Artykuł metodologiczny

-on-a-chip: bezznacznikowe badanie interakcji białko-fosfoinozytyd

DOI:

10.3791/55869

⸱

27 lipca 2017

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, The Pennsylvania State University, 2Department of Chemistry, The Pennsylvania State University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy wspieraną dwuwarstwę lipidową w kontekście platformy mikroprzepływowej do badania interakcji białko-fosfoinozytyd przy użyciu metody bezznacznikowej opartej na modulacji pH.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Liczne białka komórkowe oddziałują z powierzchniami błony, wpływając na podstawowe procesy komórkowe. Interakcje te mogą być skierowane na określony składnik lipidowy w błonie, jak w przypadku fosfoinozytydów (), aby zapewnić określoną lokalizację subkomórkową i/lub aktywację. i komórkowe domeny wiążące zostały szeroko przebadane, aby lepiej zrozumieć ich rolę w fizjologii komórki. Zastosowaliśmy test modulacji pH na obsługiwanych dwuwarstwach lipidowych (SLB) jako narzędzie do badania interakcji białko-. W tych badaniach do wykrywania interakcji białko-stosuje się wrażliwą na pH fosfatydyloodaminę B sprzężoną z fosfatydyloetanoloaminą. Po związaniu białka z powierzchnią błony zawierającej, potencjał międzyfazowy jest modulowany (tj. zmiana lokalnego pH), przesuwając stan protonacji sondy. Studium przypadku udanego zastosowania testu modulacji pH przedstawiono na przykładzie domeny fosfolipazy C delta1 Pleckstrin Homology (PLC-δ1 PH) i interakcji fosfatydyloinozytolu 4,5-bisfosforanu (PI(4,5)P2) jako przykładu. Pozorna stała dysocjacji (Kd,app) dla tej interakcji wynosiła 0,39 ± 0,05 μM, podobnie jak wartości Kd,app uzyskane przez inne. Jak wcześniej zaobserwowano, domena PH PLC-δ1 jest specyficzna dla PI(4,5)P2, wykazuje słabsze wiązanie z 4-fosforanem fosfatydyloinozytolu i brak wiązania z czystymi SLB fosfatydylocholiny. Test-on-a-chip ma przewagę nad tradycyjnymi testami wiążącymi, w tym między innymi małą objętość próbki i brak wymagań dotyczących znakowania ligandów/receptorów, możliwość testowania interakcji błonowych o wysokim i niskim powinowactwie zarówno z małymi, jak i dużymi cząsteczkami oraz lepszy stosunek sygnału do szumu. W związku z tym zastosowanie podejścia-on-a-chip ułatwi wyjaśnienie mechanizmów szerokiego zakresu oddziaływań błonowych. Co więcej, metoda ta może być potencjalnie wykorzystana do identyfikacji środków terapeutycznych, które modulują zdolność białka do interakcji z błonami.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niezliczone interakcje i procesy biochemiczne zachodzą na dwuwymiarowo płynnych powierzchniach membran. Organelle otoczone błoną w komórkach eukariotycznych są wyjątkowe nie tylko pod względem procesów biochemicznych i związanego z nimi proteomu, ale także pod względem składu lipidowego. Jedną z wyjątkowych klas fosfolipidów są fosfoinozytydy (). Mimo że stanowią one tylko 1% lipidomu komórkowego, odgrywają kluczową rolę m.in. w transdukcji sygnału, autofagii i transporcie błonowym1,2,3,4. Dynamiczna fosforylacja grupy głównej inozytolu przez komórkowe kinazy prowadzi do powstania siedmiu grup głównych, które są mono-, bis- lub tris-fosforylowane5. Ponadto definiują subkomórkową tożsamość błon i służą jako wyspecjalizowane miejsca dokowania błon dla białek/enzymów zawierających jedną lub więcej domen wiążących fosfoinozytyd, na przykład Homologia Pleckstrin (PH), Homologia Phox (PX) i Homologia N-końcowa epsyny (ENTH)6,7. Jedną z najlepiej zbadanych domen wiążących jest domena PH fosfolipazy C (PLC)-δ1, która specyficznie oddziałuje z 4,5-bisfosforanem fosfatydyloinozytolu (PI(4,5)P2) w zakresie wysokiego powinowactwa nanomolowego i niskiego mikromolowego8,9,10,11.

Różnorodne jakościowe i ilościowe metody in vitro zostały opracowane i wykorzystane do badania mechanizmu, termodynamiki i specyfiki tych oddziaływań. Do najczęściej stosowanych testów wiązania należą powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR), kalorymetria izotermiczna (ITC), spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR), test flotacji/sedymentacji liposomów oraz plamy lipidowe (Fat-blots/-strips)12,13. Mimo że są one szeroko stosowane, wszystkie mają wiele wad. Na przykład SPR, ITC i NMR wymagają dużych ilości próbek, drogiego oprzyrządowania i/lub przeszkolonego personelu12,13. Niektóre formaty testów, takie jak bloty lipidowe oparte na przeciwciałach, wykorzystują rozpuszczalne w wodzie formy i prezentują je w sposób niefizjologiczny12,14,15,16. Ponadto nie można wiarygodnie określić ilościowo pęcherzy lipidowych i często prowadzą one do obserwacji fałszywie dodatnich/negatywnych12,17,18. Aby sprostać tym wyzwaniom i ulepszyć obecny zestaw narzędzi, opracowano nową metodę bezznacznikową opartą na wspieranej dwuwarstwie lipidowej (SLB) w kontekście platformy mikroprzepływowej, która została z powodzeniem zastosowana do badania interakcji białko-(Rysunek 1)19.

Strategia stosowana do wykrywania interakcji białko-opiera się na wykrywaniu modulacji pH. Obejmuje to barwnik wrażliwy na pH, który ma ortosulodaminę B (oSRB) bezpośrednio sprzężoną z lipidem fosfatydyloetanoloaminy head group20. Sonda SRB-POPE (Rysunek 2A) jest wysoce fluorescencyjna przy niskim pH i wygaszona przy wysokim pH z pKa około 6,7 w granicach 7,5% mol% PI(4,5)P2-zawierających SLB (Rysunek 5B). Domena PH PLC-δ1 była szeroko stosowana do walidacji metodologii wiązania białka-ze względu na jej wysoką specyficzność w stosunku do PI(4,5)P2 (Rysunek 5A)21,22,23,24,25. W związku z tym doszliśmy do wniosku, że domena PH PLC-δ1 może być wykorzystana do przetestowania jej wiązania z PI(4,5)P2 za pomocą testu-on-a-chip. Konstrukt domeny PH użyty w tym badaniu ma dodatni ładunek netto (pI 8,4), a zatem przyciąga jony OH- (Rysunek 5C). Po związaniu się z SLB zawierającymi PI(4,5)P2, domena PH przenosi jony OH- na powierzchnię błony, co z kolei moduluje potencjał międzyfazowy i zmienia stan protonacji oSRB-POPE (Rysunek 5C)26. W funkcji stężenia w domenie PH fluorescencja jest wygaszana (Rysunek 6A). Wreszcie, znormalizowane dane są dopasowane do izotermy wiążącej w celu określenia powinowactwa interakcji domeny PH-PI(4,5)P2 (Rysunek 6B, 6C).

W tym badaniu dostarczono szczegółowy protokół do wiązania białek z SLB zawierającymi w ramach platformy mikroprzepływowej. Protokół ten prowadzi czytelnika od złożenia urządzenia mikroprzepływowego i przygotowania pęcherzyków do tworzenia SLB i wiązania białek. Ponadto podano wskazówki dotyczące analizy danych w celu wyodrębnienia informacji o powinowactwie dla interakcji PLC-δ1 PH domain-PI(4,5)P2.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Czyszczenie szklanych szkiełek nakrywkowych

  1. Rozcieńczyć 7-krotny roztwór czyszczący (patrz Tabela materiałów) 7-krotnie wodą dejonizowaną w głębokim, 100 mm, borokrzemowym naczyniu szklanym o płaskim dnie i podgrzać do 95 °C na wypoziomowanej płycie grzejnej przez 20 min lub do momentu, aż zmętniały roztwór stanie się klarowny.
    UWAGA: Roztwór będzie gorący, należy zachować ostrożność, aby uniknąć obrażeń ciała. 7-krotny roztwór czyszczący jest zastrzeżoną mieszaniną fosforanu heksasodowego [oxido-[oxido(fosfonatooxy)fosforyl]oxyfosforylu], 2-(2-butoksyetoksy)etanolu, 1,4-bis(2-etylheksoksy)-1,4-dioxobutanu-2-sulfonianu sodu oraz dodatków nietoksycznych.
  2. Używając pęsety, ułożyć szkiełka nakrywkowe (długość 40 mm x szerokość 22 mm x wysokość 0,16-0,19 mm) na aluminiowej kasecie do barwienia w naprzemiennych kierunkach. Pozostawić wolne miejsce między każdym szkiełkiem, aby zapobiec ich dotykaniu.
  3. Całkowicie zanurzyć kasetę do barwienia ze szkiełkami w roztworze czyszczącym. Pozostawić szkiełka w roztworze na 1 h.
    UWAGA: W miarę odparowywania wody należy dodawać świeżą wodę dejonizowaną, aby utrzymać niezmienne stężenie roztworu.
  4. Wyjąć kasety do barwienia z roztworu czyszczącego i wypłukać szkiełka obficie wodą dejonizowaną, aby usunąć detergent.
  5. Osuszyć szkiełka azotem (około 5 min na każdą kasetę do barwienia), a następnie umieścić szkiełka w piecu na 6 h w temperaturze 550 °C w celu wyżarzania.
    UWAGA: Jest to kluczowy etap, który wygładza chropowatości na powierzchni szkła.
  6. Umieścić szkiełka w plastikowym pojemniku i chronić je przed kurzem.

2. Wytwarzanie mikrowzorowanych bloków PDMS

  1. Wymieszać prepolimer polidimetylosiloksanu (PDMS) oraz utwardzacz w stosunku 10:1 (w/w) w dużym plastikowym naczyniu wagowym i odgazować w próżni przez 1 h przy ciśnieniu 500 Torr lub niższym.
    UWAGA: PDMS jest przezroczystym i obojętnym polimerem silikonowym. Aby uzyskać pożądaną grubość bloku PDMS (0,5 cm), należy zmieszać 55 g prepolimeru z 5,5 g utwardzacza.
  2. Umieścić matrycę krzemową zawierającą wiele powtórzeń tego samego mikrowzoru SU-8 w dużym (średnica podstawy 10 cm) plastikowym naczyniu wagowym i wlać odgazowany PDMS. Następnie utwardzać w suszarce w temperaturze 60 °C przez noc.
    UWAGA: Mikrowzory są wystarczająco duże, aby były widoczne gołym okiem. Każdy wzór zawiera 8 mikrokanałów (szerokość 100 µm x wysokość 40 µm x długość 1 cm) z odstępami 40 µm między nimi (Rysunek 1A, 1B). Forma z wafla krzemowego składająca się z utwardzonego na gorąco fotorezystu SU-8 została wykonana w zakładzie nanofabrykacji27. Inne podejścia do przygotowania matrycy obejmują trawienie kwasem fluorowodorowym (HF), trawienie wodą w wysokiej temperaturze, ksyrografię oraz druk 3D28,29,30,31. Można również korzystać z komercyjnych źródeł przygotowania matryc krzemowych. Wzory dla urządzenia mikrofluidycznego zostały zaprojektowane za pomocą oprogramowania kreślarskiego (patrz tabela materiałów). Oryginalny plik zawierający projekt wzoru jest dostarczony jako plik uzupełniający „Pattern Design.dwg”, który można przekazać bezpośrednio producentowi.
  3. Ostrożnie oddzielić PDMS od matrycy krzemowej ręcznie. Zaznaczyć granice każdego mikrowzoru w formie prostokątów za pomocą skalpela chirurgicznego i linijki. Następnie pociąć PDMS na bloki.
  4. Wykonać 16 otworów (8 wlotów i 8 wylotów na blok) na obu końcach każdego mikrokanału za pomocą wycinaka do biopsji (średnica otworu 1,0 mm), zgodnie ze wskazaniem na Rysunku 3B.
  5. Nakleić taśmę na każdy blok PDMS, aby chronić mikrowzory przed uszkodzeniami i kurzem. Przechowywać je w plastikowym pojemniku.

3. Przygotowanie małych pęcherzyków jednowarstwowych (SUVs)

UWAGA: Skład dwuwarstwy kontrolnej negatywnej to 99,5 mol% 1-palmitylo-2-oleoylo-sn-glycero-3-fosfocholiny (POPC) oraz 0,5 mol% ortho-sulforodaminy B-1-palmitylo-2-oleoylo-sn-glycero-3-fosfoetanolaminy (oSRB-POPE). Skład dwuwarstwy testowej to 92,0 mol% POPC, 0,5 mol% oSRB-POPE oraz 7,5 mol% L-α-fosfatydyloinozyto-4-fosforanu (PI4P) lub L-α-fosfatydyloinozyto-4,5-bisfosforanu (PI(4,5)P2). Poniżej znajduje się procedura przygotowania SUV-ów zawierających 92,0 mol% POPC, 0,5 mol% oSRB-POPE i 7,5 mol% PI(4,5)P2. Synteza oSRB-POPE zastosowana w niniejszym badaniu została opisana wcześniej20.

  1. Oblicz objętość POPC, PI(4,5)P2 oraz oSRB-POPE, którą należy zmieszać, uwzględniając następujące ilości całkowite: 2,22 mg POPC, 0,26 mg PI(4,5)P2 oraz 2,1 x 10-5 mg oSRB-POPE.
  2. Pipetuj obliczoną objętość POPC, PI(4,5)P2 i oSRB-POPE do jednej szklanej fiolki scyntylacyjnej o pojemności 20 mL.
    UWAGA: Roztwory zapasowe POPC i oSRB-POPE są dostarczane w chloroformie, natomiast roztwór zapasowy PI(4,5)P2 (oraz innych fosfoinozytoli) znajduje się w mieszaninie rozpuszczalników chloroform:metanol:woda (20:9:1). W celu zapewnienia dokładności należy zwilżyć końcówkę pipety chloroformem przed użyciem. Ze względów bezpieczeństwa ten krok powinien być wykonywany w dygestorium chemicznym.
  3. Wysusz mieszaninę strumieniem azotu w dygestorium chemicznym przez 10 min lub do momentu odparowania rozpuszczalnika i utworzenia cienkiej warstwy lipidowej na dnie fiolki.
  4. Poddaj mieszaninę desykacji w próżni przez ≥3 h przy ciśnieniu 10 mTorr, aby usunąć wszelkie pozostałości organicznego rozpuszczalnika.
    UWAGA: 3-godzinny czas desykacji jest wystarczający dla skali przygotowania SUV opisanej w tym protokole, która pozwala na przeprowadzenie 50 eksperymentów. W przypadku potrzeby przygotowania większej ilości SUV można przeprowadzić desykację przez noc.
  5. Rehydratyzuj wysuszoną warstwę lipidową przy użyciu 5 mL buforu roboczego (20 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 7,0) i umieść w kąpieli ultradźwiękowej o częstotliwości pracy 35 kHz na 30 min w RT.
    UWAGA: Zmieszanie ilości lipidów określonych w kroku 3.1 i dodanie 5 mL buforu roboczego w kroku 3.5 daje zawiesinę pęcherzyków o stężeniu 0,5 mg/mL. Na tym etapie zawiesina pęcherzyków stanowi mieszaninę pęcherzyków jednowarstwowych i wielowarstwowych (Rysunek 2B). Roztwór będzie miał kolor różowo-fioletowy i będzie stosunkowo mętny.
  6. Poddaj zawiesinę pęcherzyków cyklom zamrażania i rozmrażania przy użyciu ciekłego azotu oraz kąpieli wodnej w temperaturze 40 °C, aby uzyskać pęcherzyki jednowarstwowe. Powtórz proces zamrażania i rozmrażania 10 razy.
    UWAGA: (Opcjonalnie) Aby zapewnić brak pęcherzyków innych niż jednowarstwowe w zawiesinie, można zastosować etap wirowania32,33.
  7. Wytłaczaj zawiesinę pęcherzyków przez poliwęglanową membranę z otworami o średnicy 0,10 µm za pomocą ekstrudera lipidowego (patrz tabela materiałów), aby wzbogacić próbkę w SUV. Powtórz ekstruzję 10 razy.
    UWAGA: Do zbierania wytłoczonych pęcherzyków można użyć stożkowej probówki 15-mL. Na tym etapie roztwór nie powinien być mętny. Średnicę SUV można potwierdzić za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (DLS) (Rysunek 2C). SUV najlepiej nadają się do tworzenia SLB34.
  8. Przykryj probkę stożkową folią aluminiową i przechowuj w temperaturze 4 °C do momentu użycia.

4. Montaż urządzenia mikrofluidycznego

  1. Sprawdź wloty i wyloty bloku PDMS pod kątem zatorów, przepłukując otwory wodą dejonizowaną za pomocą butelki do płukania. Następnie wysusz blok PDMS strumieniem azotu.
    UWAGA: Ten krok pozwoli również usunąć wszelkie cząsteczki kurzu, które mogły zostać uwięzione wewnątrz i/lub pomiędzy kanałami. W razie potrzeby oczyść uprzednio umyte szkiełka nakrywki strumieniem azotu w celu usunięcia zanieczyszczeń pyłowych.
  2. Umieść blok PDMS oraz uprzednio umytą szkiełko nakrywkę (patrz sekcja 1) w komorze próbkowania systemu plazmy tlenowej (patrz tabela materiałów), aby poddać je działaniu plazmy tlenowej przez 45 s przy mocy 75 Watts, przepływie tlenu 10 cm3/min i próżni na poziomie 200 mTorr.
  3. Bezpośrednio po obróbce plazmą tlenową dociśnij ustrukturyzowaną powierzchnię bloku PDMS do szkiełka nakrywki. Przyciśnij delikatnie, aby usunąć pęcherzyki powietrza z miejsc styku.
  4. Umieść urządzenie na wypoziomowanej płycie grzewczej w temperaturze 100 °C przez 3 min w celu wzmocnienia wiązania.
  5. Użyj wilgotnej, niepozostawiającej włókien ściereczki (np. kimwipe) nasączonej 100% etanolem, aby usunąć cząsteczki kurzu z górnej części (PDMS) oraz dolnej części (szkło) urządzenia. Następnie przymocuj urządzenie taśmą do szklanego preparatu mikroskopowego.
    UWAGA: Nie używaj nadmiernej ilości etanolu i unikaj dostania się go do kanałów wlotowych i wylotowych. Zaleca się wykonanie tego kroku, gdy urządzenie jest jeszcze gorące, aby zapewnić natychmiastowe odparowanie etanolu. Szklane preparaty mikroskopowe można przechowywać w 100% roztworze etanolu w celu usunięcia kurzu i innych zanieczyszczeń.

5. Tworzenie wspieranych dwuwarstw lipidowych (SLBs)

  1. Transfer 100 µL PI(4,5)P22zawierające SUV-y z etapu 3.8 do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 0,65 ml. Dostosować pH roztworu do wartości ~3,2 poprzez dodanie 6.4 µL 0,2 N kwasu solnego.
    UWAGA: Należy potwierdzić wartość pH roztworu za pomocą pH-metru wyposażonego w mikroelektrodę pH (patrz tabela z materiałami).
  2. Pipeta 10 µL roztworu SUV o skorygowanym pH do każdego kanału przez wlot i wywieraj nacisk za pomocą pipety, aż roztwór dotrze do wylotu. Odłącz końcówkę od pipety, pozostawiając ją przytwierdzoną do urządzenia.
  3. Powtórz powyższy krok dla każdego kanału, a następnie inkubuj urządzenie przez 10 min w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Wtryskiwanie pęcherzyków do mikrokanałów należy przeprowadzić niezwłocznie po montażu urządzenia.
  4. Odciąć zestawy przewodów wlotowych i wylotowych o długości odpowiednio 60 cm (przewód wlotowy) i 8 cm (przewód wylotowy).
    UWAGA: Przecięcie rurki pod kątem i utworzenie ostrej krawędzi ułatwia wprowadzenie rurki do wlotów i wylotów. Rurka wylotowa powinna mieć kształt łuku. Długość rurki wlotowej może się różnić w zależności od konfiguracji mikroskopu. Średnica wewnętrzna rurki wynosi 0,05 cm.
  5. Za pomocą pęsety podłącz zestaw rurek wylotowych do urządzenia, a następnie przymocuj urządzenie taśmą do stolika mikroskopu.
  6. Zanurz jeden koniec zestawu rurek doprowadzających w 25 ml buforu do płukania w probówce stożkowej i przymocuj go taśmą, aby upewnić się, że rurki są stabilnie zamocowane.
  7. Umieść probówkę stożkową na podwyższeniu (~20 cm) względem urządzenia, aby umożliwić przepływ roztworu przez mikrokanały pod wpływem grawitacji; w tym celu można wykorzystać podnośnik laboratoryjny.
  8. Dla każdej rurki dopływowej należy za pomocą strzykawki pobrać 1 ml buforu płuczącego z wolnego końca rurki. Należy wyjąć końcówkę pipety z wlotu, a następnie włożyć wolny koniec rurki dopływowej do urządzenia.
    UWAGA: Należy nanieść kroplę buforu do elektroforezy na wlot, aby zmniejszyć prawdopodobieństwo wprowadzenia pęcherzyka powietrza do kanału podczas tego etapu. Po podłączeniu rurki wlotowej do urządzenia należy usunąć nadmiar buforu za pomocą ściereczki bezpyłowej.
  9. Powtórz powyższy krok, aby podłączyć wszystkie fragmenty przewodów wlotowych do urządzenia.
    UWAGA: Przepływ buforu roboczego przez kanały pomaga usunąć nadmiar pęcherzyków i doprowadzić dwuwarstwę do stanu równowagi w warunkach eksperymentalnych.
  10. Uruchom oprogramowanie do sterowania mikroskopem (patrz tabela materiałów). W panelu po lewej stronie kliknij "Mikroskop" zakładka i wybierz "10X" cel
  11. Kliknij w "Na żywo" a następnie "Alexa 568" ikony obrazów na pasku narzędzi. Używając pokręteł regulacji precyzyjnej i grubej, ustaw ostrość na mikrokanały.
  12. Przeskanuj urządzenie, aby sprawdzić jakość SLB i kanałów (Rysunek 8). Następnie kliknij "Zamknięta migawka FL" ikona obrazu na pasku narzędzi.
  13. Kliknij w "Pozyskiwanie danych" zakładka oraz w sekcji "Podstawowe regulacje" wybierz "Czas ekspozycji." Ustaw czas ekspozycji na "200 ms".
  14. W lewym panelu kliknij "Akwizycja wielowymiarowa" a w menu filtrów wybierz kanał czerwony (oznaczony jako "Alexa 568"). Następnie kliknij w "pokreślenie czasowe (time-lapse)" menu, ustaw interwał czasowy na 5 min, czas trwania na 30 min i kliknij "Start".
    UWAGA: Na podstawie czasu trwania (30 min) i szybkości przepływu (~1.0 µL/min), 30 µL buforu do elektroforezy jest używany do równoważenia SLB wewnątrz kanału, t. j. 240 µL buforu do elektroforezy stosuje się dla wszystkich 8 kanałów.
  15. Wybierz "Okrąg" narzędzie pod "Pomiar" zakładka i narysowanie okręgu w dowolnym kanale. Kliknij prawym przyciskiem myszy podczas zaznaczenia okręgu i wybierz "Właściwości"Pod "Profil" zakładka, sprawdź "wszystkie T" aby zaobserwować intensywność fluorescencji w funkcji czasu.
    1. Upewnij się, że krzywa ta osiągnęła plateau, co wskazuje na stan równowagi, przed przejściem do następnego kroku.
  16. Obniżyć poziom roztworu buforowego do poziomu urządzenia, aby zatrzymać przepływ.
  17. Zapisz plik z zapisem poklatkowym.

6. Badanie interakcji domeny PH białka PLC-δ1 z SLB zawierającymi PI(4,5)P2

  1. Przygotuj rozcieńczenia domeny PH, używając buforu roboczego jako rozcieńczalnika.
    UWAGA: Ponieważ urządzenie posiada osiem kanałów, wykorzystaj co najmniej dwa z nich jako kontrole ślepe. Wybierz skrajne kanały po obu stronach, a pozostałe wykorzystaj do rozcieńczeń białka. Przetestowano następujące stężenia domeny PH: 0,10, 0,25, 0,50, 1,00 oraz 2,50 µM. Około 200 µL każdego rozcieńczenia było wystarczające do osiągnięcia stanu równowagi w ciągu 30 min.
  2. Odłączaj kolejno każdą rurkę wylotową i za pomocą pipety nanieś 200 µL każdego rozcieńczenia białka do kanału wylotowego. Nie wywieraj żadnego nacisku, pozwól działać grawitacji. Odłącz końcówkę z pipety i pozostaw ją przytwierdzoną do urządzenia mikroprzepływowego.
  3. Powtórz powyższy krok dla każdego kanału, upewniając się, że podczas tego procesu do kanałów nie dostały się pęcherzyki powietrza.
  4. Obniż rurkę wlotową poniżej poziomu urządzenia mikroprzepływowego, aby rozpocząć przepływ białka przez mikrokanały. Przymocuj wolny koniec rurki taśmą do pojemnika na odpady. Pozostaw rozcieńczenia białka w przepływie przez 30 min.
    UWAGA: Spowoduje to odwrócenie kierunku przepływu i umożliwi wprowadzenie białka do kanałów. Czas osiągnięcia stanu równowagi oraz objętość potrzebnych rozcieńczeń białka będą zależeć od powinowactwa oddziaływania.
  5. W lewym panelu oprogramowania, w zakładce „Time Lapse”, kliknij „Start”, aby ponownie rozpocząć obrazowanie.
  6. Powtórz krok 5.15, aby upewnić się, że osiągnięto stan równowagi. Po zakończeniu eksperymentu zapisz plik z sekwencją czasową (time lapse).

7. Ocena płynności błony

UWAGA: Eksperymenty z zakresu fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP) należy przeprowadzać z każdą nową partią SUV oraz oczyszczonymi szkiełkami podstawowymi, aby upewnić się, że SLB są płynne.

  1. Postępuj zgodnie z procedurą czyszczenia szklanych szkiełek nakrywkowych (1.1-1.6), wytwarzania mikrowzorowanych bloków PDMS (2.1-2.5), przygotowywania SUV (3.1-3.8), montażu urządzenia mikrofluidycznego (4.1-4.5) oraz tworzenia SLB (5.1-5.17), zgodnie z wcześniejszym opisem.
  2. Ustaw ostrość mikroskopu na dwuwarstwę, ustaw czas ekspozycji na 200 ms oraz binning na 1.
  3. Przeprowadź fotowybielenie okrągłego obszaru za pomocą wiązki lasera o długości fali 532 nm i mocy 2 mW (promień 13 µm). Natychmiast po fotowybieleniu rozpocznij rejestrowanie serii obrazów co 3 s przez pierwsze 45 s, a następnie w odstępach 30 s przez pozostały czas (całkowity czas trwania 15 min). Po zakończeniu akwizycji danych zapisz plik time-lapse.
  4. Wybierz wybielony obszar za pomocą narzędzia do rysowania kół, aby wyekstrahować wartości natężenia fluorescencji w funkcji czasu. Dodatkowo wybierz dwa kolejne obszary w pobliżu: jeden odpowiadający regionowi niewybielonemu oraz jeden odpowiadający regionowi pozbawionemu SLB.
  5. Oblicz regenerację fluorescencji (y) korzystając z następującego równania:
    figure-protocol-1
    UWAGA: Tutaj Ft oznacza natężenie w regionie wybielonym w funkcji czasu, Fi oznacza natężenie fluorescencji przed wybieleniem (w tym przypadku należy użyć wartości znormalizowanej „1”), a F0 to natężenie tła.
  6. Przedstaw regenerację fluorescencji (oś y) w funkcji czasu (oś x), aby wygenerować krzywą FRAP. Następnie dopasuj dane do pojedynczej funkcji wykładniczej w następujący sposób:
    figure-protocol-2
    UWAGA: Tutaj A oznacza frakcję mobilną, a k to stała kinetyczna dla frakcji mobilnej, wykorzystywana do obliczenia czasu połowicznego regeneracji (t1/2):
    figure-protocol-3
  7. Wykorzystaj t1/2 do obliczenia stałej dyfuzji (D):
    figure-protocol-4
    UWAGA: Tutaj R oznacza promień wiązki lasera (13 µm). Stała dyfuzji dla płynnej dwuwarstwy powinna wynosić ≥1.0 µm2/s.

8. Przetwarzanie danych

UWAGA: Procedura analizy danych będzie zależeć od użytego mikroskopu, oprogramowania do przetwarzania obrazów oraz oprogramowania do dopasowywania krzywych.

  1. Otwórz pliki time-lapse sprzed (z kroku 5.17) i po (z kroku 6.6) miareczkowania domeny PH. Przejdź do ostatniej klatki każdego pliku time-lapse i wykonaj skan liniowy w poprzek wszystkich mikrokanałów, aby uzyskać dane dotyczące intensywności fluorescencji w funkcji odległości w pikselach (Rysunek 6A). Przenieś dane do programu arkusza kalkulacyjnego.
  2. Dla każdego mikrokanału (przed i po dodaniu domeny PH) pobierz próbki danych wewnątrz kanału oraz po obu jego stronach, reprezentujące poziom bazowy (Rysunek 7A).
    UWAGA: Intensywność fluorescencji kanału pustego powinna pozostać niezmieniona. Wszystkie pozostałe kanały są normalizowane względem kanału pustego, dlatego kluczowe jest posiadanie dwóch kanałów pustych i upewnienie się, że ich intensywności fluorescencji pozostają ze sobą spójne.
  3. Zastosuj poniższy wzór, aby znormalizować dane względem kanału pustego; przykładowe obliczenia przedstawiono w Rycina 7B.
    figure-protocol-5
    UWAGA: Tutaj ΔFbiałko reprezentuje intensywność fluorescencji kanału białkowego po odjęciu tła, ΔFProszę wprowadzić tekst źródłowy do tłumaczenia. reprezentuje fluorescencyjną intensywność kanału pustego po odjęciu tła, pre i Wpis odnieś się do etapów przed i po mianowaniu białka, a następnie α reprezentuje współczynnik korekcyjny, który jest stosunkiem intensywności fluorescencji kanału białkowego i kanału ślepego ([Fbiałko/FTekst źródłowy nie został dostarczony. Proszę o przesłanie treści do tłumaczenia.]pre) na etapie miareczkowania pre-białka. Ponieważ intensywność fluorescencji spada w funkcji stężenia domeny PH, znormalizowane dane będą miały wartości ujemne.
  4. Korzystając z oprogramowania do dopasowywania krzywych (patrz Tabela materiałów), przedstaw znormalizowaną fluorescencję jako funkcję stężenia domeny PH i dopasuj do izotermy Langmuira (Rysunek 6C):
    figure-protocol-6
    UWAGA: Tutaj ∆F reprezentuje zmianę intensywności fluorescencji w stosunku do maksymalnej zmiany intensywności fluorescencji przy obecności nasycającego stężenia białka (∆Fmaks.), podczas gdy Kd,app reprezentuje pozorną stałą dysocjacji, która jest równa stężeniu białka w roztworze ([PLC-δ1 PH]), przy którym osiągnięto 50% pokrycia (kompleksu związanego z błoną). Jest to pomiar wiązania oparty na równowadze, zatem znormalizowane dane dopasowano do prostej izotermy Langmuira w celu wyznaczenia pozornego parametr eksperymentalny Kd,appNa podstawie oprogramowania do dopasowywania the Kd,app dla PLC-δ1 PH-PI(4,5)P2 interakcja wynosi 0,39 ± 0.05 µM (Rysunek 6B).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykorzystaliśmy test modulacji pH do zbadania oddziaływania domeny PH białka PLC-δ1 z PI(4,5)P2 w mikro urządzeniu PIP-on-a-chip (Rysunek 1). Poprzez szczegółowy protokół zademonstrowaliśmy sposób przygotowania i montażu komponentów urządzenia mikroprzepływowego, wytwarzania małych jednowarstwowych pęcherzyków (SUVs) (Rysunek 2), tworzenia SLB wewnątrz urządzenia (Rysunek 3) oraz testowani...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Każdy wariant, choć w niskich stężeniach, jest obecny na powierzchni cytozolowej określonych organelli, gdzie przyczynia się do ustalenia unikalnego składu fizycznego i swoistości funkcjonalnej błony organellarnej1. Jednym z najważniejszych zastosowań jest swoista platforma dokująca dla wielu białek wymagających określonej lokalizacji subkomórkowej i/lub aktywacji 6,7. Ze względu na ich rolę w fizjologii i chorobie komórkowej ważna jest mo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

D.S. i C.E.C. były częściowo wspierane przez granty AI053531 (NIAID, NIH); S.S i P.S.C. otrzymały wsparcie w ramach grantu N00014-14-1-0792 (ONR).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szkiełko nakrywkowe
szklane Szkiełka nakrywkowe: prostokątneFisher Scientific12-544B22 x 40 x 0,16 - 0,19 mm, nr 1 1/2; Szkło borokrzemianowe
7X Roztwór czyszczącyMP Biomedicals976670Detergent
Naczynie krystalizujące PYREXCorning3140-190Naczynie ze szkła borokrzemianowego z płaskim dnem; Średnica x wysokość (190 x 100 mm); Dystrybutor: VWR (89090-700)
Sentry Xpress 2.0Paragon IndustriesSC-2
PiecNazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
PDMS
Sylgard 184 Zestaw elastomerów silikonowychDow Corning4019862polidimetylosiloksan (PDMS); Dystrybutor: Ellsworth Adhesives
PYREX EksykatorVWR89134-402Próżniowy
dziurkacz do biopsjiHarris15110-10Harris Uni-Core; średnica 1,0 mm; Dziurkacz do biopsji Miltex z tłokiem (Kat. Nr 15110-10) może być stosowany jako alternatywa
NazwaFirmaNumer katalogowyUwagi
Device
Plasma Cleaning SystemPlasmaEtchPE25-JW2-stopniowa pompa próżniowa oleju z napędem bezpośrednim, Usługa O2 (Krytox Charged)
test porównawczypłyty grzejnejH3760-Hzakupiony za pośrednictwem Denville Scientific (Kat. Nr 1005640)
Matowe mikroprowadniceVWR48312-003Matowe, wyselekcjonowane i wstępnie oczyszczone; Wykonany ze szwajcarskiego szkła; Grubość: 1 mm; Wymiary: 75 x 25 mm; GR 144
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mold
AutoCAD Autodeskv.2016Oprogramowanie kreślarskie do projektowania fotomaski
PhotomaskCAD/Art ServicesN/AProjekt z czarnym tłem i wyraźnymi elementami został wydrukowany w rozdzielczości 20k dpi na przezroczystej masce (5 x 7 cali) przez CAD/Art
Services Silicone WafersUniversity Wafer1575Prime Grade, jednostronnie polerowany; Średnica 100 mm (4 cale); Grubość 525 um
SU-8 50MicroChem Corp.Nie dotyczyFotorezystor o tonie ujemnym; Penn State Nanofabrication Facility Property
SU-8 DeweloperMicroChem Corp.N/APenn State Nanofabrication Facility Nieruchomość
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
SUV
1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glycero-3-fosfocholinaAvanti Polar Lipids850457CPOPC
L-&alfa;-fosfatydyloinozytol-4-fosforanAvanti Polar Lipids840045XPI4P
L-&alfa;-fosfatydyloinozytol-4,5-bisfosforanAvanti Polar Lipids840046XPI(4,5)P2
1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloaminaAvanti Polar Lipids850757CPOPE; Wymagane do syntezy oSRB-POPE
Lissamine Rodamine B Sulfonyl Chloride (mieszane izomery)ThermoFisher ScientificL-20Wymagane do syntezy oSRB-POPE
Fluorescencyjna sonda lipidowa wrażliwa na pH (oSRB-POPE)Własnan/Awe własnym zakresie (Huang D. i in. 2013)
Szklana fiolka scyntylacyjnaVWR66022-065Pojemność 20 ml
Aquasonic 250DVWRN/AUltradźwiękowe
membrany nukleporoweWhatman110605Membrana poliwęglanowa; Średnica: 25 mm; Wielkość porów: 0,1 μm; Dystrybutor: Sigma-Aldrich
ChloroformVWRCX1054-6HPLC
grade LIPEX ExtruderTransferra NanosciencesT.001LIPEX 10 mL Thermobarrel Extruder
Viscotek 802 DLSMalvern InstrumentsN/ADynamiczne rozpraszanie światła; Zakład krystalografii rentgenowskiej w Penn State Właściwość
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Analiza danych
GraphPad Prism GraphPadSoftwarev.6Oprogramowanie do dopasowywania krzywych do analizy danych
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
mikroskop
Axiovert 200M Mikroskop epifluorescencyjnyZeiss MikroskopiaN/A
Mikroskop AxioCam MRm MikroskopCarl ZeissNie dotyczyKamera
X-Cite 120Excelitas TechnologiesNie dotyczyŹródło światła
Alexa 568 Zestaw filtrówCarl Zeiss MicroscopyN/AEx/Em 576/603 nm
AxioVision LE64 v.4.9.1.0 OprogramowanieCarl Zeiss MicroscopyN/AOprogramowanie do przetwarzania obrazu
NazwaFirma Numer katalogowyUwagi
Inne
TipsVWR10034-132Końcówki do pipet 200 μL; Cienka i gładka końcówka do nakładania roztworu białkowego do kanału mikroprzepływowego
KońcówkiVWR53509-07010 μL; Cienka i gładka końcówka do nakładania roztworu pęcherzykowego do kanału mikroprzepływowego
Miernik pH Orion Star A321Termo ScientificSTARA3210pH-metr
Mikrosonda pH Orion TermoScientific8220BNWPmikrosonda pH
N-(2-hydroksyetylo)-piperazyno-N'-(kwas 2-etanosulfonowy)VWRVWRB30487HEPES, Wolny kwas
chlorek soduVWRBDH8014-2,5 KGR
RurkiDrut pokrewny i TFT-200-24 NŚrednica wewnętrzna: 0,020-0,026 cala (0,051-0,066 cm); Grubość ścianki: 0,010 cala (0,025 cm); Elastyczne cienkościenne rurki z politetrafluoroetylenu; Naturalny kolor
Azot Gaz - PrzemysłowyPraxairN/ALokalny dostawca
Tlen Gaz - PrzemysłowyPraxairN/ALokalny dostawca
Ciekły azotPraxairN/ALokalny dostawca
Cyfrowy synteza w kąpieli wodnej Carl NaCl

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Di Paolo, G., De Camilli, P. Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics. Nature. 443 (7112), 651-657 (2006).
  2. Shewan, A., Eastburn, D. J., Mostov, K. Phosphoinositides in cell architecture. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (8), a004796(2011).
  3. Picas, L., Gaits-Iacovoni, F., Goud, B. The emerging role of phosphoinositide clustering in intracellular trafficking and signal transduction. F1000Res. 5, (2016).
  4. Lystad, A. H., Simonsen, A. Phosphoinositide-binding proteins in autophagy. FEBS Lett. 590 (15), 2454-2468 (2016).
  5. Balla, T. Phosphoinositides: Tiny lipids with giant impact on cell regulation. Physiol Rev. 93, 1019-1137 (2013).
  6. Lemmon, M. A. Membrane recognition by phospholipid-binding domains. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (2), 99-111 (2008).
  7. Kutateladze, T. G. Translation of the phosphoinositide code by PI effectors. Nat Chem Biol. 6 (7), 507-513 (2010).
  8. Harlan, J. E., Hajduk, P. J., Yoon, H. S., Fesik, S. W. Pleckstrin homology domains bind to phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate. Nature. 371 (6493), 168-170 (1994).
  9. Garcia, P., et al. The pleckstrin homology domain of phospholipase C-delta 1 binds with high affinity to phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in bilayer membranes. Biochemistry. 34 (49), 16228-16234 (1995).
  10. Lemmon, M. A., Ferguson, K. M., O'Brien, R., Sigler, P. B., Schlessinger, J. Specific and high-affinity binding of inositol phosphates to an isolated pleckstrin homology domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (23), 10472-10476 (1995).
  11. Flesch, F. M., Yu, J. W., Lemmon, M. A., Burger, K. N. Membrane activity of the phospholipase C-delta1 pleckstrin homology (PH) domain. Biochem J. 389, 435-441 (2005).
  12. Narayan, K., Lemmon, M. A. Determining selectivity of phosphoinositide-binding domains. Methods. 39 (2), 122-133 (2006).
  13. Scott, J. L., Musselman, C. A., Adu-Gyamfi, E., Kutateladze, T. G., Stahelin, R. V. Emerging methodologies to investigate lipid-protein interactions. Integr Biol (Camb). 4 (3), 247-258 (2012).
  14. Dowler, S., Currie, R. A., Downes, C. P., Alessi, D. R. DAPP1: A dual adaptor for phosphotyrosine and 3-phosphoinositides. Biochem J. 342, 7-12 (1999).
  15. He, J., et al. Molecular basis of phosphatidylinositol 4-phosphate and ARF1 GTPase recognition by the FAPP1 pleckstrin homology (PH) domain. J Biol Chem. 286 (21), 18650-18657 (2011).
  16. Ceccarelli, D. F., et al. Non-canonical interaction of phosphoinositides with pleckstrin homology domains of Tiam1 and ArhGAP9. J Biol Chem. 282 (18), 13864-13874 (2007).
  17. Huang, S., Gao, L., Blanchoin, L., Staiger, C. J. Heterodimeric capping protein from Arabidopsis is regulated by phosphatidic acid. Mol Biol Cell. 17 (4), 1946-1958 (2006).
  18. Yu, J. W., et al. Genome-eide analysis of membrane targeting by S. cerevisiae pleckstrin homology domains. Mol Cell. 13 (5), 677-688 (2004).
  19. Jung, H., Robison, A. D., Cremer, P. S. Detecting protein-ligand binding on supported bilayers by local pH modulation. J Am Chem Soc. 131 (3), 1006-1014 (2009).
  20. Huang, D., Zhao, T., Xu, W., Yang, T., Cremer, P. S. Sensing small molecule interactions with lipid membranes by local pH modulation. Anal Chem. 85 (21), 10240-10248 (2013).
  21. Saxena, A., et al. Phosphoinositide binding by the pleckstrin homology domains of Ipl and Tih1. J Biol Chem. 277 (51), 49935-49944 (2002).
  22. Knödler, A., Mayinger, P. Analysis of phosphoinositide-binding proteins using liposomes as an affinity matrix. Biotechniques. 38 (6), 858-862 (2005).
  23. Baumann, M. K., Swann, M. J., Textor, M., Reimhult, E. Pleckstrin homology-phospholipase C-delta1 interaction with phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate containing supported lipid bilayers monitored in situ with dual polarization interferometry. Anal Chem. 83 (16), 6267-6274 (2011).
  24. Saliba, A. E., et al. A quantitative liposome microarray to systematically characterize protein-lipid interactions. Nat Methods. 11 (1), 47-50 (2014).
  25. Arauz, E., Aggarwal, V., Jain, A., Ha, T., Chen, J. Single-molecule analysis of lipid-protein interactions in crude cell lysates. Anal Chem. 88 (8), 4269-4276 (2016).
  26. Best, Q. A., Xu, R., McCarroll, M. E., Wang, L., Dyer, D. J. Design and investigation of a series of rhodamine-based fluorescent probes for optical measurements of pH. Org Lett. 12 (14), 3219-3221 (2010).
  27. Lee, J., Choi, K. H., Yoo, K. Innovative SU-8 lithography techniques and their applications. Micromachines. 6 (1), 1-18 (2014).
  28. Poyton, M. F., Sendecki, A. M., Cong, X., Cremer, P. S. Cu(2+) binds to phosphatidylethanolamine and increases oxidation in lipid membranes. J Am Chem Soc. 138 (5), 1584-1590 (2016).
  29. Karasek, P., Grym, J., Roth, M., Planeta, J., Foret, F. Etching of glass microchips with supercritical water. Lab Chip. 15 (1), 311-318 (2015).
  30. Thomas, M. S., et al. Print-and-peel fabrication for microfluidics: what's in it for biomedical applications? Ann Biomed Eng. 38 (1), 21-32 (2010).
  31. Waheed, S., et al. 3D printed microfluidic devices: enablers and barriers. Lab Chip. 16 (11), 1993-2013 (2016).
  32. Axmann, M., Schutz, G. J., Huppa, J. B. Single molecule fluorescence microscopy on planar supported bilayers. J Vis Exp. (105), e53158(2015).
  33. Barenholz, Y., et al. A simple method for the preparation of homogeneous phospholipid vesicles. Biochemistry. 16 (12), 2806-2810 (1977).
  34. Castellana, E. T., Cremer, P. S. Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design. Surface Science Reports. 61 (10), 429-444 (2006).
  35. Hamai, C., Yang, T., Kataoka, S., Cremer, P. S., Musser, S. M. Effect of average phospholipid curvature on supported bilayer formation on glass by vesicle fusion. Biophys J. 90 (4), 1241-1248 (2006).
  36. Tero, R. Substrate effects on the formation process, structure and physicochemical properties of supported lipid bilayers. Materials. 5 (12), 2658-2680 (2012).
  37. Ferguson, K. M., Lemmon, M. A., Schlessinger, J., Sigler, P. B. Structure of the high affinity complex of inositol trisphosphate with a phospholipase C pleckstrin homology domain. Cell. 83 (6), 1037-1046 (1995).
  38. Simonsson, L., Hook, F. Formation and diffusivity characterization of supported lipid bilayers with complex lipid compositions. Langmuir. 28 (28), 10528-10533 (2012).
  39. Cong, X., Poyton, M. F., Baxter, A. J., Pullanchery, S., Cremer, P. S. Unquenchable surface potential dramatically enhances Cu(2+) binding to phosphatidylserine lipids. J Am Chem Soc. 137 (24), 7785-7792 (2015).
  40. Robison, A. D., et al. Polyarginine interacts more strongly and cooperatively than polylysine with phospholipid bilayers. J Phys Chem B. 120 (35), 9287-9296 (2016).
  41. Robison, A. D., Huang, D., Jung, H., Cremer, P. S. Fluorescence modulation sensing of positively and negatively charged proteins on lipid bilayers. Biointerphases. 8 (1), 1(2013).
  42. Tabaei, S. R., et al. Formation of cholesterol-rich supported membranes using solvent-assisted lipid self-assembly. Langmuir. 30 (44), 13345-13352 (2014).
  43. Johnson, S. J., et al. Structure of an adsorbed dimyristoylphosphatidylcholine bilayer measured with specular reflection of neutrons. Biophys J. 59 (2), 289-294 (1991).
  44. Koenig, B. W., et al. Neutron reflectivity and atomic force microscopy studies of a lipid bilayer in water adsorbed to the surface of a silicon single crystal. Langmuir. 12 (5), 1343-1350 (1996).
  45. Tanaka, M., Sackmann, E. Polymer-supported membranes as models of the cell surface. Nature. 437 (7059), 656-663 (2005).
  46. Renner, L., et al. Supported lipid bilayers on spacious and pH-responsive polymer cushions with varied hydrophilicity. J Phys Chem B. 112 (20), 6373-6378 (2008).
  47. Wagner, M. L., Tamm, L. K. Tethered polymer-supported planar lipid bilayers for reconstitution of integral membrane proteins: Silane-polyethyleneglycol-lipid as a cushion and covalent linker. Biophys J. 79 (3), 1400-1414 (2000).
  48. Pace, H., et al. Preserved transmembrane protein mobility in polymer-supported lipid bilayers derived from cell membranes. Anal Chem. 87 (18), 9194-9203 (2015).
  49. Braunger, J. A., Kramer, C., Morick, D., Steinem, C. Solid supported membranes doped with PIP2: Influence of ionic strength and pH on bilayer formation and membrane organization. Langmuir. 29 (46), 14204-14213 (2013).
  50. Paridon, P. A., de Kruijff, B., Ouwerkerk, R., Wirtz, K. W. Polyphosphoinositides undergo charge neutralization in the physiological pH range: A 31P-NMR study. Biochim Biophys Acta. 877 (1), 216-219 (1986).
  51. Liu, C., Huang, D., Yang, T., Cremer, P. S. Monitoring phosphatidic acid formation in intact phosphatidylcholine bilayers upon phospholipase D catalysis. Anal Chem. 86 (3), 1753-1759 (2014).
  52. Saad, J. S., et al. Structural basis for targeting HIV-1 Gag proteins to the plasma membrane for virus assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11364-11369 (2006).
  53. Hsu, N. Y., et al. Viral reorganization of the secretory pathway generates distinct organelles for RNA replication. Cell. 141 (5), 799-811 (2010).
  54. Del Campo, C. M., et al. Structural basis for PI(4)P-specific membrane recruitment of the Legionella pneumophila effector DrrA/SidM. Structure. 22 (3), 397-408 (2014).
  55. Kolli, S., et al. Structure-function analysis of vaccinia virus H7 protein reveals a novel phosphoinositide binding fold essential for poxvirus replication. J Virol. 89 (4), 2209-2219 (2015).
  56. Cho, N. J., et al. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate is an HCV NS5A ligand and mediates replication of the viral genome. Gastroenterology. 148 (3), 616-625 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Test PIP on a chipwspierane dwuwarstwy lipidowetest modulacji pHdomena PH fosfolipazy Cfosfatydyloinozytol 45 bisfosforanwytwarzanie urz dze mikroprzep ywowychma e p cherzyki jednowarstwowepomiar intensywno ci fluorescencjipozorna sta a dysocjacji

Powiązane artykuły