Wielokrotne pobieranie krwi z żyły ogonowej szczurów nieznieczulonych za pomocą próżniowego systemu pobierania krwi

Podsumowanie

Tutaj opisujemy prostą metodę pobierania próbek krwi z żyły ogonowej u szczurów nieznieczulonych za pomocą systemu probówek do ekstrakcji próżniowej. Metoda ta zmniejsza ryzyko bezpośredniego kontaktu z krwią i upraszcza pobieranie wielu próbek z jednego nakłucia żyły.

Streszczenie

Krew może być pobierana od szczurów w wielu miejscach pobierania próbek. Na przykład żyła ogonowa jest lepszym miejscem do pobierania próbek krwi. Jednak żyła ogonowa jest cienka, więc czasami trudno ją przebić. Ponadto żyła ogonowa ma niski przepływ krwi i wymaga długiego czasu pobierania próbek, aby uzyskać wystarczającą ilość krwi. Niniejszy raport opisuje prostą metodę pobierania krwi, metodę próżniowego pobierania krwi, która jest zwykle stosowana do pobierania próbek krwi od pacjentów, w tym przypadku stosowana u szczurów nieznieczulonych. Końcówkę igły motylkowej o gramaturze 22 G wprowadzono do jednej z bocznych żył ogonowych w odległości około 2-3 cm od końcówki ogona pod kątem około 20°, a krew zebrano w probówce próżniowej poprzez włożenie gumowego końca igły motylkowej do probówki do pobierania krwi próżniowej. Obecne wyniki eksperymentu pokazują, że wskaźnik sukcesu wynosił 95% w grupie eksperymentalnej i 90% w grupie początkującej. Wskaźnik powodzenia i czas nakłucia były podobne w obu grupach. Czas trwania pobierania próbek był istotnie krótszy w grupie eksperymentalnej w porównaniu z grupą początkującą. Podsumowując, ta próżniowa metoda pobierania krwi do sekwencyjnego pobierania krwi z żyły ogonowej szczurów nieznieczulonych jest wykonalna i łatwa do nauczenia, co może służyć jako niezawodna alternatywa dla innych konwencjonalnie stosowanych technik pobierania krwi u szczurów.

Wprowadzenie

Pobieranie próbek krwi od szczurów jest wymagane do szerokiej gamy badań eksperymentalnych. Techniki pobierania krwi od szczura obejmują nakłucie serca, splotu zaoczodołowego, żyły szyjnej, żyły odpiszczelowej, naczyń krwionośnych ogona, tętnicy szyjnej, aorty brzusznej i żyły głównej. Większość technik (z wyjątkiem nakłucia żyły odpiszczelowej i naczyń krwionośnych ogona) wymaga znieczulenia^1,2. Żyły ogona szczura są rutynowo nakłuwane w celu pobrania próbki krwi i wstrzyknięcia naczyniowego. Po potraktowaniu ogona ciepłą wodą, naczynia krwionośne są dobrze rozszerzone i nadają się do manipulacji, nawet gdy szczury są znieczulone³.

Pomimo rozwoju nowych i ulepszonych technik pobierania próbek krwi u małych zwierząt laboratoryjnych², nie zawsze łatwo jest uzyskać wystarczającą ilość krwi podczas pobierania próbek od małych zwierząt. Żyła ogonowa szczurów jest lepszym miejscem do pobierania próbek krwi⁴. Jednak żyła ogonowa jest cienka, dlatego czasami trudno jest ją przebić i uzyskanie wystarczającej ilości krwi zajęłoby dużo czasu ze względu na niski przepływ krwi. Pobieranie krwi za pomocą systemu probówek do ekstrakcji próżniowej jest typową metodą w codziennej praktyce klinicznej. Ten zamknięty system pobierania krwi zmniejsza ryzyko bezpośredniego kontaktu z krwią i ułatwił pobieranie wielu próbek z jednego nakłucia żyły⁵. Niniejszy raport opisuje prostą metodę pobierania próbek krwi z żyły ogonowej u szczurów nieznieczulonych przy użyciu systemu rurek do ekstrakcji próżniowej. Ta metoda jest łatwa do opanowania i może być stosowana do wielokrotnego uzyskiwania dużej objętości krwi u szczurów.

Protokół

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Radę Tongji Medical College przy Komitecie Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Nauki i Technologii Huazhong (Wuhan, Chiny). Manuskrypt został przygotowany zgodnie z wytycznymi ARRIVE (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments)⁶.

1. Hodowla

1. Używać szczurów Sprague-Dawley (SD) (n = 20, 10 samców, 8 tygodniowych, o wadze od 261 do 291 g, średnia = 272,85 ±9,07 g) z Centrum Zwierząt Doświadczalnych Uniwersytetu Nauki i Technologii Huazhong i utrzymywać szczury zgodnie z Przewodnikiem opieki i wykorzystywania zwierząt laboratoryjnych opublikowanym przez Narodowy Instytut Zdrowia USA (publikacja NIH nr 85-23, Poprawiona w 1996 r.)
2. Dom w standardowych warunkach ze swobodnym dostępem do wyżywienia i wody pitnej. Trzymaj szczury w² klatkach o długości 530 cm z ściółką do golenia drewna. Trzymaj dwa szczury w każdej klatce. Utrzymuj wszystkie klatki otwarte na środowisko pomieszczenia (bez mikroizolacji lub wentylowanych klatek)
3. Upewnij się, że personel zaangażowany w protokół eksperymentalny regularnie zajmuje się szczurami.
4. Utrzymuj temperaturę pokojową między 21 °C a 23 °C. Podawaj dawki normalnej diety solnej (0,3% NaCl) przez cały czas trwania badania.

2. Procedura pobierania krwi

UWAGA: System próżniowego pobierania krwi składa się z dwupunktowej igły [22 G (0,7 mm x 25 mm)], plastikowego uchwytu i szeregu rurek próżniowych (2 ml) z gumowymi korkami (Rysunek 1).

1. Umieść szczura w plastikowym uchwycie przytrzymującym i umyj ogon ciepłą (20-30 °C) wodą, aby usunąć wszelkie widoczne zabrudzenia lub kał. Podczas gdy asystent trzyma ogon w wyprostowanej pozycji, przetrzyj ogon 70% etanolem i wyczyść gazą, aby żyła była czysta.
2. Włóż końcówkę igły motylkowej 22 G do jednej z bocznych żył ogonowych (około 5 mm) w odległości około 2-3 cm od końcówki ogona pod kątem około 20° (Rysunek 2). Zbierz krew do probówki próżniowej, wkładając gumową końcówkę igły motylkowej do probówki do pobierania krwi próżniowej (Rysunek 3).
   UWAGA: Maksymalna objętość krwi do pobrania wynosi 1,2 ml⁷.
3. Po pobraniu krwi wyjmij igłę i delikatnie uciskaj miejsce nakłucia gazą przez 15-30 s, aby zatrzymać przepływ krwi. Następnie uwolnij szczura z plastikowego uchwytu przytrzymującego i włóż go z powrotem do klatki.
4. Użyj probówek zawierających EDTA jako antykoagulantu do zbierania osocza krwi. Delikatnie odwróć probówkę kilka razy, aby wymieszać antykoagulant z krwią i umieścić próbki pionowo na lodzie.
5. Odwirować probówki do pobierania próbek krwi w wirówce z chłodzeniem o stężeniu 2 000 x g przez 10 minut w celu oddzielenia osocza lub surowicy.
6. Ekstrahować osocze/surowicę, uważając, aby nie naruszyć warstw czerwonych i białych krwinek. Aby pobrać surowicę krwi, użyj probówek bez antykoagulantu. Oba rodzaje próbek mogą być używane natychmiast lub przechowywane w temperaturze -80 °C przez okres do jednego roku.
   UWAGA: Pomyślne pobranie krwi zdefiniowano jako uzyskanie 1,2 ml krwi za każdym razem. Maksymalny czas nakłucia ustalono na trzy próby, jeśli całkowita objętość krwi była mniejsza niż 1,2 ml po trzecim nakłuciu, zdefiniowano to jako nieudane pobranie krwi. Czas pobierania próbek rozpoczyna się od nakłucia żyły ogonowej do usunięcia igły motylkowej po pobraniu krwi.
7. Zbierz krew dwa razy w ciągu dwóch tygodni⁷.
   1. Aby przetestować i zweryfikować wykonalność tej metody, przeszkol dwóch studentów medycyny (początkujących) przez 2 godziny przed wykonaniem tego protokołu pobierania krwi. Użyj dwudziestu szczurów i pobierz krew od 10 szczurów przez 2 doświadczonych kolegów (grupa eksperymentalna) i od 10 szczurów przez 2 studentów medycyny (grupa początkująca).

3. Analiza statystyczna

1. Wyraź dane jako wartość średnią ± odchylenie standardowe i przeanalizuj je za pomocą SPSS Statistics 17. Wybrano wartość α równą 0,05, dlatego p <0,05 uznano za statystycznie istotne.

Wyniki

Czas trwania pobierania próbek, masa ciała i objętość pobranej krwi w dwóch grupach
Krew pobierano od 10 szczurów (w tym 5 samców) dwukrotnie w ciągu dwóch tygodni w każdej grupie. Średnia masa ciała w obu grupach była zbliżona (272,0 ±9,6 g i 273,70 ±8,87 g). Czas trwania pobierania próbek był istotnie krótszy w grupie eksperymentalnej w porównaniu z grupą początkową (2,77 ±0,53 min vs. 3,28 ±0,83 min, p <0,05) (Tabela 1).

Wskaźnik sukcesu i czasy nakłucia w dwóch grupach
Wskaźnik sukcesu wyniósł 95% (19/20) w grupie doświadczalnej oraz 90% (18/20) w grupie początkującej (p >0.05). Czasy nakłucia nie różniły się znacząco między dwiema grupami (1.50 ±0.61 min vs. 1.85 ±0.75 min, p >0.05) (Tabela 2). Wyniki te wskazują, że metoda ta jest łatwa do opanowania, a technikę można w pełni opanować po 2 h szkolenia.

Rysunek 1: probówka do próżniowego pobierania krwi o pojemności 2 ml (po lewej); igła motylkowa 2 G (na środku); plastikowy uchwyt stabilizujący (po prawej). Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Rysunek 2: Koniec igły wprowadzono do bocznej żyły ogonowej (na głębokość około 5 mm) w miejscu oddalonym o około 2–3 cm od końcówki ogona, pod kątem około 20°. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 3: Pomyślne nakłucie żyły. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej figury.

Grupa eksperymentalna						Grupa początkująca
	Płeć	Masa ciała (g)	Objętość pobranej krwi (ml)	czas próbkowania (min)			Płeć	Masa ciała (g)	Objętość pobranej krwi (ml)	czas próbkowania (min)
E1-1	męski	291	1.2	3.12		B1-1	samiec	282	1.2	3.18
E1-2	samiec	291	1.2	2.73		B1-2	samiec	282	1.2	2.18
E2-1	samiec	276	1.2	2.3		B2-1	mężczyzna	264	1.2	3.73
E2-2	samiec	276	1.2	2.37		B2-2	męski	264	1.2	2.47
E3-1	samiec	267	1.2	2.73		B3-1	męski	265	1.2	3.52
E3-2	samiec	267	1.0	3.88		B3-2	męski	265	1.2	2.53
E4-1	samiec	263	1.2	2.41		B4-1	samiec	289	1.2	2.32
E4-2	mężczyzna	263	1.2	2.52		B4-2	samiec	289	1.2	3.62
E5-1	męski	265	1.2	3.61		B5-1	samiec	277	1.2	3.48
E5-2	męski	265	1.2	2.42		B5-2	mężczyzna	277	1.2	3.12
E6-1	żeńska	285	1.2	3.33		B6-1	żeńska	274	0.9	4.87
E6-2	żeńska	285	1.2	3.03		B6-2	żeńska	274	1.2	3.37
E7-1	żeńska	271	1.2	2.82		B7-1	żeńska	268	1.0	3.93
E7-2	żeńska	271	1.2	2.42		B7-2	żeńska	268	1.2	3.82
E8-1	żeńska	268	1.2	1.93		B8-1	żeńska	262	1.2	2.07
E8-2	żeńska	268	1.2	3.05		B8-2	żeńska	262	1.2	3.67
E9-1	żeńska	273	1.2	2.52		B9-1	żeńska	281	1.2	4.38
E9-2	żeńska	273	1.2	3.17		B9-2	żeńska	281	1.2	4.57
E10-1	żeńska	261	1.2	1.82		B10-1	żeńska	275	1.2	2.53
E10-2	żeńska	261	1.2	3.25		B10-2	żeńska	275	1.2	2.28
Średnia				2.77						3.28
En-1: numer seryjny szczurów w grupie eksperymentalnej podczas pierwszego pobrania krwi.
En-2: numer seryjny szczurów w grupie eksperymentalnej podczas drugiego pobrania krwi.
Bn-1: numer seryjny szczurów w grupie początkowej podczas pierwszego pobrania krwi.
Bn-2: numer seryjny szczurów w grupie początkowej podczas drugiego pobrania krwi.

Tabela 1: Wyniki analizy krwi pobranej w grupie eksperymentalnej i grupie początkującej.

	Terminy pobierania krwi	Średnie czasy nakłucia	Jednorazowe nakłucie	Dwukrotne nakłucie	Trzykrotne nakłucie	Niepowodzenie	Wskaźnik sukcesu
Grupa eksperymentalna	20	1.50 ±0.61	11	8	0	1	95%
Grupa początkująca	20	1.85 ±0.75	7	9	2	2	90%
Jednorazowe nakłucie: liczba szczurów, u których pomyślnie pobrano krew po pierwszym nakłuciu
Podwójna punkcja: Liczba szczurów z pomyślnym pobraniem krwi po drugiej punkcji
Trzykrotne nakłucie: Liczba szczurów z udanym pobraniem krwi po trzecim nakłuciu
Niepowodzenia: liczba szczurów, u których nie udało się pobrać krwi po trzecim nakłuciu

Tabela 2: Porównanie czasu nakłucia i odsetka sukcesów w grupie eksperymentalnej i grupie początkujących.

Dyskusja

W niniejszym raporcie opisano łatwą do nauczenia się metodę pobierania krwi u szczurów. Nasze wyniki wykazały, że ta metoda jest wykonalna w przypadku wielokrotnego pobierania dużej objętości krwi od szczurów. Co więcej, metodę tę można łatwo opanować dzięki krótkoterminowej krzywej uczenia się. Procedura ta może być wykonywana u szczurów nieznieczulonych i powoduje tylko minimalny stres u zwierząt.

Krew można pobierać od szczurów w różnych miejscach. Żyła ogonowa jest lepszym miejscem do pobierania próbek krwi⁴. Jednak nie zawsze łatwo jest uzyskać wystarczającą objętość krwi z cienkiej i nisko przepływowej żyły ogonowej szczurów. Próżniowy system pobierania krwi jest zwykle używany do pobierania próbek krwi od pacjentów w codziennej praktyce klinicznej. Ten próżniowy system pobierania krwi jest stosowany u pacjentów i zwierząt badawczych od dłuższego czasu ^8,9,10. System ten składa się z próżniowej probówki do pobierania krwi z wewnętrzną ścianką rurki pokrytej silikonem i igły motylkowej. Został on oparty na zasadzie podciśnienia próżniowego i umożliwia ciągłe pobieranie krwi bez ryzyka jej gromadzenia, co również zmniejsza ryzyko zanieczyszczenia i hemolizy¹¹. Objętość próbki krwi w cewniku wynosi około 0,3 ml. Po wyjęciu igły z żyły ogonowej krew zablokowana w cewniku spłynie do zbiorczej rurki próżniowej z powodu podciśnienia. Metoda ta ma również zastosowanie do pobierania krwi od szczurów o masie ciała poniżej 100 g przy użyciu mniejszej igły do nakłuwania.

Ta metoda pobierania krwi ma kilka zalet. Procedura ta powoduje tylko minimalne obrażenia u szczurów, a pobieranie krwi można przeprowadzić bez użycia środków znieczulających, dzięki czemu można uniknąć wpływu reakcji na stres i środków znieczulających na próbkę krwi. Nasze obserwacje wykazały, że szczury zachowywały się cicho w plastikowym uchwycie przytrzymującym podczas zabiegu i nie było żadnych zgonów podczas tych eksperymentów. Po drugie, możliwe jest wielokrotne pobieranie krwi co jeden lub dwa dni, co umożliwia częste pobieranie próbek krwi o odpowiedniej objętości do różnych celów badawczych. Wreszcie, metoda ta jest łatwa do nauczenia i została łatwo opanowana przez początkujących po krótkim (2 godzin) okresie nauki, na co wskazują podobne wskaźniki sukcesu i czasy nakłucia między grupą eksperymentalną i początkującą w tym raporcie. W poprzednim raporcie Lee i wsp. zademonstrowali podobną metodę pobierania próbek krwi z bocznej żyły ogonowej szczura⁴. Nasza metoda jest prostsza niż ta opisana przez Lee i wsp.⁴ W tym sensie, że bezpośrednio wprowadzamy igłę do nakłucia do żyły ogonowej, a drugi koniec rurki jest bezpośrednio podłączony do rurki próżniowej w celu pobrania krwi, bez użycia dodatkowej strzykawki i ręcznego zasysania krwi oraz bez konieczności "dojenia" żyły w celu ułatwienia przepływu krwi. Pobieranie krwi za pomocą tego zamkniętego systemu zmniejsza ryzyko zanieczyszczenia krwi. Użycie plastikowego uchwytu krępującego zmniejsza również stres szczura i ułatwia mocowanie ogona.

Następujące dwa kroki mają kluczowe znaczenie dla pomyślnego zastosowania tej metody. 1) Wysuń ogon i unikaj ruchu ogona; 2) Delikatnie nakłuj żyłę pod kątem 20°, aby uniknąć przebicia przez żyłę i trzymaj igłę do nakłucia w żyle.

Podsumowując, przyjęta metoda próżniowego pobierania krwi u szczurów jest bezpieczna, wykonalna i łatwa do praktykowania. Metoda ta umożliwia częste pobieranie próbek krwi o odpowiedniej objętości krwi uzyskanej od szczurów nieznieczulonych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
igła dwustronna Shanghai	Kang Nong instrument medyczny co., LTD, Chiny	22G	(0,7 razy; 25mm)
rury próżniowe	Wuhan Zhi Yuan, medical science and technology co., LTD, Chiny	2 ml
uchwyt do krępowania szczurów	Shanghai Kang Nong medical instrument co., LTD, Chiny	250g szczur
normalna dieta solna dla szczurów			Szczury otrzymywały normalną dietę solną (0,3% NaCl) przez cały czas trwania badania
Oprogramowanie SPSS do analizy statystycznej	SPSS Inc,  Chicago; Stany Zjednoczone	Wersja 17.0.

model hodera