Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wzbogacanie nierozpuszczalnych w detergentach agregatów białkowych z ludzkiego mózgu pośmiertnego

12.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55835

⸱

24 października 2017

 ,  , 
1Department of Biochemistry, Emory School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Opisany jest skrócony protokół frakcjonowania do wzbogacania nierozpuszczalnych w detergentach agregatów białkowych z ludzkiego mózgu pośmiertnego.

Streszczenie

W tym badaniu opisujemy skrócony protokół frakcjonowania jednoetapowego do wzbogacania nierozpuszczalnych w detergentach agregatów białkowych z ludzkiego mózgu pośmiertnego. Jonowy detergent N-laurylo-sarkozyna (sarkozyl) skutecznie rozpuszcza natywnie pofałdowane białka w tkance mózgowej, umożliwiając wzbogacenie nierozpuszczalnych w detergentach agregatów białkowych z szerokiego zakresu neurodegeneracyjnych proteinopatii, takich jak choroba Alzheimera (AD), choroba Parkinsona i stwardnienie zanikowe boczne oraz choroby prionowe. Ludzka kontrola i pośmiertne tkanki mózgowe AD zostały zhomogenizowane i sedymentowane przez ultrawirowanie w obecności sarkozylu w celu wzbogacenia nierozpuszczalnych w detergentach agregatów białkowych, w tym patologicznego fosforylowanego tau, podstawowego składnika splątków neurofibrylarnych w AD. Western blot wykazał różnicową rozpuszczalność zagregowanego fosforylowanego tau i rozpuszczalnego w detergentach białka, wczesnego antygenu endosomowego 1 (EEA1) w grupie kontrolnej i mózgu AD. Analiza proteomiczna wykazała również wzbogacenie β-amyloidu (Aβ), tau, snRNP70 (U1-70K) i apolipoproteiny E (APOE) w nierozpuszczalne w sarkozylu frakcje mózgu AD w porównaniu z frakcjami kontrolnymi, zgodnie z wcześniejszymi strategiami frakcjonowania tkanek. W związku z tym ten prosty protokół wzbogacania jest idealny do szerokiego zakresu zastosowań eksperymentalnych, począwszy od testów Western blotting i funkcjonalnej koagregacji białek, a skończywszy na proteomice opartej na spektrometrii mas.

Wprowadzenie

Choroby neurodegeneracyjne, takie jak choroba Alzheimera (AD), choroba Parkinsona (PD), choroba Huntingtona (HD), stwardnienie zanikowe boczne (ALS) i blisko związane choroby prionowe to proteinopatie charakteryzujące się stopniowym gromadzeniem się nierozpuszczalnych w detergentach agregatów białkowych w mózgu z towarzyszącym spadkiem funkcji poznawczych. 1,2 Uważa się, że ta wspólna cecha patologiczna odgrywa kluczową rolę w etiologii i patofizjologii tych chorób neurodegeneracyjnych. 2 Te agregaty zazwyczaj składają się z polimerowych włókien amyloidowych, które składają się z powtarzających się jednostek nieprawidłowo sfałdowanego białka wykazującego krzyżową strukturę β. 1,2,3,4 Biochemicznie, agregaty amyloidowe są wysoce odporne na chemiczną lub termiczną denaturację i solubilizację,3, co stanowi wyjątkowe wyzwanie dla ich oczyszczania, analizy i badania za pomocą tradycyjnych technik biochemicznych. 2,5,6,7,8,9,10,11 Nic dziwnego, że frakcja białkowa nierozpuszczalna w detergentach była przedmiotem wielu badań nad patofizjologią chorób neurodegeneracyjnych obejmujących akumulację nieprawidłowo sfałdowane białka. 6,12,13,14

Techniki frakcjonowania biochemicznego były często wykorzystywane do wzbogacania frakcji nierozpuszczalnej w detergentach z pośmiertnych homogenatów mózgu. 6,12,13,14 Jedną z najpowszechniejszych metod jest sekwencyjna ekstrakcja homogenatów tkankowych za pomocą i detergentów o rosnącym stopniu rygorystyczności, a następnie ultrawirowanie w celu podzielenia frakcji rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych. Powszechnie stosowany protokół frakcjonowania sekwencyjnego6,14 polega na homogenizacji zamrożonych próbek tkanek w bezdetergentowym buforze o niskiej zawartości soli (LS), a powstałe w ten sposób nierozpuszczalne granulki są następnie sekwencyjnie ekstrahowane zawierającymi detergenty o wysokiej zawartości soli, detergenty niejonowe, sacharozę, detergenty jonowe i wreszcie chaotropy, takie jak mocznik. 6,14 Oczywistą wadą takich protokołów sekwencyjnego frakcjonowania jest znaczne zaangażowanie czasu i pracy wymagane do ich wykonania. Łącznie z homogenizacją i ultrawirowaniem, typowy pięcioetapowy protokół frakcjonowania może zająć kilka godzin, a nawet dni. 4,6,7,10,15,16,17,18 Dodatkowo, tyle samo patologicznych agregatów białkowych pozostaje nierozpuszczalnych we wszystkich warunkach, z wyjątkiem najtrudniejszych19,20 Większość generowanych frakcji ma ograniczoną wartość. W związku z tym mniej rygorystyczne etapy frakcjonowania wykorzystujące wysokie stężenia soli i niejonowe detergenty są w dużej mierze zbędne.

Poprzednie badania wykazały, że jonowy detergent N-lauryl-sarkozyna (sarkozyl) jest doskonałym kandydatem do uproszczonego jednoetapowego protokołu frakcjonowania detergentu. 5,6,12,13,14,21,22,23 Jako detergent denaturujący, sarkozyl jest wystarczająco rygorystyczny, aby rozpuścić zdecydowaną większość natywnie pofałdowanych białek w mózgu bez rozpuszczania nieprawidłowo sfałdowanych agregatów białkowych beta-amyloidu (Aβ),6,11 fosforylowane tau (pTau),6 TAR DNA-binding protein 43 (TDP-43),14 alfa-synukleina,12,13 trzęsawka,23 lub U1 małe jądrowe rybonukleoproteiny (U1 snRNPs), takie jak U1-70K. 5,21,22Ponieważ sarkozyl jest mniej rygorystyczny niż wszechobecny anionowy detergent dodecylosiarczan sodu (SDS), zachowuje mniej wytrzymałe oligomeryczne formy nieprawidłowo sfałdowanych agregatów białkowych, które nie są w stanie wytrzymać obróbki SDS. 9

Poprzednio opisaliśmy skrócony protokół frakcjonowania detergentem, który osiągnął wyniki porównywalne z bardziej pracochłonnymi metodologiami frakcjonowania sekwencyjnego. 5 Pomijając mniej rygorystyczne etapy frakcjonowania, byliśmy w stanie opracować łatwy jednoetapowy protokół frakcjonowania do wzbogacania nierozpuszczalnych w detergentach agregatów białkowych z pośmiertnego ludzkiego mózgu. 5 Ten szczegółowy protokół opisany tutaj doskonale nadaje się do szerokiego zakresu zastosowań eksperymentalnych, począwszy od Western blotting i proteomiki opartej na spektrometrii mas, a skończywszy na funkcjonalnych testach błędnego fałdowania białek i agregacji. 5,6,21

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Oświadczenie etyczne: Wszystkie tkanki mózgowe zostały pozyskane z Banku Mózgu Centrum Badań nad Chorobą Alzheimera (ADRC) Emory. Ludzkie tkanki pośmiertne zostały pozyskane zgodnie z odpowiednimi protokołami Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej (IRB).

1. Homogenizacja i frakcjonowanie

  1. Selekcja tkanek
    UWAGA: Zamrożona pośmiertna tkanka kory czołowej ze zdrowej grupy kontrolnej (Ctl) i patologicznie potwierdzone przypadki AD zostały wybrane z banku mózgu Emory ADRC (n = 2). Pośmiertną ocenę neuropatologiczną rozmieszczenia blaszek amyloidowych przeprowadzono zgodnie z półilościowymi kryteriami punktacji Consortium to Establish a Registry for Alzheimer's Disease 24, chociaż patologia splątania neurofibrylarnego została oceniona zgodnie z systemem oceny stopnia zaawansowania Braaka. 16
    1. Uzyskaj zamrożoną pośmiertną tkankę mózgową od zdrowej grupy kontrolnej (Ctl) i patologicznie potwierdzonych przypadków AD. Wykorzystując pojemniki z suchym lodem, kleszcze i żyletkę, wyciąć ~ 250 mg porcji istoty szarej z każdej próbki tkanki na tarowanych jednorazowych łodziach wagowych, uważając, aby zapobiec rozmrożeniu tkanki. Zapisać masę każdego kawałka, który ma być homogenizowany.
    2. Wyciąć ~ 250 mg istoty szarej za pomocą kleszczy i brzytwy, dokonując oględzin w celu zlokalizowania granicy faz między zewnętrzną istotą szarą a wewnętrzną istotą białą. Unikaj istoty białej, a co ważniejsze, wszelkich dużych naczyń krwionośnych lub krwawych obszarów, opon mózgowych lub pajęczynówki. Utrzymuj tkankę zamrożoną podczas procesu cięcia, pracując szybko i często, umieszczając łódkę wagową z tkanką mózgową w polistyrenowych pojemnikach z suchym lodem.
    3. Zapisać dokładną masę istoty szarej wyciętej z każdego zamrożonego kawałka za pomocą wagi analitycznej. Obliczyć objętość buforu o niskiej zawartości soli (LS) (patrz Tabela 1) potrzebnego do homogenizacji z beczki (5 ml/g lub 20% w/v).
    4. Przygotuj 10 ml buforu LS z 1x koktajlem inhibitorów proteazy i fosfatazy i schłodź na lodzie.
    5. Wyjmij zważoną chusteczkę i łódkę wagową z suchego lodu i pokrój w kostkę na kawałki o wymiarach około 2 x 2 mm podczas rozmrażania. Przenieść do 2 ml wstępnie schłodzonej probówki homogenizatora z beczki na lodzie.
    6. Dodaj 5 ml / g (20% w/v) lodowatego buforu o niskiej zawartości soli (LS) z koktajlem 1X inhibitorów proteazy i fosfatazy.
    7. Homogenizuj tkankę mózgową na lodzie za pomocą około 10 uderzeń tłuczka A o wysokim prześwicie i 15 uderzeń tłuczka B o niskim prześwicie.
    8. Przenieść cały homogenat do probówki polipropylenowej o pojemności 2 ml za pomocą szklanej pipety Pasteura. Oznacz probówkę symbolem "TH" (Total Homogenate), numerem tkanki i objętością homogenatu. Podajmy 0,8 ml do oznakowanej probówki o pojemności 1,5 ml. Nadmiar homogenatu może być podobnie podzielony i przechowywany w temperaturze -80 °C.
    9. Do każdej podwielokrotności 0,8 ml dodać po 100 μl 5 M NaCl i 10% (w/v) sarkozylu do stężeń odpowiednio 0,5 M i 1% w/v. Dobrze wymieszaj probówki przez odwrócenie i inkubuj na lodzie przez 15 minut. Oznaczyć probówki symbolem "TH-S" (Total Homogenate-Sarkosyl), aby wskazać, że homogenaty znajdują się w buforze sarkozylu (Tabela 1).
    10. Sonikuj każdą probówkę przez trzy 5-sekundowe impulsy o amplitudzie 30% na lodzie (maksymalna intensywność = 40%) za pomocą sondy z mikrokońcówką.
    11. Oznaczyć stężenia białek w homogenatach za pomocą testu kwasu bicinchoninowego (BCA)25 method.
      UWAGA: Średnie stężenie białka w homogenatach TH-S przygotowanych w dawce 5 ml LS na gram tkanki wynosi 15-20 mg/ml. Homogenaty mogą być natychmiast frakcjonowane lub przechowywane w temperaturze -80 °C do czasu użycia.
    12. Rozcieńczyć homogenaty TH-S do 10 mg / ml za pomocą lodowatego buforu Sark (Tabela 1) z 1x inhibitorami proteazy i fosfatazy.
    13. Przenieść 5 mg białka (0,5 ml) z każdego homogenatu TH-S do probówek ultrawirówek z poliwęglanu o pojemności 500 μl i zrównoważyć parami za pomocą buforu sark. Załadować probówki do wstępnie schłodzonego rotora i ultrawirować przy 180 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść rozpuszczalne w sarkozylu supernatanty (S1) do probówek o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C.
      UWAGA: (Opcjonalne mycie) Dodać 200 μl buforu sark do probówek ultrawirówek zawierających frakcje nierozpuszczalne w detergentach (P1) i usunąć granulki (P1) z dna probówek ultrawirówek za pomocą końcówki do pipety o pojemności 200 μl.
    14. Krótko wiruj pulsacyjnie odwrócone probówki przez 2-3 s (≤2,500 x g) na mikrowirówce, aby przenieść granulki (P1) i bufor do probówek o pojemności 1,5 ml poniżej. Zawiesić nierozpuszczalne granulki (P1) w buforze sark, pipetując w górę i w dół, aby upewnić się, że osad został rozerwany.
    15. Zrównoważyć parami i odwirować przy 180 000 x g przez dodatkowe 30 minut w temperaturze 4 °C.
    16. Odrzucić opcjonalny supernatant do przemywania (S2) i inkubować nierozpuszczalne w sarkozylu granulki (P2) w 50-75 μl buforu mocznikowego (Tabela 1) z 1x (koktajl inhibitorów proteazy i fosfatazy) przez 30 minut w temperaturze pokojowej w celu rozpuszczenia osadu.
      UWAGA: Przed użyciem podgrzej bufor mocznikowy do temperatury pokojowej, aby uniknąć wytrącania się SDS. W przypadku zastosowań wrażliwych na detergenty należy pominąć SDS w buforze mocznikowym i rozważyć umycie nierozpuszczalnego osadu (P2) w buforze o niskiej zawartości soli przed ponownym zawieszeniem w buforze mocznikowym.
    17. Przenieś zawieszone granulki (P2) do probówek o pojemności 0,5 ml i użyj krótkiej (1 s) sonikacji mikrokońcówek o amplitudzie 20% (maksymalna intensywność = 40%), aby w pełni rozpuszczono granulki.
    18. Oznaczyć stężenia białek we frakcjach rozpuszczalnych w sarkozylu (S1) i nierozpuszczalnych (P2) przy użyciu metody oznaczania BCA. Frakcje te należy zużyć natychmiast lub przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia.

2. Immunoblotting

  1. Western blotting
    UWAGA: Western blotting został wykonany zgodnie z wcześniej opisanymi procedurami z niewielkimi modyfikacjami. 5,10
    1. Przygotować 40 μg próbek całkowitych homogenatów (TH-S), frakcji rozpuszczalnych w sarku (S1) i nierozpuszczalnych w sarku (P2) w 1X buforze próbek Laemmli SDS z 5 mM TCEP pH 7. Próbki inkubować w temperaturze 95 °C przez 5 minut.
    2. Załaduj próbki na prefabrykowany 10-dołkowy żel Bis-Tris SDS-PAGE o stężeniu 4-12%. Elektroforeza pod napięciem 80 V przez pierwszy centymetr (10 min) i 120 V przez pozostałą część (60 min) lub do momentu, gdy barwnik śledzący dotrze do dna żelu.
    3. Użyj świeżej żyletki i noża do żelu, aby rozciąć wstępnie odlewaną kasetę z żelem. Delikatnie odetnij grzebienie i sam spód żelu świeżą żyletką.
    4. Zawiesić nierozpuszczalne granulki (P1) w 200 μl buforze sark z 1x, pipetując w górę i w dół.
    5. Przenieść na membranę nitrocelulozową o grubości 0,2 μm metodą suchego transferu na bibułce (patrz tabela materiałów).
    6. Zablokuj membranę w buforze blokującym (BB) bez Tween 20 na 30 min, a następnie BB z 0,05% Tween 20 (BB/T) na 30 min. Po zablokowaniu przepłukać membranę w TBS/T (0,1% Tween 20) przez 5 minut, aby usunąć nadmiar buforu blokującego.
    7. Przygotować rozcieńczenia pierwszorzędowe w stosunku 1:1,000 przeciwciał pierwszorzędowych pT231, Tau-2 (pan tau), AT8 i EEA1 w BB/T (0,05% Tween 20).
    8. Inkubować błony w roztworze przeciwciała pierwszorzędowego przez noc w temperaturze 4 °C z mieszaniem okrężnym. Płukać membranę w TBS/T przez 3 x 15 min.
    9. Sondować membranę rozcieńczeniem 1:20 000 znakowanego fluorescencyjnie przeciwciała wtórnego bliskiej podczerwieni w BB / T przez 60 minut w temperaturze pokojowej w ciemności na wytrząsarce. Płukać membranę przez 3 x 10 min w TBS/T i 2 x 5 min w TBS.
    10. Zeskanuj membranę za pomocą systemu obrazowania w podczerwieni o odpowiedniej długości fali wzbudzenia (np. 700 nm (kanał czerwony) dla barwnika podczerwonego, 680 kozy anty-mysiej IgG (H+L) wtórnej i 800 nm (kanał zielony) dla barwnika podczerwonego, 790 osła anty-króliczej IgG (H+L) wtórnej).
    11. Użyj oprogramowania do obrazowania, aby określić ilościowo natężenie sygnału i wykonać pomiary densytometryczne zgodnie z instrukcjami producenta, upewniając się, że ustawienie automatycznego tła jest ustawione na uśrednianie całego tła.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Skrócony jednoetapowy protokół frakcjonowania sarkozylowego został wykorzystany do wzbogacenia agregatów białkowych nierozpuszczalnych w detergencie z mózgów postmortem osób z grupy kontrolnej i chorych na AD (Rycina 1). Białka z frakcji TH-S, S1, S2 i P2 rozdzielono metodą SDS-PAGE, utrwalono przez 15 min w buforze utrwalającym z błękitem Coomassie, a następnie delikatnie zabarwiono buforem barwiącym Coomassie Brilliant Blue G-250. Etap resuspensji jest opcj...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W niniejszym artykule przedstawiamy i omawiamy skrócony jednoetapowy protokół frakcjonowania detergentem, który ma zastosowanie w szerokiej gamie zastosowań eksperymentalnych, począwszy od analizy proteomicznej opartej na spektrometrii mas, a skończywszy na funkcjonalnych testach błędnego fałdowania białek i western blot. 5,6,7,10 Ta metodologia jest prawdopodobnie najbardziej skuteczna, gdy jest stosowana do badania neurodegeneracyjnych proteinopatii, takich jak choroba Alzheimera, AL...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują doktorom Jimowi Lahowi i Allanowi Leveyowi, Emory Department of Neurology, za pomocne komentarze i sugestie. Praca ta została częściowo sfinansowana z grantu Accelerating Medicine Partnership (U01AG046161-02), Emory Alzheimer's Disease Research Center (P50AG025688) oraz grantu National Institute on Aging (R01AG053960-01) dla NTS. Badania te były również częściowo wspierane przez Neuropathology Core w ramach grantu Emory Neuroscience NINDS Core Facilities, P30NS055077.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Koktajl inhibitorów proteaz i fosfataz, bez EDTA (100X)Thermo Fisher78441inhibitorów proteazy i fosfataz
Sonic Dismembrator System (ultradźwięki)Ultrasonograf Fisher ScientificFB505110mikrokońcówką Ultrawirówka
Optimax TLX UltrawirówkaBeckman Coulter361545z chłodzeniem
Wirnik TLA120.1Wirnik ultrawirówkowyBeckman Coulter362224
500 ul (8 x 34 mm) probówki poliwęglanowe, grubościenneProbówki do ultrawirówek Beckman Coulter343776do wirnika TLA120.1
Bufor do próbek 4X SDS DomowyN/ASDS-PAGE
TCEP, neutralne pHThermo Fisher77720środek redukujący
(TBS) bufor blokującyThermo Fisher37542bufor blokujący
(TBS) bufor blokujący + 0,05% Tween 20 ThermoFisher37543bufor blokujący i rozcieńczalnik przeciwciał
4-12% Żele Bolt Bis-Tris Plus, 10-dołkowe żeleThermo FisherNW04120BOXprefabrykowane żele SDS-PAGE
Bufor do biegania MES SDS (20X)Bufor do biegania Thermo FisherB0002SDS-PAGE Bufor do biegania
Sól sodowa N-lauroilosarkozyny (sarkozyl)Sigma Detergent AldrichL5777-50G
Przeciwciało anty-Tau-2 (pan tau)Przeciwciała ChemiconMAB375
Przeciwciało antyfosfo-treoniny 231 Przeciwciało TauPrzeciwciała MilliporeMAB5450Przeciwciała
anty-fosfo-seroiny 202 i treoniny 205 Przeciwciało Tau (AT8)Przeciwciała Thermo FisherMN1020
Przeciwciało anty-wczesnego antygenu endosomów 1 (EEA1)abcamPrzeciwciała ab2900
Alexa Fluor 680 kozie przeciwciało anty-mysie IgG (H+L) Przeciwciała drugorzędoweThermo FisherA21058
Alexa Fluor 790 przeciwciało drugorzędowe anty-królicze IgG (H+L) osłaPrzeciwciała Thermo FisherA11374
iBlot2 Dry Blotting SystemThermo FisherIB21001Transfer żelu
iBlot2 Stacki transferowe, nitroceluloza, miniThermo FisherIB23002Transfer żelu
koktajl roztwór

Bibliografia

  1. Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. Toxic Proteins in Neurodegenerative Disease. Science. 296 (5575), 1991(1991).
  2. Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature Medicine. 10, S10-S17 (2004).
  3. Ramírez-Alvarado, M., Merkel, J. S., Regan, L. A systematic exploration of the influence of the protein stability on amyloid fibril formation in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (16), 8979-8984 (2000).
  4. Hamley, I. W. The Amyloid Beta Peptide: A Chemist's Perspective. Role in Alzheimer's and Fibrillization. Chem Rev. 112 (10), 5147-5192 (2012).
  5. Diner, I., et al. Aggregation Properties of the Small Nuclear Ribonucleoprotein U1-70K in Alzheimer Disease. J. Biol. Chem. 289 (51), 35296-35313 (2014).
  6. Gozal, Y. M., et al. Proteomics Analysis Reveals Novel Components in the Detergent-Insoluble Subproteome in Alzheimer's Disease. J. Proteome Res. 8 (11), 5069-5079 (2009).
  7. Hales, C. M., et al. Changes in the detergent-insoluble brain proteome linked to amyloid and tau in Alzheimer's Disease progression. PROTEOMICS. , (2016).
  8. Julien, C., Bretteville, A., Planel, E. Amyloid Proteins: Methods and Protocols. Sigurdsson, E. M., Calero, M., Gasset, M. , Humana Press. 473-491 (2012).
  9. Nizhnikov, A. A., et al. Proteomic Screening for Amyloid Proteins. PLoS ONE. 9 (12), e116003(2014).
  10. Seyfried, N. T., et al. Quantitative analysis of the detergent-insoluble brain proteome in frontotemporal lobar degeneration using SILAC internal standards. J. Proteome Res. 11 (5), 2721-2738 (2012).
  11. Woltjer, R. L., et al. Proteomic determination of widespread detergent insolubility, including Aβ but not tau, early in the pathogenesis of Alzheimer's disease. FASEB J. , (2005).
  12. Miake, H., Mizusawa, H., Iwatsubo, T., Hasegawa, M. Biochemical Characterization of the Core Structure of α-Synuclein Filaments. J. Biol. Chem. 277 (21), 19213-19219 (2002).
  13. Hasegawa, M., et al. Phosphorylated α-Synuclein Is Ubiquitinated in α-Synucleinopathy Lesions. J. Biol. Chem. 277 (50), 49071-49076 (2002).
  14. Neumann, M., et al. Ubiquitinated TDP-43 in Frontotemporal Lobar Degeneration and Amyotrophic Lateral Sclerosis. Science. 314 (5796), 130(2006).
  15. Bishof, I., Diner, I., Seyfried, N. An Intrinsically Disordered Low Complexity Domain is Required for U1-70K Self-association. FASEB J. 29 (Suppl 1), (2015).
  16. Braak, H., Braak, E. Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathol. 82 (4), 239-259 (1991).
  17. Noguchi, A., et al. Isolation and Characterization of Patient-derived, Toxic, High Mass Amyloid β-Protein (Aβ) Assembly from Alzheimer Disease Brains. J. Biol. Chem. 284 (47), 32895-32905 (2009).
  18. Bai, B., et al. U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer's disease. Proc. Natl. Acad. Sci. 110 (41), 16562-16567 (2013).
  19. Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. Alzheimer's β-Amyloid Protein Is Covalently Modified when Dissolved in Formic Acid. J Neurochem. 54 (6), 2050-2056 (1990).
  20. Yang, L. -S., Gordon-Krajcer, W., Ksiezak-Reding, H. Tau Released from Paired Helical Filaments with Formic Acid or Guanidine Is Susceptible to Calpain-Mediated Proteolysis. J Neurochem. 69 (4), 1548-1558 (1997).
  21. Bai, B., et al. U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16562-16567 (2013).
  22. Hales, C. M., et al. U1 small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs) aggregate in Alzheimer's disease due to autosomal dominant genetic mutations and trisomy 21. Mol Neurodegener. 9 (1), 15(2014).
  23. Xiong, L. -W., Raymond, L. D., Hayes, S. F., Raymond, G. J., Caughey, B. Conformational change, aggregation and fibril formation induced by detergent treatments of cellular prion protein. J Neurochem. 79 (3), 669-678 (2001).
  24. Mirra, S. S., et al. The Consortium to Establish a Registry for Alzheimer's Disease (CERAD). Part II. Standardization of the neuropathologic assessment of Alzheimer's disease. Neurology. 41 (4), 479-486 (1991).
  25. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
  26. Guo, J. L., et al. Unique pathological tau conformers from Alzheimer's brains transmit tau pathology in nontransgenic mice. J. Exp. Med. 213 (12), 2635-2654 (2016).
  27. Matveev, S. V., et al. A distinct subfraction of Aβ is responsible for the high-affinity Pittsburgh compound B-binding site in Alzheimer's disease brain. J Neurochem. 131 (3), 356-368 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

frakcjonowanie sarkosyloweprotok ultrawirowaniaanaliza Western blotanaliza proteomicznawzbogacanie fosforylowanej bia ka tauneurodegeneracyjne proteinopatiemetoda testu BCAsystem obrazowania w podczerwieni
Wzbogacanie nierozpuszczalnych w detergentach agregatów białkowych z ludzkiego mózgu pośmiertnego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.