Dostrajanie w paśmie theta hipokampa in vitro: metodologie nagrywania z izolowanego obwodu septohipokampa gryzoni

Oscylacje theta w hipokampie (4 - 12 Hz) są jednymi z najbardziej dominujących form aktywności rytmicznej w mózgu ssaków i uważa się, że odgrywają kluczową rolę w funkcjach poznawczych, takich jak przetwarzanie informacji czasoprzestrzennych i tworzenie wspomnień epizodycznych^1,2,3. Podczas gdy kilka badań in vivo, które podkreślają związek komórek miejsca modulowanych przez theta z nawigacją przestrzenną i badaniami nad zmianami chorobowymi, a także dowody kliniczne, wspierają pogląd, że oscylacje theta w hipokampie są zaangażowane w tworzenie pamięci^4,5^,6, mechanizmy związane z generowaniem oscylacji theta w hipokampie nadal nie są w pełni zrozumiałe. Wczesne badania in vivo sugerowały, że aktywność theta zależy głównie od zewnętrznych oscylatorów, w szczególności rytmicznego sygnału wejściowego z aferentnych struktur mózgu, takich jak przegroda i kora śródwęchowa^7,8,9,10. Na podstawie obserwacji in vitro postulowano również rolę czynników wewnętrznych - wewnętrznej łączności sieci neuronowych hipokampa wraz z właściwościami neuronów hipokampa - ^{11,12,13,14,15,16,17,18}. Jednakże, poza kilkoma przełomowymi badaniami^19,20,21, trudności w opracowaniu podejść, które mogłyby odtworzyć fizjologicznie realistyczne działania populacji w prostych preparatach in vitro, na długi czas opóźniły bardziej szczegółowe badania eksperymentalne wewnętrznych zdolności hipokampa i pokrewnych obszarów do samodzielnego generowania theta. Drgań.

Ważną wadą standardowego eksperymentu in vitro z cienkimi plasterkami jest to, że komórkowa i synaptyczna organizacja struktur mózgu w 3D jest zwykle zagrożona. Oznacza to, że wiele form skoordynowanych działań sieciowych opartych na przestrzennie rozproszonych zespołach komórek, począwszy od zlokalizowanych grup (promień ≤1 mm) do populacji neuronów rozsianych po jednym lub więcej obszarach mózgu (>1 mm), nie może być obsługiwanych. Biorąc pod uwagę te rozważania, potrzebny był inny rodzaj podejścia, aby zbadać, w jaki sposób oscylacje theta pojawiają się w hipokampie i rozprzestrzeniają się do powiązanych korowych i podkorowych struktur wyjściowych.

W ostatnich latach, początkowy rozwój preparatu "kompletna septo-hipokamp" do badania dwukierunkowych interakcji dwóch struktur²², oraz wynikająca z tego ewolucja preparatu "izolowanego hipokampa", ujawniły, że wewnętrzne oscylacje theta występują spontanicznie w hipokampie bez zewnętrznego rytmicznego bodźca²³. Wartość tych podejść opiera się na początkowym spostrzeżeniu, że cała struktura funkcjonalna tych regionów musiała zostać zachowana, aby funkcjonować jako generator rytmu theta in vitro²².

Wszystkie procedury zostały wykonane zgodnie z protokołami i wytycznymi zatwierdzonymi przez Komitet Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu McGill i Kanadyjską Radę Opieki nad Zwierzętami.

1. Ostra hipokamp in vitro Przygotowanie

UWAGA: Izolacja nienaruszonego preparatu hipokampa obejmuje trzy główne kroki: (1) przygotowanie roztworów i sprzętu, (2) Rozwarstwienie hipokampa i (3) ustawienie systemu szybkiej perfuzji niezbędnego do generowania wewnętrznych oscylacji theta. W tym protokole terminowe wykonanie procedur – od sekcji po rejestrację – jest szczególnie ważne, ponieważ izolowany hipokamp stanowi tak gęsty, ale delikatny preparat, że utrzymanie funkcjonalnej łączności struktury in vitro wymaga dużej staranności. Przygotowanie wszystkiego wcześniej zapewnia, że odpowiedni poziom perfuzji jest dostępny tak wcześnie, jak to możliwe, aby zminimalizować uszkodzenia komórek i utrzymać funkcje fizjologiczne.

1. Roztwór sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego na bazie sacharozy (aCSF)
   1. Przygotować 1X podstawowy roztwór sacharozy do użycia do preparacji i inkubacji po rozbiorze. Połączyć wszystkie składniki wymienione w tabeli 1, z wyjątkiem CaCl₂, w 1 l wody dejonizowanej i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni.
2. Standardowe rozwiązanie aCSF
   1. Przygotuj standardowy aCSF do perfuzji izolowanego hipokampa o wysokim natężeniu przepływu podczas zapisów elektrofizjologicznych. Aby uzyskać skoncentrowany (5X) surowiec aCSF, należy rozpuścić wszystkie składniki wymienione w tabeli 2, z wyjątkiem CaCl₂, w 2 litrach wody dejonizowanej i przechowywać w temperaturze 4 °C.
3. Przygotuj sprzęt
   1. Przed rozpoczęciem sekcji należy ustawić obszar stołu z plastikową tacą wypełnioną lodem (30 x 20 x 5 cm), przewodami rurkowymi połączonymi karbogenem i trzema szklanymi szalkami Petriego (10 x 2 cm) (patrz Rysunek 1).
   2. Dodaj 300 ml roztworu sacharozy (1X bulion) do zlewki o pojemności 500 ml, bąbelkuj karbogenem (95%_O2, 5% CO₂) i dodaj Ca²⁺ [1,2 mM].
   3. Przenieść 60 ml roztworu sacharozy na szklaną szalkę Petriego i pozostawić w temperaturze pokojowej. Resztę umieść w zamrażarce o temperaturze 4 °C na 10 - 15 minut.
   4. Bąbelkować lodowaty roztwór sacharozy z karbogenem podczas sekcji.
   5. Napełnić drugą szalkę Petriego (zimną komorę) roztworem sacharozy (4 °C) i przechowywać na lodzie.
   6. Dodaj 30 ml lodowatego roztworu sacharozy do zlewki o pojemności 50 ml.

2. Całe rozwarstwienie hipokampa

UWAGA: Metoda preparowania izolowanego hipokampa jest zasadniczo identyczna z tą opracowaną i opisaną pierwotnie²², ale z dodatkowymi szczegółami i zmianami dotyczącymi szybkości perfuzji i technik nagrywania.

1. Rozwarstwienie mózgu
   1. Znieczulić mysz (P20 - 35) pod wyciągiem za pomocą małego ręcznika papierowego nasączonego 1 ml izofluranu (100%), który dodaje się do klatki.
   2. Odetnij głowę znieczulonej myszy i szybko zanurz głowę w lodowatym roztworze sacharozy (zlewka 50 ml, ~ 5 s). Przełóż na ręcznik papierowy.
   3. Użyj skalpela, aby wykonać przyśrodkowe nacięcie skóry (od ogonowej do rostralnej) i popchnij skórę po bokach, aby odsłonić czaszkę.
   4. Rozetnij czaszkę małymi nożyczkami i użyj szpatułki, aby szybko wydobyć mózg i wrzucić go na szalkę Petriego zawierającą lodowaty roztwór sacharozy. Odczekaj 1-2 minuty, aż mózg ostygnie.
   5. Podczas gdy mózg dochodzi do siebie, dodaj 2-3 ml roztworu sacharozy na pokrytą bibułą tarczę Petriego na lodowym naczyniu Petriego.
2. Izolowanie hipokampa
   1. Umieść mózg na naczyniu sekcyjnym w pozycji pionowej.
   2. Usuń móżdżek i korę czołową za pomocą żyletki. Przetnij mózg na pół wzdłuż płaszczyzny środkowej i włóż dwie izolowane półkule z powrotem do komory trzymania. Odczekaj kolejne 1-2 minuty na regenerację.
   3. Umieść pojedynczy mózg z półsekcji pionowo na naczyniu separacyjnym.
   4. Obracaj szalkę, aż struktury strzałkowe będą zwrócone w stronę obserwatora, a osadzony zarys kompleksu przegrody będzie widoczny jako cienka warstwa tkanki w kształcie gruszki przed wzgórzem.
   5. Przytrzymaj mózg z półkulą stabilnie za pomocą mikroszpatułki i umieść mały koniec szpatułki pokrytej politetrafluoroetylenem (PTFE) bezpośrednio za (ogonowo do) obszaru przegrody.
   6. Włóż powlekaną szpatułkę pod przegrodę i przesuń końcówkę w dół, aż dojdziesz do naczynia sekcyjnego. Odetnij włókna, które łączą obszar przegrody doogonowo. Powtórz tę samą operację wzdłuż przedniej krawędzi przegrody i przetnij włókna łączące się z czołową częścią mózgu.
   7. Trzymając szpatułkę lekko przytrzymując wewnętrzną część kory tuż nad hipokampem w pozycji pionowej, użyj mikroszpatułki, aby ostrożnie pociągnąć w dół jądra wzgórza, podwzgórza i pozostałe jądra pnia mózgu. Za pomocą szpatułki odetnij i usuń odciągniętą chusteczkę.
   8. Obróć izolowaną półkulę na bok i zidentyfikuj zarys hipokampa.
   9. Włóż powlekaną szpatułkę do komory bocznej, pod rostralnym końcem grzbietowego hipokampa.
   10. Trzymaj szpatułkę poziomo wyrównaną z płaszczyzną strzałkową mózgu podzielonego na półkę i przesuwaj ją po gładkim konturze ścian komór, aż końcówka wyłoni się doogonowo.
   11. Przytrzymaj szpatułkę pod hipokampem i lekko dociśnij ją do włókien łączących, wzdłuż wewnętrznej warstwy, w miejscu, w którym hipokamp łączy się z leżącą nad nim korą. Nałóż mikroszpatułkę na zewnętrzną stronę tej warstwy i przesuń ją po powlekanej szpatułce, aby przeciąć łączące włókna.
   12. Aby zakończyć ekstrakcję, obróć naczynie preparacyjne i włóż powlekaną szpatułkę pod brzuszny hipokamp. Lekko przytrzymaj wnętrze fałdu korowego szpatułką i przetnij połączenia śródwęchowe, wykonując ruch tnący na mikroszpatułkę.
       UWAGA: Cały kompleks septohipokampa można usunąć, umieszczając powlekaną szpatułkę pod całym hipokampem i wyciągając pozostałą tkankę mózgową od spodu.
   13. Po zakończeniu izolacji utrzymuj hipokamp oparty na naczyniu i dodaj kroplę lodowatego roztworu sacharozy, aby był chłodny. Ostrożnie odetnij pozostałą korę i włókna i oddziel hipokamp od przegrody, delikatnie przekładając żyletkę przez otwór.
       UWAGA: Jeśli zapisy patch clamp mają być wykonane z komórek piramidalnych (patrz Sekcja 4.6 Kontrola optogenetyczna), izolowany hipokamp można przeciąć poprzecznie pod kątem 45°, aby odsłonić piramidalną warstwę preparatu CA1 (preparacja "pod kątem"), bez naruszania obwodów sieci lokalnej w pozostałej części hipokampa.
   14. Przenieść preparat do roztworu sacharozy o temperaturze pokojowej i pozostawić do odzyskania przez 15 - 30 minut przed przeniesieniem do komory rejestrującej.

3. Ustaw szybką perfuzję do nagrywania izolowanego hipokampa

1. Skonfiguruj grawitacyjny system perfuzyjny, aby umożliwić ciągły szybki dopływ natlenionego aCSF z prędkością 20 - 25 ml / min.
   1. Przygotować wcześniej kolby CSF (1X) i zanurzyć je w kąpieli rozgrzewającej (~30 °C) co najmniej 15 minut przed rozpoczęciem eksperymentu. Włączyć system podgrzewania roztworu w linii (30 °C).
   2. Użyj bełkotek akwariowych i przewodów rurowych podłączonych do zbiornika karbogenu, aby natlenić aCSF przez cały eksperyment i dodaj CaCl₂ [2 mM] przed rozpoczęciem perfuzji.
   3. Zatrzymaj przepływ płynu mózgowo-rdzeniowego i przenieś hipokamp do komory rejestracyjnej za pomocą szerokiego końca szklanej pipety. Pozwól, aby preparat nasycony sacharozą opadł i osiadł na dnie.
   4. Umieścić preparat na środku komory rejestracyjnej (w linii z osią wlot-wylot) z gładką powierzchnią CA1 i SUB na górze. Ustabilizuj hipokamp za pomocą małych ciężarów na końcach przegrody i skroniowej i ponownie uruchom przepływ CSF.

4. Elektrofizjologia w izolowanym hipokampie

1. Zewnątrzkomórkowy zapis in vitro oscylacji theta hipokampa
   1. Do zewnątrzkomórkowego monitorowania potencjału pola lokalnego (LFP) lub aktywności pojedynczej jednostki z izolowanego hipokampa in vitro należy użyć szklanych mikropipet (1 - 3 MΩ) wypełnionych płynem CSF. Nagrywaj niskoszumowe sygnały potencjału pola sprzężonego z prądem przemiennym za pomocą wzmacniacza krosowego o wzmocnieniu x1000, filtrowaniu pasmowo-przepustowym online 0,1 - 500 Hz i częstotliwości próbkowania 5-20 kHz.
      UWAGA: Specjalnie skonstruowany mikroskop używany w tym protokole jest wyposażony w obiektywy o małym (2,5x) i dużym powiększeniu (40x) do oglądania hipokampa w małym powiększeniu, a także mikroskopię wideo w podczerwieni i epifluorescencję do rozpoznawania pojedynczych komórek. Elementy tego systemu obejmują pionowy mikroskop fluorescencyjny, kostki filtrów fluorescencyjnych, analogową kamerę wideo i cyfrowy frame grabber z oprogramowaniem do obrazowania, niestandardową komorę perfuzyjną na scenie (Rysunek 2A, wstawka i) oraz wysoce precyzyjne mikromanipulatory do zapisów neuronalnych i umieszczania światłowodów.
   2. Użyj kamery zamontowanej na mikroskopie i podłączonej do wyświetlacza komputera, aby sprawdzić preparat hipokampa w małym powiększeniu (2,5x) i szybko sprawdzić, czy nie ma podcięć lub uszkodzeń na powierzchni zewnętrznej. Ukośnie zorientowany układ włókien wyrostka zębodołowego wzdłuż gładkiej powierzchni CA1 powinien być widoczny (Rysunek 2A, wstawka ii) podczas świecenia przechodzącego światła przez hipokamp.
   3. Użyj obiektywu szerokokątnego o małym powiększeniu, aby wyświetlić izolowany hipokamp i rozmieszczenie elektrod LFP w określonych miejscach nagrywania.
      UWAGA: Układ izolowanego preparatu hipokampa z wieloma elektrodami umieszczonymi w różnych miejscach zapisu jest zilustrowany na Rysunek 2A.
   4. Opuść elektrodę LFP do kąpieli, aż dotknie powierzchni (pęcherzyka) obszaru CA1.
      UWAGA: Zwykle powoduje to szybki stan przejściowy w nagraniu sprzężonym z prądem przemiennym, podobny do tego, co dzieje się, gdy elektroda styka się z nośnikiem zapisu. Po wykonaniu tego kroku monitor audio może być przydatny do odsłuchiwania sygnału kanału LFP.
      UWAGA: Często wczesne oznaki aktywności pojawiają się dopiero po 10 - 15 minutach, dlatego ważne jest, aby nie przechodzić szybko do przygotowania. Jeśli po tym okresie powierzchniowa elektroda LFP nadal nie nabiera aktywności, przesuń się nieco dalej w dół przez warstwę oriens i zatrzymuj się okresowo, aby sprawdzić, czy podczas zbliżania się do głównej warstwy ogniw pojawia się jakaś forma aktywności. Jeśli nic nie zostanie wykryte po kolejnych 5-10 minutach, ostrożnie schuj elektrodę i umieść ją w innym miejscu wzdłuż tego samego obszaru.
   5. Przełóż elektrodę LFP przez warstwę piramidalną. Obserwuj, że zewnątrzkomórkowa aktywność impulsowa początkowo wzrasta, gdy wykrywane jest pojedyncze wyładowanie z pojedynczych neuronów (głównie piramidowych i hamujących komórek koszowych). Obniż elektrodę jeszcze bardziej i zwróć uwagę, że wybicie zaczyna ponownie zanikać, gdy końcówka przechodzi w promienie. Zauważ, że wyraźnie widoczna oscylacja sieci w zakresie częstotliwości theta (4 - 12 Hz) staje się widoczna i osiąga maksymalną amplitudę (~100 - 300 μV), gdy miejsce nagrywania jest obniżane przez promienie.
2. Oscylacje theta w jednym regionie
   1. Aby przetestować właściwości przestrzenne spontanicznych oscylacji theta w regionie CA1, umieść końcówkę referencyjnej elektrody LFP w przyśrodkowym miejscu CA1 (przyśrodkowo umieszczonym wzdłuż podłużnej osi przegrodowo-skroniowej) i opuść ją do promienia, jak opisano wcześniej.
   2. Umieść drugą elektrodę LFP w miejscu CA1 (200 - 800 μm przegrody lub skroniowej od pierwszego LFP) i obserwuj, że oscylacje theta CA1 mogą synchronizować się na stosunkowo duże odległości.
3. Oscylacje Theta w różnych warstwach
   1. Aby przetestować właściwości oscylacji theta w warstwach hipokampa, pozostaw referencyjną elektrodę LFP w miejscu promieniowania CA1. Zaczynając tuż nad warstwą oriens, opuść drugą elektrodę do warstwy komórki piramidalnej i przez promienie. Obserwuj stopniowe odwrócenie sygnału LFP (względne odwrócenie fazy) w poprzek warstwy piramidalnej.
      UWAGA: Reprezentatywne przykłady tego typu działań można znaleźć w Rysunek 2B. Przykłady profili laminarnych/głębokości oraz analizy gęstości źródła prądu (CSD) ilustrujące miejsce odwrócenia faz w izolowanych hipokampach zostały opublikowane wcześniej^23,24,25.
4. Oscylacje gamma i sprzężenie theta-gamma w nienaruszonym hipokampie
   1. Umieść elektrodę polową na granicy CA1 / SUB i opuść ją, aż znajdzie się na granicy między warstwą piramidalną i molekularną. Na tym poziomie można zarejestrować potencjał pola wykazujący wyraźne oscylacje gamma ze zmianami amplitudy, które synchronizują fazę z lokalnym rytmem theta²⁴. Dostosuj skalowanie, aby obserwować powolną skalę czasową sprzężenia theta-gamma. Zauważ, że rozbłyski gamma występują w dwóch różnych pasmach częstotliwości, które mogą być ujawnione przez filtrowanie pasmowo-przepustowe trwającego sygnału LFP w zakresie wolnym (25 - 50 Hz) i szybkim gamma (150 - 250 Hz) (Zobacz Rysunek 2C dla reprezentatywnych filtrowanych ścieżek).
5. Zapis klamry krosowej całej komórki podczas oscylacji theta hipokampa in vitro
   UWAGA: W tej części protokołu celem jest uzyskanie wizualnie kierowanych nagrań klamrów krosowych całych komórek ze zidentyfikowanych interneuronów w izolowanych hipokampach od transgenicznych myszy PV-TOM eksprymujących białko fluorescencyjne, tdTomato, pod kontrolą promotora PV (więcej szczegółów można znaleźć w materiałach i Ref ²⁶).
   1. Użyj wideomikroskopii fluorescencyjnej z małym (2,5x) i dużym (40x) powiększeniem, aby zobrazować tdTomato-dodatnie interneurony znajdujące się w pobliżu powierzchni preparatu hipokampa z myszy PV-TOM (Rysunek 3). Należy zauważyć, że podczas gdy neurony PV-TOM mogą być z powodzeniem wizualizowane i celowane w łatkę przez pęcherzyk zębodołowy (do 100 μm), niefluorescencyjne komórki piramidalne można również stosunkowo łatwo uzyskać, gdy hipokamp jest przygotowany techniką cięcia pod kątem (patrz uwaga sekcja 2.2.14).
   2. W widoku hipokampa w małym powiększeniu umieść elektrodę LFP w CA1 / SUB, aby monitorować oscylacje theta, przygotowując się do eksperymentów z zaciskiem krosowym.
   3. Przełącz się na 40-krotne powiększenie i zanurz obiektyw w obszarze docelowym; Opuść go, aż górne warstwy staną się widoczne. Manipuluj położeniem mikroskopu, aby zapewnić wystarczający otwarty dostęp do pipety z plastrem z przeciwnej strony.
   4. Pod mikroskopią fluorescencyjną wybierz fluorescencyjną komórkę PV-TOM i zbliż się do niej za pomocą pipety płatowej (2 - 3 MΩ) wypełnionej standardowym roztworem wewnątrzkomórkowym.
   5. Użyj ustnika, aby wywrzeć lekkie nadciśnienie na pipecie i monitoruj rezystancję, gdy elektroda jest opuszczana na ogniwo. Gdy końcówka styka się z komórką docelową, opór pipety wzrasta i pojawia się wyraźny wgłębienie, gdy dodatnie ciśnienie naciska na membranę. Zwolnij ciśnienie i sprawdź, czy impuls prądu spłaszcza się, gdy zaczyna tworzyć się uszczelka. Natychmiast zacisnąć na potencjale hiperpolaryzacyjnym (-70 mV), a po uzyskaniu uszczelnienia GΩ rozerwać błonę komórkową za pomocą niewielkiej ilości podciśnienia przyłożonego przez uchwyt pipety.
   6. Po skonfigurowaniu całej komórki zbadaj właściwości fizjologiczne zidentyfikowanej komórki PV podczas spontanicznych oscylacji hipokampa (Rysunek 3B).
   7. Obserwuj, że wewnątrzkomórkowy zapis potencjału błonowego z ogniw PV charakteryzuje się szybkim wzrostem i wybuchami potencjałów czynnościowych zsynchronizowanych z trwającym rytmem CA1 / SUB theta.
   8. Przełącz się na zacisk napięciowy i utrzymuj komórkę przy różnych potencjałach błonowych, aby scharakteryzować stosunek pobudzających i hamujących prądów synaptycznych generowanych przez wewnętrzną aktywność rytmiczną. Przykład nagrania patch clamp z komórki piramidalnej jest pokazany w Rysunek 3A dla porównania.
6. Kontrola optogenetyczna w izolowanym hipokampie
   UWAGA: Do optogenetycznej kontroli aktywności sieci hipokampa stosuje się tutaj strategię specyficzną dla typu komórki, obejmującą rytmiczną aktywację komórek GABA-ergicznych zawierających PV, ponieważ wykazano, że komórki te odgrywają główną rolę w synchronizacji głównych populacji komórek w izolowanym hipokampie²⁵. Selektywną ekspresję pobudzającej rodopsyny kanałowej-2 (ChR2) w komórkach PV uzyskuje się poprzez skrzyżowanie linii myszy PV-Cre z myszami konstytutywnie wykazującymi ekspresję ChR2 Cre w zależności od (Ai32), tworząc w ten sposób myszy PV-ChY. Alternatywnie, konstrukty wektorów wirusowych (np. AAVdj-ChETA-eYFP) można wstrzyknąć do hipokampa myszy PV-Cre lub PV-TOM (P15-16) w celu sterowania ekspresją pobudzającej opsyny w interneuronach CA1 / SUB (Figura 4A).
   UWAGA: Ta strategia została opisana wcześniej²⁵.
   1. Umieść elektrodę LFP w obszarze CA1 / SUB i załataj pobliską komórkę piramidową w izolowanym hipokampie myszy wyrażającej wrażliwą na niebieskie światło pobudzającą opsynę ChR2 w interneuronach PV.
   2. Umieść światłowód światłowodowy (o średnicy 0,2 - 1 mm) nad preparatem hipokampa i wyśrodkuj go na zarejestrowanym obszarze. Użyj niebieskiego światła (473 nm) ze źródła LED do stymulacji optogenetycznej, składającej się z impulsów świetlnych (10 - 20 ms, wyzwalanych sygnałem logicznym tranzystor-tranzystor) lub poleceń napięcia fali sinusoidalnej dostarczanych na częstotliwościach theta (4 - 12 Hz).
      UWAGA: Niestandardowy zestaw stymulacji świetlnej oparty na diodach LED został opisany w innym miejscu²⁵.
   3. Przełącz się na cęgi prądowe i scharakteryzuj aktywność piramidy podczas spontanicznych oscylacji theta.
   4. Uruchom protokół stymulacji i zarejestruj reakcje świetlne. Obserwuj, że oscylacje pola i aktywność synaptyczna w zarejestrowanym neuronie stają się coraz bardziej zsynchronizowane podczas stymulacji optogenetycznej i że rytmiczne stymulacja komórek PV skutkuje solidną kontrolą zarówno częstotliwości, jak i mocy oscylacji theta (Rysunek 4).

Ta sekcja ilustruje przykłady wyników, które można uzyskać, badając oscylacje theta w izolowanym preparacie hipokampa myszy in vitro. Procedura preparacji w celu ekstrakcji izolowanego hipokampa jest zilustrowana na Rysunek 1. Za pomocą tego preparatu można badać wewnętrzne oscylacje theta podczas umieszczania wielu elektrod polowych, rejestrując ogólną aktywność i zsynchronizowane dane synaptyczne do populacji neuronów w różnych regionach i warstwach izolowanego hipokampa (Rysunek 2). Przedstawiono reprezentatywne wyniki z jednoczesnego zacisku płatkowego całej komórki i nagrań zewnątrzkomórkowych w celu scharakteryzowania właściwości wypalania i synaps określonych typów komórek podczas spontanicznych oscylacji theta hipokampa (Rysunek 3), a także podczas optogenetycznej manipulacji aktywnością rytmiczną (Rysunek 4).

Rycina 1: Procedura preparacji izolowanego nienaruszonego preparatu hipokampa.
(a) Ogólny widok układu preparacji. U góry po prawej: kolba z karbogenowanym lodowatym roztworem sacharozy (1); u dołu po lewej: plastikowa taca wypełniona lodem (2) trzymająca naczynie preparacyjne pokryte papierem do soczewek (3); zimna komora zawierająca roztwór sacharozy (4); oraz zestaw narzędzi chirurgicznych (5). (b) Widok mózgu myszy przed hemisekcją na czaszy sekcyjnej. (c) Odzyskanie mózgu poddanego hemisekcji w zimnej komorze trzymania i powiększony widok (wstawka) lewej półkuli mózgu przed włożeniem małego końca powlekanej szpatułki pod przegrodę. (d) Powlekana szpatułka umieszczona pod izolowanym hipokampem, wzdłuż regionu CA1/SUB, z pozostałą tkanką mózgową jest wyciągana od spodu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Konfiguracja układu do rejestracji in vitro oscylacji theta z nienaruszonego preparatu hipokampa w zanurzonej komorze zapisu.
(a) Izolowany hipokamp jest pokazany z układem regionów hipokampa i wieloma elektrodami umieszczonymi w czterech różnych miejscach rejestracji rozmieszczonych septotemporalnie (oznaczonych białymi gwiazdkami). W widoku powyższej platformy komory rejestracyjnej (wstawka i) wlot i wylot dla przepływu szybkiej perfuzji są oznaczone cyframi (1, 2). Na powiększonym obrazie hipokampa pokazanym poniżej (wstawka ii) pojedyncza elektroda jest umieszczona w środkowej części skroniowej CA1, a włókna zębodołu są łatwo widoczne, biegnąc po przekątnej w kierunku subiculum. S: przegroda, T: skroniowa, f/fx: fimbria-fornix. (b) Schematyczne przedstawienie organizacji warstw CA1 z reprezentatywnymi śladami LFP zarejestrowanymi jednocześnie z warstwy oriens (szarej) i warstwy promienistej (czarnej). Zwróć uwagę na odwróconą fazę sygnałów między dwiema warstwami. Alv: warstwa brzuszna, PR: warstwa piramidalna, SR: warstwa promieniowa. SLM: Stratum Lacunosum Moleculare. c) Przykładowy ślad LFP pokazujący spontaniczne oscylacje theta zarejestrowane z obszaru CA1/SUB (segment 20 sekund) i 2-sekundowe segmenty rozszerzone (poniżej) z sygnału niefiltrowanego; filtrowanie pasmowo-przepustowe dla częstotliwości theta (0,5 - 12 Hz); wolna gamma (25 - 55 Hz); i szybki gamma (125 - 250 Hz). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 3: Specyficzna dla typu komórki aktywność interneuronu piramidowego i PV podczas spontanicznych oscylacji Theta w nienaruszonym preparacie hipokampa z myszy PV-TOM.
(a) Aktywność synaptyczna zarejestrowana przez komórkę piramidową podczas oscylacji theta. Ślady cęgów prądowych (lewy panel) wykazują spontaniczne, ale nie rytmiczne odpalanie w spoczynku oraz hamujące potencjały postsynaptyczne (iPSP), które nie były wyraźnie zsynchronizowane z powoli pojawiającymi się oscylacjami LFP. Zapisy cęgów napięciowych (prawy panel) pokazują, że odpowiednie hamujące prądy postsynaptyczne (iPSC) mają swój potencjał odwrócenia około -70 mV. (b) Aktywność synaptyczna zarejestrowana przez szybko rosnący fluorescencyjny interneuron PV podczas oscylacji theta. W cęgach prądowych (po lewej) ogniwo to spontanicznie odpalało się w spoczynku i było silnie napędzane przez rytmiczne pobudzające potencjały postsynaptyczne (ePSP), które były zsynchronizowane fazowo ze stabilną oscylacją LFP. W nagraniach cęgowych napięcia (po prawej) wzbudzający postsynaptyczny potencjał odwrócenia prądu wynosił około 0 mV. Schematyczne rysunki na górze pokazują układ eksperymentalny wraz z umieszczeniem elektrod łatkowych i polowych w CA1/SUB i obrazach o dużym powiększeniu (40x) zarejestrowanej komórki piramidalnej i fluorescencyjnego interneuronu PV. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 4: Potencjał pola lokalnego i jednoczesne zapisy patch clamp z pojedynczych neuronów piramidowych i PV CA1/SUB podczas spontanicznych i optogenetycznie napędzanych oscylacji Theta w izolowanym hipokampie.
(a) Schemat przedstawiający miejsca rejestracji LFP i elektrody krosowej z umieszczeniem światłowodu nad regionem CA1 / SUB wyrażającym wrażliwą na światło niebieskie opsynę (ChETA sprzężoną z fluoroforem eYFP). (b) Charakterystyka neuronu piramidalnego wykazującego typowe właściwości Regular-Spiking (RS) (na górze) i obraz zarejestrowanej komórki w dużym powiększeniu (40X) (na dole). (c) Próbny zapis cęgowy tego samego ogniwa przy zdepolaryzowanym potencjale błonowym () wraz z sygnałem LFP (szary) i pokazujący zsynchronizowane rytmiczne IPSP podczas spontanicznych oscylacji (po lewej) i podczas stymulacji światłem o częstotliwości theta (6 Hz) (po prawej). Wzór stymulacji świetlnej (niebieskie cieniowanie) jest przedstawiony na górze ścieżek napięcia. (d) Widmo spektrogramu i widma mocy fali LFP przed, w trakcie i po symulacji światła 6 Hz (linia bazowa, bodziec, post). (e) Obrazy jasnego pola i fluorescencji o małym powiększeniu izolowanego preparatu hipokampa, pokazujące fluorescencję eYFP (na zielono) zlokalizowaną w regionie CA1 / SUB. (f) Charakterystyka obecnych etapów pokazująca zachowanie Fast-Spiking (FS) zarejestrowanego interneuronu PV-TOM (40-krotny obraz fluorescencji poniżej). (g) Zapis potencjału błonowego pokazujący duże EPSP i rytmiczne wypalanie zarejestrowanego ogniwa fotowoltaicznego zsynchronizowane z sygnałem LFP podczas spontanicznych oscylacji pola (po lewej) i podczas stymulacji światłem (po prawej) przy 3 Hz. (h) Średnia wyzwalana polem (FTA) skoków ogniwa fotowoltaicznego nad sygnałem CA1/SUB LFP. Rozładowanie ogniwa fotowoltaicznego w wielu próbach (wyśrodkowanych na pikach LFP) zostało przekształcone w FTA skoków zarejestrowanych podczas spontanicznych oscylacji (linia wyjściowa) i podczas stymulacji światłem (stim). Środkowy i dolny wykres pokazują wykresy rastrowe skoków i histogramy prawdopodobieństwa skoków (średnie prawdopodobieństwo jest pokazane na czerwono). Najwyższe wykresy pokazują wykresy średniego sygnału LFP, który zwiększał swoją moc podczas stymulacji świetlnej równolegle z wysoce zsynchronizowanym odpalaniem ogniwa fotowoltaicznego z synchronizacją fazową do szczytu oscylacji LFP. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1.

Tabela 2.

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów handlowych lub finansowych.