Artykuł metodologiczny

Protokół dla HER2 FISH z wykorzystaniem niesieciowanego, wolnego od formaliny utrwalacza tkankowego, aby połączyć zalety kriokonserwacji i utrwalania formaliny

14.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55885

⸱

25 grudnia 2017

 ,  ,  ,  , 
1Christian Doppler Laboratory for Biospecimen Research and Biobanking Technologies, Institute of Pathology, Medical University Graz, 2Institute of Pathology, Medical University Graz, 3Research and Development, Qiagen GmbH

W tym artykule

Podsumowanie

Fluorescencyjna hybrydyzacja in-situ (FISH) jest często wymagana w połączeniu z histopatologią i diagnostyką molekularną w celu wyboru terapii w medycynie spersonalizowanej. Nowatorski, niesieciowany, wolny od formaliny utrwalacz tkankowy, który umożliwia wysokiej jakości analizy morfologiczne, molekularne i FISH z tej samej próbki poprzez dodanie etapu po utrwaleniu przed przedstawieniem FISH.

Streszczenie

Morfologiczna ocena próbek tkanek z utrwalonymi w formalinie, zatopionymi w parafinie (FFPE) była złotym standardem w diagnostyce raka przez dziesięciolecia ze względu na doskonałe zachowanie morfologii. Medycyna spersonalizowana w coraz większym stopniu zapewnia indywidualnie dostosowane i ukierunkowane terapie dla scharakteryzowanych poszczególnych chorób, możliwe dzięki połączonym technologiom analizy morfologicznej i molekularnej oraz diagnostyce. Wykonanie testów morfologicznych i molekularnych z tej samej próbki FFPE jest trudne ze względu na negatywny wpływ formaliny spowodowany modyfikacją chemiczną i sieciowaniem kwasów nukleinowych i białek. Niedawno opracowano niesieciowany, wolny od formaliny utrwalacz tkankowy, aby spełnić oba wymagania, tj. zachować morfologię, taką jak FFPE i biomolekuły, takie jak kriokonserwacja. Ponieważ FISH jest często wymagany w połączeniu z histopatologią i diagnostyką molekularną, przetestowaliśmy możliwość zastosowania protokołów FISH na tkankach leczonych tym nowym utrwalaczem. Odkryliśmy, że formalina po utrwaleniu histologicznych odcinków tkanki raka piersi niesieciowanej, wolnej od formaliny i zatopionej w parafinie (NCFPE) uzyskała wyniki równoważne wynikom z tkanką FFPE w analizie FISH receptora ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu 2 (HER2). Protokół ten opisuje, w jaki sposób test FISH, pierwotnie opracowany i zwalidowany dla tkanki FFPE, może być wykorzystany do tkanek NCFPE poprzez prosty etap po utrwaleniu odcinków histologicznych.

Wprowadzenie

Medycyna spersonalizowana w coraz większym stopniu opiera się na testach wieloparametrowych obejmujących morfologiczne i molekularne analizy tkanek. Fixacja tkanek formaliną, będąca złotym standardem, zapewnia doskonałą jakość morfologiczną1,2. Jednakże wywołana formaliną modyfikacja chemiczna i sieciowanie białek oraz kwasów nukleinowych3,4,5 negatywnie wpływają na analizę molekularną6. Modyfikacje molekularne te ograniczają jakość kwasów nukleinowych i białek oraz mogą prowadzić do powstania artefaktów w sekwencjach genów7 lub do obniżenia czułości testów opartych na reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR)8. Mimo znacznych wysiłków podjętych w celu optymalizacji testów molekularnych dla tkanek FFPE, krio-konserwacja tkanek jest w ogólnym ujęciu lepsza od fixacji formaliną, co sprawia, że konieczny jest podział próbek tkankowych na różne procedury konserwacji. Aby uniknąć konieczności krio-konserwacji w analizach molekularnych, opracowano PAXgene Tissue – fiksatyw bezformalinowy, niewywołujący sieciowania. Ten dostępny komercyjnie system składa się z roztworu do fixacji i stabilizacji, zawierającego różne alkohole, kwas octowy oraz rozpuszczalny związek organiczny. Prawidłową konserwację kwasów nukleinowych, (fosfo)białek i morfologii wykazano w kilku badaniach6,9,10,1,12,13.

Jednym ze szczególnych zastosowań w diagnostyce nowotworów jest metoda FISH, która pozwala na wykrycie szerokiego zakresu zmian chromosomalnych, takich jak translokacje, delecje submikroskopowe i amplifikacje 14. Na przykład u dwudziestu procent pacjentów z inwazywnym rakiem piersi stwierdza się amplifikację genu ludzkiego receptora 2 czynnika wzrostu naskórka (HER2)15,16,17, co wiąże się ze złym rokowaniem18,19. Oznaczenie stanu nadekspresji i amplifikacji HER2 w raku piersi za pomocą metody FISH jest niezbędne do wyboru pacjentów do terapii skierowanej przeciwko HER2 i stanowi diagnostykę towarzyszącą zatwierdzoną przez Federalną Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) (http://www.fda.gov/MedicalDevices/ProductsandMedicalProcedures/InVitroDiagnostics/ucm301431.htm)17. Aby umożliwić szerokie zastosowanie diagnostyki towarzyszącej opartej na metodzie FISH w opiece zdrowotnej, opracowano i zatwierdzono testy dla tkanek utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie (FFPE).

W poprzednim badaniu wykazaliśmy, że tkanki NCFPE nie mogą być stosowane w testach FISH, które zostały zatwierdzone dla tkanek FFPE. Jednakże testy serii czasowych różnych procedur dofixacji tkanek NCFPE w 4 % buforowanym formaldehydzie wykazały, że czas dofixacji przekroczył 18 h dla skrawków tkanek NCFPE pozwolił na uzyskanie wyników równoważnych z wynikami uzyskanymi dla tkanek FFPE14.

W niniejszym badaniu przedstawiamy szczegółowy protokół i demonstrujemy wpływ utrwalania tkanek bez użycia formaliny i bez sieciowania oraz 24-godzinnej postfiksacji w 4% buforowanym formaldehydzie na skrawki wykorzystywane do badania HER2 FISH oraz na jakość RNA z tego samego pierwotnego preparatu tkankowego.

Schemat przetwarzania próbek tkankowych; obejmuje fiksację, ekstrakcję RNA oraz analizę real-time PCR.
Rycina 1: Schemat przedstawiający etapy fluorescencji in situ hybrydyzacja fluorescencyjna in situ (FISH) oraz analiza RNA tkanek utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie (FFPE) oraz tkanek zatopionych w parafinie utrwalonych bez użycia formaliny i bez tworzenia wiązań krzyżowych (NCFPE). Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Protokół

Badanie zostało zatwierdzone przez Komisję Etyki Uniwersytetu Medycznego w Grazu (numer referencyjny 20-066), Austria. Próbki tkanek pobrano z dwóch przypadków chirurgicznie wyciętego pierwotnego inwazyjnego raka piersi po wyrażeniu przez pacjentki pisemnej świadomej zgody.

1. Utrwalenie tkanek

UWAGA: Utrwalanie tkanek odbywa się za pomocą standardowego buforowanego roztworu formaliny (SBFS), zdefiniowanego jako 10 % roztwór formaliny zawierający udział masowy 3,7 % (co odpowiada ułamkowi objętościowemu 4 %) formaldehydu buforowanego do pH 6,8 do pH 7,2 zgodnie z CEN/TS 16827-1:2015 lub niesieciowany, wolny od formaliny system utrwalania tkanek (określany również jako alternatywny roztwór utrwalający poniżej) składający się z roztworu utrwalającego i stabilizującego w temperaturze pokojowej (RT).

  1. Pokrój próbki tkanki raka piersi sterylnym skalpelem na dwie połówki o grubości 4 mm każda, aby zapewnić odpowiednią ilość tkanki. Użyj maksymalnego rozmiaru 4 x 15 x 15 mm do mocowania tkanek NCFPE lub SBFS.
  2. Umieść każdą połówkę próbki guza w standardowej kasecie tkankowej i zanurz ją w SBFS lub alternatywnym roztworze utrwalającym na 24 godziny ze stosunkiem objętości do objętości (v/v) 4 części utrwalacza i jednej części tkanki (4 ml / 1 g tkanki (najlepiej 10 ml / 1 g)).
  3. Przenieść alternatywnie utrwalone próbki do roztworu stabilizatora na 2-72 godziny, otwierając pojemnik, obracając kasetę z tkankami o 180° i zanurzając ją.
  4. Umieścić kasety z tkankami z próbkami utrwalonymi przez SBFS w 250 ml 70 % etanolu na 30 minut w temperaturze pokojowej w celu usunięcia pozostałości SBFS.
    UWAGA: Ten krok jest ważny, aby uniknąć zanieczyszczenia SBFS próbek poddanych działaniu utrwalacza niesieciującego w automatycznym procesorze tkanek, co zniszczyłoby korzystne właściwości utrwalaczy niesieciujących dla zachowania biomolekuł.
    UWAGA: SBFS jest niebezpiecznym roztworem, powoduje podrażnienie skóry, poważne uszkodzenie oczu, może powodować alergiczną reakcję skórną, podejrzewa się o powodowanie wad genetycznych, może powodować raka, podrażnienie dróg oddechowych, senność i powoduje uszkodzenia narządów. Alternatywny utrwalacz jest toksyczny przez drogi oddechowe, w kontakcie ze skórą i po połknięciu, działa drażniąco na oczy i skórę, co grozi bardzo poważnymi, nieodwracalnymi skutkami w wyniku wdychania, w kontakcie ze skórą i po połknięciu. W przypadku obu roztworów utrwalających należy unikać wdychania i kontaktu fizycznego. Nosić odpowiednią odzież ochronną, rękawice oraz ochronę oczu i twarzy. Praca pod wyciągiem.
  5. Przejdź do przetwarzania tkanek, osadzania i cięcia tkanek (sekcje 2 i 3).

2. Przetwarzanie i osadzanie tkanek

  1. Przeprowadzić stopniowe odwadnianie kaset tkankowych za pomocą utrwalonych próbek tkanek w 70 % (2 x 15 min), 80 % (30 min), 90 % (60 min) i 99 % (2 x 60 min) etanolu, a następnie ksylenu (2 x 60 min). Następnie naciekać parafiną w automatycznym procesorze tkanek (4 x 45 min).
  2. Za pomocą kleszczy umieść odwodnione i naciekane parafiną próbki (alternatywnie i utrwalone SBFS) w metalowych formach.
  3. Zanurzyć próbki w 5 - 10 ml stopionej parafiny (temperatura krzepnięcia 56-58 °C) za pomocą przyrządu do zatapiania parafiny.
  4. Umieścić foremki na płycie chłodzącej w temperaturze -5 °C na 30 minut.
  5. Odzyskaj bloki tkanek zatopione w parafinie z form.
  6. Powstałe w ten sposób bloki (alternatywnie utrwalone, zatopione w parafinie (NCFPE) i zatopione w parafinie SBFS (FFPE)) należy przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C do czasu użycia.

3. Cięcie tkanek i przygotowanie preparatu dla FISH

UWAGA: Sekcje FFPE są bezpośrednio używane do FISH, podczas gdy slajdy z sekcjami NCFPE są mocowane w SBFS na 24 godziny przed procedurą FISH.

  1. Włóż jednorazowe ostrze do mikrotomu i ustaw mikrotom na 10 μm.
  2. Wyjmij pierwszy blok z płyty chłodzącej i włóż go do instrumentu.
  3. Przytnij blok, aż uzyskasz równą powierzchnię. Wyczyść mikrotom za pomocą szczoteczki i ustaw go na 3 μm. Odrzuć pierwsze 2-3 sekcje.
  4. Wytnij 3 μm odcinki bloków NCFPE i FFPE i umieść je w zimnej kąpieli wodnej (woda ultraczysta).
    UWAGA: Aby uzyskać lepsze zdjęcia bez nakładających się jąder, w tym miejscu pokazane są obrazy odcinków 2 μm zamiast 3-5 μm, jak zaleca się w instrukcjach producenta.
  5. Podnieś każdą pływającą sekcję za pomocą cienkiego pędzla i igły na powlekane szkiełko mikroskopowe w celu przyklejenia odcinków tkanki.
  6. Zanurz tę zjeżdżalnię w ciepłej (40 °C) łaźni wodnej i pozwól, aby sekcja całkowicie się rozciągnęła.
  7. Umieść sekcję z powrotem na zjeżdżalni, ostrożnie wyciągając zjeżdżalnię z wody i unikając zmarszczek.
  8. Pozostaw wszystkie sekcje do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  9. Podgrzewać szkiełka w temperaturze 70 °C przez 30 minut w inkubatorze, aby rozpuścić parafinę.
  10. Umieść szkiełka poziomo w szklanym słoiku do barwienia.
  11. Ponownie uwodnić skrawki krok po kroku w temperaturze pokojowej w słoikach do barwienia wypełnionych 250 ml każdego z następujących płynów: 100 % ksylen 2 x 15 min, 96 % etanol 2 x 15 min, 90 % etanol 2 min, 80 % etanol 2 min, 70 % etanol 2 min, 50 % etanol 2 min i woda destylowana 2 x 10 min.
    UWAGA: Etapy deparafinowania i ponownego nawodnienia należy wykonywać w dygestorium, nie wdychać toksycznych rozpuszczalników ulatniających się.
    UWAGA: W zależności od skrawków i tkanek może być konieczne wcześniejsze przetestowanie różnych czasów inkubacji.

4. Po utrwaleniu próbek NCFPE

  1. Wykonaj utrwalenie szkiełek NCFPE, umieszczając je w nowym słoiku do barwienia wypełnionym SBFS na 24 godziny w temperaturze pokojowej. Umieść słoik w dygestorium podczas 24-godzinnego etapu po utrwaleniu.
  2. Usunąć nadmiar SBFS przez przemycie solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (3 x 10 min) i wodą destylowaną (2 x 10 min).

5. Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH)

UWAGA: Tutaj FISH jest wykonywany przy użyciu dostępnego na rynku zestawu dwukolorowej sondy HER2/CEN17 zgodnie z instrukcjami producenta. Nie dopuścić do wyschnięcia skrawków tkanki podczas etapów hybrydyzacji i mycia. Nie pozwól, aby sonda DNA i roztwory 4', 6-diamidyno-2-fenyloindolowe (DAPI) DNA były wystawione na działanie światła przez dłuższy czas. Wykonaj te czynności w ciemności, używając światłoszczelnych pojemników. W zależności od wieku i etapu utrwalania materiału próbki, zwiększ lub zmniejsz temperaturę denaturacji i płukania, aby uzyskać lepsze wyniki hybrydyzacji.

  1. Umieścić słoik do barwienia zawierający 250 ml roztworu do wstępnej obróbki cieplnej cytryny w łaźni wodnej o temperaturze 98 °C.
  2. Umieść ponownie uwodnione szkiełka FFPE i NCFPE po utrwaleniu w słoiku i inkubuj przez 15 minut. Nie używaj więcej niż sześciu szkiełek na słoik do barwienia.
  3. Myj szkiełka w wodzie destylowanej przez 3 minuty w temperaturze suchej tonacji w nowym słoiku do barwienia.
  4. W celu przeprowadzenia proteolizy należy umieścić szkiełka w systemie hybrydyzacji o kontrolowanej temperaturze 37 °C.
    1. Gotowy do użycia roztwór pepsyny (2 mg/ml) należy natychmiast nanieść kroplami (~ 30 μl na kroplę) na skrawki tkanki, aż do całkowitego pokrycia. Inkubować przez 9 minut w temperaturze 37 °C w systemie hybrydyzacji.
      UWAGA: Zalecany czas inkubacji wynosi 5-15 minut. Optymalny czas na proteolizę należy ustalić z wyprzedzeniem
      2. .
    2. Umieścić szkiełka w słoiku zawierającym bufor do płukania SSC i inkubować przez 5 minut.
    3. Opłucz szkiełka w wodzie destylowanej przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
    4. Przeprowadzić dehydratację sekcji w następujących stopniowanych alkoholach: 50 %, 70 %, 90 % i 100 % każdy przez 1 minutę. Wysuszyć sekcje na powietrzu.
    5. W celu hybrydyzacji należy pobrać pipetę 10 μl sondy HER2/CEN17 na wysuszone skrawki tkanki, przykryć każdą próbkę szkiełkiem nakrywkowym i uszczelnić cementem gumowym.
      UWAGA: Zaleca się 10 μl sondy na powierzchnię tkanki 22 x 22 mm. Delikatne nagrzewanie sondy ułatwia proces pipetowania. Unikaj pęcherzyków powietrza i długiej ekspozycji sondy na światło.
    6. Sonda kodenaturacji i próbka DNA w układzie hybrydyzacji w temperaturze 75 °C przez 10 min.
    7. Ustaw system hybrydyzacji na 37 °C i hybrydyzuj przez noc.
    8. Ostrożnie usuń cement kauczukowy za pomocą kleszczy w celu późniejszej hybrydyzacji i wykrywania.
    9. Inkubować szkiełka w słoiku do barwienia zawierającym 37 °C, wstępnie podgrzanym, 1 x bufor do płukania A przez 5 minut. Usunąć szkiełka nakrywkowe.
    10. Umyć szkiełka przy użyciu wstępnie podgrzanego 1 x buforu myjącego A dwukrotnie przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
    11. Odwodnić szkiełka w 70%, 90% i 100% etanolu, każdy po 1 minutę.
    12. Wysuszyć próbki na powietrzu i chronić przed światłem.
    13. Do barwienia nałóż 30 μl roztworu DAPI na hybrydyzowany obszar, unikając pęcherzyków. Przykryj sekcje szkiełkiem nakrywkowym.
    14. Inkubować przez 15 minut, chroniąc przed światłem.
    15. Ostrożnie usunąć nadmiar roztworu DAPI, delikatnie naciskając szkiełko między bibułą filtracyjną.
    16. Szkiełka należy przechowywać w temperaturze 2 - 8 °C w ciemności przez okres do 2 tygodni, do czasu oceny za pomocą mikroskopii konfokalnej.

6. Obrazowanie konfokalne i skanowanie preparatów FISH

  1. Wykonaj obrazowanie konfokalne i skanowanie slajdów na konfokalnym skanerze cyfrowym wyposażonym w obiektyw 40x/1,2 NA, filtry czteropasmowe (DAPI/FITC/TRITC/Cy5) oraz 5,5 Mpx, 16-bitową, chłodzoną naukową kamerę z komplementarnym półprzewodnikiem tlenku metalu (CMOS).
  2. Pozyskiwanie obrazów odbywa się za pomocą filtrów dla kanałów zielonego (wzbudzenie: 503 nm, emisja: 528 nm) i pomarańczowego (wzbudzenie: 547 nm, emisja: 572 nm).

7. Interpretacja

UWAGA: Sonda HER2/CEN17 jest mieszaniną sondy CEN17 znakowanej czerwonym fluorochromem specyficznej dla regionu centromerowego alfa satelitarnego chromosomu 17 (D17Z1) i zielonej sondy HER2 znakowanej fluorochromem specyficznej dla genu HER2 (lokalizacja sondy 17q12). Próbki guza o stosunku HER2:CEN17 ≤2,0 na jądro są oceniane normalnie, podczas gdy te o stosunku HER2:CEN17 ≥2,0 są oceniane jako amplifikowane17.

  1. Przeprowadź analizę jakości obrazów za pomocą oprogramowania CaseViewer 2.120.
    1. Oceń co najmniej 20 komórek, które znajdują się w dwóch różnych regionach inwazyjnego składnika raka, zgodnie z definicją patologa. Uwzględnić wyraźnie rozróżnialne, dobrze rozmieszczone jądra w obszarze zliczania. Wyklucz z liczenia obszary tkanki na granicy oraz obszary cofnięte lub ściśnięte.

8. Jakość RNA

  1. Ekstrakcja RNA
    1. Upewnij się, że wszystkie instrumenty i narzędzia są wolne od RNAzy. Użyj roztworu do usuwania RNAse.
    2. Wyciąć od 10 do 20 odcinków (o grubości 5 μm) próbek NCFPE lub FFPE za pomocą mikrotomu zgodnie z protokołem do kroku 3.8.
    3. Ekstrahuj RNA z próbek NCFPE za pomocą zestawu do izolacji RNA (patrz Tabela materiałów). Ekstrakcja RNA z próbek FFPE za pomocą zestawu do izolacji RNA FFPE.
      UWAGA: Ekstrakcja RNA z utrwalaczy niesieciujących wymaga metody izolacji dostosowanej do metody utrwalania. Nie należy stosować żadnej innej metody izolacji RNA (np. Trizol, RNeasy FFPE itp. dla próbki NCFPE).
    4. Oznaczyć stężenie i czystość RNA za pomocą spektrofotometru. Stosunek absorbancji przy 260 nm i 280 nm (A260/280) powinien wynosić ~ 2,0.
    5. Wyizolowany RNA należy przechowywać w temperaturze -70 °C do czasu dalszej analizy.
  2. Wykonaj PCR z odwrotną transkrypcją dehydrogenazy 3-fosforanowej aldehydu glicerynowego (GAPDH) w czasie rzeczywistym przy użyciu starterów do generowania amplikonów o różnych długościach8,9.
    1. Użyj zestawu do odwrotnej transkrypcji cDNA zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi syntezy cDNA. Użyj 500 ng RNA z każdej próbki. Przechowywać cDNA w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia.
    2. Przygotuj główną mieszankę PCR zgodnie z instrukcjami producenta.
    3. Odpipetować główną mieszaninę PCR w trzech egzemplarzach na 384-dołkowej płytce reakcyjnej. Dodać 4 μl cDNA rozcieńczonego w stosunku 1:16 (matryca PCR). Wykonaj PCR zgodnie z instrukcjami producenta.
      UWAGA: Dla ludzkiego GAPDH zastosowano następujące startery: GAPDH do przodu: 5'-CCACATCGCTCAGACACCAT-3'; GAPDH odwrócony: 71 bp 5'-ACCAGGCGCCCAATACG-3', 153 bp 5'-GTAAACCATGTAGTTGAGGTC-3', 200 bp 5'-TTGACGGTGCCATGGAATTT-3', 277 bp 5'-ACTTGATTTGGAGGAGGGATCT-3', 323 bp 5'-AAGACGCCAGTGGACTCCA-3' i 530 bp 5'-ACGATACCAAAGTTGTCATG-3'.
    4. Przeanalizuj wyniki za pomocą oprogramowania odpowiedniego dla maszyny do PCR. Produkty niespecyficzne muszą być wykluczone na podstawie analizy krzywej topnienia21.

Wyniki

Oznaczanie HER2 metodą FISH:

Intensywności sygnałów HER2-FISH w próbkach FFPE i NCFPE są podobne (Rycina 2). W obu przypadkach w większości komórek widoczna jest wyraźna nadwyżka sygnału zielonego (wskazującego na amplifikację locus genu HER2) w porównaniu z sygnałem czerwonym (gen referencyjny CEN17). Oznacza to, że w badanych przypadkach występuje amplifikacja genu HER2, co sugeruje, że pacjent ten powinien odpowiedzieć na trastuzumab, terapię celowaną anty-HER2. Próbka FFPE posłużyła jako kontrola dodatnia. Sygnały obserwowane w komórkach nienowotworowych (zarówno w FFPE, jak i NCFPE) służą jako referencja wewnętrzna i kontrola ujemna amplifikacji genu HER2. W każdej serii analiz należy wykorzystać co najmniej jeden przekrój o znanym statusie amplifikacji genu jako kontrolę dodatnią reakcji hybrydyzacji.

Jakość RNA:

Odpowiadające sobie próbki FFPE i NCFPE z dwóch różnych przypadków wykazują różnice w jakości RNA przy zastosowaniu polimerazy łańcuchowej w czasie rzeczywistym z odwrotną transkrypcją (real-time RT-PCR). Uzyskane wyniki pokazują różną wydajność amplifikacji dla różnych długości amplikonów (tj. 71 bp, 153 bp, 20 bp, 275 bp, 323 bp) mRNA GAPDH. Wszystkie wartości Ct (cycle threshold) uzyskane z próbek FFPE były wyższe niż te z NCFPE. Różnica ta świadczy o niższej zdolności do amplifikacji PCR mRNA wyizolowanego z tkanek FFPE, co sugeruje bardziej wyraźną modyfikację chemiczną. Co więcej, wyższe wartości Ct dla długich w porównaniu z krótkimi amplikonami są wskaźnikiem fragmentacji mRNA. W porównaniu, nachylenie krzywych wartości Ct dla różnych długości amplikonów wykazuje bardziej zaznaczoną fragmentację mRNA w tkankach FFPE niż w NCFPE (Rycina 3).

Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej komórek przedstawiające rozkład markerów chromosomowych w analizie DNA.
Rycina 2: Reprezentatywne wyniki badania HER2 FISH dla odpowiadających im przekrojów tkanek utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie (FFPE) oraz przekrojów tkanek zatopionych w parafinie, utrwalonych bez użycia formaliny i bez tworzenia wiązań sieciujących (NCFPE). Przedstawiono odpowiadające sobie próbki z tych samych tkanek FFPE (A) i NCFPE (B). W przeciwieństwie do prawidłowych komórek w fazie interfazy (C), w których oczekuje się dwóch sygnałów zielonych (HER2) i dwóch czerwonych (CEN17), komórki z amplifikacją locus genu HER2 wykazują wielokrotne kopie sygnałów zielonych (HER2) (D). Status amplifikacji HER2 był identyczny zarówno w preparatach FFPE, jak i w sekcjach NCFPE po utrwaleniu (A, B). Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Kontrola jakości RNA; RT-PCR w czasie rzeczywistym; wykres; wartości Ct w zależności od długości amplikonu GAPDH; porównanie danych.
Rysunek 3: Wyniki analizy RT-PCR w czasie rzeczywistym wykorzystanej do kontroli jakości RNA. Oś Y: wartości Ct (próg cyklu) dla genu GAPDH przedstawiono dla różnych długości amplikonów (71 bp, 153 bp, 200 bp, 275 bp, 323 bp) na osi X. mRNA wyizolowano z FFPE i NCFPE dwóch różnych próbek tkanki raka piersi przetwarzanych równolegle, a następnie przetranskrybowano do cDNA na potrzeby reakcji PCR. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Wyniki wskazują na dwa kluczowe wnioski. Po pierwsze, prosty 24-godzinny etap SBFS po utrwaleniu skrawków wyciętych z tkanek NCFPE jest wystarczający do uzyskania wyników równoważnych do tych z FFPE w analizach FISH przy użyciu testów FISH zatwierdzonych dla tkanek FFPE (patrz również odniesienie14). Protokół ten ma tę zaletę, że wykorzystuje testy FISH pierwotnie opracowane i zatwierdzone dla FFPE bez konieczności kompleksowej ponownej walidacji (np. poprzez optymalizację warunków przed hybrydyzacją dla tkanek nieusieciowanych). Protokół FISH może być używany dokładnie tak, jak opisano w instrukcjach producenta.

Drobne modyfikacje w stosunku do instrukcji producenta opisanej w niniejszym protokole (np. średnica przekroju tkanki i okresy inkubacji na etapach deparafinowania) wynikają z wcześniejszych adaptacji, co jest wyraźnie zalecane przez producenta ze względu na zastosowanie różnych typów tkanek i metod utrwalania.

Etap po utrwaleniu ma kluczowe znaczenie, ponieważ wymaga czasu reakcji chemicznej wynoszącego 18-24 godziny, co wydłuża czas analizy o jeden dzień, ale pozwala na taki sam codzienny przepływ pracy, jak w przypadku tkanek FFPE (ryc. 1). Podawano, że SBFS przenika do tkanek ze średnią szybkością 1 mm na godzinę,od 22 do 5 mm w ciągu 2 godzin, w zależności od typu tkanki23,24. Obserwacja, że tylko przedłużone okresy po utrwaleniu, trwające dłużej niż 18 godzin, mogą zmienić właściwości NCFPE na skrawki FFPE, wskazuje, że nie penetracja utrwalacza, ale czas reakcji chemicznej ma kluczowe znaczenie dla osiągnięcia pożądanych rezultatów 1,14.

Po drugie, pozostała tkanka NCFPE, która nie jest używana do utrwalenia, może być wykorzystana do dalszych analiz molekularnych, ponieważ biomolekuły są dobrze zachowane. Wykazano to za pomocą PCR z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym (Figura 3). Test jest bardziej czuły i specyficzny niż wartość RIN pochodząca z elektroferogramu (liczba integralności RNA) w odniesieniu do jakości RNA (tj. modyfikacji chemicznej i fragmentacji) dla mRNA wyizolowanego z tkanek zanurzonych w parafinie8. Kontrola jakości została ograniczona w tym badaniu do PCR w czasie rzeczywistym, ponieważ niezależne grupy wykazały, że oprócz RNA, jakość DNA i białek wyizolowanych z NCFPE jest lepsza niż z tkanek FFPE 8,9,13.

Przedstawiony protokół jest następujący, w stosownych przypadkach (np. receptura SBFS, warunki utrwalania, kontrola jakości RNA, walidacja), wymagania specyfikacji technicznych CEN dotyczących procedur przedanalitycznych w diagnostyce in vitro (IVD), które zostały niedawno wydane przez Europejski Komitet Normalizacyjny (CEN) (np. CEN/TS 16827-1:2015 dla izolacji RNA z tkanek FFPE, która odnosi się do normy ISO 15189).

Metoda ogranicza się do tego konkretnego utrwalacza. Chociaż dobre zachowanie biomolekuł i morfologii przy użyciu niesieciowanego, wolnego od formaliny utrwalacza zostało przedstawione w kilku badaniach, jest on stosowany głównie w badaniach, ale nie w rutynowych zastosowaniach medycznych. Jednym z powodów jest to, że zastąpienie złotego standardu utrwalania SBFS innym utrwalaczem wymagałoby różnych badań walidacyjnych, ponieważ nie wszystkie protokoły zoptymalizowane pod kątem materiału FFPE mogą być stosowane do materiałów utrwalanych za pomocą utrwalaczy niesieciujących. Inne metody utrwalania tkanek nie były testowane dla tego protokołu FISH.

Prosty etap po utrwaleniu opisany w tym manuskrypcie ma tę zaletę, że wykorzystuje testy zatwierdzone do diagnostyki in vitro zarówno dla tkanek FFPE, jak i NCFPE.

Oświadczenia

D.G. jest zatrudniony przez Qiagen i posiada opcje na akcje lub obligacje w ramach planu emerytalnego firmy. Dane przedstawione w tym manuskrypcie odnoszą się do systemu tkankowego PAXgene, który został opracowany we wspólnym wysiłku przez Qiagen i PreAnalytiX. Qiagen jest partnerem przemysłowym finansowanego ze środków publicznych Chrześcijańskiego Laboratorium Dopplerowskiego ds. Badań Biopróbek i Technologii Biobankowania. Wszystkich autorów nie ma konfliktu interesów ani konkurujących interesów finansowych.

Podziękowania

Dziękujemy zespołowi laboratorium patologii molekularnej w Instytucie Patologii Uniwersytetu Medycznego w Grazu za ich wiedzę i wsparcie. Ponadto dziękujemy Iris Kufferath i Danieli Pabst za pomoc techniczną, Bernadette Rieger i Sylvii Eidenhammer za opracowanie przypadków HER2, a także Kingi Szurian (patolog) i Tamasowi Regényi (3DHISTEC). Dziękujemy Penelope Kungl za korektę rękopisu. Prace te zostały wsparte finansowo przez Chrześcijański Fundusz Badawczy Dopplera, Austriackie Federalne Ministerstwo Nauki, Badań i Gospodarki oraz Narodową Fundację Badań, Technologii i Rozwoju.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
SAV LP GmbH, Flintsbach a. I., Niemcywww.sav-lp.deFN-200L-4-1Utrwalacz tkanek
Simport Plastic Ltd., Beloeil, Kanadawww.simport.comM-498Urządzenie zabezpieczające zapewniające etykietowanie, utrwalanie i osadzanie parafiny w próbkach tkanek.
Qiagen GmbH, Hilden, Niemcywww.qiagen.com765112Do pobierania, utrwalania i stabilizacji próbek tkanek: 10 wstępnie napełnionych pojemników na odczynniki, zawierających PAXgene Tissue FIX i PAXgene Tissue STABILIZER.
ThermoFisher Scientificwww.thermofisher.com813150Przetwarzanie próbek biologicznych od utrwalenia chemicznego do infiltracji parafiny
Merck Millipore, Monachium, Niemcywww.analytics-shop.com/de/hersteller/millipore.htmlMC1009834000Odwodnienie próbek tkanek
VWR Chemicals, Darmstadt, Niemcyhttps://at.vwr.com10293EPOdwodnienie próbek tkanek
ACM Herba Chemosan Apotheker AG, Wiedeń, Austriawww.herba-chemosan.at 2549662 32Parafina stosowana w urządzeniu do przetwarzania tkanek
Leica Mikrosysteme Handels GmbH, Wiedeń, Austriawww.LeicaBiosystems.com 39602004Podłoże do zatapiania parafiny
Sanova Diagnostik, Wiedeń, Austriawww.sanova.at5229Przyrząd do zatapiania parafiny w tkankach do badań histologicznych
Histocom Medizintechnik Vertriebs GmbH, Wiener Neudorf, Austriawww.histocom.infoM 910010 Tourządzenie jest używane do szczególnie wyrafinowanych technik cięcia parafiny w biologii i medycynie. Tylko wykwalifikowany lub specjalnie przeszkolony personel może obsługiwać mikrotom, tj. zaciskać próbkę, przycinać, ciąć i zdejmować skrawki z instrumentu.
Dako Denmark A/S, Glostrup, Daniawww.chem.agilent.comK802021-2Szkiełka podstawowe powlekane, przeznaczone do montażu skrawków tkanek utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie.
Qiagen GmbH, Hilden Niemcywww.qiagen.com73504Do oczyszczania całkowitego RNA z utrwalonych formaliną, zatopionych w parafinie skrawków tkanek
Qiagen GmbH, Hilden, Niemcywww.qiagen.com 765134Do oczyszczania całkowitego RNA z utrwalonych przez PAXgene, zatopionych w parafinie skrawków tkanek
ZytoVision GmbH, Bremerhaven, Niemcywww.zytovision.comZ-2015-200Do wykrywania amplifikacji genu ERBB2 (znanej również jako HER2) często obserwowanej w litych nowotworach złośliwych, np. próbkach raka piersi.
3DHISTEC, Budapeszt, Węgrywww.3dhistech.comCyfrowe urządzenie do skanowania preparatów tkankowych wyposażone w obiektyw 40x/1,2 NA, filtry czteropasmowe (DAPI/FITC/TRITC/Cy5) oraz 5,5Mpx, 16-bitową, chłodzoną naukową kamerę CMOS (Complementary Metal Oxide Semiconductor).
ThermoFisher Scientificwww.thermofisher.com4368814Zestaw do odwrotnej transkrypcji cDNA o dużej pojemności zawiera wszystkie składniki niezbędne do ilościowej konwersji do 2 &mikro; g całkowitego RNA do jednoniciowego cDNA w pojedynczym 20 &mikro; Reakcja L.
ThermoFisher Scientificwww.thermofisher.com4367659PCR Master Mix zawierający polimerazę, nukleotydy i SYBR Green do PCR i kwantyfikacji amplikonów.
ThermoFisher Scientific, Wilmington, DEwww.thermofisher.comSer. Nr. F239Spektrofotometr do oznaczania ilościowego kwasów nukleinowych.
System PCR w czasie rzeczywistym QuantStudio 7 Flex www.thermofisher.com4485701maszynie do PCR,
Laboratoria Vysis / Abbott. Abbott Park, Illinois, Stany Zjednoczonewww.molecular.abbott/us/en/products/instrumentation/thermobrite#ordere.g. (ThermoBrite) 07J91-020System przetwarzania szkiełek z kontrolowaną temperaturą do procedur denaturacji/hybrydyzacji in-situ.

Bibliografia

  1. Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, R. P. Formaldehyde fixation. J. Histochem.Cytochem. 33 (8), 845-853 (1985).
  2. Oosterhuis, J. W., Coebergh, J. W., van Veen, E. B. Tumour banks: well-guarded treasures in the interest of patients. Nat. Rev. Cancer. 3 (1), 73-77 (2003).
  3. Masuda, N., Ohnishi, T., Kawamoto, S., Monden, M., Okubo, K. Analysis of chemical modification of RNA from formalin-fixed samples and optimization of molecular biology applications for such samples. Nucleic Acids Res. 27 (22), 4436-4443 (1999).
  4. Metz, B., Kersten, G. F., Hoogerhout, P., Brugghe, H. F., Timmermans, H. A., de Jong, A., et al. Identification of formaldehyde-induced modifications in proteins: reactionswith model peptides. J. Biol. Chem. 279 (8), 6235-6243 (2003).
  5. Evers, D. L., Fowler, C. B., Cunningham, B. R., Mason, J. T., O'Leary, T. J. The effect of formaldehyde fixation on RNA: optimization of formaldehyde adduct removal. J.Mol. Diagn. 13 (3), 282-288 (2011).
  6. Groelz, D., Sobin, L., Branton, P., Compton, C., Wyrich, R., Rainen, L. Non-formalin fixative versus formalin-fixed tissue: A comparison of histology and RNA quality. Exp. Mol. Pathol. 94 (1), 188-194 (2013).
  7. Do, H., Dobrovic, A. Sequence artifacts in DNA from formalin-fixed tissues: causes and strategies for minimization. Clin. Chem. 61, 64-71 (2015).
  8. Kashofer, K., Viertler, C., Pichler, M., Zatloukal, K. Quality Control of RNA Preservation and Extraction from Paraffin-Embedded Tissue: Implications for RT-PCR and Microarray Analysis. PloS One. 8 (7), e70714(2013).
  9. Viertler, C., Groelz, D., Gündisch, S., Kashofer, K., Reischauer, B., Riegman, P. H., et al. A new technology for stabilization of biomolecules in tissues for combined histological and molecular analyses. J. Mol. Diagn. 14 (5), 458-466 (2012).
  10. Gundisch, S., Slotta-Huspenina, J., Verderio, P., Maura, C., Ciniselli, S. P., Schott, S., et al. Evaluation of colon cancer histomorphology: A comparison between formalin and PAXgene tissue fixation by an international ring trial. Virchows Arch. 465 (5), 509-519 (2014).
  11. Ergin, B., Meding, S., Langer, R., Kap, M., Viertler, C., Schott, C., et al. Proteomic analysis of PAXgene-fixed tissues. J. Proteome Res. 9 (10), 5188-5196 (2010).
  12. Kap, M., Smedts, F., Oosterhuis, W., Winther, R., Christensen, N., Reischauer, B., et al. Histological Assessment of PAXgene Tissue Fixation and Stabilization Reagents. PLoS ONE. 6 (11), e27704(2011).
  13. Mathieson, W., Marcon, N., Antunes, L., Ashford, D. A., Betsou, F., Frasquilho, S. G., et al. A Critical Evaluation of the PAXgene Tissue Fixation System: Morphology, Immunohistochemistry, Molecular Biology, and Proteomics. Am J Clin Pathol. 146, 25-40 (2016).
  14. Oberauner-Wappis, L., Loibner, M., Viertler, C., Groelz, D., Wyrich, R., Zatloukal, K. Protocol for HER2 FISH determination on PAXgene-fixed and paraffin-embedded tissue in breast cancer. Int J. Exp. Path. 97 (2), 202-206 (2016).
  15. Pauletti, G., Godolphin, W., Press, M. F., Slamon, D. J. Detection and quantitation ofHER-2/neu gene amplification in human breast cancer archival material using fluorescence in situ hybridization. Oncogene. 13 (1), 63-72 (1996).
  16. Owens, M. A., Horten, B. C., Da Silva, M. M. HER2 amplification ratios by fluorescence in situ hybridization and correlation with immunohistochemistry in a cohort of 6556 breast cancer tissues. Clin.Breast Cancer. 5 (1), 63-69 (2004).
  17. Wolff, A. C., Hammond, M. E., Schwartz, J. N., Hagerty, K. L., Allred, D. C., Cote, R. J., et al. American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer. Arch Pathol Lab Med. 131 (1), 18-43 (2007).
  18. Press, M. F., Bernstein, L., Thomas, P. A., Meisner, L. F., Zhou, J. Y., Ma, Y., et al. HER-2/neu gene amplification characterized by fluorescence in situ hybridization: poor prognosis in node-negative breast carcinomas. J. Clin. Oncol. 15 (8), 2894-2904 (1997).
  19. Yamauchi, H., Stearns, V., Hayes, D. F. When is a tumor marker ready for prime time? A case study of c-erbB-2 as a predictive factor in breast cancer. J. Clin. Oncol. 19 (8), 2334-2356 (2001).
  20. Paulik, R., Micsik, T., Kiszler, G., Kaszál, P., Székely, J., Paulik, N., Várhalmi, E., Prémusz, V., Krenács, T., Molnár, B. An optimized image analysis algorithm for detecting nuclear signals in digital whole slides for histopathology. Cytometry A. , (2017).
  21. Applied Biosystems. QuantStudio 6 and 7 Flex Real-Time PCR System Software. , Publication Number 4489822 (2013).
  22. NCCLS. Quality Assurance for Immunocytochemistry. , Wayne. (1999).
  23. Baker, J. R. Principles of Biological Microtechnique. , London: Methuen. Reprinted 1970, with corrections (1958).
  24. Hewitt, S. M., Lewis, F., Cao, Y., Conrad, R. C., Cronin, M., Danenberg, K. D., et al. Tissue handling and specimen preparation in surgical pathology: issues concerning the recovery of nucleic acids from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Arch Pathol. Lab Med. 132 (12), 1929-1935 (2008).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

utrwalacz niesieciuj cypostutrwalanie formalintkanka NCFPEtkanka FFPEhybrydyzacja in situanaliza jako ci RNAmikroskopia konfokalnaetap proteolizyseria odwodnienia
Protokół dla HER2 FISH z wykorzystaniem niesieciowanego, wolnego od formaliny utrwalacza tkankowego, aby połączyć zalety kriokonserwacji i utrwalania formaliny
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.