Artykuł metodologiczny

-on-a-chip: bezznacznikowe badanie interakcji białko-fosfoinozytyd

DOI:

10.3791/55869

⸱

27 lipca 2017

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, The Pennsylvania State University, 2Department of Chemistry, The Pennsylvania State University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy wspieraną dwuwarstwę lipidową w kontekście platformy mikroprzepływowej do badania interakcji białko-fosfoinozytyd przy użyciu metody bezznacznikowej opartej na modulacji pH.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Liczne białka komórkowe oddziałują z powierzchniami błony, wpływając na podstawowe procesy komórkowe. Interakcje te mogą być skierowane na określony składnik lipidowy w błonie, jak w przypadku fosfoinozytydów (), aby zapewnić określoną lokalizację subkomórkową i/lub aktywację. i komórkowe domeny wiążące zostały szeroko przebadane, aby lepiej zrozumieć ich rolę w fizjologii komórki. Zastosowaliśmy test modulacji pH na obsługiwanych dwuwarstwach lipidowych (SLB) jako narzędzie do badania interakcji białko-. W tych badaniach do wykrywania interakcji białko-stosuje się wrażliwą na pH fosfatydyloodaminę B sprzężoną z fosfatydyloetanoloaminą. Po związaniu białka z powierzchnią błony zawierającej, potencjał międzyfazowy jest modulowany (tj. zmiana lokalnego pH), przesuwając stan protonacji sondy. Studium przypadku udanego zastosowania testu modulacji pH przedstawiono na przykładzie domeny fosfolipazy C delta1 Pleckstrin Homology (PLC-δ1 PH) i interakcji fosfatydyloinozytolu 4,5-bisfosforanu (PI(4,5)P2) jako przykładu. Pozorna stała dysocjacji (Kd,app) dla tej interakcji wynosiła 0,39 ± 0,05 μM, podobnie jak wartości Kd,app uzyskane przez inne. Jak wcześniej zaobserwowano, domena PH PLC-δ1 jest specyficzna dla PI(4,5)P2, wykazuje słabsze wiązanie z 4-fosforanem fosfatydyloinozytolu i brak wiązania z czystymi SLB fosfatydylocholiny. Test-on-a-chip ma przewagę nad tradycyjnymi testami wiążącymi, w tym między innymi małą objętość próbki i brak wymagań dotyczących znakowania ligandów/receptorów, możliwość testowania interakcji błonowych o wysokim i niskim powinowactwie zarówno z małymi, jak i dużymi cząsteczkami oraz lepszy stosunek sygnału do szumu. W związku z tym zastosowanie podejścia-on-a-chip ułatwi wyjaśnienie mechanizmów szerokiego zakresu oddziaływań błonowych. Co więcej, metoda ta może być potencjalnie wykorzystana do identyfikacji środków terapeutycznych, które modulują zdolność białka do interakcji z błonami.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niezliczone interakcje i procesy biochemiczne zachodzą na dwuwymiarowo płynnych powierzchniach membran. Organelle otoczone błoną w komórkach eukariotycznych są wyjątkowe nie tylko pod względem procesów biochemicznych i związanego z nimi proteomu, ale także pod względem składu lipidowego. Jedną z wyjątkowych klas fosfolipidów są fosfoinozytydy (). Mimo że stanowią one tylko 1% lipidomu komórkowego, odgrywają kluczową rolę m.in. w transdukcji sygnału, autofagii i transporcie błonowym1,2,3,4. Dynamiczna fosforylacja grupy głównej inozytolu przez komórkowe kinazy prowadzi do powstania siedmiu grup głównych, które są mono-, bis- lub tris-fosforylowane5. Ponadto definiują subkomórkową tożsamość błon i służą jako wyspecjalizowane miejsca dokowania błon dla białek/enzymów zawierających jedną lub więcej domen wiążących fosfoinozytyd, na przykład Homologia Pleckstrin (PH), Homologia Phox (PX) i Homologia N-końcowa epsyny (ENTH)6,7. Jedną z najlepiej zbadanych domen wiążących jest domena PH fosfolipazy C (PLC)-δ1, która specyficznie oddziałuje z 4,5-bisfosforanem fosfatydyloinozytolu (PI(4,5)P2) w zakresie wysokiego powinowactwa nanomolowego i niskiego mikromolowego8,9,10,11.

Różnorodne jakościowe i ilościowe metody in vitro zostały opracowane i wykorzystane do badania mechanizmu, termodynamiki i specyfiki tych oddziaływań. Do najczęściej stosowanych testów wiązania należą powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR), kalorymetria izotermiczna (ITC), spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR), test flotacji/sedymentacji liposomów oraz plamy lipidowe (Fat-blots/-strips)12,13. Mimo że są one szeroko stosowane, wszystkie mają wiele wad. Na przykład SPR, ITC i NMR wymagają dużych ilości próbek, drogiego oprzyrządowania i/lub przeszkolonego personelu12,13. Niektóre formaty testów, takie jak bloty lipidowe oparte na przeciwciałach, wykorzystują rozpuszczalne w wodzie formy i prezentują je w sposób niefizjologiczny12,14,15,16. Ponadto nie można wiarygodnie określić ilościowo pęcherzy lipidowych i często prowadzą one do obserwacji fałszywie dodatnich/negatywnych12,17,18. Aby sprostać tym wyzwaniom i ulepszyć obecny zestaw narzędzi, opracowano nową metodę bezznacznikową opartą na wspieranej dwuwarstwie lipidowej (SLB) w kontekście platformy mikroprzepływowej, która została z powodzeniem zastosowana do badania interakcji białko-(Rysunek 1)19.

Strategia stosowana do wykrywania interakcji białko-opiera się na wykrywaniu modulacji pH. Obejmuje to barwnik wrażliwy na pH, który ma ortosulodaminę B (oSRB) bezpośrednio sprzężoną z lipidem fosfatydyloetanoloaminy head group20. Sonda SRB-POPE (Rysunek 2A) jest wysoce fluorescencyjna przy niskim pH i wygaszona przy wysokim pH z pKa około 6,7 w granicach 7,5% mol% PI(4,5)P2-zawierających SLB (Rysunek 5B). Domena PH PLC-δ1 była szeroko stosowana do walidacji metodologii wiązania białka-ze względu na jej wysoką specyficzność w stosunku do PI(4,5)P2 (Rysunek 5A)21,22,23,24,25. W związku z tym doszliśmy do wniosku, że domena PH PLC-δ1 może być wykorzystana do przetestowania jej wiązania z PI(4,5)P2 za pomocą testu-on-a-chip. Konstrukt domeny PH użyty w tym badaniu ma dodatni ładunek netto (pI 8,4), a zatem przyciąga jony OH- (Rysunek 5C). Po związaniu się z SLB zawierającymi PI(4,5)P2, domena PH przenosi jony OH- na powierzchnię błony, co z kolei moduluje potencjał międzyfazowy i zmienia stan protonacji oSRB-POPE (Rysunek 5C)26. W funkcji stężenia w domenie PH fluorescencja jest wygaszana (Rysunek 6A). Wreszcie, znormalizowane dane są dopasowane do izotermy wiążącej w celu określenia powinowactwa interakcji domeny PH-PI(4,5)P2 (Rysunek 6B, 6C).

W tym badaniu dostarczono szczegółowy protokół do wiązania białek z SLB zawierającymi w ramach platformy mikroprzepływowej. Protokół ten prowadzi czytelnika od złożenia urządzenia mikroprzepływowego i przygotowania pęcherzyków do tworzenia SLB i wiązania białek. Ponadto podano wskazówki dotyczące analizy danych w celu wyodrębnienia informacji o powinowactwie dla interakcji PLC-δ1 PH domain-PI(4,5)P2.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Czyszczenie szkiełek nakrywkowych

  1. Rozcieńczyć 7 razy roztwór czyszczący (patrz tabela materiałów) 7-krotnie wodą dejonizowaną w naczyniu ze szkła borokrzemianowego o głębokości 100 mm z płaskim dnem i podgrzewać do temperatury 95 °C na płaskiej płycie grzejnej przez 20 minut lub do momentu, gdy mętny roztwór stanie się klarowny.
    UWAGA: Roztwór będzie gorący, należy zachować ostrożność, aby uniknąć obrażeń ciała. Roztwór czyszczący 7x jest zastrzeżoną mieszanką fosforanu heksasodu [oksydo-[oksydo(fosfonatooksy)fosforylo]oksyfosforylo]oksyfosforylu], 2-(2-butoksyetoksy)etanolu, 1,4-bis(2-etyloheksoksy)-1,4-dioksobutano-2-sulfonianu sodu i bezpiecznych dodatków.
  2. Za pomocą pęsety ułóż szkiełka nakrywkowe (40 mm długości x 22 mm szerokości x 0,16-0,19 mm wysokości) na aluminiowym stojaku do barwienia w naprzemiennych kierunkach. Zachowaj puste miejsce między każdym szkiełkiem nakrywkowym, aby nie stykały się ze sobą.
  3. Całkowicie zanurz stojak do barwienia wraz ze szkiełkami nakrywkowymi w roztworze czyszczącym. Szkiełka nakrywkowe należy przechowywać w roztworze przez 1 godz.
    UWAGA: Gdy woda odparuje, dodawaj świeżą wodę dejonizowaną, aby utrzymać niezmienione stężenie roztworu.
  4. Wyjmij stojaki do barwienia z roztworu czyszczącego i umyj szkiełka nakrywkowe dużą ilością wody dejonizowanej, aby usunąć detergent.
  5. Wysuszyć szkiełka nakrywkowe gazowym azotem (około 5 minut na ruszt do barwienia), a następnie umieścić szkiełka nakrywkowe w piecu na 6 godzin w temperaturze 550 °C w celu wyżarzania.
    UWAGA: Jest to kluczowy krok, który wygładza szorstkie elementy na powierzchni szkła.
  6. Umieść szkiełka nakrywkowe w plastikowym pojemniku i trzymaj je z dala od kurzu.

2. Wytwarzanie mikrowzorcowych bloków PDMS

  1. Wymieszaj prepolimer polidimetylosiloksanu (PDMS) i utwardzacz w stosunku 10:1 (w/w) w dużej plastikowej łodzi wagowej i odgazuj w próżni przez 1 godzinę z podciśnieniem 500 Torr lub mniejszym.
    UWAGA: PDMS jest przezroczystym i obojętnym polimerem silikonowym. Aby uzyskać pożądaną grubość bloku PDMS (0,5 cm), należy wymieszać 55 g prepolimeru z 5,5 g utwardzacza.
  2. Umieścić silikonowy wzorzec wzorcowy, który zawiera wiele powtórzeń tego samego mikrowzoru SU-8, w dużej (10 cm średnicy podstawy) plastikowej łódce wagowej i wlać odgazowany PDMS. Następnie utwardź go w suchym piekarniku w temperaturze 60 °C przez noc.
    UWAGA: Mikrowzory są na tyle duże, że można je dostrzec gołym okiem. Każdy wzór zawiera 8 mikrokanalików (100 μm szerokości x 40 μm wysokości x 1 cm długości) z odstępami 40 μm pomiędzy nimi (Rysunek 1A, 1B). Forma wafla krzemowa składająca się z wypalonego na twardo fotorezystu SU-8 została wyprodukowana w zakładzie nanoprodukcyjnym27. Inne podejścia do przygotowania wzorca obejmują trawienie kwasem fluorowodorowym (HF), trawienie wodą w wysokiej temperaturze, kserografię i druk 3D28,29,30,31. Można również korzystać z komercyjnych źródeł przygotowania wzorca krzemu. Wzory urządzenia mikroprzepływowego zostały zaprojektowane za pomocą oprogramowania kreślarskiego (patrz tabela materiałów). Oryginalny plik zawierający projekt wzoru jest dostarczany jako plik uzupełniający "Wzór Design.dwg", który może być dostarczony bezpośrednio do producenta.
  3. Delikatnie oderwij PDMS od silikonowego wzorca rękami. Zaznacz granice każdego mikrowzoru w prostokątach za pomocą skalpela chirurgicznego i linijki. Następnie pokrój PDMS na bloki.
  4. Przebij 16 otworów (8 wlotów i 8 wylotów na blok) na obu końcach każdego mikrokanału za pomocą stempla do biopsji (średnica otworu 1,0 mm), jak wskazano w Rysunek 3B.
  5. Nałóż taśmę na każdy blok PDMS, aby chronić mikrowzory przed uszkodzeniem i kurzem. Przechowuj je w plastikowym pojemniku.

3. Przygotowanie małych pęcherzyków jednowarstwowych (SUV)

UWAGA: Dwuwarstwowy skład kontroli ujemnej to 99,5% mol% 1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glicero-3-fosfocholiny (POPC) i 0,5% mol% orto-sulforodaminy B-1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloaminy (oSRB-POPE). Dwuwarstwowy skład testu wynosi 92,0% mol POPC, 0,5 mol% SRB-POPi 7,5 mol% L-α-fosfatydyloinozytolo-4-fosforanu (PI4P) lub L-α-fosfatydyloinozytolo-4,5-bisfosforanu (PI(4,5)P2). Poniżej znajduje się procedura przygotowania SUV-ów zawierających 92,0% mol% POPC, 0,5% mol% SRB-POPi 7,5% mol% PI(4,5)P2. Synteza oSRB-POPE użyta w tym badaniu została wcześniej opisana20.

  1. Obliczyć objętość POPC, PI(4,5)P2 i oSRB-POPE, którą należy wymieszać, co odpowiada następującym łącznym ilościom: 2,22 mg POPC, 0,26 mg PI(4,5)P2 i 2,1 x 10-5 mg oSRB-POPE.
  2. Odpipetować obliczoną objętość POPC, PI(4,5)P2, oSRB-POPE do jednej szklanej fiolki scyntylacyjnej o pojemności 20 ml.
    UWAGA: Roztwory podstawowe POPC i oSRB-POPE występują w roztworze chloroformu, podczas gdy roztwór podstawowy PI(4,5)P2 (i inne fosfoinozytytydy) występuje w mieszaninie rozpuszczalników chloroform:metanol:woda (20:9:1). Aby zapewnić dokładność, przed użyciem zwilż końcówkę pipety chloroformem. Ze względów bezpieczeństwa ten krok powinien odbywać się wewnątrz dygestorium chemicznego.
  3. Wysuszyć mieszaninę w strumieniu azotu gazowego wewnątrz dygestorium chemicznego przez 10 minut lub do momentu, gdy rozpuszczalnik odparuje i na dnie fiolki utworzy się cienki film lipidowy.
  4. Wysuszać mieszaninę w próżni przez ≥3 godziny przy sile podciśnienia 10 mTorr, aby usunąć wszelkie pozostałości rozpuszczalnika organicznego.
    UWAGA: 3 godzinny czas wysuszania jest wystarczający dla skali przygotowania SUV opisanej w niniejszym protokole, która jest wystarczająca dla 50 eksperymentów. Jeśli wymagane jest przygotowanie SUV-a na większą skalę, można przeprowadzić suszenie przez noc.
  5. Ponownie uwodnić wysuszony film lipidowy za pomocą 5 ml bieżącego buforu (20 mM HEPES, 100 mM NaCl, przy pH 7,0) i umieścić go w łaźni ultradźwiękowej o częstotliwości roboczej 35 kHz na 30 minut przy RT.
    UWAGA: Zmieszanie ilości lipidów określonych w kroku 3.1 i dodanie 5 ml buforu bieżącego w kroku 3.5 daje zawiesinę pęcherzyków o stężeniu 0,5 mg/ml. Na tym etapie zawiesina pęcherzyków jest mieszanką pęcherzyków jedno- i wielopłytkowych (Ryc. 2B). Roztwór będzie miał różowo-fioletowy kolor i będzie stosunkowo mętny.
  6. Zamrozić i rozmrozić zawiesinę pęcherzyków za pomocą ciekłego azotu i łaźni wodnej w temperaturze 40 °C, aby uzyskać pęcherzyki jednowarstwowe. Powtórz zamrażanie i rozmrażanie 10 razy.
    UWAGA: (Opcjonalnie) Aby upewnić się, że w zawiesinie nie ma pęcherzyków niejednowarstwowych, można zastosować etap wirowania32,33.
  7. Wytłaczaj zawiesinę pęcherzyków przez wytrawioną torowo membranę poliwęglanową o grubości 0,10 μm za pomocą wytłaczarki lipidowej (patrz tabela materiałów) w celu wzbogacenia dla SUV-ów. Powtórz wytłaczanie 10 razy.
    UWAGA: Do zebrania wytłaczanych pęcherzyków można użyć stożkowej rurki o pojemności 15 ml. Na tym etapie roztwór powinien być pozbawiony zmętnienia. Średnicę SUV-a można potwierdzić za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (DLS) (Rysunek 2C). SUV-y najlepiej nadają się do tworzenia SLBs34.
  8. Przykryj stożkową rurkę folią aluminiową i przechowuj w temperaturze 4 °C do momentu użycia.

4. Montaż urządzenia mikroprzepływowego

  1. Przetestuj wloty i wyloty bloku PDMS pod kątem zablokowania, tryskając dejonizowaną wodą przez otwory za pomocą butelki do mycia wodą. Następnie osusz blok PDMS azotem gazowym.
    UWAGA: Ten krok usunie również wszelkie cząsteczki kurzu, które mogły zostać uwięzione w kanałach i/lub między nimi. W razie potrzeby należy odpylić szkiełka nakrywkowe wstępnie oczyszczonymi azotem, aby usunąć wszelkie cząsteczki kurzu.
  2. Umieść blok PDMS i wstępnie oczyszczone szkiełko nakrywkowe (patrz sekcja 1) w komorze na próbki systemu plazmy tlenowej (patrz tabela materiałów), aby wystawić na działanie plazmy tlenowej przez 45 sekund z mocą ustawioną na 75 watów, prędkością przepływu tlenu 10 cm3/min i siłą podciśnienia 200 mTorr.
  3. Umieścić wzorzystą powierzchnię bloku PDMS w kontakcie ze szkiełkiem nakrywkowym natychmiast po obróbce plazmą tlenową. Delikatnie naciśnij, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza w miejscach kontaktu.
  4. Umieść urządzenie na równej płycie grzejnej w temperaturze 100 °C na 3 minuty, aby wzmocnić wiązanie.
  5. Użyj mokrej, niestrzępiącej się chusteczki (np. kimwipe) ze 100% etanolem, aby usunąć wszelkie cząsteczki kurzu z góry (PDMS) i spodu (szkła) urządzenia. Następnie przyklej urządzenie do szklanego szkiełka mikroskopowego.
    UWAGA: Nie używaj nadmiernej ilości etanolu i nie dostajesz się etanolu do kanałów wlotowych i wylotowych. Zaleca się wykonanie tego kroku, gdy urządzenie jest jeszcze gorące, aby zapewnić natychmiastowe odparowanie etanolu. Szklane szkiełka mikroskopowe mogą być przechowywane w 100% roztworze etanolu w celu usunięcia kurzu i innych zanieczyszczeń.

5. Tworzenie wspieranych dwuwarstw lipidowych (SLB)

  1. Przenieść 100 μl SUV zawierających PI(4,5)P2 z kroku 3.8 do probówki mikrowirówkowej o pojemności 0,65 ml. Doprowadzić pH roztworu do ~3,2 dodając 6,4 μl 0,2 N kwasu solnego.
    UWAGA: Potwierdzić pH roztworu za pomocą pH-metru wyposażonego w mikrosondę pH (patrz tabela materiałów).
  2. Odpipetować 10 μl roztworu SUV o dostosowanym pH do każdego kanału przez wlot i wywierać ciśnienie przez pipetę, aż roztwór dotrze do wylotu. Odłącz końcówkę od pipety i pozostaw ją przymocowaną do urządzenia.
  3. Powtórz powyższy krok dla każdego kanału, a następnie inkubuj urządzenie przez 10 minut w temperaturze RT.
    UWAGA: Iniekcja pęcherzyków do mikrokanalików powinna być wykonana bezpośrednio po zmontowaniu urządzenia.
  4. Wytnij zestawy rurek wlotowych i wylotowych odpowiednio o długości 60 cm (rura wlotowa) i 8 cm (rurka wylotowa).
    UWAGA: Przecięcie rurki po przekątnej i utworzenie ostrej krawędzi ułatwia wkładanie rurki do wlotów i wylotów. Rurka wylotowa powinna mieć kształt łuku. Długość rurki dopływowej może się różnić w zależności od konfiguracji mikroskopu. Średnica wewnętrzna rurki wynosi 0,05 cm.
  5. Za pomocą pęsety podłącz zestaw wężyków wylotowych do urządzenia, a następnie przyklej urządzenie do stolika mikroskopu.
  6. Zanurz jeden koniec zestawu rurki wlotowej w 25 ml buforu roboczego zawartego w stożkowej rurce i przyklej go taśmą, aby upewnić się, że przewód jest zabezpieczony.
  7. Umieść stożkową rurkę na wyższym podłożu (~20 cm) niż urządzenie, aby przepchnąć roztwór przez mikrokanaliki za pomocą przepływu grawitacyjnego; można w tym celu użyć podnośnika laboratoryjnego.
  8. Do każdej rurki wlotowej użyj strzykawki, aby pobrać 1 ml buforu z wolnego końca rurki. Wyjmij końcówkę pipety z wlotu i włóż wolny koniec rurki wlotowej do urządzenia.
    UWAGA: Wprowadź kroplę buforu do pracy na wlocie, aby zmniejszyć prawdopodobieństwo wprowadzenia pęcherzyków powietrza do kanału podczas tego etapu. Po podłączeniu rurki dopływowej do urządzenia użyj niestrzępiącej się ściereczki, aby usunąć nadmiar bufora.
  9. Powtórz powyższy krok, aby podłączyć wszystkie elementy rurki dopływowej do urządzenia.
    UWAGA: Przepływający bufor biegowy przez kanały pomaga usunąć nadmiar pęcherzyków i zrównoważyć dwuwarstwę do warunków eksperymentalnych.
  10. Otwórz oprogramowanie sterujące mikroskopem (patrz tabela materiałów). Na lewym panelu kliknij zakładkę "Mikroskop" i wybierz obiektyw "10X".
  11. Kliknij ikony obrazu "Na żywo", a następnie "Alexa 568" na pasku narzędzi. Za pomocą pokręteł regulacji kursu i regulacji kursu skup się na mikrokanałach.
  12. Przeskanuj urządzenie, aby sprawdzić jakość SLB i kanałów ( Rysunek 8). Następnie kliknij ikonę obrazu "FL Shutter Closed" na pasku narzędzi.
  13. Kliknij zakładkę "Akwizycja" i w sekcji "Podstawowe korekty" wybierz "Czas ekspozycji". Ustaw czas naświetlania na "200 ms".
  14. Na lewym panelu kliknij "Multidimensional Acquisition" i pod menu filtrów wybierz czerwony kanał (oznaczony jako "Alexa 568"). Następnie kliknij menu "upływ czasu", ustaw przedział czasu na 5 minut, czas trwania na 30 minut i kliknij "Start".
    UWAGA: W zależności od czasu trwania (30 min) i natężenia przepływu (~1,0 μL/min), do zrównoważenia SLB w kanale używa się 30 μL bufora roboczego, tj. 240 μL bufora roboczego stosuje się dla wszystkich 8 kanałów.
  15. Wybierz narzędzie "Okrąg" w zakładce "Zmierz" i narysuj okrąg w dowolnym kanale. Kliknij prawym przyciskiem myszy, gdy okrąg jest zaznaczony i wybierz "Właściwości". W zakładce "Profil" zaznacz "wszystkie T", aby wyświetlić intensywność fluorescencji w funkcji czasu.
    1. Upewnij się, że ta krzywa osiąga plateau, co wskazuje równowagę, zanim przejdziesz do następnego kroku.
  16. Opuścić roztwór buforowy do równego podłoża co urządzenie, aby zatrzymać przepływ.
  17. Zapisz plik poklatkowy.

6. Testowanie interakcji PLC-δ1 w domenie PH z SLB zawierającymi PI(4,5)P2

  1. Przygotować rozcieńczenia domeny PH, używając uruchomionego buforu jako rozcieńczalnika.
    UWAGA: Ponieważ w urządzeniu znajduje się osiem kanałów, użyj co najmniej dwóch z nich do pustych elementów sterujących. Wybierz dalsze końce z każdej strony i użyj pozostałych kanałów do rozcieńczania białek. Badano następujące stężenia w domenie pH: 0,10, 0,25, 0,50, 1,00 i 2,50 μM. Około 200 μl każdego rozcieńczenia wystarczało do osiągnięcia równowagi w ciągu 30 minut.
  2. Pojedynczo odłącz każdą rurkę wylotową i nałóż 200 μl każdego rozcieńczonego białka do kanału wylotowego za pomocą pipety. Nie wywieraj żadnego nacisku, pozwól, aby grawitacja wykonała pracę. Odłącz końcówkę od pipety i pozostaw ją przymocowaną do urządzenia mikroprzepływowego.
  3. Powtórz powyższy krok dla każdego kanału i upewnij się, że podczas tego procesu do kanałów nie zostaną wprowadzone pęcherzyki powietrza.
  4. Opuść rurkę wlotową na ziemię poniżej urządzenia mikroprzepływowego, aby rozpocząć przepływ białka przez mikrokanały. Przyklej wolny koniec rurki do pojemnika na odpady. Rozcieńczenia białka płynąć przez 30 min.
    UWAGA: Spowoduje to odwrócenie przepływu i umożliwi wprowadzenie białka do kanałów. Czas do zrównoważenia i objętość potrzebnych rozcieńczeń białek będą zależeć od powinowactwa oddziaływania.
  5. W lewym panelu oprogramowania, w zakładce "Upływ czasu", kliknij "Start", aby ponownie rozpocząć obrazowanie.
  6. Powtórz krok 5.15, aby upewnić się, że osiągnięta została równowaga. Po zakończeniu eksperymentu zapisz plik poklatkowy.

7. Ocena płynności membrany

UWAGA: Eksperymenty z odzyskiwaniem fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP) powinny być przeprowadzane z każdą nową partią SUV-ów i oczyszczonymi szklanymi szkiełkami nakrywkowymi, aby upewnić się, że SLB są płynne.

  1. Postępuj zgodnie z procedurą czyszczenia szkiełek nakrywkowych (1.1-1.6), wytwarzania mikrowzorzystych bloków PDMS (2.1-2.5), przygotowania SUV-ów (3.1-3.8), montażu urządzenia mikroprzepływowego (4.1-4.5) i formowania SLB (5.1-5.17), jak opisano wcześniej.
  2. Ustaw ostrość mikroskopu na dwuwarstwie, ustaw czas ekspozycji na 200 ms, a binning na 1.
  3. Fotowybielanie okrągłego miejsca za pomocą wiązki laserowej o długości fali 532 nm i mocy 2 mW (promień 13 μM). Natychmiast po fotowybielaniu zacznij robić serię zdjęć co 3 s przez pierwsze 45 s, a następnie w odstępie 30 s przez pozostałą część czasu (łączny czas trwania 15 minut). Po zakończeniu zbierania danych zapisz plik poklatkowy.
  4. Wybierz wybielony obszar za pomocą narzędzia do rysowania okręgów, aby wyodrębnić wartości intensywności fluorescencji w funkcji czasu. Dodatkowo wybierz dwa dodatkowe obszary w pobliżu, jeden odpowiadający niebielonemu regionowi, a drugi odpowiadający regionowi bez żadnych SLB.
  5. Obliczyć odzysk fluorescencji (y) za pomocą następującego równania:
    figure-protocol-1
    UWAGA: Tutaj Ft oznacza intensywność bielonego obszaru w funkcji czasu, Fi reprezentuje intensywność fluorescencji przed wybielaniem (w tym przypadku użyj "1" jako wartości znormalizowanej); F0 to intensywność tła.
  6. Wykreśl odzysk fluorescencji (oś y) w funkcji czasu (oś x), aby wygenerować krzywą FRAP. Następnie dopasuj dane do pojedynczej funkcji wykładniczej w następujący sposób,
    figure-protocol-2
    UWAGA: Tutaj A reprezentuje ułamek ruchomy, a k jest stałą kinetyczną dla frakcji ruchomej, która służy do obliczania czasu połowicznego powrotu do zdrowia (t1/2):
    figure-protocol-3
  7. Użyj t1/2, aby obliczyć stałą dyfuzji (D):
    figure-protocol-4
    UWAGA: Tutaj R oznacza promień wiązki laserowej (13 μm). Stała dyfuzji dla dwuwarstwy płynnej powinna wynosić ≥1,0 μm2/s.

8. Przetwarzanie danych

UWAGA: Rutyna analizy danych będzie zależna od używanego mikroskopu, oprogramowania do przetwarzania obrazu i oprogramowania do dopasowywania krzywych.

  1. Otwórz pliki poklatkowe przed (z kroku 5.17) i po (od kroku 6.6) miareczkowaniu domeny PH. Przejdź do ostatniej klatki każdego pliku poklatkowego i wykonaj skanowanie linii we wszystkich mikrokanałach, aby uzyskać dane o intensywności fluorescencji w funkcji odległości w pikselach (Rysunek 6A). Przenieś dane do arkusza kalkulacyjnego.
  2. Dla każdego mikrokanału (przed i po dodaniu domeny PH) pobierz próbki danych w kanale i po obu stronach kanału reprezentujących linię bazową (Rysunek 7A).
    UWAGA: Intensywność fluorescencji ślepego kanału powinna pozostać niezmieniona. Wszystkie inne kanały są znormalizowane do kanału ślepego, dlatego ważne jest, aby mieć dwa ślepe kanały i upewnić się, że ich intensywności fluorescencji pozostają ze sobą spójne.
  3. Zastosuj poniższą formułę, aby znormalizować dane do pustego kanału; przykładowe obliczenia znajdują się w Rysunek 7B.
    figure-protocol-5
    UWAGA: Tutaj białko ΔF reprezentuje intensywność fluorescencji kanału białkowego odjętą w tle, ślepa próba ΔF reprezentuje intensywność fluorescencji odjętej w tle kanału ślepego, przed i po etapach miareczkowania białek, a α reprezentuje współczynnik korekcyjny, który jest stosunkiem intensywności fluorescencji kanału białkowego i kanału ślepej próby ([białko F/Fblank]pre) na etapie miareczkowania przed uzyskaniem białka. Ponieważ intensywność fluorescencji zmniejsza się w funkcji stężenia w domenie pH, znormalizowane dane będą miały wartość ujemną.
  4. Korzystając z oprogramowania do dopasowywania krzywych (patrz tabela materiałów), wykreśl znormalizowaną fluorescencję w funkcji stężenia domeny PH i dopasuj do izotermy Langmuira (Rysunek 6C):
    figure-protocol-6
    UWAGA: Tutaj ∆F reprezentuje zmianę intensywności fluorescencji w stosunku do maksymalnej zmiany intensywności fluorescencji, gdy obecne jest stężenie nasycenia białka (∆F max), podczas gdy K d (F max), podczas gdy Kd (app reprezentuje pozorną stałą dysocjacji, która jest równa stężeniu białka objętościowego ([PLC-δ1 PH]), przy którym uzyskuje się 50% pokrycia (kompleks związany z błoną). Jest to pomiar wiązania oparty na równowadze, więc znormalizowane dane są dopasowane do prostej izotermy Langmuira w celu wyodrębnienia pozornego parametru eksperymentalnego Kd, app. W oparciu o oprogramowanie montażowe, aplikacja K d dla PLC-δ1 PH-PI(4,5)P2 interakcja wynosi 0,39 ± 0,05 μM (Rysunek 6B).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Użyliśmy testu modulacji pH do zbadania interakcji domeny PLC-δ1 PH-PI(4,5)P2 w mikrourządzeniu-on-a-chip (Rysunek 1). Za pomocą szczegółowego protokołu pokazaliśmy, jak przygotować i zmontować elementy urządzenia mikroprzepływowego, stworzyć małe pęcherzyki jednowarstwowe (SUV) (Rysunek 2), utworzyć SLB w urządzeniu (Rysunek 3) i przetestowaliśmy wiązanie białka z SLB zawierającymi. Schemat blokowy typowego eksperymen...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Każdy wariant, choć w niskich stężeniach, jest obecny na powierzchni cytozolowej określonych organelli, gdzie przyczynia się do ustalenia unikalnego składu fizycznego i swoistości funkcjonalnej błony organellarnej1. Jednym z najważniejszych zastosowań jest swoista platforma dokująca dla wielu białek wymagających określonej lokalizacji subkomórkowej i/lub aktywacji 6,7. Ze względu na ich rolę w fizjologii i chorobie komórkowej ważna jest mo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

D.S. i C.E.C. były częściowo wspierane przez granty AI053531 (NIAID, NIH); S.S i P.S.C. otrzymały wsparcie w ramach grantu N00014-14-1-0792 (ONR).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szkiełko nakrywkowe
szklane Szkiełka nakrywkowe: prostokątneFisher Scientific12-544B22 x 40 x 0,16 - 0,19 mm, nr 1 1/2; Szkło borokrzemianowe
7X Roztwór czyszczącyMP Biomedicals976670Detergent
Naczynie krystalizujące PYREXCorning3140-190Naczynie ze szkła borokrzemianowego z płaskim dnem; Średnica x wysokość (190 x 100 mm); Dystrybutor: VWR (89090-700)
Sentry Xpress 2.0Paragon IndustriesSC-2
PiecNazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
PDMS
Sylgard 184 Zestaw elastomerów silikonowychDow Corning4019862polidimetylosiloksan (PDMS); Dystrybutor: Ellsworth Adhesives
PYREX EksykatorVWR89134-402Próżniowy
dziurkacz do biopsjiHarris15110-10Harris Uni-Core; średnica 1,0 mm; Dziurkacz do biopsji Miltex z tłokiem (Kat. Nr 15110-10) może być stosowany jako alternatywa
NazwaFirmaNumer katalogowyUwagi
Device
Plasma Cleaning SystemPlasmaEtchPE25-JW2-stopniowa pompa próżniowa oleju z napędem bezpośrednim, Usługa O2 (Krytox Charged)
test porównawczypłyty grzejnejH3760-Hzakupiony za pośrednictwem Denville Scientific (Kat. Nr 1005640)
Matowe mikroprowadniceVWR48312-003Matowe, wyselekcjonowane i wstępnie oczyszczone; Wykonany ze szwajcarskiego szkła; Grubość: 1 mm; Wymiary: 75 x 25 mm; GR 144
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mold
AutoCAD Autodeskv.2016Oprogramowanie kreślarskie do projektowania fotomaski
PhotomaskCAD/Art ServicesN/AProjekt z czarnym tłem i wyraźnymi elementami został wydrukowany w rozdzielczości 20k dpi na przezroczystej masce (5 x 7 cali) przez CAD/Art
Services Silicone WafersUniversity Wafer1575Prime Grade, jednostronnie polerowany; Średnica 100 mm (4 cale); Grubość 525 um
SU-8 50MicroChem Corp.Nie dotyczyFotorezystor o tonie ujemnym; Penn State Nanofabrication Facility Property
SU-8 DeweloperMicroChem Corp.N/APenn State Nanofabrication Facility Nieruchomość
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
SUV
1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glycero-3-fosfocholinaAvanti Polar Lipids850457CPOPC
L-&alfa;-fosfatydyloinozytol-4-fosforanAvanti Polar Lipids840045XPI4P
L-&alfa;-fosfatydyloinozytol-4,5-bisfosforanAvanti Polar Lipids840046XPI(4,5)P2
1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloaminaAvanti Polar Lipids850757CPOPE; Wymagane do syntezy oSRB-POPE
Lissamine Rodamine B Sulfonyl Chloride (mieszane izomery)ThermoFisher ScientificL-20Wymagane do syntezy oSRB-POPE
Fluorescencyjna sonda lipidowa wrażliwa na pH (oSRB-POPE)Własnan/Awe własnym zakresie (Huang D. i in. 2013)
Szklana fiolka scyntylacyjnaVWR66022-065Pojemność 20 ml
Aquasonic 250DVWRN/AUltradźwiękowe
membrany nukleporoweWhatman110605Membrana poliwęglanowa; Średnica: 25 mm; Wielkość porów: 0,1 μm; Dystrybutor: Sigma-Aldrich
ChloroformVWRCX1054-6HPLC
grade LIPEX ExtruderTransferra NanosciencesT.001LIPEX 10 mL Thermobarrel Extruder
Viscotek 802 DLSMalvern InstrumentsN/ADynamiczne rozpraszanie światła; Zakład krystalografii rentgenowskiej w Penn State Właściwość
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Analiza danych
GraphPad Prism GraphPadSoftwarev.6Oprogramowanie do dopasowywania krzywych do analizy danych
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
mikroskop
Axiovert 200M Mikroskop epifluorescencyjnyZeiss MikroskopiaN/A
Mikroskop AxioCam MRm MikroskopCarl ZeissNie dotyczyKamera
X-Cite 120Excelitas TechnologiesNie dotyczyŹródło światła
Alexa 568 Zestaw filtrówCarl Zeiss MicroscopyN/AEx/Em 576/603 nm
AxioVision LE64 v.4.9.1.0 OprogramowanieCarl Zeiss MicroscopyN/AOprogramowanie do przetwarzania obrazu
NazwaFirma Numer katalogowyUwagi
Inne
TipsVWR10034-132Końcówki do pipet 200 μL; Cienka i gładka końcówka do nakładania roztworu białkowego do kanału mikroprzepływowego
KońcówkiVWR53509-07010 μL; Cienka i gładka końcówka do nakładania roztworu pęcherzykowego do kanału mikroprzepływowego
Miernik pH Orion Star A321Termo ScientificSTARA3210pH-metr
Mikrosonda pH Orion TermoScientific8220BNWPmikrosonda pH
N-(2-hydroksyetylo)-piperazyno-N'-(kwas 2-etanosulfonowy)VWRVWRB30487HEPES, Wolny kwas
chlorek soduVWRBDH8014-2,5 KGR
RurkiDrut pokrewny i TFT-200-24 NŚrednica wewnętrzna: 0,020-0,026 cala (0,051-0,066 cm); Grubość ścianki: 0,010 cala (0,025 cm); Elastyczne cienkościenne rurki z politetrafluoroetylenu; Naturalny kolor
Azot Gaz - PrzemysłowyPraxairN/ALokalny dostawca
Tlen Gaz - PrzemysłowyPraxairN/ALokalny dostawca
Ciekły azotPraxairN/ALokalny dostawca
Cyfrowy synteza w kąpieli wodnej Carl NaCl

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Di Paolo, G., De Camilli, P. Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics. Nature. 443 (7112), 651-657 (2006).
  2. Shewan, A., Eastburn, D. J., Mostov, K. Phosphoinositides in cell architecture. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (8), a004796(2011).
  3. Picas, L., Gaits-Iacovoni, F., Goud, B. The emerging role of phosphoinositide clustering in intracellular trafficking and signal transduction. F1000Res. 5, (2016).
  4. Lystad, A. H., Simonsen, A. Phosphoinositide-binding proteins in autophagy. FEBS Lett. 590 (15), 2454-2468 (2016).
  5. Balla, T. Phosphoinositides: Tiny lipids with giant impact on cell regulation. Physiol Rev. 93, 1019-1137 (2013).
  6. Lemmon, M. A. Membrane recognition by phospholipid-binding domains. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (2), 99-111 (2008).
  7. Kutateladze, T. G. Translation of the phosphoinositide code by PI effectors. Nat Chem Biol. 6 (7), 507-513 (2010).
  8. Harlan, J. E., Hajduk, P. J., Yoon, H. S., Fesik, S. W. Pleckstrin homology domains bind to phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate. Nature. 371 (6493), 168-170 (1994).
  9. Garcia, P., et al. The pleckstrin homology domain of phospholipase C-delta 1 binds with high affinity to phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in bilayer membranes. Biochemistry. 34 (49), 16228-16234 (1995).
  10. Lemmon, M. A., Ferguson, K. M., O'Brien, R., Sigler, P. B., Schlessinger, J. Specific and high-affinity binding of inositol phosphates to an isolated pleckstrin homology domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (23), 10472-10476 (1995).
  11. Flesch, F. M., Yu, J. W., Lemmon, M. A., Burger, K. N. Membrane activity of the phospholipase C-delta1 pleckstrin homology (PH) domain. Biochem J. 389, 435-441 (2005).
  12. Narayan, K., Lemmon, M. A. Determining selectivity of phosphoinositide-binding domains. Methods. 39 (2), 122-133 (2006).
  13. Scott, J. L., Musselman, C. A., Adu-Gyamfi, E., Kutateladze, T. G., Stahelin, R. V. Emerging methodologies to investigate lipid-protein interactions. Integr Biol (Camb). 4 (3), 247-258 (2012).
  14. Dowler, S., Currie, R. A., Downes, C. P., Alessi, D. R. DAPP1: A dual adaptor for phosphotyrosine and 3-phosphoinositides. Biochem J. 342, 7-12 (1999).
  15. He, J., et al. Molecular basis of phosphatidylinositol 4-phosphate and ARF1 GTPase recognition by the FAPP1 pleckstrin homology (PH) domain. J Biol Chem. 286 (21), 18650-18657 (2011).
  16. Ceccarelli, D. F., et al. Non-canonical interaction of phosphoinositides with pleckstrin homology domains of Tiam1 and ArhGAP9. J Biol Chem. 282 (18), 13864-13874 (2007).
  17. Huang, S., Gao, L., Blanchoin, L., Staiger, C. J. Heterodimeric capping protein from Arabidopsis is regulated by phosphatidic acid. Mol Biol Cell. 17 (4), 1946-1958 (2006).
  18. Yu, J. W., et al. Genome-eide analysis of membrane targeting by S. cerevisiae pleckstrin homology domains. Mol Cell. 13 (5), 677-688 (2004).
  19. Jung, H., Robison, A. D., Cremer, P. S. Detecting protein-ligand binding on supported bilayers by local pH modulation. J Am Chem Soc. 131 (3), 1006-1014 (2009).
  20. Huang, D., Zhao, T., Xu, W., Yang, T., Cremer, P. S. Sensing small molecule interactions with lipid membranes by local pH modulation. Anal Chem. 85 (21), 10240-10248 (2013).
  21. Saxena, A., et al. Phosphoinositide binding by the pleckstrin homology domains of Ipl and Tih1. J Biol Chem. 277 (51), 49935-49944 (2002).
  22. Knödler, A., Mayinger, P. Analysis of phosphoinositide-binding proteins using liposomes as an affinity matrix. Biotechniques. 38 (6), 858-862 (2005).
  23. Baumann, M. K., Swann, M. J., Textor, M., Reimhult, E. Pleckstrin homology-phospholipase C-delta1 interaction with phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate containing supported lipid bilayers monitored in situ with dual polarization interferometry. Anal Chem. 83 (16), 6267-6274 (2011).
  24. Saliba, A. E., et al. A quantitative liposome microarray to systematically characterize protein-lipid interactions. Nat Methods. 11 (1), 47-50 (2014).
  25. Arauz, E., Aggarwal, V., Jain, A., Ha, T., Chen, J. Single-molecule analysis of lipid-protein interactions in crude cell lysates. Anal Chem. 88 (8), 4269-4276 (2016).
  26. Best, Q. A., Xu, R., McCarroll, M. E., Wang, L., Dyer, D. J. Design and investigation of a series of rhodamine-based fluorescent probes for optical measurements of pH. Org Lett. 12 (14), 3219-3221 (2010).
  27. Lee, J., Choi, K. H., Yoo, K. Innovative SU-8 lithography techniques and their applications. Micromachines. 6 (1), 1-18 (2014).
  28. Poyton, M. F., Sendecki, A. M., Cong, X., Cremer, P. S. Cu(2+) binds to phosphatidylethanolamine and increases oxidation in lipid membranes. J Am Chem Soc. 138 (5), 1584-1590 (2016).
  29. Karasek, P., Grym, J., Roth, M., Planeta, J., Foret, F. Etching of glass microchips with supercritical water. Lab Chip. 15 (1), 311-318 (2015).
  30. Thomas, M. S., et al. Print-and-peel fabrication for microfluidics: what's in it for biomedical applications? Ann Biomed Eng. 38 (1), 21-32 (2010).
  31. Waheed, S., et al. 3D printed microfluidic devices: enablers and barriers. Lab Chip. 16 (11), 1993-2013 (2016).
  32. Axmann, M., Schutz, G. J., Huppa, J. B. Single molecule fluorescence microscopy on planar supported bilayers. J Vis Exp. (105), e53158(2015).
  33. Barenholz, Y., et al. A simple method for the preparation of homogeneous phospholipid vesicles. Biochemistry. 16 (12), 2806-2810 (1977).
  34. Castellana, E. T., Cremer, P. S. Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design. Surface Science Reports. 61 (10), 429-444 (2006).
  35. Hamai, C., Yang, T., Kataoka, S., Cremer, P. S., Musser, S. M. Effect of average phospholipid curvature on supported bilayer formation on glass by vesicle fusion. Biophys J. 90 (4), 1241-1248 (2006).
  36. Tero, R. Substrate effects on the formation process, structure and physicochemical properties of supported lipid bilayers. Materials. 5 (12), 2658-2680 (2012).
  37. Ferguson, K. M., Lemmon, M. A., Schlessinger, J., Sigler, P. B. Structure of the high affinity complex of inositol trisphosphate with a phospholipase C pleckstrin homology domain. Cell. 83 (6), 1037-1046 (1995).
  38. Simonsson, L., Hook, F. Formation and diffusivity characterization of supported lipid bilayers with complex lipid compositions. Langmuir. 28 (28), 10528-10533 (2012).
  39. Cong, X., Poyton, M. F., Baxter, A. J., Pullanchery, S., Cremer, P. S. Unquenchable surface potential dramatically enhances Cu(2+) binding to phosphatidylserine lipids. J Am Chem Soc. 137 (24), 7785-7792 (2015).
  40. Robison, A. D., et al. Polyarginine interacts more strongly and cooperatively than polylysine with phospholipid bilayers. J Phys Chem B. 120 (35), 9287-9296 (2016).
  41. Robison, A. D., Huang, D., Jung, H., Cremer, P. S. Fluorescence modulation sensing of positively and negatively charged proteins on lipid bilayers. Biointerphases. 8 (1), 1(2013).
  42. Tabaei, S. R., et al. Formation of cholesterol-rich supported membranes using solvent-assisted lipid self-assembly. Langmuir. 30 (44), 13345-13352 (2014).
  43. Johnson, S. J., et al. Structure of an adsorbed dimyristoylphosphatidylcholine bilayer measured with specular reflection of neutrons. Biophys J. 59 (2), 289-294 (1991).
  44. Koenig, B. W., et al. Neutron reflectivity and atomic force microscopy studies of a lipid bilayer in water adsorbed to the surface of a silicon single crystal. Langmuir. 12 (5), 1343-1350 (1996).
  45. Tanaka, M., Sackmann, E. Polymer-supported membranes as models of the cell surface. Nature. 437 (7059), 656-663 (2005).
  46. Renner, L., et al. Supported lipid bilayers on spacious and pH-responsive polymer cushions with varied hydrophilicity. J Phys Chem B. 112 (20), 6373-6378 (2008).
  47. Wagner, M. L., Tamm, L. K. Tethered polymer-supported planar lipid bilayers for reconstitution of integral membrane proteins: Silane-polyethyleneglycol-lipid as a cushion and covalent linker. Biophys J. 79 (3), 1400-1414 (2000).
  48. Pace, H., et al. Preserved transmembrane protein mobility in polymer-supported lipid bilayers derived from cell membranes. Anal Chem. 87 (18), 9194-9203 (2015).
  49. Braunger, J. A., Kramer, C., Morick, D., Steinem, C. Solid supported membranes doped with PIP2: Influence of ionic strength and pH on bilayer formation and membrane organization. Langmuir. 29 (46), 14204-14213 (2013).
  50. Paridon, P. A., de Kruijff, B., Ouwerkerk, R., Wirtz, K. W. Polyphosphoinositides undergo charge neutralization in the physiological pH range: A 31P-NMR study. Biochim Biophys Acta. 877 (1), 216-219 (1986).
  51. Liu, C., Huang, D., Yang, T., Cremer, P. S. Monitoring phosphatidic acid formation in intact phosphatidylcholine bilayers upon phospholipase D catalysis. Anal Chem. 86 (3), 1753-1759 (2014).
  52. Saad, J. S., et al. Structural basis for targeting HIV-1 Gag proteins to the plasma membrane for virus assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11364-11369 (2006).
  53. Hsu, N. Y., et al. Viral reorganization of the secretory pathway generates distinct organelles for RNA replication. Cell. 141 (5), 799-811 (2010).
  54. Del Campo, C. M., et al. Structural basis for PI(4)P-specific membrane recruitment of the Legionella pneumophila effector DrrA/SidM. Structure. 22 (3), 397-408 (2014).
  55. Kolli, S., et al. Structure-function analysis of vaccinia virus H7 protein reveals a novel phosphoinositide binding fold essential for poxvirus replication. J Virol. 89 (4), 2209-2219 (2015).
  56. Cho, N. J., et al. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate is an HCV NS5A ligand and mediates replication of the viral genome. Gastroenterology. 148 (3), 616-625 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Test PIP on a chipwspierane dwuwarstwy lipidowetest modulacji pHdomena PH fosfolipazy Cfosfatydyloinozytol 45 bisfosforanwytwarzanie urz dze mikroprzep ywowychma e p cherzyki jednowarstwowepomiar intensywno ci fluorescencjipozorna sta a dysocjacji

Powiązane artykuły