Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

In vitro Test bioluminescencji w celu scharakteryzowania rytmu okołodobowego w komórkach nabłonka sutka

9.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55832

⸱

28 września 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Environmental and Occupational Health, School of Public Health, NIEHS Center for Environmental Exposures and Disease, Environmental and Occupational Health Sciences Institute, Rutgers University, 2Veterinary Drugs & Biologics Division, Animal and Plant Quarantine Agency

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiono test bioluminescencji in vitro w celu określenia komórkowego rytmu dobowego w komórkach nabłonka sutka. Metoda ta wykorzystuje plazmidy reporterowe komórek ssaków eksprymujące zdestabilizowaną lucyferazy pod kontrolą promotora genu PERIOD 2. Można go dostosować do innych typów komórek w celu oceny specyficznego dla narządu wpływu na rytm okołodobowy.

Streszczenie

Rytm okołodobowy jest podstawowym procesem fizjologicznym obecnym we wszystkich organizmach, który reguluje procesy biologiczne, począwszy od ekspresji genów, a skończywszy na zachowaniu podczas snu. U kręgowców rytm okołodobowy jest kontrolowany przez oscylator molekularny, który działa zarówno w jądrze nadskrzyżowaniowym (SCN; centralny rozrusznik serca), jak i w pojedynczych komórkach składających się z większości tkanek obwodowych. Co ważniejsze, zakłócenie rytmu okołodobowego przez ekspozycję na światło w nocy, stresory środowiskowe i/lub toksyny wiąże się ze zwiększonym ryzykiem chorób przewlekłych i starzenia się. Zdolność do identyfikacji czynników, które mogą zakłócać centralny i/lub obwodowy zegar biologiczny oraz czynników, które mogą zapobiegać lub łagodzić skutki zaburzeń okołodobowych, ma istotne implikacje dla zapobiegania chorobom przewlekłym. Chociaż modele gryzoni mogą być wykorzystywane do identyfikacji ekspozycji i czynników, które wywołują lub zapobiegają/łagodzą zakłócenia okołodobowe, eksperymenty te wymagają dużej liczby zwierząt. Badania in vivo wymagają również znacznych zasobów i infrastruktury, a także wymagają od badaczy pracy przez całą noc. W związku z tym istnieje pilna potrzeba stworzenia systemu in vitro odpowiedniego dla danego typu komórek do badań przesiewowych pod kątem środowiskowych substancji zaburzających i wzmacniających rytm dobowy w typach komórek pochodzących z różnych narządów i stanów chorobowych. Skonstruowaliśmy wektor, który steruje transkrypcją zdestabilizowanej lucyferazy w komórkach eukariotycznych pod kontrolą ludzkiego promotora genu PERIOD 2. Ten okołodobowy konstrukt reporterowy został stabilnie transfekowany do ludzkich komórek nabłonka sutka, a komórki reporterowe reagujące okołodobowo zostały wybrane do opracowania testu bioluminescencji in vitro. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół do ustalenia i walidacji testu. Ponadto podajemy szczegóły dotyczące eksperymentów potwierdzających słuszność koncepcji, demonstrujących zdolność naszego testu in vitro do podsumowania wpływu in vivo różnych substancji chemicznych na komórkowy zegar biologiczny. Wyniki wskazują, że test można dostosować do różnych typów komórek w celu wykrycia zarówno substancji zaburzających środowisko, jak i chemoprewencyjnych wzmacniaczy zegarów okołodobowych.

Wprowadzenie

Zegar okołodobowy reguluje szeroki zakres procesów biologicznych, od dziennej ekspresji genów po zachowanie podczas snu w przewidywalnym rytmie z częstotliwością około 24 godzin. Badania epidemiologiczne zdecydowanie sugerują, że przewlekłe zaburzenie rytmu okołodobowego zwiększa ryzyko raka piersi i prostaty u pracowników zmianowych, w tym pielęgniarek i załóg lotniczych1, 2,3. Wyniki te są potwierdzone badaniami na gryzoniach, wykazując, że ekspozycja na stałe światło, światło w nocy lub cykle świetlne, które naśladują jet-lag, zwiększają częstość występowania guza i przyspieszają jego wzrost4,5. Na podstawie danych z badań na ludziach i gryzoniach, Międzynarodowa Agencja Badań nad Rakiem sklasyfikowała pracę zmianową jako prawdopodobny czynnik rakotwórczy dla ludzi (typ 2A) w 20106.

Poprzednio wykazaliśmy, że pojedyncza rakotwórcza dawka specyficznego dla guza sutka, N-nitrozo-N-metylomocznika (NMU), zakłóciła dobową ekspresję głównych genów okołodobowych (CG) (np. Okres 2, Per2) i kilku genów kontrolowanych okołodobowo (CCG), w tym kluczowych genów reagujących i naprawiających uszkodzenia DNA (DDRR) w docelowym gruczole sutkowym (ale nie w wątrobie). Co więcej, zresetowanie okołodobowej ekspresji zarówno genów Per2, jak i DDRR do normy za pomocą chemoprewencyjnego schematu L-metylo-selenocysteiny (MSC) zmniejszyło częstość występowania nowotworu o 63%. Odkrycia te były pierwszymi, które wykazały mechanistyczny związek między rytmem okołodobowym, chemiczną kancerogenezą i chemoprewencją7,8. Narażenie na inne toksyny środowiskowe, które zaburzają okołodobową ekspresję genów in vivo, wiąże się również ze zwiększonym ryzykiem chorób środowiskowych9,10. Zrozumienie mechanizmów, które łączą zakłócenia okołodobowe spowodowane przez toksyny środowiskowe i patogenezę, może doprowadzić do opracowania mechanistycznego podejścia do zapobiegania chorobom. Jednak badania mające na celu określenie interakcji między ekspozycją a rytmem okołodobowym są zwykle przeprowadzane in vivo. Typowe doświadczenie in vivo badające wpływ na rytm okołodobowy wymaga dużej liczby zwierząt, ponieważ tkanki od co najmniej trzech zwierząt kontrolnych i trzech narażonych muszą być pobierane co 3-4 godziny przez okres 24 lub 48 godzin. Opracowanie zwalidowanego systemu in vitro, który podsumowuje obserwacje i mechanizmy in vivo, nie tylko zmniejszyłoby zatem liczbę potrzebnych zwierząt, ale także radykalnie zmniejszyłoby koszty eksperymentalne i wymóg ciągłej pracy naukowców przez okres 24-48 godzin. Co więcej, zwalidowany system in vitro może zostać wykorzystany do wysokoprzepustowych badań przesiewowych pod kątem związków i/lub zmian genetycznych, które wpływają na rytm okołodobowy lub jego reakcję na stresory środowiskowe lub substancje toksyczne. W związku z tym potrzebne jest strategiczne połączenie modeli i eksperymentów in vitro i in vivo, aby uzyskać różne spostrzeżenia o różnym ukierunkowaniu.

U ssaków oscylatory okołodobowe występują nie tylko w wyspecjalizowanych neuronach SCN, ale także w większości typów komórek obwodowych. Te zegary molekularne są podobne do tych w ustalonych liniach komórkowych fibroblastów oraz w pierwotnych fibroblastach z zarodków lub dorosłych zwierząt; Istnieje jednak zapotrzebowanie na modele komórkowe specyficzne dla typu tkanki11. W związku z tym tradycyjne badania aktywności lokomotorycznej in vivo, eksplantaty SCN ex vivo oraz testy in vitro oparte na komórkach w unieśmiertelnionych komórkach fibroblastów są szeroko stosowane do badania autonomicznych komórek defektów okołodobowych. Nie ma jednak dowodów wskazujących na to, że test in vitro oparty na komórkach fibroblastów może podsumować mechanizmy okołodobowe i reakcje obecne w komórkach innych narządów obwodowych in vivo. Różne typy komórek mogą mieć różne wzorce ekspresji genów, metabolizmu ksenobiotyków i DDRR, a powiązania między toksycznością a ekspresją genów okołodobowych mogą być specyficzne dla typu komórki i/lub modulowane przez różne parametry fizjologiczne. Ponadto oscylatory okołodobowe w systemach opartych na fibroblastach nie zostały w pełni ocenione pod kątem reakcji na toksyny środowiskowe, stresory i czynniki zapobiegawcze, które łączą narażenie z mechanizmami rozwoju choroby i zapobiegania. W związku z tym istnieje potrzeba przeprowadzenia łatwych, zwalidowanych, specyficznych dla typu komórki testów bioluminescencyjnych in vitro w celu zbadania specyficznych dla narządów środowiskowych zaburzeń okołodobowych. Chociaż w ostatnich latach opracowano różne modele zegara komórkowego (np. w wątrobie, keratynocytach i komórkach tłuszczowych, a także w linii komórkowej kostniakomięsaka), 12,13,14,15, opisany tutaj test jest pierwszym modelem zegara komórkowego w komórkach nabłonka piersi i pierwszą demonstracją podsumowującą in vivo reakcje na stresory środowiskowe, toksyny, leki i środki chemoprewencyjne.

Lucyferazy Renilla (rLuc) i lucyferazy świetlika to białka monomeryczne o masie 30-61 kDa, które nie wymagają przetwarzania potranslacyjnego dla aktywności enzymatycznej i mogą funkcjonować jako reporter genetyczny natychmiast po translacji. Gdy substrat połączy się z enzymem lucyferazy, katalizowana reakcja biochemiczna generuje błysk światła. Tak więc konstrukty lucyferazy są szeroko stosowane jako system reporterowy ekspresji genów in vitro i in vivo. Jednak w badaniach rytmu okołodobowego użyteczność reportera lucyferazy jest ograniczona przez stosunkowo długi okres półtrwania białka lucyferazy (T1/2 = 3,68 h) w stosunku do okresu (zwłaszcza do krótkiego okresu) dla zmian w okołodobowej ekspresji genów; jednak liczne badania na przestrzeni lat z powodzeniem wykorzystały gen lucyferazy w wektorze pGL3, co wskazuje, że szybko degradowalna lucyferazy może nie być konieczna do zgłaszania rytmów okołodobowych, zwłaszcza w przypadku rytmów o dłuższym okresie, takich jak 24 godziny. W związku z tym opracowano plazmid reporterowy wykorzystujący zdestabilizowany wektor lucyferazy, pGL [Luc2P / Neo], który zawiera hPEST (sekwencję destabilizacji białka), co pozwala nam użyć go jako okołodobowego wektora reporterowego dla naszego obecnego testu bioluminescencji in vitro. Białko kodowane przez Luc2P ma znacznie krótszy okres półtrwania (T1/2 = 0,84 h), a zatem reaguje szybciej i z większą wielkością na zmiany aktywności transkrypcyjnej niż białko typu dzikiego, co wskazuje, że można je wykorzystać do monitorowania rytmicznej ekspresji lucyferazy regulowanej przez promotor PER2 dokładnie w czasie rzeczywistym16.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Budowa zdestabilizowanego wektora reportera lucyferazy napędzanej przez promotor PER2

  1. Kup niestandardowy wektor pLS[hPER2P/rLuc/Puro], który zawiera kodujący cDNA rLuc i ludzki fragment promotora PER2 (hPER2P, 941 bp) w miejscu między Sac I i Hind III w regionie klonowania wielokrotnego17.
  2. Wyciąć ludzki fragment promotora PER2 (hPER2P, 941 pz) z wektora.
    1. Dodać 2,5 μl buforu enzymu restrykcyjnego, 10 μl (180 ng) wektora pLS[hPER2P/rLuc/Puro] i po 1 μl każdego z enzymów restrykcyjnych, Sac I (10 jednostek/μl) i Hind III (10 jednostek/μl), do probówki mikrowirówkowej wolnej od DNA/RNA/nukleotydów. Dodać ultraczystą wodę (10,5 μl) do 25 μl i delikatnie wymieszać pipetując.
    2. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 90 minut w bloku grzewczym.
    3. Uruchomić całą objętość (25 μl) reakcji enzymu restrykcyjnego na 0,7% żelu agarozowym zawierającym 0,0001% bromku etydyny (EtBr), aby oddzielić hPER2P od wektora.
      UWAGA: EtBr, bromek 3,8-diamino-1-etylo-6-fenylofenantrydyniowy (numer rejestracyjny CAS: 1239-45-8), jest bezwonną czerwoną cieczą. Jest to środek interkalacyjny, który jest powszechnie stosowany jako znacznik fluorescencyjny (barwienie kwasem nukleinowym) w elektroforezie żelu agarozowego i widoczny jako pomarańczowy kolor w świetle UV. Możliwe ryzyko nieodwracalnych skutków mutagennych wystąpiło u zwierząt doświadczalnych, chociaż żadna z agencji regulacyjnych nie sklasyfikowała go jako czynnika rakotwórczego18. W związku z tym zebraliśmy zużyty żel agarozowy i bufor do elektroforezy zawierający EtBr jako odpady stanowiące zagrożenie chemiczne i poprosiliśmy Rutgers Environmental Health & Safety (REHS) o odbiór i bezpieczną utylizację.
    4. Wyciąć kawałek żelu agarozowego zawierającego pasmo fluorescencji EtBr przy 941 pz i oczyścić fragmenty hPER2P z żelu za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu DNA, a następnie dokonać kwantyfikacji na spektrofotometrze, mierząc gęstość absorpcji (OD) przy długości fali 260 nm.
  3. Zlinearyzuj 1,0 μl (1 μg) zdestabilizowanego wektora ekspresji lucyferazy świetlika, pGL[Luc2P/Neo] tą samą metodą, jak opisano w krokach 1.2.1-1.2.2. Ekstrahować wektor za pomocą zestawu do oczyszczania DNA, a następnie dokonać kwantyfikacji, jak opisano powyżej, przy użyciu spektrofotometru.
  4. Zliguj hPER2P do zlinearyzowanego wektora pGL[Luc2P/Neo].
    UWAGA: Zgodnie z instrukcją producenta, idealny stosunek molowy wkładki i wektora wynosi 2:1. Dla wektora 50 ng idealna ilość wstawki jest obliczana jako 23,6 ng za pomocą wzoru: [(50 ng wektor x 1,0 kb wkładka)/4,242 kb wektor] x (2/1) = 23,6 ng wkładka]. Na podstawie stężeń hPER2P (7,26 ng/μL) i pGL[Luc2P/Neo] (50 ng/μL) objętości 50 ng pGL[Luc2P/Neo] i 23,6 ng hPER2P oblicza się odpowiednio jako 1 μL i 3,26 μL.
    1. Dodaj 2 μl buforu reakcyjnego ligazy DNA T4 (10X) (50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM ATP i 10 mM DTT), 3,26 μL (23,6 ng) hPER2P, 1 μL (50 ng) pGL[Luc2P/Neo] i 13,74 μl wody do 20 μL, delikatnie wymieszaj.
    2. Dodać 1 μl ligazy DNA T4 (400 jednostek/μl), delikatnie wymieszać i inkubować w temperaturze 16 °C przez noc w termocyklerze, a następnie schłodzić zligowany wektor na lodzie zgodnie z instrukcją producenta.
  5. Przekształć ligowany wektor pGL[hPer2P/Luc2P/Neo] w chemicznie kompetentny E. coli19.
    1. Ustawić łaźnię wodną na 42 °C, podgrzać bulion Super Optimal z podłożem do tłumienia katabolitu (S.O.C.) (2% tryptonu, 0,5% ekstraktu drożdżowego, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mMMgSO4 i 20 mM glukozy), rozgrzać płytkę agarową Luria-Bertani (LB) (zawierającą 100 μg/ml ampicyliny, 80 μg/ml X-gal i 0,5 μM IPTG) w inkubatorze w temperaturze 37 °C i rozmrozić na lodzie jedną fiolkę z kompetentnymi komórkami E. coli dla każdej transformacji.
    2. Dodać 6 μl (21 ng) ligowanego wektora lub 1 μl (30 ng) pustego wektora (kontrola ujemna) do jednej probówki chemicznie kompetentnej E. coli (50 μl), a następnie delikatnie obrócić probówkę do wymieszania. Inkubować na lodzie przez 30 minut.
    3. Szok termiczny w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C przez 30 s bez wstrząsania, a następnie powrót do lodu.
  6. Wybierz kolonię E. coli przekształconą za pomocą ligowanego wektora przy użyciu niebiesko-białego przesiewania.
    1. Dodać 250 μl pożywki S.O.C. do przekształconej probówki E. coli i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min.
    2. Rozprowadź równomiernie 10-50 μl przekształconej E. coli na powierzchni płytki agarowej LB. Umieść płytkę do góry nogami w inkubatorze w temperaturze 37 °C na noc.
      UWAGA: Skuteczna reakcja klonowania powinna wytworzyć kilkaset kolonii. Zaleca się posiewanie dwóch różnych objętości, aby upewnić się, że co najmniej jedna płytka będzie miała duży, wyraźny biały lub niebieski kolor i dobrze rozmieszczone kolonie. Gdy kolonie są zbyt małe, a kolor nie jest rozróżnialny, pomocne jest użycie mikroskopu (10X lub 50X).
    3. Wybierz 3-6 białych kolonii z płytek za pomocą wysterylizowanych patyczków do zębów i uwolnij każdą kolonię do jednej probówki hodowlanej zawierającej 4 ml pożywki hodowlanej LB z 50 μg/ml ampicyliny.
    4. Inkubować probówki w temperaturze 37 °C, wytrząsając je przy prędkości 200 obr./min przez noc. Wyodrębnij DNA za pomocą 2 ml 4 ml hodowanej E. coli z mini zestawem przygotowawczym do ekstrakcji plazmidowego DNA zgodnie z instrukcją producenta.
  7. Sprawdź i przeanalizuj wkładkę (hPER2P, 941 pz)
    1. Trawić plazmidowe DNA za pomocą enzymów restrykcyjnych i przeprowadzić elektroforezę zgodnie z opisem w krokach 1.2.1-1.2.3, aby potwierdzić, czy jest wstawka.
      UWAGA: Uwzględniono kontrolę pozytywną (hPER2P oczyszczoną na etapie 1.2.4) i kontrolę ujemną (E. coli przekształconą z pustym wektorem).
    2. Sekwencjonuj wybrane DNA plazmidu za pomocą starterów M13 do przodu i M13 do tyłu, aby potwierdzić orientację i sekwencję wstawiania w plazmid19.
      UWAGA: Wybrano tylko jedną kolonię, która miała wkładkę o prawidłowej wielkości hPER2P w elektroforezie oraz prawidłowej orientacji i kolejności w wyniku sekwencjonowania.
    3. Przeanalizuj sekwencję ludzkiego fragmentu promotora PER2 (hPER2P, 941 pz) pod kątem okołodobowych elementów regulatorowych, w tym motywu E-box (miejsce wiązania Bmal1, CAT / CGTG), CCAATC, pudełko GC i miejsce rozpoczęcia transkrypcji (CAGCGG) 20.
  8. Amplifikować wybraną E. coli, dodając pozostałe 2 ml kultury E. coli do 200 ml pożywki hodowlanej LB zawierającej 50 μg/ml ampicyliny, a następnie inkubując ją przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min.
  9. Wyodrębnij DNA za pomocą zestawu do przygotowania plazmidu bez endotoksyn zgodnie z instrukcją producenta, a następnie określ go ilościowo, mierząc OD przy długości fali 260 nm za pomocą spektrofotometru. Podziel i przechowuj plazmidowe DNA, pGL[hPer2P/Luc2P/Neo], w zamrażarce w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.

2. Transfekcja przejściowa

  1. Zakup i hodowla komórek MCF10A
    1. Kup unieśmiertelnioną, nieprzekształconą normalną ludzką linię komórkową nabłonka sutka (MCF10A) z komercyjnego banku komórek, gdzie komórki są testowane cytogenetycznie i uwierzytelniane za pomocą krótkiej analizy powtórzeń tandemowych przed zamrożeniem. Rozmrażać i przechowywać każdą fiolkę z zamrożonymi komórkami w hodowli przez maksymalnie 8 tygodni.
      UWAGA: W przeciwieństwie do innych komórek, komórki te mają hamowanie kontaktu, gdy osiągną ~70% konfluencji. Wymaga to, aby subkultura była prowadzona na poziomie ~70%.
    2. Hoduj komórki za pomocą pożywki do wzrostu komórek nabłonka sutka (MEGM), zawierającej podłoże podstawowe nabłonka sutka (MEBM), suplementy wzrostu i toksynę w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C, wilgotności 95% i 5% CO2,
      UWAGA: Kup gotowe do użycia czynniki wzrostu dostarczone w SingleQuot (SQ) i zaopatrz się w toksynę osobno. Końcowe stężenia suplementów na wzrost to 0,4% ekstraktu z przysadki bydlęcej, 0,1% insuliny, 0,1% hydrokortyzonu, 0,1% ludzkich naskórkowych czynników wzrostu, 100 ng / ml toksyny oraz 0,05% siarczanu gentamycyny i 0,05% amfoterycyny B.
    3. Oddzielić komórki w 10-centymetrowym naczyniu hodowlanym przez inkubację z 10 ml trypsyny/EDTA przez ~ 20 minut, a następnie zneutralizować trypsynę, dodając 10 ml roztworu neutralizującego trypsynę. Zbierz wszystkie komórki za pomocą buforowanego roztworu soli fizjologicznej HEPES (HBSS).
    4. Policz komórki za pomocą hemocytometru pod odwróconym mikroskopem i oblicz stężenie zawiesiny pojedynczej komórki, a następnie zasiej określoną liczbę komórek w razie potrzeby. Dokładnie zamieszaj płytki, aby uzyskać równomierny rozkład komórek w każdej płytce. Inkubować komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C, wilgotności 95% i 5% CO2,
      UWAGA: Kup pakiet odczynników do subkultur zawierający trypsynę/EDTA, roztwór neutralizujący trypsynę i HBSS do użycia.
  2. Przejściowa transfekcja komórek z skonstruowanym wektorem okołodobowym.
    1. Wysiewaj 2 x 105 komórek MCF10A równomiernie w naczyniu hodowlanym o średnicy 35 mm z MEGM i osiągnij 20-30% konfluencji (następnego dnia).
    2. Zredukowaną pożywkę surowicy (np. Opti-MEM) rozgrzać w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i odczynniku do transfekcji w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Rozcieńczyć zbudowane plazmidowe DNA (pGL[hPer2P/Luc2P/Neo]) do 30 ng/μL buforem Tris-EDTA (TE) wolnym od endotoksyn i przechowywać w temperaturze pokojowej.
    3. Przygotuj mieszaninę transfekcji plazmidu w probówce mikrowirówki o pojemności 1,5 ml, dodając najpierw 63,6 μl ciepłej zredukowanej pożywki surowicy, a następnie dodając 33,4 μl (0,1 μg) plazmidowego DNA i delikatnie mieszając pipetując, a następnie dodając 3 μl odczynnika do transfekcji bezpośrednio do środka probówki bez dotykania ścianki. Po delikatnym wymieszaniu przez pipetowanie przechowywać w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
    4. Upuść całą mieszaninę plazmidu (100 μl) bezpośrednio na środkową powierzchnię pożywki w płytce, a następnie delikatnie wymieszaj, potrząsając naczyniem. Hodować komórki w inkubatorze CO2 przez dodatkowe 48-72 godz.
      UWAGA: Przewiduje się, że najwyższa wydajność transfekcji będzie przy 40-70% zbiegu tych komórek ze względu na ich hamowanie kontaktu na poziomie ~ 70%. Dlatego transfekcja działa najlepiej zaczynając od ~ 20% i kończąc na ~ 70% zbiegu.

3. Przeprowadzenie testu bioluminescencji in vitro w przejściowo transfekowanych komórkach MCF10A

  1. Zagłodź hodowane komórki przy ~70% konfluencji (po transfekcji przez 48-72 godzin) w MEBM bez czynników wzrostu przez 24 godziny.
  2. Traktować komórki środkiem synchronizującym (np. 50% surowicą końską (HS)) w MEBM przez 1,5 godziny w inkubatorzeCO2.
    UWAGA: W celu wyboru idealnego czynnika synchronizacyjnego porównano 10 μM forskoliny, 1 nM melatoniny, 0,1 μM deksametazonu, 50% HS i 100% SQ pod względem amplitudy i okresu okołodobowego w komórkach transfekowanych wektorem okołodobowym. Puste transfekowane komórki wektorowe są traktowane 100% SQ jako kontrola ujemna.
  3. Wstępnie przygotuj 20 ml pożywki rejestrującej (dla 10 30-milimetrowych szalek hodowlanych), dodając 5 ml MEGM, 15 ml MEBM, 150 μl wodorowęglanu sodu, 200 μl HEPES i 40 μl roztworu podstawowego lucyferyny (50 mM) w 50 ml wysterylizowanej probówce wirówkowej.
    UWAGA: Końcowe stężenia każdego składnika: 20% SQ i 20 ng/ml toksyny, 0,06% wodorowęglanu sodu, 1% penicyliny/streptomycyny i 10 mM HEPES. Podgrzej wcześniej przygotowany nośnik do nagrywania i wysterylizuj 1x PBS przez 30 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Dodaj 100 μM lucyferyny bezpośrednio przed użyciem.
  4. Umyj komórki ciepłą solą fizjologiczną buforowaną fosforanem Dulbecco (D-PBS) 3 razy po inkubacji ze środkiem synchronizującym, a następnie dodaj 2 ml pożywki rejestrującej.
  5. Uszczelnij naczynie wysterylizowaną pokrywą za pomocą smaru silikonowego, aby zapobiec parowaniu, a następnie oznacz je z boku.
  6. Umieść zapieczętowaną czaszę w gnieździe wewnątrz luminometru i włącz opcję zapisywania lokalizacji pliku w folderze (szczegóły patrz rozdział 6).

4. Wybór stabilnie transfekowanych komórek

  1. Zoptymalizuj idealne stężenie G418 (800 μg/ml) za pomocą testu krzywej zabijania zgodnie z instrukcją producenta dotyczącą wyboru stabilnie transfekowanych komórek.
  2. Po transfekcji przejściowej przez 48 godzin lub 72 godziny, subkulturuj i wysiewaj komórki za pomocą MEGM w większych szalkach po 5 000 komórek na szalkę (100 mm). Po 24 godzinach hodowli w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C, 95% wilgotności i 5% CO2 ) potraktuj komórki 800 μg/ml G418, zastępując starą pożywkę nową pożywką zawierającą 800 μg/ml G418 co 3-4 dni przez 2 tygodnie.
  3. Subkultura stabilnie transfekowanych kolonii, które przeżyły, przez 1-3 pasaże za pomocą MEGM zawierającego 500 μg / ml G418 w celu utrzymania stabilnej ekspresji hPer2P / Luc2P i zamrożenia w ciekłym azocie do wykorzystania w przyszłości.
  4. Traktuj 500 μg / ml G418 po ogólnej subkulturze, aby ponownie wybrać stabilnie transfekowaną populację komórek, jeśli intensywność bioluminescencji w wyniku testu bioluminescencji in vitro staje się stopniowo niższa po użyciu w wielu pasażach.

5. Leczenie chemikaliami

  1. Po 48 godzinach lub 72 godzinach od transfekcji należy zagłodzić komórki przed czynnikami wzrostu w MEBM przez 24 godziny.
  2. Po synchronizacji z 50% HS przez 2 godziny, potraktuj komórki 0,25 mM lub 0,5 mM nitrosomethylurea (NMU), 20 nM EX527 lub 1 μM cambinol przez 1 godzinę w MEBM zawierającym 20% SQ.
  3. Po umyciu 1x D-PBS dodać do komórek pożywkę zapiskową zawierającą 12,5 μM MSC samodzielnie lub w połączeniu z 20 nM EX527 lub 1 μM kambinolem. Monitorowanie bioluminescencji za pomocą luminometru.
  4. Stabilnie transfekowane komórki MCF10A/PER2-dLuc należy traktować NMU przy 0,5, 1 lub 2 mM, EX527 przy 40 nM lub Kambinolu przy 2,0 μM przez 1 godzinę po synchronizacji z 50% HS, a następnie inkubować komórki w pożywce rejestrującej zawierającej 12,5 μM MSC lub różne dawki (5, 10 lub 20 μM) n-acetylocysteiny (NAC). Umieścić płytki w luminometrze, zarejestrować i zapisać bioluminescencję za pomocą luminometru przez 4-8 dni, jak opisano w sekcji 3.6.
    UWAGA: NMU to metylowany związek nitrozomocznikowy o właściwościach mutagennych, rakotwórczych i teratogennych. NMU jest środkiem alkilującym o bezpośrednim działaniu i ma krótki okres półtrwania (T1/2 = ~ 30 min). Jest stabilny w stanie kwaśnym (pH 4-5), ale niestabilny w stanie zasadowym (pH 9-10) i w temperaturach powyżej 20 °C. Dlatego wybielacz o stężeniu 10% może być stosowany jako skuteczny środek dezaktywujący do czyszczenia powierzchni stołów i wyrobów laboratoryjnych potencjalnie zanieczyszczonych roztworem NMU. Resztki roztworu podstawowego są zbierane i bezpiecznie usuwane przez REHS. W zależności od sposobu działania substancji chemicznych, zsynchronizowane komórki mogą być poddawane krótszej obróbce przed hodowlą na nośniku zapisowym. Komórki mogą być również poddawane obróbce na nośniku zapisu przez dłuższy czas (kilka dni).

6. Zbieranie, analiza i prezentacja danych

UWAGA: Żywotność komórek musi być określona przy użyciu standardowych metod (np. testu MTT) po traktowaniu komórek w tych samych stężeniach przez te same wskazane czasy. Wszystkie stężenia stosowane w teście bioluminescencji in vitro były niższe niż 30% stężenie śmiertelne (LC30). Wszystkie doświadczenia przeprowadzono w trzech egzemplarzach, a ich reprezentatywne wyniki zostały przedstawione.

  1. Po zamknięciu szalki (krok 3.5) załadować szalki na siedzenia w luminometrze, który jest przechowywany w inkubatorze ustawionym na 37 °C bezH2Oi CO2 i podłączonym do komputera.
  2. Kliknij "zapisz" i wprowadź nazwy folderu i pliku, w którym zostanie zapisany zarejestrowany sygnał luminescencji z odpowiedniej anteny.
    UWAGA: System wykrywa sygnał luminescencji w czasie rzeczywistym z komórek w czaszy w poszczególnych pozycjach. Sygnały są przesyłane do komputera za pomocą 4-fotonowych lamp zliczających fotony, a następnie zapisywane i wyświetlane w komputerze przez oprogramowanie do zbierania danych.
  3. Analizuj sygnały po nagraniu przez 4-7 dni, po czym w razie potrzeby może nastąpić zmiana podłoża i ciągłe nagrywanie przez drugi tydzień.
    UWAGA: Aby uzyskać parametry okołodobowe, w tym fazę, długość okresu, amplitudę rytmu i szybkość tłumienia, użyliśmy oprogramowania do analizy luminometru do analizy danych bioluminescencyjnych.
  4. Odblokuj surowe dane za pomocą średniej bieżącej i przeanalizuj najlepsze dopasowania do fali sinusoidalnej, aby uzyskać okres, fazę, amplitudę i współczynnik tłumienia21,22.
  5. Ze względu na wysoką przejściową bioluminescencję po leczeniu i zmianę pożywki, należy wykluczyć pierwszy cykl danych z analizy.
  6. Aby przedstawić dane, wykreśl surowe dane (bioluminescencja, liczba/s) w funkcji czasu (h lub dzień). W razie potrzeby można wykreślić dane odjęte od linii bazowej w celu porównania amplitudy i fazy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wektor reporterowy bioluminescencji okołodobowej: ekspresja destabilizowanego wariantu lucyferazy sterowana ludzkim promotorem PER2

Sekwencja DNA obejmująca fragment o długości 941 bp pochodzący z ludzkiego promotora PER2, wykorzystana do konstrukcji wektora reporterowego rytmu okołodobowego pGL[hPer2P/Luc2P/Neo, została w pierwszej kolejności poddana analizie pod kątem obecności elementów regula...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W komórkach ssaków okresowość zegara okołodobowego jest regulowana przez połączone pętle transkrypcyjne/translacyjnego sprzężenia zwrotnego. Heterodimery Bmal1 i Clock lub Npas2 regulują transkrypcję okołodobową poprzez wiązanie się z elementami E-box w promotorach podstawowych CG, w tym Per2 i Cry oraz licznych CCG4. Gromadząc się w komórce, heterodimery Per:Cry są modyfikowane potranslacyjnie i transportowane do jądra w celu stłumienia aktywności transkrypcyjnej Clock:Bmal1. Ta...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez 2012 Society of Toxicology (SOT)-Colgate Palmolive Grant for Alterative Research (M. Fang) oraz międzynarodowy fundusz badawczy współpracy z Animal and Plant Quarantine Agency, Republic of Korea (M. Fang), oraz grant NIEHS P30ES005022 (H. Zarbl). Chcielibyśmy podziękować dr Zheng Chen (McGovern Medical School w Centrum Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Teksańskiego w Houston) za jego pomocną dyskusję, panu Shao-An Juanowi za pomoc eksperymentalną oraz pani Kimi Nakata za korektę tekstu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Wektor pLS[hPER2P/rLuc/Puro]SwitchGear GenomicsS700000niestandardowy wektor
wektor pGL4.18[Luc2P/Neo]Promega9PIE673zdestabilizowany wektor ekspresji lucyferazy
Ligaza DNA T4Invitrogen15224041Do subklonowania
Zestaw do klonowania TOPO TAInvitrogenK4500-02z One Shot TOP10 Chemicznie kompetentny E. coli
Sac INew England BioLabsR0156SEnzym restrykcyjny
Hind III-HFNew England BioLabsR3104SEnzym restrykcyjny
Bufor CutSmartNew England BioLabsB7204SBufor enzymatyczny restrykcyjny
zestaw do ekstrakcji żelu DNAQiagen28704Oczyszczanie fragmentów DNA z żelu agarozowego
Zestaw do oczyszczania PCRQiagen28104Oczyszczanie DNA
Modyfikacja LB MilleraTEKNOVAL8600Do transformowanej kultury E. Coli
Płytka agarowa LBTEKNOVAL1902Do selekcji biało-niebieskiej
QIAprep spin miniprep KitQiagen27104Do ekstrakcji plazmidu DNA
EndoFree maxi prep KitQiagen12362Do ekstrakcji DNA plazmidu
Odczynnik do transfekcjiFuGene HDPromegaE2311
Opti-MEM zredukowana pożywka surowicyInvitrogen31985-062Do transfekcji
Linia komórkowa MCF10AKolekcja kultur typu amerykańskiegoCRL-10317Komórki nabłonka sutka
MEGM BulletKitLonzaCC-3150Pożywka do wzrostu nabłonka sutka
MEBMLonzaCC-3151Nabłonek sutkowy Podłoże
Zestaw MEGM SingleQuot LonzaCC-4136Suplementy i Odczynnik wzrostu
Odczynnik ZestawLonzaCC-5034Odczynnik do subkultur
D-PBS (10X)SigmaD1408Mycie komórek w naczyniach hodowlanych
UltraPure Woda destylowanaInvitrogen10977Rozcieńczony 10X D-PBS
Naczynie do hodowli tkankowych (35 mm)BD/Falcon353001naczynie do hodowli komórkowych odpowiednie do smaru silikonowego LumiCycle
FisherNC9044707Do uszczelniania naczynia z nośnikiem zapisu
Okrągła szklanka nakrywkowaHarvard Bioscience64-1500 (CS-40R)Do uszczelniania naczynia z podłożem rejestrującym
Toksyna cholerycznaSigmaC8052Suplement do podłoża
wzrostowego Siarczan G418 (Geniticin)Invitrogen10131035Antybiotyk do selekcji stabilnie transfekowanych komórek
AmpicylinaSigmaA9393Do selekcji kolonii
ForskolinSigmaF6886Agent synchronizujący
MelatoninaSigmaM5250Agent synchronizujący
DeksametazonSigmaD4902Agent synchronizujący
Surowica koniaSigmaH1138Środek synchronizujący
d-Lucyferyna, sól sodowaInvitrogenL2912Substrat lucyferazy
IC261Sigma10658Kontrola pozytywna dla substancji zaburzającej rytm okołodobowy
Metylonitromocznik (NMU)SigmaN1517Specyficzny dla sutka czynnik rakotwórczy
Metylosielenocysteina (MSC)SigmaM6680Selen organiczny (środek chemoprewencyjny)
EX527SigmaE7034Inhibitor specyficzny dla SIRT1
CambinolSigmaC0494SIRT1 & Inhibitor SIRT2
Spektrofotometr NanoDropThermo ScientificNanoDrop 8000Quantify nukleotyd
GeneAmp PCR System 9700Applied BiosystemsN805-0200Do eksperymentu biologii molekularnej
Inkubator CO2SeriaNAPCO 8000 DHDo hodowli komórkowej przy 5% CO2 przy 37 stopniach; C
Wirówka biurkowa z refrezeratoremEppendorf5430RDo eksperymentu biologii molekularnej
Wirówka z uchylnym wiadremEppendorf5810 RDo hodowli komórkowych
Mikroskop odwróconyNikon80124Kontrast fazowy opcjonalnie
Kaptur do hodowli tkankowychLabconcoKlasa II A2Certyfikat BSL-2
LumiCycle 32AkumetrianiedostępnaDetektor luminescencji

Bibliografia

  1. Akerstedt, T., et al. Night work and breast cancer in women: a Swedish cohort study. BMJ Open. 5 (4), e008127(2015).
  2. Parent, M. E., El-Zein, M., Rousseau, M. C., Pintos, J., Siemiatycki, J. Night work and the risk of cancer among men. Am J Epidemiol. 176 (9), 751-759 (2012).
  3. Knutsson, A., et al. Breast cancer among shift workers: results of the WOLF longitudinal cohort study. Scand J Work Environ Health. 39 (2), 170-177 (2013).
  4. Fu, L., Lee, C. C. The circadian clock: pacemaker and tumour suppressor. Nat Rev Cancer. 3 (5), 350-361 (2003).
  5. Fu, L., Kettner, N. M. The circadian clock in cancer development and therapy. Prog Mol Biol Transl Sci. 119, 221-282 (2013).
  6. IARC. Painting, Firefighting, and Shiftwork. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. 98, 563-764 (2010).
  7. Zhang, X., Zarbl, H. Chemopreventive doses of methylselenocysteine alter circadian rhythm in rat mammary tissue. Cancer Prev Res (Phila Pa). 1 (2), 119-127 (2008).
  8. Fang, M. Z., Zhang, X., Zarbl, H. Methylselenocysteine resets the rhythmic expression of circadian and growth-regulatory genes disrupted by nitrosomethylurea in vivo. Cancer Prev Res (Phila). 3 (5), 640-652 (2010).
  9. Burbulla, L. F., Kruger, R. Converging environmental and genetic pathways in the pathogenesis of Parkinson's disease. J Neurol Sci. 306 (1-2), 1-8 (2011).
  10. Aitlhadj, L., Avila, D. S., Benedetto, A., Aschner, M., Sturzenbaum, S. R. Environmental exposure, obesity, and Parkinson's disease: lessons from fat and old worms. Environ Health Perspect. 119 (1), 20-28 (2011).
  11. Nagoshi, E., Brown, S. A., Dibner, C., Kornmann, B., Schibler, U. Circadian gene expression in cultured cells. Methods Enzymol. 393, 543-557 (2005).
  12. Ramanathan, C., et al. Cell type-specific functions of period genes revealed by novel adipocyte and hepatocyte circadian clock models. PLoS Genet. 10 (4), e1004244(2014).
  13. Sporl, F., et al. A circadian clock in HaCaT keratinocytes. J Invest Dermatol. 131 (2), 338-348 (2011).
  14. Zhang, E. E., et al. A genome-wide RNAi screen for modifiers of the circadian clock in human cells. Cell. 139 (1), 199-210 (2009).
  15. Yoo, S. H., et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (15), 5339-5346 (2004).
  16. Leclerc, G. M., Boockfor, F. R., Faught, W. J., Frawley, L. S. Development of a destabilized firefly luciferase enzyme for measurement of gene expression. Biotechniques. 29 (3), (2000).
  17. Genomics, S. Technical Note: SwitchGear methods for gene model construction and transcription start site prediction. , (2009).
  18. Scientific, F. Safety Data Sheet: Ethidium bromide, 1% Solution/Molecular Biology. , (2010).
  19. Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. Current Protocols in Molecular Biology. , Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience. New York. (1994).
  20. Yoo, S. H., et al. A noncanonical E-box enhancer drives mouse Period2 circadian oscillations in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (7), 2608-2613 (2005).
  21. Chen, Z., et al. Identification of diverse modulators of central and peripheral circadian clocks by high-throughput chemical screening. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (1), 101-106 (2012).
  22. Fang, M., Guo, W. R., Park, Y., Kang, H. G., Zarbl, H. Enhancement of NAD+-dependent SIRT1 deacetylase activity by methylselenocysteine resets the circadian clock in carcinogen-treated mammary epithelial cells. Oncotarget. , (2015).
  23. Chen-Goodspeed, M., Lee, C. C. Tumor suppression and circadian function. J Biol Rhythms. 22 (4), 291-298 (2007).
  24. Balsalobre, A. Clock genes in mammalian peripheral tissues. Cell Tissue Res. 309 (1), 193-199 (2002).
  25. Jung-Hynes, B., Huang, W., Reiter, R. J., Ahmad, N. Melatonin resynchronizes dysregulated circadian rhythm circuitry in human prostate cancer cells. J Pineal Res. 49 (1), 60-68 (2010).
  26. von Gall, C., et al. Melatonin plays a crucial role in the regulation of rhythmic clock gene expression in the mouse pars tuberalis. Ann N Y Acad Sci. 1040, 508-511 (2005).
  27. Vujovic, N., Davidson, A. J., Menaker, M. Sympathetic input modulates, but does not determine, phase of peripheral circadian oscillators. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 295 (1), R355-R360 (2008).
  28. Schofl, C., Becker, C., Prank, K., von zur Muhlen, A., Brabant, G. Twenty-four-hour rhythms of plasma catecholamines and their relation to cardiovascular parameters in healthy young men. Eur J Endocrinol. 137 (6), 675-683 (1997).
  29. Yu, H., et al. Circadian rhythm of circulating fibroblast growth factor 21 is related to diurnal changes in fatty acids in humans. Clin Chem. 57 (5), 691-700 (2011).
  30. Nakagawa, H., et al. Modulation of circadian rhythm of DNA synthesis in tumor cells by inhibiting platelet-derived growth factor signaling. J Pharmacol Sci. 107 (4), 401-407 (2008).
  31. Yang, X., Guo, M., Wan, Y. J. Deregulation of growth factor, circadian clock, and cell cycle signaling in regenerating hepatocyte RXRalpha-deficient mouse livers. Am J Pathol. 176 (2), 733-743 (2010).
  32. Virag, L. Structure and function of poly(ADP-ribose) polymerase-1: role in oxidative stress-related pathologies. Curr Vasc Pharmacol. 3 (3), 209-214 (2005).
  33. Kon, N., Sugiyama, Y., Yoshitane, H., Kameshita, I., Fukada, Y. Cell-based inhibitor screening identifies multiple protein kinases important for circadian clock oscillations. Commun Integr Biol. 8 (4), e982405(2015).
  34. Ramanathan, C., Khan, S. K., Kathale, N. D., Xu, H., Liu, A. C. Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters. J Vis Exp. (67), e4234(2012).
  35. Welsh, D. K., Yoo, S. H., Liu, A. C., Takahashi, J. S., Kay, S. A. Bioluminescence imaging of individual fibroblasts reveals persistent, independently phased circadian rhythms of clock gene expression. Curr Biol. 14 (24), 2289-2295 (2004).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza rytmu okołodobowegoreporter promotora PER2pomiar ekspresji lucyferazyprzesiewowe badanie disruptorów chemicznychprotokół synchronizacji komórekoprogramowanie analityczne LumiCycleśrodowiskowe modulatory rytmu okołodobowegokwantyfikacja intensywności bioluminescencji
In vitro Test bioluminescencji w celu scharakteryzowania rytmu okołodobowego w komórkach nabłonka sutka
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.