Artykuł metodologiczny

Oceny neurobehawioralne w mysim modelu niedotlenionego i niedokrwiennego uszkodzenia mózgu u noworodków

11.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55838

⸱

24 listopada 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department and Research Institute of Rehabilitation Medicine, Yonsei University College of Medicine, 2Brain Korea 21 PLUS Project for Medical Science, Yonsei University, 3Department of Rehabilitation Medicine, Yonsei University Wonju College of Medicine, 4Rehabilitation Institute of Neuromuscular Disease, Yonsei University College of Medicine, 5Graduate Program of NanoScience and Technology, Yonsei University

W tym artykule

Podsumowanie

Przeprowadziliśmy jednostronne zamknięcie tętnicy szyjnej w 7-10 dniu po urodzeniu mysich szczeniąt CD-1, aby stworzyć model niedotlenienia niedotlenienia (HI) noworodka i zbadaliśmy skutki uszkodzenia mózgu HI. Badaliśmy funkcje neurobehawioralne u tych myszy w porównaniu z normalnymi myszami, które nie były operowane.

Streszczenie

Przeprowadziliśmy jednostronne zamknięcie tętnicy szyjnej na myszach CD-1, aby stworzyć model niedotlenienia niedotlenienia (HI) u noworodków i zbadaliśmy skutki uszkodzenia mózgu u noworodków, badając funkcje neurobehawioralne u tych myszy w porównaniu do myszy nieoperowanych (tj. normalnych). Podczas badania metodę Rice-Vannucci zastosowano w celu wywołania uszkodzenia mózgu u noworodków w wieku 7-10 dni (P7-10) myszy. Operację HI przeprowadzono na szczeniętach poprzez jednostronne podwiązanie tętnicy szyjnej i narażenie na niedotlenienie (8% O2 i 92% N2 przez 90 min). Tydzień po operacji uszkodzone mózgi oceniano gołym okiem przez półprzezroczystą czaszkę i podzielono na podgrupy na podstawie braku (grupa "brak uszkodzenia kory") lub obecności (grupa "uszkodzenie kory") uszkodzenia kory mózgowej, takiego jak zmiana w prawej półkuli. W 6 tygodniu przeprowadzono następujące testy neurobehawioralne w celu oceny funkcji poznawczych i motorycznych: zadanie pasywnego unikania (PAT), test chodzenia po drabinie i test siły chwytu. Te testy behawioralne są pomocne w określaniu skutków uszkodzenia mózgu u noworodków i są stosowane w innych mysich modelach chorób neurodegeneracyjnych. W tym badaniu noworodki myszy z uszkodzeniem mózgu HI wykazywały deficyty motoryczne, które odpowiadały uszkodzeniu prawej półkuli. Wyniki testów behawioralnych są istotne dla deficytów obserwowanych u pacjentów z HI u noworodków, takich jak porażenie mózgowe lub pacjenci z udarem noworodkowym. W tym badaniu ustalono mysi model uszkodzenia mózgu u noworodków, który wykazał różne stopnie deficytów motorycznych i upośledzenia funkcji poznawczych w porównaniu z myszami nieoperowanymi. Ta praca zawiera podstawowe informacje na temat modelu myszy HI. Obrazy MRI pokazują różne fenotypy, oddzielone w zależności od stopnia uszkodzenia mózgu za pomocą testów motorycznych i poznawczych.

Wprowadzenie

Noworodkowe uszkodzenie mózgu HI występuje we wczesnym dzieciństwie (około dwóch pacjentów na 1 000 dzieci)1,2,3,4,5. Badania dotyczące uszkodzenia mózgu u noworodków z przewrotu kości są ważne, a wykorzystanie uznanego mysiego modelu uszkodzenia mózgu u noworodków z przechodnim może ułatwić badania przedkliniczne in vivo nad uszkodzeniem mózgu w postaci hi.

Tradycyjne modele HI są używane na dorosłych szczurach6. W przypadku modelu noworodków metoda Rice'a-Vannucciego jest powszechnie stosowana u szczurów P77,8. Ponieważ jednak szczury i myszy są nieco różne9,10, mimo że oba są gryzoniami, przeprowadziliśmy zmodyfikowaną metodę Rice'a-Vannucciego na szczeniętach CD-1 w P7-10, w oparciu o wcześniejsze badania, które wykazały, że P7-10 to okres z niedojrzałymi oligodendrocytami, odpowiadający ludzkiemu terminowi P011,12. Mysi model HI u noworodków ustala się zarówno poprzez podwiązanie jednostronnej tętnicy szyjnej, jak i narażenie myszy na niedotlenienie 8% tlenem u szczeniąt P7-10.

Myszy poddane zabiegowi wykazywały różne stopnie uszkodzeń mózgu w tylno-bocznej części prawej półkuli. W celu zidentyfikowania deficytów poznawczych i motorycznych przeprowadzono oceny neurobehawioralne oparte na PAT, teście chodzenia po drabinie i teście siły chwytu. Przeanalizowano różnice między myszami nieoperowanymi (tj. Normalnymi) i HI. W pracy przedstawiono podstawowe informacje na temat modelu myszy HI. Obrazy MRI pokazują różne fenotypy, oddzielone w zależności od ciężkości uszkodzeń mózgu za pomocą testów motorycznych i poznawczych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie zwierzęta były utrzymywane w standardowych klatkach (27 × 22.5 × 14 cm3) w placówce akredytowanej przez Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC), z dostępem do pokarmu i wody ad libitum w cyklu 12-godzinnego światła i ciemności. Autorzy przestrzegali przepisów dotyczących ochrony zwierząt, a procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee przy Yonsei University College of Medicine (IACUC nr 2010-0252; 2013-0220).

1. Myszowy model neonatalnego niedotlenienia i niedokrwienia mózgu

  1. Zanurz szczeniaki w narkozie przy użyciu izofluranu.
    1. Umieść szczeniaki (mniej niż 5) w komorze anestetycznej i zamknij pokrywę.
    2. Włącz system anestezjologiczny na około 15 min; dostosuj dopływ gazu i izofluranu za pomocą przenośnego aparatu do znieczulenia. Ustaw przepływomierz tlenu na 1,5 L/min. Ustaw parownik izofluranu na 3-5% w celu indukcji znieczulenia.
    3. Po 15 min ustaw parownik izofluranu na 1-2% w celu podtrzymania znieczulenia.
  2. Połóż w pełni znieczulonego szczeniaka pod mikroskopem sekcyjnym (brzuchem w stronę badacza) i przymocuj go taśmą.
  3. Wykonaj nacięcie o długości ~0,7 mm na szyi za pomocą wysterylizowanych nożyczek.
  4. Ostrożnie usuń tkankę tłuszczową za pomocą wysterylizowanej pęsety i odsłoń prawą tętnicę szyjną.
  5. Podwiąż prawą tętnicę szyjną za pomocą wchłanialnej nici chirurgicznej 5-0.
  6. Zaszyj nacięcie na szyi nicią 5-0.
  7. Umieść każdego szczeniaka w podgrzewanej do 37 °C komorze hipoksycznej na 1 h w celu rekonwalescencji. Nie zamykaj pokrywy komory.
  8. 1 h po zabiegu, gdy szczeniaki całkowicie się obudzą, zamknij pokrywę komory hipoksycznej i obniż poziom gazów, aby ustanowić warunki hipoksji (8% O2 i 92% N2).
  9. Po 90 min hipoksji przenieś szczeniaki z powrotem do klatek.
  10. Tydzień po urazie mózgu HI powtórz krok 1.
    1. Po znieczuleniu wykonaj nacięcie skóry głowy wysterylizowanymi nożyczkami i pęsetą, aby zidentyfikować uszkodzenie mózgu w obszarze tylno-bocznym prawej półkuli.
      Uwaga: Zabieg ten wywołuje hipoksję u szczeniąt. Obecność i zakres uszkodzenia mózgu u wszystkich myszy są oceniane wizualnie gołym okiem przez półprzezroczystą czaszkę. Szczeniaki są klasyfikowane do grup na podstawie wielkości lub objętości odbarwienia (tj. zmiany w mózgu). Jeśli nie ma widocznego uszkodzenia kory, mysz jest zaliczana do grupy „bez uszkodzenia kory”. Jeśli występuje widoczne uszkodzenie kory (tj. zmiana w prawej półkuli), mysz jest zaliczana do grupy „z uszkodzeniem kory”. Ponieważ klasyfikacja myszy do grup odbywa się tydzień po operacji, grupy mogą zostać zmodyfikowane, gdy morfologia próbek mózgu zostanie wyraźnie określona w momencie uśmiercenia zwierząt1,2,3,4.

figure-protocol-1
Rycina 1: Model noworodkowego niedotlenienia i niedokrwienia (HI) mózgu u myszy.
(A) Siedmiodniowe piszczątko mysie poddano zabiegowi chirurgicznemu, podczas którego wykonano podwiązanie prawego tętnicy szyjnej jednostronnie. (B) Piszczątka umieszczono w komorze hipoksyjnej na 90 min w atmosferze 8% O2 i 92% N2. (C, D i E) Mózgi z noworodkowym uszkodzeniem HI wykazywały różny stopień nasilenia obrażeń i zostały sklasyfikowane na podstawie stopnia uszkodzenia. W 14. tygodniu pobrano mózgi i zwizualizowano zmiany chorobowe. (C) Obraz mózgu sklasyfikowanego jako „brak uszkodzenia kory”. Zarówno (D), jak i (E) zostały zakwalifikowane do grupy „uszkodzenie kory”. (F, G i H) Reprezentacyjne obrazy MRI odpowiednio dla myszy z punktów (C), (D) i (E). (F) Uszkodzenie w hipokampie zaznaczono żółtą strzałką, a zmiany w prawej półkuli również wskazano żółtymi strzałkami (G i H). Paski skali = 1 mm  Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

2. Neonatalne testy behawioralne

Uwaga: W tym przypadku testy behawioralne przeprowadzono w 6. tygodniu życia.

  1. Test biernego unikania.
    UWAGA: W celu oceny funkcji pamięci w oparciu o uczenie się i unikanie bodźca awersyjnego należy przeprowadzić dwukomorowy test biernego unikania (PAT) typu step-through13,14,15,16.
    1. Umieścić mysz w jasnej komorze pleksiglasowej skrzynki transportowej (41,5 × 21 × 35 cm3) aparatury PAT.
    2. Po 30 s otworzyć drzwi gilotynowe i zarejestrować czas utajenia przejścia myszy do ciemnej komory (do 300 s).
    3. Zamknąć drzwi gilotynowe, gdy wszystkie cztery kończyny myszy znajdą się całkowicie w ciemnej komorze.
    4. Podać wstrząs elektryczny w obrębie stóp (0,5 mA) przez 2 s, a następnie zwrócić mysz do klatki.
    5. Ponownie umieścić mysz w jasnej komorze 24 h po podaniu wstrząsu elektrycznego.
    6. Otworzyć drzwi gilotynowe 10 s po całkowitym umieszczeniu myszy w jasnej komorze i zarejestrować czas utajenia przejścia myszy do ciemnej komory (do 300 s).
  2. Test chodzenia po drabinie.
    UWAGA: Zadanie chodzenia po szczeblach drabiny pozwala na rozróżnienie subtelnych zaburzeń funkcji motorycznych poprzez połączenie jakościowej i ilościowej analizy sprawnego chodzenia17,18.
    1. Włączyć kamerę wideo.
    2. Umieścić mysz na panelu startowym drabiny i natychmiast rozpocząć nagrywanie.
    3. Nagrywać wideo, koncentrując się na kończynach myszy.
    4. Zatrzymać nagrywanie, gdy mysz dotknie ostatniego panelu drabiny. Powtórzyć przejście w obie strony cztery razy.
    5. Przeanalizować nagranie wideo i ręcznie policzyć liczbę poślizgów każdej przedniej kończyny w następujący sposób:
      1. Odtworzyć nagranie wideo na komputerze z niską prędkością (0,1x) i ręcznie policzyć kroki.
  3. Test siły chwytu.
    UWAGA: Test siły chwytu wykonuje się przy użyciu miernika siły chwytu, który zawiera czujnik naprężeń typu push-pull.
    1. Zamocować aparat do pomiaru siły chwytu do akrylowego panelu.
    2. Umieścić mysz na akrylowym panelu i przytrzymać ją za ogon.
      1. Przesunąć rękę trzymającą ogon tak, aby mysz mogła dosięgnąć i chwycić metalowy drut aparatury.
    3. Wykonać kilka prób, aż mysz chwyci trójkątny element metalowego drutu (o średnicy 2 mm); siła szczytowa jest automatycznie rejestrowana przez aparat w gramach.
      UWAGA: Do analizy należy wykorzystać średnią siłę szczytową z trzech prób19,20,21.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wszystkie dane przedstawiono jako średnią ± błąd standardowy średniej (SEM). Porównanie zmiennych między dwiema grupami przeprowadzono za pomocą niezależnego lub parzystego testu t w oprogramowaniu statystycznym SPSS. Wartość p <0,05 uznano za istotną statystycznie.

Mózgi z noworodkowym urazem HI wykazywały różny stopień nasilenia uszkodzeń i zostały odpowiednio skategoryzowane (Rysunek...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym badaniu wywołaliśmy uszkodzenie mózgu HI u noworodka myszy P7-10 CD-1 i zidentyfikowaliśmy uszkodzenie mózgu z odpowiednimi deficytami poznawczymi i motorycznymi. Podczas tego zabiegu krytyczne było zamknięcie jednostronnej prawej tętnicy szyjnej. Na tym etapie tętnica może zostać uszkodzona i rozerwana. Większość szczeniąt, które doświadczyły pęknięcia tętnicy, zmarła. I odwrotnie, jeśli naukowcy podwiązali inną żyłę krwionośną zamiast jednostronnej prawej tętnicy szyjnej, mózg szczeniaka był tylko nieznacznie usz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają sprzecznych interesów.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez granty z National Research Foundation (NRF-2014R1A2A1A11052042; 2015M3A9B4067068), Ministerstwa Nauki i Technologii, Republiki Korei, Koreańskiego Projektu Badawczo-Rozwojowego Technologii Medycznych (HI16C1012), Ministerstwa Zdrowia i Opieki Społecznej, Republiki Korei, oraz Programu Pomocy Badawczej Wydziału "Dongwha" Kolegium Medycznego Uniwersytetu Yonsei (6-2016-0126).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Komora hipoksyjnaJeung Do Bio & Plant CoExperimental Builder
Aparatura PATJeung Do Bio & Plant CoEksperymentalny budowniczy
Szczebel drabiny chodzącyJeung Do Bio & Plant CoEksperymentalny budowniczy
SDI System siły chwytuSan Diego Instruments Inc.
Miernik siły chwytuUgo Basile47200
Harvard Apparatus System anestezjologiczny Fluovac Aparat Harvard Pudełko
anestezjologicznePudełko akrylowe
Fran Liquid (Isofluoran)Hana Pharm. Co., Ltd.Znieczulenie ogólne ( izofluran 100ml)
Myszy CD-1Orient Co., Ltd.
Niebieski nylonowy mono niewchłanialny szew 5-0 50cmAilee Co., Ltd.NB 521
IBM SPSS StatisticsIBMVer. 23

Bibliografia

  1. Yager, J. Y. Animal models of hypoxic-ischemic brain damage in the newborn. Semin Pediatr Neurol. 11 (1), 31-46 (2004).
  2. Vannucci, R. C., et al. Rat model of perinatal hypoxic-ischemic brain damage. J Neurosci Res. 55 (2), 158-163 (1999).
  3. Im, S. H., et al. Induction of striatal neurogenesis enhances functional recovery in an adult animal model of neonatal hypoxic-ischemic brain injury. Neuroscience. 169 (1), 259-268 (2010).
  4. Clowry, G. J., Basuodan, R., Chan, F. What are the Best Animal Models for Testing Early Intervention in Cerebral Palsy? Front Neurol. 5 (258), 1-17 (2014).
  5. Colver, A., Fairhurst, C., Pharoah, P. O. Cerebral palsy. Lancet. 383 (9924), 1240-1249 (2014).
  6. Levine, S. Anoxic-ischemic encephalopathy in rats. Am J Pathol. 36, 1-17 (1960).
  7. Rice 3rd, J. E., Vannucci, R. C., Brierley, J. B. The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat. Ann Neurol. 9 (2), 131-141 (1981).
  8. Lafemina, M. J., Sheldon, R. A., Ferriero, D. M. Acute hypoxia-ischemia results in hydrogen peroxide accumulation in neonatal but not adult mouse brain. Pediatr Res. 59 (5), 680-683 (2006).
  9. Brazel, C. Y., Rosti 3rd, R. T., Boyce, S., Rothstein, R. P., Levison, S. W. Perinatal hypoxia/ischemia damages and depletes progenitors from the mouse subventricular zone. Dev Neurosci. 26 (2-4), 266-274 (2004).
  10. Buono, K. D., et al. Mechanisms of mouse neural precursor expansion after neonatal hypoxia-ischemia. J Neurosci. 35 (23), 8855-8865 (2015).
  11. Rumajogee, P., Bregman, T., Miller, S. P., Yager, J. Y., Fehlings, M. G. Rodent Hypoxia-Ischemia Models for Cerebral Palsy Research: A Systematic Review. Front Neurol. 7 (57), 1-20 (2016).
  12. Hagberg, H., Peebles, D., Mallard, C. Models of white matter injury: comparison of infectious, hypoxic-ischemic, and excitotoxic insults. Ment Retard Dev Disabil Res Rev. 8 (1), 30-38 (2002).
  13. Wi, S., Yu, J. H., Kim, M., Cho, S. R. In Vivo Expression of Reprogramming Factors Increases Hippocampal Neurogenesis and Synaptic Plasticity in Chronic Hypoxic-Ischemic Brain Injury. Neural Plast. 2016 (2580837), 1-11 (2016).
  14. Lu, Y., Christian, K., Lu, B. BDNF: a key regulator for protein synthesis-dependent LTP and long-term memory? Neurobiol Learn Mem. 89 (3), 312-323 (2008).
  15. Manabe, T., et al. Facilitation of long-term potentiation and memory in mice lacking nociceptin receptors. Nature. 394 (6693), 577-581 (1998).
  16. Alonso, M., et al. BDNF-triggered events in the rat hippocampus are required for both short- and long-term memory formation. Hippocampus. 12 (4), 551-560 (2002).
  17. Seo, J. H., et al. In Situ Pluripotency Factor Expression Promotes Functional Recovery From Cerebral Ischemia. Mol Ther. 24 (9), 1538-1549 (2016).
  18. Kim, M. S., et al. Environmental enrichment enhances synaptic plasticity by internalization of striatal dopamine transporters. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (12), 2122-2133 (2015).
  19. Lee, M. Y., et al. Alteration of synaptic activity-regulating genes underlying functional improvement by long-term exposure to an enriched environment in the adult brain. Neurorehabil Neural Repair. 27 (6), 561-574 (2013).
  20. Rha, D. W., et al. Effects of constraint-induced movement therapy on neurogenesis and functional recovery after early hypoxic-ischemic injury in mice. Dev Med Child Neurol. 53 (4), 327-333 (2011).
  21. Chong, H. J., Cho, S. R., Jeong, E., Kim, S. J. Finger exercise with keyboard playing in adults with cerebral palsy: A preliminary study. J Exerc Rehabil. 9 (4), 420-425 (2013).
  22. Chong, H. J., Cho, S. R., Kim, S. J. Hand rehabilitation using MIDI keyboard playing in adolescents with brain damage: a preliminary study. NeuroRehabilitation. 34 (1), 147-155 (2014).
  23. Seo, J. H., Yu, J. H., Suh, H., Kim, M. S., Cho, S. R. Fibroblast growth factor-2 induced by enriched environment enhances angiogenesis and motor function in chronic hypoxic-ischemic brain injury. PLoS One. 8 (9), e74405(2013).
  24. Washington, P. M., et al. The effect of injury severity on behavior: a phenotypic study of cognitive and emotional deficits after mild, moderate, and severe controlled cortical impact injury in mice. J Neurotrauma. 29 (13), 2283-2296 (2012).
  25. Cho, S. R., et al. Astroglial Activation by an Enriched Environment after Transplantation of Mesenchymal Stem Cells Enhances Angiogenesis after Hypoxic-Ischemic Brain Injury. Int J Mol Sci. 17 (9), 1-15 (2016).
  26. Tsuji, M., et al. A novel reproducible model of neonatal stroke in mice: comparison with a hypoxia-ischemia model. Exp Neurol. 247, 218-225 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Jednostronne podwi zanie t tnicy szyjnejzadanie pasywnego unikaniatest chodzenia po drabinietest si y chwytuobrazowanie MRIocena uszkodze kory m zgowejuszkodzenie hipokampadeficyty motoryczne

Powiązane artykuły