Protokół dla HER2 FISH z wykorzystaniem niesieciowanego, wolnego od formaliny utrwalacza tkankowego, aby połączyć zalety kriokonserwacji i utrwalania formaliny

Podsumowanie

Fluorescencyjna hybrydyzacja in-situ (FISH) jest często wymagana w połączeniu z histopatologią i diagnostyką molekularną w celu wyboru terapii w medycynie spersonalizowanej. Nowatorski, niesieciowany, wolny od formaliny utrwalacz tkankowy, który umożliwia wysokiej jakości analizy morfologiczne, molekularne i FISH z tej samej próbki poprzez dodanie etapu po utrwaleniu przed przedstawieniem FISH.

Streszczenie

Morfologiczna ocena próbek tkanek z utrwalonymi w formalinie, zatopionymi w parafinie (FFPE) była złotym standardem w diagnostyce raka przez dziesięciolecia ze względu na doskonałe zachowanie morfologii. Medycyna spersonalizowana w coraz większym stopniu zapewnia indywidualnie dostosowane i ukierunkowane terapie dla scharakteryzowanych poszczególnych chorób, możliwe dzięki połączonym technologiom analizy morfologicznej i molekularnej oraz diagnostyce. Wykonanie testów morfologicznych i molekularnych z tej samej próbki FFPE jest trudne ze względu na negatywny wpływ formaliny spowodowany modyfikacją chemiczną i sieciowaniem kwasów nukleinowych i białek. Niedawno opracowano niesieciowany, wolny od formaliny utrwalacz tkankowy, aby spełnić oba wymagania, tj. zachować morfologię, taką jak FFPE i biomolekuły, takie jak kriokonserwacja. Ponieważ FISH jest często wymagany w połączeniu z histopatologią i diagnostyką molekularną, przetestowaliśmy możliwość zastosowania protokołów FISH na tkankach leczonych tym nowym utrwalaczem. Odkryliśmy, że formalina po utrwaleniu histologicznych odcinków tkanki raka piersi niesieciowanej, wolnej od formaliny i zatopionej w parafinie (NCFPE) uzyskała wyniki równoważne wynikom z tkanką FFPE w analizie FISH receptora ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu 2 (HER2). Protokół ten opisuje, w jaki sposób test FISH, pierwotnie opracowany i zwalidowany dla tkanki FFPE, może być wykorzystany do tkanek NCFPE poprzez prosty etap po utrwaleniu odcinków histologicznych.

Wprowadzenie

Medycyna spersonalizowana coraz częściej opiera się na testach wieloparametrowych, obejmujących morfologiczną i molekularną analizę tkanek. Utrwalanie tkanek w formalinie jako złoty standard zapewnia doskonałą jakość morfologiczną^1,2. Jednak wywołana formaliną modyfikacja chemiczna i sieciowanie białek i kwasów nukleinowych ^3,4,5 negatywnie zakłóca analizę molekularną⁶. Te modyfikacje molekularne ograniczają jakość kwasów nukleinowych i białek i mogą powodować artefakty sekwencji genów⁷ lub zmniejszoną czułość testów opartych na reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR)⁸. Chociaż podjęto znaczne wysiłki w celu optymalizacji testów molekularnych dla tkanek FFPE, kriokonserwacja tkanek jest na ogół lepsza niż utrwalanie formaliny, co sprawia, że konieczne jest dzielenie próbek tkanek do różnych procedur konserwacji. Aby uniknąć konieczności kriokonserwacji do analiz molekularnych, opracowano niesieciowany, wolny od formaliny utrwalacz PAXgene Tissue. Ten dostępny na rynku system składa się z roztworu utrwalającego i stabilizującego zawierającego różne alkohole, kwas octowy i rozpuszczalny związek organiczny. Prawidłowe zachowanie kwasów nukleinowych, (fospo)białek i morfologii wykazano w kilku badaniach^{6,9,10,11,12,13}.

Jednym szczególnym zastosowaniem w diagnostyce nowotworów jest FISH wykrywający szeroki zakres zmian chromosomowych, takich jak translokacje, submikroskopowe delecje i amplifikacje ¹⁴. Na przykład dwadzieścia procent inwazyjnych nowotworów raka piersi wykazuje amplifikację genu receptora ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu 2 (HER2)^15,16,17, co wiąże się ze złym rokowaniem^18,19. Określenie statusu nadekspresji i amplifikacji HER2 w raku piersi za pomocą FISH jest potrzebne do selekcji pacjentów do terapii skierowanej przeciwko HER2 i jest diagnostyką towarzyszącą wymienioną przez Federalne Stowarzyszenie Leków (FDA) (http://www.fda.gov/MedicalDevices/ProductsandMedicalProcedures/InVitroDiagnostics/ucm301431.htm)¹⁷. Aby umożliwić szerokie zastosowanie diagnostyki celowanej opartej na FISH w opiece zdrowotnej, opracowano i zatwierdzono testy dla tkanek FFPE.

W poprzednim badaniu wykazaliśmy, że tkanki NCFPE nie mogą być używane do testów FISH, które zostały zatwierdzone dla tkanek FFPE. Jednak testy szeregów czasowych różnych procedur po utrwaleniu tkanek NCFPE z 4% buforowanym formaldehydem wykazały, że czas po utrwaleniu wynoszący 18 godzin lub dłuższy w skrawkach tkanki NCFPE osiągnął wyniki równoważne do tych w przypadku tkanek FFPE¹⁴.

W tym badaniu przedstawiamy szczegółowy protokół i pokazujemy wpływ niesieciowanego, wolnego od formaliny utrwalania tkanek i 24 h 4 % buforowanego formaldehydu po utrwaleniu na skrawki używane do jakości HER2 FISH i RNA z tej samej pierwotnej próbki tkanki.

Rysunek 1: Diagram przedstawiający etapy fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) i analizy RNA tkanek zatopionych w parafinie utrwalonej w formalinie (FFPE) i niesieciowanych, wolnych od formaliny tkanek zatopionych w parafinie (NCFPE). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Protokół

Badanie zostało zatwierdzone przez Komisję Etyki Uniwersytetu Medycznego w Grazu (numer referencyjny 20-066), Austria. Próbki tkanek pobrano z dwóch przypadków chirurgicznie wyciętego pierwotnego inwazyjnego raka piersi po wyrażeniu przez pacjentki pisemnej świadomej zgody.

1. Utrwalenie tkanek

UWAGA: Utrwalanie tkanek odbywa się za pomocą standardowego buforowanego roztworu formaliny (SBFS), zdefiniowanego jako 10 % roztwór formaliny zawierający udział masowy 3,7 % (co odpowiada ułamkowi objętościowemu 4 %) formaldehydu buforowanego do pH 6,8 do pH 7,2 zgodnie z CEN/TS 16827-1:2015 lub niesieciowany, wolny od formaliny system utrwalania tkanek (określany również jako alternatywny roztwór utrwalający poniżej) składający się z roztworu utrwalającego i stabilizującego w temperaturze pokojowej (RT).

1. Pokrój próbki tkanki raka piersi sterylnym skalpelem na dwie połówki o grubości 4 mm każda, aby zapewnić odpowiednią ilość tkanki. Użyj maksymalnego rozmiaru 4 x 15 x 15 mm do mocowania tkanek NCFPE lub SBFS.
2. Umieść każdą połówkę próbki guza w standardowej kasecie tkankowej i zanurz ją w SBFS lub alternatywnym roztworze utrwalającym na 24 godziny ze stosunkiem objętości do objętości (v/v) 4 części utrwalacza i jednej części tkanki (4 ml / 1 g tkanki (najlepiej 10 ml / 1 g)).
3. Przenieść alternatywnie utrwalone próbki do roztworu stabilizatora na 2-72 godziny, otwierając pojemnik, obracając kasetę z tkankami o 180° i zanurzając ją.
4. Umieścić kasety z tkankami z próbkami utrwalonymi przez SBFS w 250 ml 70 % etanolu na 30 minut w temperaturze pokojowej w celu usunięcia pozostałości SBFS.
   UWAGA: Ten krok jest ważny, aby uniknąć zanieczyszczenia SBFS próbek poddanych działaniu utrwalacza niesieciującego w automatycznym procesorze tkanek, co zniszczyłoby korzystne właściwości utrwalaczy niesieciujących dla zachowania biomolekuł.
   UWAGA: SBFS jest niebezpiecznym roztworem, powoduje podrażnienie skóry, poważne uszkodzenie oczu, może powodować alergiczną reakcję skórną, podejrzewa się o powodowanie wad genetycznych, może powodować raka, podrażnienie dróg oddechowych, senność i powoduje uszkodzenia narządów. Alternatywny utrwalacz jest toksyczny przez drogi oddechowe, w kontakcie ze skórą i po połknięciu, działa drażniąco na oczy i skórę, co grozi bardzo poważnymi, nieodwracalnymi skutkami w wyniku wdychania, w kontakcie ze skórą i po połknięciu. W przypadku obu roztworów utrwalających należy unikać wdychania i kontaktu fizycznego. Nosić odpowiednią odzież ochronną, rękawice oraz ochronę oczu i twarzy. Praca pod wyciągiem.
5. Przejdź do przetwarzania tkanek, osadzania i cięcia tkanek (sekcje 2 i 3).

2. Przetwarzanie i osadzanie tkanek

1. Przeprowadzić stopniowe odwadnianie kaset tkankowych za pomocą utrwalonych próbek tkanek w 70 % (2 x 15 min), 80 % (30 min), 90 % (60 min) i 99 % (2 x 60 min) etanolu, a następnie ksylenu (2 x 60 min). Następnie naciekać parafiną w automatycznym procesorze tkanek (4 x 45 min).
2. Za pomocą kleszczy umieść odwodnione i naciekane parafiną próbki (alternatywnie i utrwalone SBFS) w metalowych formach.
3. Zanurzyć próbki w 5 - 10 ml stopionej parafiny (temperatura krzepnięcia 56-58 °C) za pomocą przyrządu do zatapiania parafiny.
4. Umieścić foremki na płycie chłodzącej w temperaturze -5 °C na 30 minut.
5. Odzyskaj bloki tkanek zatopione w parafinie z form.
6. Powstałe w ten sposób bloki (alternatywnie utrwalone, zatopione w parafinie (NCFPE) i zatopione w parafinie SBFS (FFPE)) należy przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C do czasu użycia.

3. Cięcie tkanek i przygotowanie preparatu dla FISH

UWAGA: Sekcje FFPE są bezpośrednio używane do FISH, podczas gdy slajdy z sekcjami NCFPE są mocowane w SBFS na 24 godziny przed procedurą FISH.

1. Włóż jednorazowe ostrze do mikrotomu i ustaw mikrotom na 10 μm.
2. Wyjmij pierwszy blok z płyty chłodzącej i włóż go do instrumentu.
3. Przytnij blok, aż uzyskasz równą powierzchnię. Wyczyść mikrotom za pomocą szczoteczki i ustaw go na 3 μm. Odrzuć pierwsze 2-3 sekcje.
4. Wytnij 3 μm odcinki bloków NCFPE i FFPE i umieść je w zimnej kąpieli wodnej (woda ultraczysta).
   UWAGA: Aby uzyskać lepsze zdjęcia bez nakładających się jąder, w tym miejscu pokazane są obrazy odcinków 2 μm zamiast 3-5 μm, jak zaleca się w instrukcjach producenta.
5. Podnieś każdą pływającą sekcję za pomocą cienkiego pędzla i igły na powlekane szkiełko mikroskopowe w celu przyklejenia odcinków tkanki.
6. Zanurz tę zjeżdżalnię w ciepłej (40 °C) łaźni wodnej i pozwól, aby sekcja całkowicie się rozciągnęła.
7. Umieść sekcję z powrotem na zjeżdżalni, ostrożnie wyciągając zjeżdżalnię z wody i unikając zmarszczek.
8. Pozostaw wszystkie sekcje do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
9. Podgrzewać szkiełka w temperaturze 70 °C przez 30 minut w inkubatorze, aby rozpuścić parafinę.
10. Umieść szkiełka poziomo w szklanym słoiku do barwienia.
11. Ponownie uwodnić skrawki krok po kroku w temperaturze pokojowej w słoikach do barwienia wypełnionych 250 ml każdego z następujących płynów: 100 % ksylen 2 x 15 min, 96 % etanol 2 x 15 min, 90 % etanol 2 min, 80 % etanol 2 min, 70 % etanol 2 min, 50 % etanol 2 min i woda destylowana 2 x 10 min.
    UWAGA: Etapy deparafinowania i ponownego nawodnienia należy wykonywać w dygestorium, nie wdychać toksycznych rozpuszczalników ulatniających się.
    UWAGA: W zależności od skrawków i tkanek może być konieczne wcześniejsze przetestowanie różnych czasów inkubacji.

4. Po utrwaleniu próbek NCFPE

1. Wykonaj utrwalenie szkiełek NCFPE, umieszczając je w nowym słoiku do barwienia wypełnionym SBFS na 24 godziny w temperaturze pokojowej. Umieść słoik w dygestorium podczas 24-godzinnego etapu po utrwaleniu.
2. Usunąć nadmiar SBFS przez przemycie solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (3 x 10 min) i wodą destylowaną (2 x 10 min).

5. Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH)

UWAGA: Tutaj FISH jest wykonywany przy użyciu dostępnego na rynku zestawu dwukolorowej sondy HER2/CEN17 zgodnie z instrukcjami producenta. Nie dopuścić do wyschnięcia skrawków tkanki podczas etapów hybrydyzacji i mycia. Nie pozwól, aby sonda DNA i roztwory 4', 6-diamidyno-2-fenyloindolowe (DAPI) DNA były wystawione na działanie światła przez dłuższy czas. Wykonaj te czynności w ciemności, używając światłoszczelnych pojemników. W zależności od wieku i etapu utrwalania materiału próbki, zwiększ lub zmniejsz temperaturę denaturacji i płukania, aby uzyskać lepsze wyniki hybrydyzacji.

1. Umieścić słoik do barwienia zawierający 250 ml roztworu do wstępnej obróbki cieplnej cytryny w łaźni wodnej o temperaturze 98 °C.
2. Umieść ponownie uwodnione szkiełka FFPE i NCFPE po utrwaleniu w słoiku i inkubuj przez 15 minut. Nie używaj więcej niż sześciu szkiełek na słoik do barwienia.
3. Myj szkiełka w wodzie destylowanej przez 3 minuty w temperaturze suchej tonacji w nowym słoiku do barwienia.
4. W celu przeprowadzenia proteolizy należy umieścić szkiełka w systemie hybrydyzacji o kontrolowanej temperaturze 37 °C.
   1. Gotowy do użycia roztwór pepsyny (2 mg/ml) należy natychmiast nanieść kroplami (~ 30 μl na kroplę) na skrawki tkanki, aż do całkowitego pokrycia. Inkubować przez 9 minut w temperaturze 37 °C w systemie hybrydyzacji.
      UWAGA: Zalecany czas inkubacji wynosi 5-15 minut. Optymalny czas na proteolizę należy ustalić z wyprzedzeniem
   .
   2. Umieścić szkiełka w słoiku zawierającym bufor do płukania SSC i inkubować przez 5 minut.
   3. Opłucz szkiełka w wodzie destylowanej przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
   4. Przeprowadzić dehydratację sekcji w następujących stopniowanych alkoholach: 50 %, 70 %, 90 % i 100 % każdy przez 1 minutę. Wysuszyć sekcje na powietrzu.
   5. W celu hybrydyzacji należy pobrać pipetę 10 μl sondy HER2/CEN17 na wysuszone skrawki tkanki, przykryć każdą próbkę szkiełkiem nakrywkowym i uszczelnić cementem gumowym.
      UWAGA: Zaleca się 10 μl sondy na powierzchnię tkanki 22 x 22 mm. Delikatne nagrzewanie sondy ułatwia proces pipetowania. Unikaj pęcherzyków powietrza i długiej ekspozycji sondy na światło.
   6. Sonda kodenaturacji i próbka DNA w układzie hybrydyzacji w temperaturze 75 °C przez 10 min.
   7. Ustaw system hybrydyzacji na 37 °C i hybrydyzuj przez noc.
   8. Ostrożnie usuń cement kauczukowy za pomocą kleszczy w celu późniejszej hybrydyzacji i wykrywania.
   9. Inkubować szkiełka w słoiku do barwienia zawierającym 37 °C, wstępnie podgrzanym, 1 x bufor do płukania A przez 5 minut. Usunąć szkiełka nakrywkowe.
   10. Umyć szkiełka przy użyciu wstępnie podgrzanego 1 x buforu myjącego A dwukrotnie przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
   11. Odwodnić szkiełka w 70%, 90% i 100% etanolu, każdy po 1 minutę.
   12. Wysuszyć próbki na powietrzu i chronić przed światłem.
   13. Do barwienia nałóż 30 μl roztworu DAPI na hybrydyzowany obszar, unikając pęcherzyków. Przykryj sekcje szkiełkiem nakrywkowym.
   14. Inkubować przez 15 minut, chroniąc przed światłem.
   15. Ostrożnie usunąć nadmiar roztworu DAPI, delikatnie naciskając szkiełko między bibułą filtracyjną.
   16. Szkiełka należy przechowywać w temperaturze 2 - 8 °C w ciemności przez okres do 2 tygodni, do czasu oceny za pomocą mikroskopii konfokalnej.

6. Obrazowanie konfokalne i skanowanie preparatów FISH

1. Wykonaj obrazowanie konfokalne i skanowanie slajdów na konfokalnym skanerze cyfrowym wyposażonym w obiektyw 40x/1,2 NA, filtry czteropasmowe (DAPI/FITC/TRITC/Cy5) oraz 5,5 Mpx, 16-bitową, chłodzoną naukową kamerę z komplementarnym półprzewodnikiem tlenku metalu (CMOS).
2. Pozyskiwanie obrazów odbywa się za pomocą filtrów dla kanałów zielonego (wzbudzenie: 503 nm, emisja: 528 nm) i pomarańczowego (wzbudzenie: 547 nm, emisja: 572 nm).

7. Interpretacja

UWAGA: Sonda HER2/CEN17 jest mieszaniną sondy CEN17 znakowanej czerwonym fluorochromem specyficznej dla regionu centromerowego alfa satelitarnego chromosomu 17 (D17Z1) i zielonej sondy HER2 znakowanej fluorochromem specyficznej dla genu HER2 (lokalizacja sondy 17q12). Próbki guza o stosunku HER2:CEN17 ≤2,0 na jądro są oceniane normalnie, podczas gdy te o stosunku HER2:CEN17 ≥2,0 są oceniane jako amplifikowane¹⁷.

1. Przeprowadź analizę jakości obrazów za pomocą oprogramowania CaseViewer 2.1²⁰.
   1. Oceń co najmniej 20 komórek, które znajdują się w dwóch różnych regionach inwazyjnego składnika raka, zgodnie z definicją patologa. Uwzględnić wyraźnie rozróżnialne, dobrze rozmieszczone jądra w obszarze zliczania. Wyklucz z liczenia obszary tkanki na granicy oraz obszary cofnięte lub ściśnięte.

8. Jakość RNA

1. Ekstrakcja RNA
   1. Upewnij się, że wszystkie instrumenty i narzędzia są wolne od RNAzy. Użyj roztworu do usuwania RNAse.
   2. Wyciąć od 10 do 20 odcinków (o grubości 5 μm) próbek NCFPE lub FFPE za pomocą mikrotomu zgodnie z protokołem do kroku 3.8.
   3. Ekstrahuj RNA z próbek NCFPE za pomocą zestawu do izolacji RNA (patrz Tabela materiałów). Ekstrakcja RNA z próbek FFPE za pomocą zestawu do izolacji RNA FFPE.
      UWAGA: Ekstrakcja RNA z utrwalaczy niesieciujących wymaga metody izolacji dostosowanej do metody utrwalania. Nie należy stosować żadnej innej metody izolacji RNA (np. Trizol, RNeasy FFPE itp. dla próbki NCFPE).
   4. Oznaczyć stężenie i czystość RNA za pomocą spektrofotometru. Stosunek absorbancji przy 260 nm i 280 nm (A260/280) powinien wynosić ~ 2,0.
   5. Wyizolowany RNA należy przechowywać w temperaturze -70 °C do czasu dalszej analizy.
2. Wykonaj PCR z odwrotną transkrypcją dehydrogenazy 3-fosforanowej aldehydu glicerynowego (GAPDH) w czasie rzeczywistym przy użyciu starterów do generowania amplikonów o różnych długościach^8,9.
   1. Użyj zestawu do odwrotnej transkrypcji cDNA zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi syntezy cDNA. Użyj 500 ng RNA z każdej próbki. Przechowywać cDNA w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia.
   2. Przygotuj główną mieszankę PCR zgodnie z instrukcjami producenta.
   3. Odpipetować główną mieszaninę PCR w trzech egzemplarzach na 384-dołkowej płytce reakcyjnej. Dodać 4 μl cDNA rozcieńczonego w stosunku 1:16 (matryca PCR). Wykonaj PCR zgodnie z instrukcjami producenta.
      UWAGA: Dla ludzkiego GAPDH zastosowano następujące startery: GAPDH do przodu: 5'-CCACATCGCTCAGACACCAT-3'; GAPDH odwrócony: 71 bp 5'-ACCAGGCGCCCAATACG-3', 153 bp 5'-GTAAACCATGTAGTTGAGGTC-3', 200 bp 5'-TTGACGGTGCCATGGAATTT-3', 277 bp 5'-ACTTGATTTGGAGGAGGGATCT-3', 323 bp 5'-AAGACGCCAGTGGACTCCA-3' i 530 bp 5'-ACGATACCAAAGTTGTCATG-3'.
   4. Przeanalizuj wyniki za pomocą oprogramowania odpowiedniego dla maszyny do PCR. Produkty niespecyficzne muszą być wykluczone na podstawie analizy krzywej topnienia²¹.

Wyniki

Określenie FISH HER2:

Intensywności sygnału HER2-FISH z FFPE i NCFPE są podobne (Rysunek 2). W obu przypadkach w większości komórek występuje wyraźny nadmiar sygnału zielonego (wskazującego na amplifikowany locus genu HER2) w porównaniu z sygnałem czerwonym (gen referencyjny CEN17). W związku z tym przypadek pokazuje amplifikowany gen HER2, co oznacza, że oczekuje się, że pacjent ten zareaguje na trastuzumab, terapię celowaną przeciwko HER2. Próbka FFPE służyła jako kontrola pozytywna. Sygnały obserwowane w komórkach nienowotworowych (zarówno w FFPE, jak i NCFPE) służą jako wewnętrzne odniesienie i kontrola negatywna dla amplifikacji genu HER2. Dla każdej serii analiz co najmniej jeden odcinek o znanym statusie amplifikacji genu powinien być użyty jako kontrola pozytywna dla reakcji hybrydyzacji.

Jakość RNA:

Odpowiednie próbki FFPE i NCFPE z dwóch różnych przypadków wykazują różnice w jakości RNA dzięki zastosowaniu PCR z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym. Uzyskane wyniki wskazują na różną skuteczność amplifikacji dla różnych długości amplikonów (tj. 71 pz, 153 pz, 200 pz, 275 pz, 323 pz) mRNA GAPDH. Wszystkie wartości Ct (próg cyklu) uzyskane z próbek FFPE były wyższe niż te z NCFPE. Różnica ta świadczy o niższej amplifikowalności PCR mRNA wyizolowanego z tkanek FFPE, co sugeruje bardziej wyraźną modyfikację chemiczną. Co więcej, wyższe wartości Ct dla długich amplikonów w porównaniu z krótkimi są wskaźnikiem fragmentacji mRNA. Dla porównania, nachylenia wartości Ct o różnych długościach amplikonów wykazują wyraźniejszą fragmentację mRNA w tkankach FFPE niż w tkankach NCFPE (Figura 3).

Rysunek 2: Reprezentatywne wyniki HER2 FISH dla odpowiednich odcinków tkanek zatopionych w parafinie utrwalonej w formalinie (FFPE) i niesieciowanych, niezawierających formaliny skrawków tkanek zatopionych w parafinie (NCFPE). Pokazano odpowiednie próbki z tych samych tkanek FFPE (A) i NCFPE (B). W przeciwieństwie do normalnych komórek interfazowych (C), w których spodziewane są dwa sygnały zielone (HER2) i dwa czerwone (CEN17), komórki ze amplifikowanym locus genu HER2 reprezentują wiele kopii zielonych sygnałów (HER2) (D). Status amplifikacji HER2 był identyczny zarówno w sekcjach FFPE, jak i post-fix NCFPE (A, B). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Wyniki testu PCR z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym stosowanego do kontroli jakości RNA. Oś Y: Wartości Ct (próg cyklu) genu GAPDH są pokazane dla różnych długości amplikonów (71 pz, 153 pz, 200 pz, 275 pz, 323 pz) na osi X. mRNA wyizolowano z FFPE i NCFPE z dwóch różnych próbek tkanki raka piersi przetworzonych równolegle i przepisanych na cDNA w celu PCR. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Wyniki wskazują na dwa kluczowe wnioski. Po pierwsze, prosty 24-godzinny etap SBFS po utrwaleniu skrawków wyciętych z tkanek NCFPE jest wystarczający do uzyskania wyników równoważnych do tych z FFPE w analizach FISH przy użyciu testów FISH zatwierdzonych dla tkanek FFPE (patrz również odniesienie¹⁴). Protokół ten ma tę zaletę, że wykorzystuje testy FISH pierwotnie opracowane i zatwierdzone dla FFPE bez konieczności kompleksowej ponownej walidacji (np. poprzez optymalizację warunków przed hybrydyzacją dla tkanek nieusieciowanych). Protokół FISH może być używany dokładnie tak, jak opisano w instrukcjach producenta.

Drobne modyfikacje w stosunku do instrukcji producenta opisanej w niniejszym protokole (np. średnica przekroju tkanki i okresy inkubacji na etapach deparafinowania) wynikają z wcześniejszych adaptacji, co jest wyraźnie zalecane przez producenta ze względu na zastosowanie różnych typów tkanek i metod utrwalania.

Etap po utrwaleniu ma kluczowe znaczenie, ponieważ wymaga czasu reakcji chemicznej wynoszącego 18-24 godziny, co wydłuża czas analizy o jeden dzień, ale pozwala na taki sam codzienny przepływ pracy, jak w przypadku tkanek FFPE (ryc. 1). Podawano, że SBFS przenika do tkanek ze średnią szybkością 1 mm na godzinę,^{od 22} do 5 mm w ciągu 2 godzin, w zależności od typu tkanki^23,24. Obserwacja, że tylko przedłużone okresy po utrwaleniu, trwające dłużej niż 18 godzin, mogą zmienić właściwości NCFPE na skrawki FFPE, wskazuje, że nie penetracja utrwalacza, ale czas reakcji chemicznej ma kluczowe znaczenie dla osiągnięcia pożądanych rezultatów ^1,14.

Po drugie, pozostała tkanka NCFPE, która nie jest używana do utrwalenia, może być wykorzystana do dalszych analiz molekularnych, ponieważ biomolekuły są dobrze zachowane. Wykazano to za pomocą PCR z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym (Figura 3). Test jest bardziej czuły i specyficzny niż wartość RIN pochodząca z elektroferogramu (liczba integralności RNA) w odniesieniu do jakości RNA (tj. modyfikacji chemicznej i fragmentacji) dla mRNA wyizolowanego z tkanek zanurzonych w parafinie⁸. Kontrola jakości została ograniczona w tym badaniu do PCR w czasie rzeczywistym, ponieważ niezależne grupy wykazały, że oprócz RNA, jakość DNA i białek wyizolowanych z NCFPE jest lepsza niż z tkanek FFPE ^8,9,13.

Przedstawiony protokół jest następujący, w stosownych przypadkach (np. receptura SBFS, warunki utrwalania, kontrola jakości RNA, walidacja), wymagania specyfikacji technicznych CEN dotyczących procedur przedanalitycznych w diagnostyce in vitro (IVD), które zostały niedawno wydane przez Europejski Komitet Normalizacyjny (CEN) (np. CEN/TS 16827-1:2015 dla izolacji RNA z tkanek FFPE, która odnosi się do normy ISO 15189).

Metoda ogranicza się do tego konkretnego utrwalacza. Chociaż dobre zachowanie biomolekuł i morfologii przy użyciu niesieciowanego, wolnego od formaliny utrwalacza zostało przedstawione w kilku badaniach, jest on stosowany głównie w badaniach, ale nie w rutynowych zastosowaniach medycznych. Jednym z powodów jest to, że zastąpienie złotego standardu utrwalania SBFS innym utrwalaczem wymagałoby różnych badań walidacyjnych, ponieważ nie wszystkie protokoły zoptymalizowane pod kątem materiału FFPE mogą być stosowane do materiałów utrwalanych za pomocą utrwalaczy niesieciujących. Inne metody utrwalania tkanek nie były testowane dla tego protokołu FISH.

Prosty etap po utrwaleniu opisany w tym manuskrypcie ma tę zaletę, że wykorzystuje testy zatwierdzone do diagnostyki in vitro zarówno dla tkanek FFPE, jak i NCFPE.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
SAV LP GmbH, Flintsbach a. I., Niemcy	www.sav-lp.de	FN-200L-4-1	Utrwalacz tkanek
Simport Plastic Ltd., Beloeil, Kanada	www.simport.com	M-498	Urządzenie zabezpieczające zapewniające etykietowanie, utrwalanie i osadzanie parafiny w próbkach tkanek.
Qiagen GmbH, Hilden, Niemcy	www.qiagen.com	765112	Do pobierania, utrwalania i stabilizacji próbek tkanek: 10 wstępnie napełnionych pojemników na odczynniki, zawierających PAXgene Tissue FIX i PAXgene Tissue STABILIZER.
ThermoFisher Scientific	www.thermofisher.com	813150	Przetwarzanie próbek biologicznych od utrwalenia chemicznego do infiltracji parafiny
Merck Millipore, Monachium, Niemcy	www.analytics-shop.com/de/hersteller/millipore.html	MC1009834000	Odwodnienie próbek tkanek
VWR Chemicals, Darmstadt, Niemcy	https://at.vwr.com	10293EP	Odwodnienie próbek tkanek
ACM Herba Chemosan Apotheker AG, Wiedeń, Austria		www.herba-chemosan.at 2549662 32	Parafina stosowana w urządzeniu do przetwarzania tkanek
Leica Mikrosysteme Handels GmbH, Wiedeń, Austria		www.LeicaBiosystems.com 39602004	Podłoże do zatapiania parafiny
Sanova Diagnostik, Wiedeń, Austria	www.sanova.at	5229	Przyrząd do zatapiania parafiny w tkankach do badań histologicznych
Histocom Medizintechnik Vertriebs GmbH, Wiener Neudorf, Austria	www.histocom.info	M 910010 To	urządzenie jest używane do szczególnie wyrafinowanych technik cięcia parafiny w biologii i medycynie. Tylko wykwalifikowany lub specjalnie przeszkolony personel może obsługiwać mikrotom, tj. zaciskać próbkę, przycinać, ciąć i zdejmować skrawki z instrumentu.
Dako Denmark A/S, Glostrup, Dania	www.chem.agilent.com	K802021-2	Szkiełka podstawowe powlekane, przeznaczone do montażu skrawków tkanek utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie.
Qiagen GmbH, Hilden Niemcy	www.qiagen.com	73504	Do oczyszczania całkowitego RNA z utrwalonych formaliną, zatopionych w parafinie skrawków tkanek
Qiagen GmbH, Hilden, Niemcy		www.qiagen.com 765134	Do oczyszczania całkowitego RNA z utrwalonych przez PAXgene, zatopionych w parafinie skrawków tkanek
ZytoVision GmbH, Bremerhaven, Niemcy	www.zytovision.com	Z-2015-200	Do wykrywania amplifikacji genu ERBB2 (znanej również jako HER2) często obserwowanej w litych nowotworach złośliwych, np. próbkach raka piersi.
3DHISTEC, Budapeszt, Węgry	www.3dhistech.com		Cyfrowe urządzenie do skanowania preparatów tkankowych wyposażone w obiektyw 40x/1,2 NA, filtry czteropasmowe (DAPI/FITC/TRITC/Cy5) oraz 5,5Mpx, 16-bitową, chłodzoną naukową kamerę CMOS (Complementary Metal Oxide Semiconductor).
ThermoFisher Scientific	www.thermofisher.com	4368814	Zestaw do odwrotnej transkrypcji cDNA o dużej pojemności zawiera wszystkie składniki niezbędne do ilościowej konwersji do 2 &mikro; g całkowitego RNA do jednoniciowego cDNA w pojedynczym 20 &mikro; Reakcja L.
ThermoFisher Scientific	www.thermofisher.com	4367659	PCR Master Mix zawierający polimerazę, nukleotydy i SYBR Green do PCR i kwantyfikacji amplikonów.
ThermoFisher Scientific, Wilmington, DE	www.thermofisher.com	Ser. Nr. F239	Spektrofotometr do oznaczania ilościowego kwasów nukleinowych.
System PCR w czasie rzeczywistym QuantStudio 7 Flex www.thermofisher.com		4485701	maszynie do PCR,
Laboratoria Vysis / Abbott. Abbott Park, Illinois, Stany Zjednoczone	www.molecular.abbott/us/en/products/instrumentation/thermobrite#order	e.g. (ThermoBrite) 07J91-020	System przetwarzania szkiełek z kontrolowaną temperaturą do procedur denaturacji/hybrydyzacji in-situ.