szerokim otworem, delikatnie pipetuj raz w górę i w dół, aby ponownie zawiesić komórki.
  6. Wirować przez 7 - 10 minut w temperaturze 1 355 x g i temperaturze 4 °C. Delikatnie wyjąć SN.
  7. Wykonaj homogenizację komórek.
    UWAGA: Warunki powinny być łagodne, aby błony plazmatyczne komórek zostały przerwane, ale endosomy pozostały nienaruszone.
    1. Dodać znaną objętość HB z inhibitorami proteazy do każdej osadki komórkowej (około 100 μl na osad komórkowy). Za pomocą mikropipety o pojemności 1 000 μl delikatnie pipetuj w górę i w dół, aż komórki zostaną ponownie zawieszone. Nie wprowadzaj pęcherzyków powietrza.
    2. Przygotować strzykawkę tuberkulinową o pojemności 1 ml z igłą 22G, wstępnie przepłukaną HB i pozbawioną powietrza i pęcherzyków powietrza.
    3. Napełnij strzykawkę zawiesiną komórek stosunkowo powoli (aby uniknąć tworzenia pęcherzyków powietrza), przyłóż ściętą końcówkę igły do ścianki rurki i szybko wydal zawiesinę komórkową, aby odciąć błony plazmatyczne przyłączonych komórek.
    4. Pobrać małą porcję homogenatu (około 3 μl) i rozcieńczyć ją do 50 μl HB na szkiełku podstawowym. Wymieszaj i przykryj szklanym szkiełkiem nakrywkowym. Zbadać homogenat pod mikroskopem z kontrastem fazowym wyposażonym w obiektyw 20x lub 40x.
      UWAGA: W optymalnych warunkach większość komórek jest uszkodzona, ale jądra, które wyglądają jak ciemnoszare i okrągłe struktury, nie są (Ryc. 1).
    5. Powtarzaj kroki 3.7.3 i 3.7.4, aż większość komórek zostanie złamana; zwykle konieczne jest wykonanie 3 - 6 ruchów igłą w górę i w dół. Zachować małą porcję (10 - 30 μl) homogenatu do oznaczania białka.
  8. Odwirować homogenat przez 7 minut w temperaturze 1 355 x g i temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Po odwirowaniu osad (zdefiniowany jako pastylka jądrowa; NP) zawiera jądra i supernatant (zdefiniowany jako supernatant postjądrowy; PNS) zawiera cytozol i organelle uwalniane podczas homogenizacji i w wolnej zawiesinie.
  9. Ostrożnie zbierz PNS. Zachować małe porcje (10–30 μl) PNS i NP do oznaczania białka i wyrzucić NP.
  10. Dostosuj PNS do 40,6% sacharozy, rozcieńczając 62% roztwór sacharozy z PNS, stosując stosunek 1:1,1 PNS:62% sacharozy. Wymieszaj delikatnie, ale dokładnie, nie tworząc pęcherzyków powietrza. Sprawdź stężenie sacharozy za pomocą refraktometru.
  11. Umieścić PNS w 40,6% sacharozie na dnie probówki do ultrawirówki. Ostrożnie zalać 2,5 ml 35% roztworu sacharozy i napełnić probówkę wirówkową HB.
    UWAGA: Roztwory sacharozy należy układać warstwami tak, aby interfejsy były wyraźnie widoczne.
  12. Ultraodwirować gradienty przez 1 godzinę przy ̴165 000 x g i 4 °C.
  13. Ostrożnie usuń białą warstwę lipidów na wierzchu gradientu. Następnie zebrać granicę faz zawierającą endosomy, między HB a 35% sacharozy, za pomocą mikropipety o pojemności 200 μl z odciętą końcówką.
    UWAGA: Frakcje endosomalne mogą być stosowane bezpośrednio w teście polimeryzacji aktynowej in vitro lub mogą być porcjowane na lodzie, zamrażane w ciekłym azocie i przechowywane w temperaturze -80 °C.
  14. Określić stężenie białka w PNS i frakcjach endosomalnych.
    UWAGA: Stężenie to powinno wynosić co najmniej 100 μg/ml. Do uzyskania PNS o stężeniu co najmniej 100 μg/ml (patrz uwaga powyżej) potrzeba około 2,5 x 107 komórek wyhodowanych na 2 szalkach Petriego.

4. Przygotowanie cytozolu

UWAGA: Przygotuj 2 szalki Petriego (10 cm średnicy; 57 cm2) z konflujących się komórek HeLa jako materiał wyjściowy. W razie potrzeby cytozol można również przygotować z komórek pozbawionych białka będącego przedmiotem zainteresowania (tj. przy użyciu RNAi lub CRISPR/Cas9) i/lub wykazujących nadekspresję typu dzikiego lub zmutowanej formy białka będącego przedmiotem zainteresowania. Jeśli chodzi o protokół frakcjonowania endosomów, wszystkie kroki należy wykonywać na lodzie.

  1. Powtórz kroki 3.1 - 3.8.
  2. Umieścić PNS w probówce wirówkowej i ultrawirować przez 45 minut w temperaturze ̴250 000 x g i temperaturze 4 °C.
  3. Ostrożnie usuń białą warstwę na wierzchu i zbierz SN (frakcję cytozolu), nie naruszając osadu mikrosomowego. Zachować podwielokrotność frakcji cytozolu do oznaczania białka.
    UWAGA: Cytozol może być stosowany bezpośrednio w teście polimeryzacji aktyny in vitro lub może być podawany na lód, zamrażany w ciekłym azocie i przechowywany w temperaturze -80 °C.
  4. Określ stężenie białka w cytozolu.
    UWAGA: Powinno to być co najmniej 3 mg/ml.

5. Test mierzący polimeryzację aktynową zależną od endosomów in vitro

UWAGA: Polimeryzacja aktyny zależna od endosomów może być przeprowadzona przy użyciu dwóch alternatywnych podejść. W pierwszym podejściu materiały są mieszane w probówce, utrwalane i przenoszone na szkiełko nakrywkowe i analizowane. W drugim podejściu, opisanym tutaj, test można przeprowadzić bezpośrednio w komorze obrazowania i można go ustalić i przeanalizować bez zakłóceń mechanicznych (rysunek 2C). W tym drugim podejściu mieszanina testowa nie jest przenoszona z probówki do szkiełka nakrywkowego, a zatem pozostaje niezakłócona, co zmniejsza niebezpieczeństwo fizycznego zakłócenia sieci F-aktyny podczas przenoszenia. Ponadto to drugie podejście jest zgodne z analizą poklatkową polimeryzacji F-aktyny. Należy zauważyć, że nie zaobserwowano różnicy w analizie polimeryzacji F-aktyny przy żadnym z podejść.
UWAGA: Używaj końcówek do cięcia w całym protokole.

  1. W probówce
    1. Delikatnie wymieszaj lodowato oczyszczone endosomy GFP-RAB5 (krok 3) z cytozolem (krok 4) w stosunku 1:10 (stężenie białka) w lodowatej stożkowej probówce o pojemności 1,5 ml.
      UWAGA: Typowy eksperyment przeprowadza się z około 40 - 50 μL.
    2. Dostosuj lodowatą mieszaninę reakcyjną do końcowych stężeń 125 mM KCl (przy użyciu 1 M roztworu podstawowego KCl), 12,5 mM Hepes i 1,5 mM MgOAc2 (przy użyciu 50-krotnego roztworu podstawowego). Następnie dostosuj mieszaninę z inhibitorami proteazy do końcowych stężeń 10 mM leupeptyny, 1 mM pepstatyny A i 10 ng/ml aprotyniny. Delikatnie wymieszaj wszystkie składniki.
    3. Umieścić probówkę zawierającą mieszaninę reakcyjną w temperaturze 37 °C, bez wstrząsania, i inkubować przez żądany czas.
      UWAGA: Zazwyczaj potrzeba około 3 minut na wykrycie polimeryzacji aktyny na endosomach i 30 minut na utworzenie rozległej sieci.
    4. W żądanym czasie (tj. 3 minuty lub 30 minut) zatrzymaj reakcję, umieszczając probówkę na lodzie i dodaj 1/10 (vol:vol) wstępnie schłodzonego 3% roztworu PFA.
    5. Dodaj 0,3:10 (vol:vol) 200 jednostek/ml (~6,6 μM) falloidyny sprzężonej z czerwono-pomarańczowym barwnikiem, aby zabarwić spolimeryzowaną aktynę.
    6. Umieścić 12 μl mieszaniny na 12 μl podłoża montażowego PVA na szkiełku podstawowym z mikroszkła. Połóż szklaną nakrywkę o wymiarach 18 x 18 mm2 na wierzchu.
    7. Przeanalizować próbkę za pomocą mikroskopii konfokalnej.
  2. W komorze obrazowania
    1. Aby wykonać mikroskopijne komory obrazowe, należy użyć środka do czyszczenia plazmowego przez 1 minutę, aby wyczyścić okrągłe szkiełko nakrywkowe o średnicy 18 mm oraz okrągłą szalkę Petriego o średnicy 35 mm wyposażoną w szklane dno o średnicy 20 mm (0,16-0,19 mm).
    2. Inkubować oczyszczone powierzchnie z 1% β-kazeiną przez 20 minut, aby zminimalizować wiązanie białek ze szkłem. Umyć dwukrotnie 3 mM imidazolu.
    3. Dodać endosom i cytozol w tej samej mieszaninie testowej, co w krokach 5.1.1 i 5.1.2, do wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 1,5 ml i uzupełnić mieszaninę testową 0,1 μg/μl rodaminy-aktyny.
    4. Dostosować końcowy współczynnik załamania światła mieszaniny do 1,375 (26,5% sacharozy) przy użyciu 39% roztworu sacharozy.
      UWAGA: Zazwyczaj dodawany jest ten sam wolumin; Musi to jednak zostać empirycznie ponownie skorygowane w zależności od stężenia sacharozy w pobranej frakcji, oznaczonego za pomocą refraktomeru, ponieważ stężenie sacharozy może się nieznacznie zmieniać w zależności od eksperymentu.
    5. Umieścić mieszaninę na wstępnie poddanej obrobionej szalce o średnicy 35 mm (krok 5.2.1) i przykryć ją wstępnie przygotowanym szkiełkiem nakrywkowym o średnicy 18 mm (krok 5.2.1).
    6. Umieścić komorę w temperaturze 37 °C, nie wstrząsając.
    7. Przeanalizować próbkę za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii konfokalnej.

6. Akwizycja i analiza obrazu sieci aktynowej

  1. Akwizycja obrazu
    1. Uzyskaj obrazy za pomocą odwróconego skaningowego mikroskopu konfokalnego.
      UWAGA: Ustawienia akwizycji obrazu zostały zoptymalizowane pod kątem odwróconego skaningowego mikroskopu konfokalnego z obiektywem olejowym 63X 1,25 NA. Dostosuj moc lasera (zwykle około 50%), aby uzyskać dobry stosunek sygnału do szumu.
  2. Kwantyfikacja sieci aktynowej
    1. Przeanalizuj mikrofotografie fluorescencyjne. Użyj oprogramowania open source CellProfiler (v2.1.1)12, aby zmierzyć ilość aktyny na endosom (można użyć alternatywnego oprogramowania).
      1. Najpierw zidentyfikuj endosomy jako główny obiekt za pomocą sygnału GFP-RAB5. Następnie określ ilościowo F-aktynę związaną z poszczególnymi endosomami, wykorzystując propagację sygnału aktyny (czerwono-pomarańczowy barwnik sprzężony z falloidyną) jako obiekt wtórny.
      2. Uśrednij i znormalizuj liczbę materiału skojarzonego dla każdego obiektu z warunkiem kontrolnym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby uzyskać wgląd w proces formowania się łatek F-aktyny na błonach wczesnych endosomów, postępowaliśmy zgodnie z protokołem opisanym w Rycina 2W skrócie, komórki poddano transfekcji GFP-RAB5, a następnie przygotowano wczesne endosomy metodą frakcjonowania subkomórkowego. Oczyszczone wczesne endosomy inkubowano z cytozolem, aby dostarczyć aktynę oraz inne czynniki, które mogą uczestniczyć w reakcji. Po zakończeniu okresu inkubacji reakcję zatrzymano poprzez u...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Aktyna odgrywa kluczową rolę w dynamice błony endosomów 4,14. Wcześniej informowaliśmy, że zarodkowanie i polimeryzacja aktyny zachodzą na wczesnych endosomach, tworząc małe plamy lub sieci F-aktyny. Te sieci F-aktyny są absolutnie niezbędne do transportu błonowego poza wczesne endosomy wzdłuż szlaku degradacji. Ingerencja na dowolnym etapie tego procesu zarodkowania i polimeryzacji zapobiega dojrzewaniu endosomów, a tym samym dalszemu transportowi w kierunku

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Otrzymano wsparcie od Szwajcarskiej Narodowej Fundacji Nauki, szwajcarskiego programu Sinergia, Polsko-Szwajcarskiego Programu Badawczego (PSPB-094/2010), NCCR w Biologii Chemicznej oraz LipidX z inicjatywy Swiss SystemsX.ch, ocenionej przez Szwajcarską Narodową Fundację Nauki (do J. G.). O. M. był wspierany przez długoterminowe stypendium EMBO (ALTF-516-2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
NaClSigma-Aldrich71380
KClAcros Organics196770010
KH2PO4AppliChemA1042
Na2HPO4Acros Organics424370025
HepesAppliChemA3724
Octan magnezuny czterowodnyFluka63047
Ditiotreitol (DTT)AppliChemA2948
ImidazolSigma-Aldrich10125
NaOHFluka71690
SacharozaMerck Millipore107687
LeupeptynaRoche11017101001
PepstatynaRoche10253286001
AprotininRoche10236624001
ParaformaldehidePolysciences. Inc380
Alexa Fluor 555Sondy molekularneA34055
aktyny rodaminy. IncAPHR-A
Mowiol 4-88Sigma-Aldrich81381poli(alkohol winylowy), Mw ~31 000
DABCOSigma-AldrichD-2522
Tris-HClAppliChemA1086
β-kazeinaSigma-AldrichC6905
Filtr 0,22 μ mMillexSL6V033RS
Okrągłe 10 cm szalki do hodowli komórkowychThermo Fisher Scientific150350
Plastikowa pipeta PasteuraAssistent569/3 40569003
15-mL probówka polipropylenowaTPP91015
Igła podskórna 22G 30mmBD Microlance300900
Sterylne strzykawki Luer-slip 1mL bez igłaBD Plastipak300013
Szkiełka MicroAssistent2406
18 x 18 mm szkiełko nakrywkoweszklane Assistent1000/1818
SW60 probówka wirówkowaBeckman 344062
wirówkowa TLS-55Redlica Beckman343778
200-μ L żółta końcówkaStarlabS1111-0706
1,000-μ L Niebieska końcówka z podziałką StarlabS1111-6801
1,5 ml probówkaAxygenMCT-175-C 311-04-051
Szkiełko nakrywkowe okrągłe o średnicy 18 mmAssistent1001/18
Okrągłe naczynie o średnicy 35 mm ze szklanym dnem 20 mm (0,16 - 0,19 mm)Refraktometr In vitro ScientificD35-20-1,5-N
Carl Zeiss79729
Myjka plazmowaHarrick PlasmaPDC-32G
Sorvall WX80 UltrawirówkaThermo Fisher Scientific46900
Ultrawirówka stołowaRedlica BeckmanTL-100
SW60Rotor Redlica Beckman335649
TLS-55Rotor Redlica Beckman346936
Mikroskopia konfokalnaCarl OdczynnikLSM-780
Fugene HDPromegaE2311
Odczynnik do oznaczania białek ABio-Rad500-0113
Odczynnik do oznaczania białek BBio-Rad500-0114
Odczynnik do oznaczania białek SBio-Rad500-0115
Skrobak do komórekdomowej robotyKawałek gumy silikonowej o długości około 2 cm, przycięty pod bardzo ostrym kątem i przymocowany do metalowego pręta lub przytrzymany kleszczami
RefraktometrCarl Zeiss
Minimum Essential Medium Eagle (MEM)Sigma-AldrichM0643
FCSThermo Fisher Scientific10270-106
MEM Aminokwasy endogenne (NEAA)Thermo Fisher Scientific11140-035
L-glutaminaThermo Fisher Scientific25030-024
Penicylina-StreptomycynaThermo Fisher Scientific15140-122
pH-metr 691Metrohm
ImageJ oprogramowanieNIH, Bethesda MD
falloidyny Cytoszkielet rurka do transfekcji Zeiss

Bibliografia

  1. Huotari, J., Helenius, A. Endosome maturation. EMBO J. 30 (17), 3481-3500 (2011).
  2. Scott, C. C., Vacca, F., Gruenberg, J. Endosome Maturation, Transport and Functions. Semin. Cell Dev Biol. 31, 2-10 (2014).
  3. Puthenveedu, M. A., et al. Sequence-dependent sorting of recycling proteins by actin-stabilized endosomal microdomains. Cell. 143 (5), 761-773 (2010).
  4. Seaman, M. N., Gautreau, A., Billadeau, D. D. Retromer-mediated endosomal protein sorting: all WASHed up! Trends Cell Biol. 23 (11), 522-528 (2013).
  5. Burd, C., Cullen, P. J. Retromer: a master conductor of endosome sorting. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (2), a016774(2014).
  6. Woodman, P. G., Futter, C. E. Multivesicular bodies: co-ordinated progression to maturity. Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 408-414 (2008).
  7. Henne, W. M., Buchkovich, N. J., Emr, S. D. The ESCRT pathway. Dev Cell. 21 (1), 77-91 (2011).
  8. Morel, E., Gruenberg, J. Annexin A2 binding to endosomes and functions in endosomal transport are regulated by tyrosine 23 phosphorylation. J Biol Chem. 284 (3), 1604-1611 (2009).
  9. Muriel, O., Tomas, A., Scott, C. C., Gruenberg, J. Moesin and cortactin control actin-dependent multivesicular endosome biogenesis. Mol Biol Cell. 27 (21), 3305-3316 (2016).
  10. Sonnichsen, B., De Renzis, S., Nielsen, E., Rietdorf, J., Zerial, M. Distinct membrane domains on endosomes in the recycling pathway visualized by multicolor imaging of Rab4, Rab5, and Rab11. J Cell Biol. 149 (4), 901-914 (2000).
  11. Morel, E., Parton, R. G., Gruenberg, J. Annexin A2-dependent polymerization of actin mediates endosome biogenesis. Dev Cell. 16 (3), 445-457 (2009).
  12. Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).
  13. Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).
  14. Granger, E., McNee, G., Allan, V., Woodman, P. The role of the cytoskeleton and molecular motors in endosomal dynamics. Semin Cell Dev Biol. 31, 20-29 (2014).
  15. Mayran, N., Parton, R. G., Gruenberg, J. Annexin II regulates multivesicular endosome biogenesis in the degradation pathway of animal cells. EMBO J. 22 (13), 3242-3253 (2003).
  16. Gorvel, J. P., Chavrier, P., Zerial, M., Gruenberg, J. rab5 controls early endosome fusion in vitro. Cell. 64 (5), 915-925 (1991).
  17. Wandinger-Ness, A., Zerial, M. Rab proteins and the compartmentalization of the endosomal system. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (11), a022616(2014).
  18. Balch, W. E., Glick, B. S., Rothman, J. E. Sequential intermediates in the pathway of intercompartmental transport in a cell-free system. Cell. 39 (3 Pt 2), 525-536 (1984).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Polimeryzacja F-aktynybadanie in vitromikroskopia fluorescencyjnagradient sacharozowyfrakcja cytozolowafrakcja endosomalnanukleacja aktynybarwienie faloidynąmikroskopia konfokalna
In vitro Polimeryzacja F-aktyny na wczesnych endosomach
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.